DE2755802A1

DE2755802A1 - Verfahren zur herstellung von gamma-globulinen und immunnucleinsaeuren sowie immundialysaten und hierfuer verwendete mittel

Info

Publication number: DE2755802A1
Application number: DE19772755802
Authority: DE
Inventors: Dimitri Adamopoulos; John Phillips; Dimitri Viza
Original assignee: International Institute of Differentiation Ltd
Current assignee: International Institute of Differentiation Ltd
Priority date: 1976-12-16
Filing date: 1977-12-14
Publication date: 1978-07-06
Also published as: SE7714218L

Description

Titel: Verfahren zur Herstellung von r-Clobulinen
und Immunnucleinsäuren sowie Immundialysaten und hierfür verwendete Mittel Beschreibung Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von immunologischem Material und insbesondere auf die Herstellung von üGlobulinen, Immunnucleinsäuren und Immundialysaten durch Einleiten bzw. Erzeugen und Züchten von Zelllinien in vitro.
Eine fundamentale Notwendigkeit für das Überleben von Tieren ist deren Fähigkeit zur Resistenz gegenüber Infektionen, die von parasitären Organismen, wie Viren, Bakterien, Fungi und parasitischen Tieren1 hervorgerufen werden, die ständig in der Umgebung vorhanden sind. Die Immunität von Tieren gegenüber derartigen Organismen wird durch zahlreiche unterschiedliche Mechanismen hervorgerufen einschließlich Phagocytose, chemische Aktivität der Antikörper und Produktion von Interferonen, um Virus-Replikation zu verhindern.
Während der letzten 20 Jahre wurde erheblicher Forschungsaufwand in verschiedene immunologische Gebiete investiert einschließlich der Untersuchung von Immunreaktionen, bei denen Material erzeugt wird, das spezifisch bestimmte in ein Tier eingeführte Antigene bekämpft. Die Produktion von Material, das diese spezifischen Immunreaktionen entweder auf nicht-immunisierte Wirte überträgt, wenn es in vivo injiziert wird1 oder aber auf "naive" Zellen, die zur Immunreaktion fähig sind, wenn es in vitro inkubiert wird, ist offensichtlich von großer Bedeutung für humanmedizinische und tiermedizinische Forschung. Hierzu beispielsweise H. S. Lawrence: "The transfer in humans of delayed skin sensitivity to streptococcal M substance and to tube=nlin with disrupted leukocytes". J. Olin-Invest, (1955), 34, 219-30 oder "Transfer of immunological in formation in humans with dialysates of leukocyte extracts", Trans. As. Amer. Physicians, (1968), 76, 84-91. Die Anwesenheit von lebenden Zellen ist wesentlich für die Replikation derartiger immunologischer Stoffe.
Lymphoide Zellen von Tieren, die gegen ein spezifisches Antigen immunisiert worden sind, enthalten wahrscheinlich die Immuninformation innerhalb ihrer Nucleinsäuren unter Bildung sogenannter "Immunnucleinsäuren", die wahrscheinlich die Träger des immunologischen Gedächtnisses sind. Die Immunnucleinsäuren sind daher durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, Immunreaktionsfähigkeit gegen spezifische Antigene an "naive" Lymphozyten weiterzugeben, wenn sie in vivo injiziert werden oder wenn native Lymphozyten mit den Immunnucleinsäuren in vitro inkubiert werden. Tiere mit derartig empfindlich gemachten lymphoiden Zellen können leicht auf eine neue Begegnung mit dem entsprechenden Antigen reagieren und beispielaweise den Angriffen von Bakterien- oder Virenorganismen, die dieses Antigen tragen, widerstehen.
Es sind zahlreiche in vitro Zellinien menschlicher und tierischer Herkunft hergestellt bzw. erzeugt worden, aber die in vitro Produktion von r-Globulinen, die spezifisch gegenüber einem bestimmten Antigen sind, hat noch zu keinem zufriedenstellenden Kultursystem geführt.
Lymphoblastoide Zellen in Kultur bzw. Züchtung können spontan Antikörper produzieren, die gegen unbekannte Antigene gerichtet sind1 rund sie können daher nicht für irgendwelche praktischen Zwecke verwendet werden. Außerdem ändern Zellen während der Kultur bzw. Züchtung häufig ihre Eigenschaften, wenn sie beliebig lang gezüchtet werdenlund verlieren einige Attribute ihres differenzierten Status. Es wurde deshalb als unwahrscheinlich angenommen, daß eine Zellinie gefunden werden könnte, die fähig ist, dazu angeregt werden zu können, spezifische Immunnucleinsäuren zu erzeugen, d.h. die fähig wäre, in die Nucleinsäuren der Zellen die Information einzubauen, die in den exogenen spezifischen Immunnucleinsäuren vorhanden ist1 und weiterhin zur Replikation dieser spezifischen Immunnucleinsäuren fähig wären. Die Produktion von spezifischen Antikörpern ( (-Globulinen) unter Verwendung einer Zellinienkultur wurde ebenfalls als unwahrscheinlich bzw. unmöglich angesehen.
Es wurde jedoch im Verlauf der Forschungsarbeiten über eine vorhandene lymphoblastoide Zellinie, bekannt als LDV/7, überraschenderweise gefunden, daß - wenn LDV/7-Zellen mit spezifischen Immunnucleinsäuren (nachfolgend i-RNS und i-DNS bezeichnet) inkubiert werden, die von menschlichen oder tierischen Gebern erhalten worden sind -lymphoide Zellen,die zuvor gegenüber einem gegebenen Antigen sensibilisiert worden sind, die immunologische Information einbauen und die einbauenden Moleküle replizieren. Außerdem hat sich gezeigt, daß beim Auftrennen oder Aufbrechen von induzierten LDV/7-Zellen und anschließender Dialyse die Dialysate spezifische zellvermittelte Immunität auf andere Zellen sowohl in vivo als auch in vitro übertragen. In der Tat ließ sich diese Immunität auf native LDV/7-Zellen übertragen, die dann weitermachten und die ursprünglich verwendeten Immunnucleinsäuren replizierten. Ein Dialysat mit diesen Eigenschaften wird nachfolgend als Immundialysat bezeichnet.
Es wurde auch gefunden, daß beim Inkubieren der Zellinie mit Immunnucleinsäuren und/oder Immundialysaten die Zellen dazu angeregt werden, (-Globuline zu erzeugen, die spezifisch sind gegenüber dem Antigen, gegen das der ursprüngliche Donor immunisiert worden ist.
Die LDV/7-Zellinie wurde aus periphären Blutleukozyten erhalten von einer 75 Jahre alten offensichtlich gesunden männlichen Versuchsperson.
Die Zellen können in Suspensionskulturen (Submersverfahren) entweder diskontinuierlich in statischen Kulturen oder kontinuierlich in "Spinner"-Rulturen (spinner cultures) und ebenfalls auf Agar gezüchtet werden. Diese Eigenschaft ist besonders nützlich, weil sie es möglich macht, gut eingeführte bakteriologische Methoden auf die in vitro-Kontrolle von Humanzellen anzuwenden. Beispielsweise ist Klonauswahl (Cloning) möglich und es ist ebenfalls möglich, die Wirkung zahlreicher Faktoren-wie Kolonie-stimulierender Faktor-auf die Differenzierung der Zellen zu untersuchen.
Die Zellinie wurde ursprünglich mit Hilfe folgenden Verfahrens angezüchtet (die Prozentangaben beziehen sich in der gesamten Beschreibung jeweils auf das Volumen): Aus der ursprünglichen Blutprobe wurden die meisten Erythrozyten durch Zugabe von 20% Plasmagel abgetrennt und nach Sedimentation in Teströhrchen verworfen. Die gewonnene Suspension wies ein Verhältnis von Erythrozyten zu Leukozyten < 20:1 auf. Die so gewonnenen Leukozyten wurden uann in RPNI 1640 Nährlösung suspendiert, die 2010 Kälberfötenserum enthielt, nit einer Konzentration von 2 x 106 Leukozyten je ml. Zweimal wöchentlich wurde 2/3 der Nährlösung durch frische Nährlösung ersetzt. Da innerhalb der ersten Wochen Zelltod eintrat, wurden die Kulturen eingeengt oder konzentriert entsprechend der Notwendigkeit, die Zellkonzentration über 106 Zellen Je ml zu halten.
Die Zellen wurden in gläsernen Roux-Flaschen gezüchtet. Sechs Wochen nach Kulturbeginn zeigten die Zellen in einer dieser Flaschen Wachstumsmerkmale, d.h.
sie wurden größer und begangen sich zu multiplizieren; diese Zellen wurden verwendet, um die lDV/7-Zellinie anzuzüchten.
Diese Zellinie ist seither in großen Mengen gezüchtet worden unter Verwendung der nachfolgend beschriebenen Vermehrungs-Arbeitsweisen: Die LDV/7-Zellinie kann in zahlreichen Nährlösungen gehalten werden. Sie können in RPPII 1640 Lösung, die 5 bis 30ß0 Kälberfötenserum enthält, gezüchtet werden; vorzugsweise besteht die Nährlösung aus RPMI Lösung, enthaltend lQ'o Kälberfötenserum. Zusätzlich können Nährlösungen nach McCoy und Eagle (I4cCoy's and Eagle's Essential Medium) zum Anlegen von Tochterkulturen der Zellinie verwendet werden.
Die Zellen wachsen in Suspension bei 370C und bilden Klumpen, die durch leichtes Rühren oder Bewegen der Nährlösung verteilt werden können. Es werden mindestens drei Zeilpassagen je Woche vorgenommen. Die übliche Keim- bzw.
Impfzeit beträgt 5 x 105 Zellen je ml und man läßt dle Zellen in statischer Kultur wachsenlbis eine Konzentration von 106 Zellen je ml erreicht ist. Die Zellen wachsen auch in "Spinner"-Kultur, wobei ein rotierender, steriler Magnetrührer die Zellen in der nährlösung in Suspension hält. Auf diese Weise kann eine höhere Konzentration im Bereich von 1,5 x 106 Zellen je ml erreicht werden. Der prozentuale Anteil an abgestorbenen Zellen liegt etwa in der Größenordnung von 5, kann aber je nach den Kulturbedingungen schwanken. Die Fortpflanzungs- oder Gen eration szeit der Zellen beträgt etwa 24 Stunden und hängt wiederum von den Bedingungen ab.
Allgemein sind die Bedingungen, wie pH-Wert und Temperatur, unter denen die Zellinie vervielfältigt wird, im wesentlichen die gleichen, wie sie Leukozyten im menschen antreffen.
Karyotype-Analyse der Zellen ergab, daß die LDV/7-Zellinie hypotetraploid ist. Die Anzahl Chromosomen schwankte zwischen 80 und 93. Eine Untersuchung der Morphologie dieser Zellen unter dem Lichtmikroskop ergab heterogene (unterschiedliche) Zellgröße und ein blasenartiges Aussehen der meisten Zellen. Weitere Untersuchungen mit dem Elektronenmikroskop bestätigten die Heterogenität der Zellinie und zeigtenrunde, einkernige Zellen unterschiedlicher Größe mit zytoplasmischer Differenzierung und rohem endoplasmischem Reticulum sowie Macrophagen-Eigenschaften. Es gibt offenbar mindestens 2 Zellpopulationen: die eine besteht aus kleinen Zellen mit pl (15 /um und die andere aus großen Zellen mit 15 bis 30 /um. Offensichtlich leiten sich die großen Zellen von den kleinen ab.
Drei Klone (Zuchtsorten bzw. Rassen) wurden erhalten von mit Chromosom-Zahfn84 für den ersten sowie 85 für den zweiten und dritten, was die Wirksamkeit der Klonauswahl (Selektivität) erweist.
Die phagocyteren Eigenschaften der Zellen wurden ebenfalls unter dem Elektronenmikroskop untersucht. Es war deutlich zu erkennen, daß einige der Zellen von den anderen Zellen gefressen (phagocytised) wurden. Keine Viren teilchen ließen sich in den Aufnahmen unter dem Elektronenmikroskop nachweisen, und zwar weder in Proben, die unter normalen Kulturbedingungen entnommen worden waren,noch von Proben aus bei +40°C gezüchteten Kulturen.
Es ist bemerkenswert, daß diese Zellinie sehr empfindlich ist gegenüber dem Nebennierenrindenhormon Cortison; dies läßt die Anwesenheit von lymphoblastoiden Zellen und/oder Stammzellen vermuten. Es ist weiterhin bemerkenswert, daß keine EB Virus-Antigene mittels Immunofluoreszenz nachgewiesen wurden.
Die Gewebeuntersuchung der LDV/7-Zellen in Hinblick auf Gewebeverträglichkeit HL-A Antigene zeigte das Vorhandensein folgender Spezifitäten: HIA 2 und BLA 32 für den ersten Ort und HLA Spezifität W 14 für den zweiten Ort. Jedoch wurde auch schwächere Reaktivität mit anderen Antisera für andere HLA Spezifitäten beobachtet; aber dies wurde als nicht-spezifisch angesehen.
LDV/7-Zellen sind im Laboratoire diImmunobiologie, FacultS de Medecine Broussa.is Httel-Dieu, 15, rue de l'Ecole de llEdecíne, Paris 75006, hinterlegt und stehen der Öffeutlichkeit auf Anforderung zur Verfügung.
Ss ist nicht in allen Fällen möglich, immunologisches Material aus anderen bestehenden Zellinien zu produzieren, weil nicht alle Zellinien in der oben in Verbindung mit der LDV/7-Zellinie beschriebenen Weise angeregt bzw.
angereizt werden tonnen. Es hat sich vor allem gezeigt, daß drei Lymphoblsstoid-Zellinien aus an Leukämie leidenden Patienten, zwei Zellinien aus Burkitt Lymphoma Tumoren und drei bestehende Zellinien aus peripheren Blutlymphozyten von gesunden Versuchspersonen nicht angeregt bzw. angereizt werden konnten. Ein erfolgreicher Anreiz (inductonj wurde jedoch bei Lymphoblastoid-Zellinien BRI 8 und BEC 11 erreicht, jedoch nicht in dem Ausmaß wie bei der LDVj7-Zelllinie.
Es hat sich gezeigt, daß eine Bedingung, die erfüllt werden muß, damit eine Zellinie erfolgreich auf einfache Weise angeregt bzw. angereizt werden kann und anschließend spezifische (-Globuline produziert, darin besteht, eine Zellinie zu verwenden, die bereits t-Globuline produziert.
Diese \L-Globuline sind natürlich gegen unbekannte Antigene gerichtet wie oben angegeben. Beispielsweise können Zellinien lymphoider Herkunft (Myeloma oder Lymphoblastoid-Zellinien), die diesem Kriterium genügen, dazu angeregt werden, spezifische -Globuline i-RNS und i-DNS zu produzieren. Jedoch sollte die Möglichkeit, dass Zellinien, die nicht spontan y-Globuline produzieren, ebenfalls angeregt bzw. dazu angereizt werden können, nicht ausgeschlossen werden. Anregung von Zellinien, die bereits spontan r-Globuline erzeugenlunter Anwendung der weiter oben in Verbindung mit der LDV/7-Zellinie beschriebenen Methoden wird daher zur Produktion von g-Globulinen führen, die die gleiche Spezifität aufweisen wie das anregende bzw. anreizende Material.
Gegenstand der Erfindung ist daher die Herstellung von W-Globulinen und Immunnucleinsäuren (wie zuvor definiert), die beide einem gegebenen Antigen gegenüber spezifisch sind; das Verfahren ist dadurch gkennzeichnet, daß man 1. in vitro eine a,nreizbare Zellinie in Gegenwart von spezifischen Immunnucleinsäuren oder spezifischen Immundialysaten züchtet, die entweder aus Lymphoid-Zellen eines menschlichen oder tierischen Spenders, die gegenüber dem spezifischen Antigen sensibilisiert worden sind( oder aus Zellen einer zuvor angeregten Zellinie, die gegen besagtes spezifisches Antigen sensibilisiert worden ist1 oder in Gegenwart der flüssigen Phase einer Kultur aus zuvor angeregter Zellinie, die gegen besagtes spezifisches Antigen sensibilisiert worden ist, erhalten wurden, und daß man 2. Globuline aus der flüssigen Phase der auf diese Weise angeregten bzw. angereizten Zellkultur extrahiert und/oder die Immunnucleinsäuren aus den auf diese Weise gezüchteten Zellen extrahiert.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Herstellung von Immundialysaten (wie zuvor definiert) bereitgestellt, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß man 1. in vitro eine anregbare Zellinie in Gegenwart der spezifischen Immunnucleinsäuren züchtet, die entweder auf Lymphoidzellen eines menschlichen oder tierischen Spenders, die gegenüber besagtem spezifischen Antigen sensibilisiert worden sind1 oder aus Zellen einer zuvor angeregten Zellinie, die gegen besagtes spezifisches Antigen sensibilisiert worden sindloder in Gegenwart der flüssigen Phase einer Kultur aus einer zuvor angeregten Zellinie, die gegen besagtes spezifisches Antigen sensibilisiert worden ist, erhalten wurden, und 2. aus den so gezüchteten Zellen das Immundialysat erhält.
Um die Anregung bestimmter Zellinien zu bewirken, reichen die in Verbindung mit der LDV/7-Zellinie angewandten Bedingungen. In anderen Zellen kann es nötig sein, diese Arbeitsweisen in trivialer Weise abzuändern, beispielaweise hinsichtlich der Inkubationszeit, oder es werden subtilere Änderungen notwendig, beispielsweise Veränderungen der Zellenoberfläche durch Anwendung von proteolytischen Enzymen oder Behandlung mit von Embryonen stammenden Nucleinsäuren.
Die erfindungsgemäß verwendeten Zellinien schließen die Mutanten-Zellinien, die sich von der LDV/7-Zellinie ableiten, ein. Eine solche Mutanten-Zellinie muß natürlich beständig sein, damit sie praktisch verwertbar ist.
Die vererbbare Veränderung, die die Mutanten-Zellinie hervorruft, kann spontan erfolgt sein oder durch verschiedene chemische Stoffe oder physikalische Mittel1 wie Röntgenstrahlen oder UV-Strahlung hervorgerufen worden sein.
Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung spezifischer r-Globuline werden bevorzugt Zellinien lymphoider Herkunft (Myeloma oder Lymphoblastoid-Zellinien) gezüchtet die spontan vor der Anregung bzw. Anreizung )r-Globuline erzeugen, beispielsweise gegen unbekannte Antigene in ihrer Nährlösung. Insbesondere bevorzugt werden die Myeloma-Zellinien. Wird eine lymphoblastoide Zellinie verwendet, so wird hier die LDV/7-Zeninie besonders bevorzugt gezüchtet.
Sowohl bei der Erzeugung von Immunnucleiasäuren, insbesondere i-RNSsowie von Immundialysaten nach der Erfindung können anregbare bzw. anreizbare Zellinien lymphoider Herkunft, wie oben angegeben, verwendet werden, die spontan spezifische r-Globuline erzeugen, bevor sie angeregt oder angereizt werden. Die Verwendung der LDV/7-Lymphoblastoiden-Zellinie wird wiederum bevorzugt. Diese Zellinien können natürlich auch bei der Bildung von Immundialysaten mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens Verwendung finden.
Die Immunnucleinsäure oder - in dem Verfahren zur Herstellung spezifischer (-Globuline oder Immunnucleinsäuren -das Immundialysat, das verwendet wirdlum am Anfang die verwendete Zellinie anzuregen, wird aus einem zuvor immunisierten menschlichen oder tierischen Spender (Donor) gewonnen, beispielsweise aus Schafen, Kaninchen, Meerschweinchen oder Ratten. Wird von Tieren als Spendern ausgegangen, so ist bei Verwendung von keimfreien Tieren, die gegen ein Antigen immunisiert sind, praktisch eine monospezifische Sensibilisierung oder Empfindlichmachung möglich. Die i-RNS kann aus den Lymphoid-Zellen des Spenders mit heißem Phenol und i-DNS mit kalten Phenol extrahiert werden und unter Verwendung eines starken chelatbildenden Mittels, beispielsweise Natrium-4-aminosalicylatlsowie eines Detergens wie Natriumtriisopropylnaphthalinsulfonat.
Wenn diese Immunnucleinsäuren oder Immundialysate mit einer anregbaren Zellinie inkubiert werden, die zur Replikation der anregenden Moleküle fähig ist; beispielsweise erhält man mit den Lymphoblastoid-Zellinien, die als LDV/7 und BRI 8 bekannt sind, große Mengen Immunnucleinsäuren, die einem gegebenen Antigen gegenüber spezifisch sind. Die Replikation, der anregenden bzw.
als Muster dienenden Immunnucleinsäuren findet in dem Zellkultursystem zur gleichen Zeit statt wie die Replikation der zelleigenen Nucleinsäuren während des normalen Verlaufs der Zellteilung. Es kann somit auf die Derepression von endogenen Nucleinsäuren, d.h.Derepression der DNS zurückzuführen sein, daß dann die entsprechende i-RNS produziert wird. Es muß aber bemerkt werden, daß vermutlich keine Artenschranke (species barrier) vorhanden ist, die beispielsweise die Induktion bzw. Anregung der lymphoblastoiden Zellinie LDV/7 menschlicher Herkunft durch i-RNS, erhalten aus den lymphoiden Zellen von Schafen, verhindert.
Ein Immundialysat kann anschließend durch Aufbrechen der angeregten Zellen, beispielsweise durch wiederholtes Frieren und Auftauen oder mit Hilfe eines Homogenisators und anschließendes Dialysieren des Homogenatalhergestellt werden. Dieses gegenüber einem gegebenen Antigen sensibilisierte Immundialysat aus menschlichen oder tierischen Leukozyten enthält Moleküle mit Molekulargewicht < 10.000.
Das Dialysat ist in der Lage, die immunologische Inforration auf die Zellen in der Kultur zu übertragen. Es hat sich gezeigt, daß diese Zellen nach dem Inkubieren mit dem anregenden Immundialysat i-RNS und i-DNS produzierten, die die gleiche Spezifität aufwiesen bzw. trugen wie das zur Anregung verwendete Immundialysat. Die Aktivität des Immundialysats wurde durch Behandeln mit RNS-ase oder DNS-ase nicht zerstört, jedoch durch Behandlung mit Pronase.
Dies legt nahe, daß die Information getragen wurde von einem kleinen Protein mit Molekulargewicht unter 10.000 und daß diese Information in eine Nucleinsäure transscribiert werden konnte. Zwar ist der Mechanismus einer solchen Transscription noch nicht aufgeklärt; das Ergebnis jedoch, nämlich die Übertragung der Information von Proteinen auf Nucleinsäurenlist bei dem derzeitigen Stand der Kenntnisse in der Molekularbiologie völlig unerwartet.
Es ist anzumerken, daß Nachweise aus Jüngster Zeit nahelegen, daß die für die Übertragung der Immunität auf ein spezifisches Antigen verantwortliche i-RNS Messenger-RNS ist (vergl. P. Bibello, M. Fishman and G. Koch, Cell Immunol, D , 309-319 (1976)).
Spezifische Antikörper ( f1,-Globuline) wurden in der flüssigen Phase gefunden, die aus Kulturen von Zellen, angeregt mit i-RNS, i-DNS und/oder Immundialysatenlerhalten wurde. Überraschenderweise zeigten diese spezifischen -Globuline (überwiegend IgG) stets Bumanspezifität, wenn die verwendete Zellinie menschlichen Ursprungs war, aibst wenn. die anregende Immunnucleinsäure tierischer Herkunft war, beispielsweise vom Schaf oder Kaninchen stammte. Dies legt erneut die Derepression des Wirtszellengenoms durch die Tier-Nucleinsäure nahe. Diese Hypothese wird durch folgenden Nachweis gestützt: Der Vorgang der Anregung (Induktion) der Zellinien ruft Veränderungen in der Zelloberfläche hervor und insbesondere das Auftreten von spezifischen Antigenrezeptoren, die wahrscheinlich 't-Globuline sind. Außerdem zeigen Experimente, die unter Verwendung von LDV/7-Zellen, Schaf- i-RNS und Kaninchen-Antischaf-f-globulin durchgeführt wurden, daß keine Schafg -globuline in den angeregten Kulturen nachweisbar sind; dies spricht dafür, daß die von den LDV/7-Zellen produzierten spezifischen t-Globuline Human-Allotypen waren.
Außerdem waren ebenfalls nur Human-Allotypen vorhanden, wenn die spezifischen Antikörper auf einer Immunoadsorbenskolonne für das entsprechende Antigen extrahiert und nach Elution geprüft wurden.
Weiterhin regt die Inkubation von nicht angeregten Zellen mit der flüssigen Phase aus einer angeregten Kultur die Produktion von i-DNS und i-RNS in den "na.iven" Zellen an und ebenso häufig die Produktion von spezifischem {-Globulin. Infolgedessen können die anregenden Faktoren des Gewebekulturmediums ebenso wie die Antikörper extrahiert und gereinigt werden. Die t-Globuline können extrahiert werden unter Verwendung einer spezifischen Immunoadsorbens-Kolonne mit dem entsprechenden Antigen oder einenGenerationswechsel bedingenden (xenogeneic) Anti-human-Globulinantikörper an das Medium enthaltene spezifische f-Globulin bindet. Die t-Globuline können dann leicht durch anschließende Elution erhalten werden.
In den nachfolgenden Beispielen wurden hauptsächlich ein bestimmtes Hämocyanin, und zwar Key-hole limpet haemocyanin (KLH)1als sensibilisierendes Antigen verwendet; dies geschah aus Gründen der experimentellen Bequemlichkeit und bedeutet keinerlei Einschränkung mit Bezug auf die sensibilisierenden Antigene, die verwendet werden können. Andere Antigene wie Brucella-Bakterien, Ooccidiodin oder Histoplasmin wurden ebenfalls mit Erfolg verwendet.
Der Gebrauch der oben beschriebenen immunologischen Stoffe, um zellbedingte Immunität gegen spezifische Antigene zu übertragen1 ist von offenkundiger Bedeutung auf dem Gebiet der Medizin. Die anregenden Moleküle können beispielsweise aus keimfreien Tieren, die gegen ein Antigen immunisiert worden sind, erhalten werden, wodurch man praktisch monospezifisch immune Mediatoren, d.h. Vermittler bzw. Zwischenträgerlerhält. Klonauswahl der Zellkulturen nach der Anregung liefert ebenfalls eine Kultur für die Erzeugung von monospezifischen t-Globulinen.
Die Massenproduktion solcher Mediatoren in vitro findet vielfältige Anwendung. Die Verwendung von Immundialysaten ist vorteilhaft gegenüber der Verwendung von Immunnucleinsäuren, weil es kaum möglich ist, Immunreaktionen gegen die Immundialysate zu erhalten und auf diese Weise anaphylactische Reaktionen vermieden werden.
Außerdem ist bei Verwendung von Zelldialysaten jegliche Virengefahr ausgeschlossen, während in Immunnucleinsäuren möglicherweise Nierengenome vorhanden sein können, die auszuschlißen umständlich ist.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf ein Medikament, das in Form einer Dosiseinheit verabreicht und mindestens eine der Immunnucleinsäuren (i-RNS oder i-DNS) und/oder Immundialysate spezifisch gegenüber einem gegebenen Antigen enthält, die durch ein wie oben beschriebenes Verfahren nach der Erfindung hergestellt worden sind. In vitro erzeugte spezifische Human (-globuline haben einen weiten Anwendungsbereich und können als Substitute bzw. Ersatz für y-Globuline eingesetzt werden, die aus Tieren oder Menschen gewonnen werden und derzeit üblicherweise in der passiven Immunotherapie wie für diagnostische Zwecke Verwendung finden. Die Erfindung bezieht sich somit auch auf ein Arzneimittel, das in Doßierungseinheitsform verabreicht werden kann und spezifische -Globuline enthält, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen bzw. erzeugt worden sind.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1 (anfänglichen) a) Allgemeine Methode zum ursprtinglichen Anreizen einer Zellinie mit von einem zuvor immunisierten Spender erhaltenen Immunnucleinsäuren.
Eine SRS- oder DliS-Lösung, die aus den Bymphoidzellen eines zuvor gegen ein spezifisches Antigen immunisierten Spenders erhalten worden war, wurde mit DNS-ase bzw.
mit RNS-ase behandelt, um sicherzustellen, daß keine DNS oder RIiS mehr vorhanden war. 107 LDV/7 Zellen wurden 30 bis 60 min lang mit 0,5 bis 1,00 mg RNS oder DNS in Lösung inkubiert.
Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 5 x 105 Zellen/ml in der Nährlösung RMPI 1640 ergänzt mit 10 % Kälberfoetenserum suspendiert. Man ließ die Kultur wachsen bis die Konzentration 106 Zellen/ml betrug; dann wurde die Kultur in frische Nährlösung verbracht, wodurch die Konzentration auf 5 x 105 Zellen/ml fiel. Die Zellen wurden geerntet bzw. gewonnen, wenn die Gesamtausbeute 10 der Kulturen der Größenordnung von 10 Zellen lag. Immun-RNS und Immundialysate wurden dann aus diesen Zellen gewonnen und spezifische 'Globuline aus dem Gewebe-Nährmedium extrahiert.
b) Allgemeine Methode der Anreizung einer Zellinie unter Verwendung von Dialysat, das aus ursprünglich angeregten oder angereizten LDV/7 Zellen erhalten worden ist.
Dialysat der wie oben hergestellten Zellen wurden nach Einfrieren-Auftauen von 109 Zellen in 10 ml destilliertem Wasser und anschließender Dialyse durch einen Dialysebeutel unter Vakuum erhalten.
100 ml LDV/7 Zellen mit einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/ml wurden mit den Dialysaten inkubiert, die aus 5 x 107 Zellen angeregt bzw. angereizt wie oben erhalten worden waren. Die Zellen wurden nachgezüchtet bzw.
Tochterkulturen angelegt, bis die Gesamtausbeute 2 x 109 Zellen betrug; aus diesen wurden i-RNS, i-DNS und Immundialysate erhalten.
Die Spezifität für bösartige Melanomaantigene der i-RNS, die aus den gezüchteten Zellen nach Anregung oder Anreizung mit i-RNS, i-DNS oder einem Immundialysat erhalten worden war, wurde in einem Zell-vermittelten Cytotoxizitätssystem bestimmt. Bösartige Melanoma-Zellinien waren die Zielscheiben-Zellen. Die Cytotoxizitätsindizes zeigten, daß Immunnukleinsäuren oder Immundialysate "nativen inaktiven peripheren Blutlymphocyten nach Inkubation eine spezifische Cytotoxizität gegenüber den Ziel-Zellen verleihen.
Beispiel 2 In einer anderen Versuchsreihe wurde festgestellt, daß durch Inkubieren von LDV/7 oder BRI 8 Zellen mit Immunnukleinsäuren oder Immundialysaten, wie in Beispiel 1, das Auftreten von spezifischen Antigenrezeptorstellen auf der Zelloberfläche der lymphoplastoiden Zellen angeregt wird.
a) Wenn LDV/7 Zellen inkubiert wurden mit i-Nukleinsäuren oder Immundialysaten, die spezifisch waren für KLH (Keyhole-limpet Haemocyanin), entwickelten die LDV/7 Zellen anschließend Rezeptorstellen für dieses Antigen.
Dies war zu erkennen an einer rosettenartigen Bildung von SRBC (Schaf rote Blutzellen), die zuvor mit KLH beschichtet worden waren. Außerdem ließ sich in diesen Versuchen die Produktion von spezifischem Anti-KLH-Antikörper in der Nährlösung nachweisen.
b) Die lymphoplastoide Zellinie BRI 8 wurde angeregt unter Anwendung der Arbeitsweisen nach Beispiel 1, in Gegenwart von i-RNS und in einem zweiten Versuch mit Immundialysaten, die beide spezifisch waren für KLH. Anschließend wurde Rosettenbildung beobachtet, wie im Versuch a).
Beispiel 3 Die in dieser Versuchsreihe verwendete i-RNS wurde aus den Lymphknoten und der Milz von Schafen extrahiert, die mit entweder Melanoma-oder Coloncarcinoma-Zellen immunisiert worden waren. Die aus Schafen isolierte Immun-RNS wird nachfolgend abgekürzt als Is-RNS bezeichnet. Als Kontrolle wurde L-RNS aus Schafen, die mit KLH immunisiert worden waren, verwendet.
Das Schema für die Immunisierung der Schafe, sowie das Verfahren der Extraktion von i-RNS mit heißem Phenol sind von D.H. Kern, D. Fritze, C.R. Drogemüller und Y.H. Pilch in "J. Nat. Cancer. Inst." 57, 97-103 (1976) bzw. von L.L. Veltman, D.H. Kern und Y.H. Pilch in "Cell. Immunol." 131, 367-377 (1974) beschrieben. Die i-RNS-Präparate wurden auf ihren Proteingehalt sowie ihren Gehalt an DNS und RNS hin untersucht und dieser bestimmt. Ebenfalls bestimmt wurden die Saccharosedichtegradientprofile der i-RNS, da diese erlauben, Abbauvorgänge, die biologische Aktivität zerstören, abzuschätzen (hierzu Y.H. Pilch, K.P. Ramming und P.J. Deckels, in WMethods in Cancer Research", (Herausgeber H. Bush) Bd. 9, New York, Academic Press, 1973, 195-259.
Die biologische Aktivität dieser i-RNSen wurde mit Hilfe eines in vitro Mikrocytotoxizitätstestes bestimmt (hierzu RflA in the Immune Response", H. Friedinan, Herausgeber Annt tJ.Y. Acad. Sci., 207 (1973). Ihre Fähigkeit, normale bzw. Allotypen hervorrufende, allogenart ige humanperiphere Blutlymphocyten zu cytotoxischen Effektorzellen umzuwandeln, wurde nach der in vitro Inkubation von Lymphocyten mit i-RNS getestet; anschließend wurde die Cytotoxizitätsaktivität der behandelten Lymphocyten gegen gezüchtete Humantumorzellen des gleichen histologischen Typs untersucht, wie sie zum Immunisieren des Is-RNS Donorschafs verwendet worden waren.
Die lymphoplastoide Zellinie LDV/7 wurde mit is-RNS,wie folgt, angeregt: 1 mg Ia-RNS wurde in 0,5 ml RPMI 1640 Nährlösung gelöst.
Diese Lösung wurde mit Bezug auf Saccharose 0,35 molar eingestellt. 107 LDV/7 Zellen wurden anschließend in dieser Lösung suspendiert und mindestens 30 min lang bei 3700 unter ständigem Rühren inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde frische Nährlösung zugegeben und das Endvolumen auf 20 ml eingestellt, wordurch die Zellkonzentration auf 5 x 105 Zellen/ml sank. Da die mittlere Verdopplungszeit dieser Zellinie, wenn sie unter statischen Bedingungen gezüchtet wird, in der Größenordnung von 24 h liegt, wurde ein gleiches Volumen wie das vorhandene an frischer Nährlösung (RPMI 1640, ergänzt durch 10 0 Kälberfoetenserum) jeden Tag zugegeben, bis das gesamte Volumen der Kultur 3 1 ausmachte, entsprechend einer Ausbeute von etwa 2 x 109 Zellen. Ein gleicher Anteil von 107 Zellen aus dieser Kultur wurde ein zweites Mal mit der gleichen Is-RNS unter Befolgung der gleichen Arbeitsweise angeregt. Dieser neu angeregte Anteil diente zum Beimpfen einer zweiten Kultur, die wiederum ergänzt wurde durch frische Nährlösung und die man wachsen ließ, bis eine gewünschte Anzahl Zellen erreicht worden war. Üblicherweise läßt man diese zweite Kultur so lange wachsen, bis man 4 x 109 Zellen erhält. Die Zellen aus beiden Kulturen wurden zusammengegeben und gefroren bei -200C aufbewahrt. I-RNS wurde aus den gefrorenen Zellen extrahiert (Ic-RNS) und,wie oben beschrieben, hinsichtlich der biologischen Aktivität untersucht.
Üblicherweise werden aus i09 Zellen 0,7 bis 1,5 mg Gesamt-RNS erhalten. Alle Ansätze von Ic-RNS, die auf diese Weise extrahiert wurden, ergaben ein nicht nachteilig verändertes (abgebautes) Profil der Saccharose-Dichtegradienten.
Die aus den gezüchteten EDV/7 Zellen extrahierten Ic-RNSn wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit geprüft, naive Humanlymphocyten zur Cytotoxizität gegenüber Tumor-Zielzellen in vitro anzuregen. Die Humanlymphocyten wurden aus dem peripheren Blut eines gesunden Spenders auf Ficoliisopaque Gradienten isoliert. Ihre Aktivität wurde mit derjenigen der anregenden Is-RNS-Präparate verglichen.
In acht von zehn Versuchen wurde gezeigt, daß Ic-RNS-Präparate in der Lage waren, naiven Allotypen hervorrufenden (allogeneic) Lymphocyten eine significante Cytotoxizität für Tumor-Zielzellen zu verleihen. In Tabelle I sind die Ergebnisse aus zwei typischen erfolgreichen Versuchen zusammengefaßt: Allotypen-hervorrufende Humanlymphocyten aus dem peripheren Blut eines gesunden Spenders wurden als Effektorzellen verwendet. 5 x 107 Zellen wurden mit i-RNS inkubiert, die extrahiert worden war aus a) nicht-angeresten EDV/7 Zellen (c-RNS), b) einem Schaf, immunisiert mit KLH (Is-RNSk), c) einem Schaf, immunisiert mit Human Colon Carcinoma Zellen (Is-RNSc), d) einem Schaf, immunisiert mit Human Melanoma Zellen (Is-RNSm) und e) drei Ansätzen von EDV/7 Zellen (Ic-RNS) nach Anregung mit Jeweils einem der drei verschiedenen Arten von Is-RNS (k, c und m). Lymphocyten, die ohne i-RNS inkubiert wurden, dienten als Kontrolle (Cl). Jeder Zahlenwert stellt den Mittelwert aus sechs Meßwerten dar. Signifikante Unterschiede (P < 0,005) wurden zwischen der Aktivität der I-RNSn erhalten entweder aus dem mit Tumorzellen immunisierten Schaf oder von LDV/7 Kulturen, angeregt mit diesen Antitumor Is-RNSn einerseits und den Kontrollen (Lymphocyten inkubiert ohne RNS, c-RNS, Is-RNSlc oder Ic-RNSk) andererseits erhalten. Keine signifikanten Unterschiede wurde zwischen den Cytotoxizitätsindizes, die mit aktivem Is-RNS-Präparaten und den Ic-RNSn aus LDV/7 Zellen, angeregt mit diesen Is-RNSn beobachtet. NT bedeutet nicht geprüft.
Der Begriff "Allotypen-hervorrufende Lymphocyten" wird hier mit Bezug auf den Patienten verwendet, der die für die Immunisierung der Schafe verwendeten Tumorzellen spendet.
Die für die Cytotoxizitätsteste verwendeten, gezüchteten Tumorzellen waren Allotypen hervorrufend mit Bezug auf den Tumorzellenspender und gehörten dem gleichen histologischen Typ an, wie diejenigen, die zur Schafimmunisierung verwendet wurden. Der gleiche Blutspender lieferte während dieser Versuche die Effektorlymphocyten.
TABELLE 1 1 2 cl O + 0,07 0 j 9,10 c-RNS 0t03 + 0,05 0,07 t 0;05 Is-RNSk NT 0,l2 i 0,02 Ic-RNSk NT 0,10 1 0,03 Is-RNSc 0,50 + 0,06 0,38 t 0,09 Ic-RNSc 0.48 1 0,06 0,30 1 0)08 Is-RNSn 0,34 # 0,03 0)33 4- 0,08 Ic-RNSn 0,34 # 0,03 0,23 t 0t05 Es muß jedoch betont werden, daß diese Ergebnisse nhV -naheliegen, daß die beobachtete Cytotoxizität ausschließlich auf Tumorspezifitäten zurückzuiühren ist, da sowohl die Is-RNS als auch Ic-RNS-Präparate Immunreaktivität gegen HL,A Spezifitäten sowie gegen mit Tumor associierten Antigenen verleihen. Was die Versuche klar zeigen, ist, daß Ic-RNS normal Humanlymphocyten gleichartige Cytotoxizitätsindizes verleiht wie die zur Anregung verwendete Is-RNS.
Zu bemerken ist noch, daß die Li1V/7 Zellen in der Lage sind, Ic-RNS zu erzeugen, die die gleichen Spezifitäten trägt wie die Is-RNSsmindestens 10 Wochen nach der ursprünglichen Anregung und daß Ic-RNS die gleiche spezifische Aktivität aufwies, wann immer es zwei bis zehn Wochen nach der Anregung extrahiert wurde.
Beispiel 4 I-RNS wurde aus dem lymphoiden Gewebe von Schafen extrahiert, die entweder mit KLH oder mit menschlichen Tumorgeweben (Melanoma,Colon Carcinoma), KSH und Freundeschem komplettem Adjuvans (FCA) oder mit FOA alleine. I-RNS aus nicht-immunisierten Schafen wurde unter den gleichen Bedingungen extrahiert. Eine Heißphenol-Methode wurde für die F2fS-Extraktion angewandt. Die DNST, RNS- und Proteinkonzentration wurde für jedes Präparat bestimmt und die Abwesenheit signifikanten Abbaus mittels Analyse von Saccharose-Dichtearadientenprofilen bestimmt. Die I-RNS-Präparate wurden lyophilisiert bis zum Gebrauch aufbewahrt.
Die LDV/7 lymphoplastoide Zellinie wurde für diese Versuche verwendet. Die Zellen wuchsen in RPMI 1640 Nährlösung (Gibco), ergänzt mit 10 % Kälberfoetenserum (FCS), in Suspensions-*) immunisiert worden waren.
gezüchtet kultur und ihre mittlere Verdopplungszeit unter den vorliegenden experimentellen Bedingungen, betrug etwa 24 h.
Für die Anregung wurden 107 LDV/7 Zellen 60 min in 1 ml RPMI 1640 Nährlösung ohne FCS, enthaltend 1 mg I-RNS, inkubiert.
Am Ende der Inkubationszeit wurden 19 ml Nährlösung mit 10 % FCS zugegeben, so daß die Zellkonzentration sich auf 5 x 105 Zellen/ml einstellte. Die Zellen wurden dann unter Standard-Kulturbedingungen wachsen gelassen.
Beweis für die Bildung von Membranrezeptoren, spezifisch für das gegebene Antigen, auf der Oberfläche der angeregten LDV/7 Zellen: a) Immun-Cytoadhärenz Rote Blutzellen des Schafes (SRBC) wurden mit einem gleichen Volumen 0,005 zeiger Gerbsäurelösung gemischt und 10 min bei 370C inkubiert. Nach Waschen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden die Zellen in PBS in einem Volumenverhältnis von 1 : 20 suspendiert. 1 ml dieser Suspension wurde mit 5 ml PBS, enthaltend 1 ms/ml KLH gemischt und 10 min bei 370C inkubiert, um das Antigen auf den SRBC Membranen zu fixieren. Nach dem Waschen wurden die mit Antigen beschichteten SRBC-Zellen erneut in 5 ml PBS suspensiert.
Gewaschene LDV/7 Zellen wurden mit Antigen-beschichtetem SRBC gemischt und 2 h bei 370C inkubiert. Proben wurden am Ende der Inkubation zeit entnommen, zwischen Objektträger und Deckplättchen (aus Glas) gegeben und unter dem Mikroskop ausgezählt. LDV/7 Zellen, an die mehr als 3 SRBC gebunden waren, wurden als "Rosetten-bildende" Zellen angesehen.
LDV/7 Zellen, die mit I-RNS aus mit KLH immunisiertem Schaf angeregt waren, zeigten eine signifikant höhere Anzahl Rosetten-bildender Zellen, wenn sie mit KLH inkubiert wurden, als Zellen, die mit RNS aus nicht-immunisierteT'irter mit I-RNS aus mit einem anderen Antigen als zur Beschichtung der SRBC verwendeten, beispielsweise FCA immunisierten Schafen, angeregt worden waren. Die mittlere Anzahl Rosetten-bildender Zellen, die für eine angeregte Kultur beobachtet wurde, lag in der Größenordnung von 10 .
b) Immunofluorescenz KLH, markiert mitTetramethylrhodaminisothiocanat, Isomer G (Sigma) (RITC) wurde verwendet, um die KLH Membran Rezeptoren mittels direkter Immunofluorecenz zu lokalisieren. 200 /ug/ml RITC, markiert mit KLH, wurden mit 6 x 105 LDV/7 Zellen während 30 min inkubiert.
Zellen wurden unter den gleichen Bedingungen mit nicht-markiertem KLH inkubiert. Das letztere wurde auf der Zelloberfläche nachgewiesen mit Hilfe eines Kaninchen anti-KLH-Antiserum konjugiert an Fluorescein-isothiocyanat)Isomer I (Sigma) (FITC). Kaninchen anti-KLH-Antisera wurden mittels dreier zweiwöchentlicher (14-tägiger) Injektionen von 1 mg KLH hergestellt.
Ein Ziegen anti-Eaninchen FITC-markiertes Antiserum wurde in der indirekten Arbeitsweise verwendet, um nicht-markierte Kaninchen anti-ELH-Antikörper zu entwickeln, die auf der Oberfläche von LDV/7 Zellen,inkubiert mit KLH, fixiert waren.
LDV/7 Zellen, die mit Schaf i-RNS-KLH angeregt und mit KLH inkubiert worden waren, zeigten fluorescierende Färbung im direktem Test (unter Verwendung von markiertem KLH) oder im indirekten Test (unter Verwendung von fluorescierendem Kaninchen anti-KLH-Antiserum oder nicht-markiertem Kaninchen anti-KLH-Antiserum und einem fluorescierenden Ziegen anti-Eaninchen-Antiserum), vergleiche Tabelle II. Zellen, die mit Schaf i-RNS-FCA oder i-RNS aus nicht-immunisierten Schafen angeregt waren, zeigten keine Antigenrezeptoren für KLH auf ihrer Oberfläche und blieben somit nicht fluorescierende Spezifisches Immunblockieren (IB) bestätigte die Spezifität der Färbung. Etwa 30 % der Zellen aus den angeregten Eulturen erwiesen sich als fluorescierend.
../Tabelle TABELLE II nicht-ange- i-RNS-KLH regte Zellen angeregte Zellen Direkte Färbung mit RITC markiertem KLH - + I.B.: pre-Inkubation mit KLH und dann mit markiertem KLH Indirekte Färbung: Inkubation mit KLH und dann mit FITC markiertem Kaninchen anti-KLH Antiserum - ++ I.B.: pre-Inkubation mit KLH, dann mit nicht-markiertem Kaninchen-anti-KLH Antiserum, anschließend mit markiertem Eaninchen-anti-ELH Antiserum -Indirekte Färbung: Inkubation mit KIEH, dann mit Kaninchen-anti-KLH Antiserum und dann mit einem FITC markiertem Ziegen anti-Kaninchen r-Globulin anti-Serum Der Grad der Fluorescenz-Färbung ist angegeben als prozentualer Anteil der fluoreszierenden Zellen, wie folgt: + > 30 ffi tt > 40 % +++ > 50 ffi FITC = Fluorescein-isothiocyanat Isomer I RITC = Tetramethyl-rhodamin-isothiocyanat Isomer G.
c) Peroxidase-diaminobenzidin (PO-DAB): vergleiche Graham, R.C. und Karnovsky, M.J. "The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique". J. Histochem. Cytochem., 14, 291, 1966.
106 LDV/7 Zellen, inkubiert mit 1 ml einer Lösung aus KLH (200 /ug/ml) wurden nach gründlichem Waschen mit Earnovskyfixativ 5 min lang fixiert und dann einem Kaninchen anti-KLH-Antiserum ausgesetzt. Nach weiterem gründlichen Waschen wurden die Kaninchen einem Ziegen anti-Kaninchen-Antiserum, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Institut Pasteur), ausgesetzt. Das Präparat wurde dann einer gesättigten Lösung aus freier 3,3'-Diaminobenzidinbase (DAB) (Sigma) 15 min bei 200C ausgesetzt und dann in Karnovsky-fixativ 30 min lang fixiert. Das Pellet wurde dann dehydratisiert und in Epon 812 (Epoxyharz) eingebettet. Dünne Schnitte wurden mit Hilfe eines Reichert Mikrotoms angefertigt und ungefärbt oder mit Blei kontrastiert in einem Philips 300 Elektronenmikroskop untersucht.
i-RNS-KLH angeregte Zellen, inkubiert mit KLH und gefärbt mit PO-DAB zeigten im Elektronenmikroskop eine dicke schwarze Linie auf der Außenfläche ihrer Membranen, entsprechenc der Peroxidasereaktion und somit zeigend die KLH Fixierung auf den Membran-Antigen-Rezeptoren. Etwa 30 % der KLH-I-RNS Zellen erwiesen sich als Peroxidase-positiv.
Es wird daraus geschlossen, daß diese i-RNS(SchaSFHerkunft) Information auf generationswechselhervorrufende lymphoplastoide Zellen in Kultur überträgt. Die letzteren sind fähig, diese Information erneut wiederzugeben. Die Ergebnisse zeigen, daß generationswechselhervorrufende (xenogenic) I-RNS nicht lediglich passiv eingebaut und durch die LDV/7 lymphoplastoiden Zellen repliziert wird, sondern funktional wird in der Weise, daß ihre Information zum Ausdruck kommt, sobald sie in die Wirtszelle eingebaut ist. In der Tat ruft sie Änderungen der Zelloberfläche hervor, sdas Auftreten von spezifischen Antigenrezeptoren und weiterhin Sekretion von spezifischen -Globulinen, obwohl dieser letztere Punkt in diesem Beispiel nicht demonstriert wird.
Beispiel 5 I-RNS wurde in der üblichen Weise aus dem Lymphoidgewebe von Kaninchen extrahiert, die mit Brucella Bacterin immunisiert worden waren. Die so hergestellten i-RNS-Präparate wurden verwendet, um die LDV/7 Zellinie mit Hilfe der in Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweisen anzuregen. Die überstehende Flüssigkeit aus dem Nährmedium wurde hinsichtlich der Anwesenheit von )'-Globulinen, die spezifisch sind gegenüber Brucella bacteria, das als ursprüngliches sensibilisierend Antigen verwendet worden war, analysiert. Das Vorhandensein derartiger spezifischer .t-Globuline wurde mit Hilfe Immunofluorescenz-Arbeitsweisen nachgewiesen und mittels Agglutination,rn Proben der überstehenden Flüssigkeit mit Brucella-Bakterien kombiniert wurden.
Beispiel 6 Entsprechend der Arbeitsweise nach Beispiel 5 wurden g--Globuline, die spezifisch waren gegenüber Coccidioidir, unter Verwendung der LDV/7 Zellinie erzeugt. Die zur Anregung des Zellkultursystems verwendete i-RNS wurde auf den Lymphoideweben von Kaninchen gewonnen, die zuvor gegenüber Coccidioidin sensibilisiert worden waren.

Claims

Pa t e n t a n s p r ü 0 h e 1. Verfahren zur Herstellung von g-Globulinen und Immunnucleinsäuren, die beide einem gegebenen Antigen gegenüber spezifisch sind, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man 1. eine anregbare Zellinie in vitro in Gegenwart von spezifischen Immunnucleinsäure oder spezifischen Immundialysaten züchtet, die erhalten worden sind aus entweder Lymphoid-Zellen eines menschlichen oder tierischen Spenders, der gegen besagtes spezifische Antigen sensibilisiert worden ist, oder aus Zellen einer zuvor angeregten Zellinie, sensibilisiert gegenüber dem spezifischen Antigen oder in Gegenwart der flüssigen Phase einer Kultur einer zuvor angeregten Zellinie, die gegen das spezifische Antigen sensibilisiert worden ist und daß man 2. die .t-Globuline aus der flüssigen Phase der derart angeregten Zellkultur extrahiert und/oder die Immunsäuren aus den so gezüchteten Zellen extrahiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man in der ersten Stufe i-RNS, erhalten aus den Lymphoidzellen eines sensibilisierten tierischen Spenders verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man als sensibilisierten tierischen Spender Schaf, Kaninchen, Merrschweinchen oder Ratten verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man in der ersten Stufe i-RNS oder i-DNS, erhalten aus Zellen einer zuvor angeregten LDV/7-Zelle verwendet.
5. Verfahren nach einem der vQrangegaflgenen Ansprüche, dadurch g e ke n n z e i c h n e t , daß man in der ersten Stufe die Spender-Lymphoidenzellen oder zuvor angeregten Zellen gegen Keyhole-limpet Haemocyanin, Coccidiodin, Histoplasmin, Brucella-Bakterien oder gegen Melanana- oder Colon-Carcinoma-Zellen sensibilisiert.
6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man in Stufe eins eine Zellinie züchtet, die vor der Anregung spontan t-Globuline produziert.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch g e k e n n -z ei c h n e t , daß man eine Myeloma.-Zellinie verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man die BR1 8 oder BEC 11-Zelllinie verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man die LDV/7-Zellinie verwendet.
10. Verfahren zur Herstellung von Immundialysaten, die spezifisch sind gegenüber einem gegebenen Antigen, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man 1. eine anregbare Zellinie in vitro züchtet in Gegenwart von spezifischen Immunnucleinsäuren, die erhalten wurden entweder aus lymphoiden Zellen eines menschlichen oder tierischen Spenders, der gegenüber dem spezifischen Antigen sensibilisiert worden ist, oder aus Zellen einer zuvor angeregten Zellinie sensibilisiert gegenüber den spezifischen Antigenen oder in Gegenwart der flüssigen Phase einer Kultur von zuvor induzierter Zellinie, angeregt gegen das spezifische Antigen und daß man 2. aus den so gezüchteten Zellen Immundialysat gewinnt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man in der ersten Stufe i-RNS, erhalten aus den lymphoiden Zellen eines sensibilisierten Tierspenders verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man als sensibilisierten Tierspender Schaf, Kaninchen, Merrschweinchen oder Ratte verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man in der ersten Stufe i-RNS oder i-DNS,erhalten aus Zellen einer zuvor angeregten LI)V/7-Zelle verwendet0
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man in der ersten Stufe die Lymphoidzellen des Spenders oder die zuvor angeregte Zellinie gegen Keyhole-limpet Haemocyanin oder gegen Melanoma- oder Coloncarcinoma-Zellen sensibilisiert.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man in der ersten Stufe eine Zellinie lymphoider Herkunft züchtet, die vor der Anregung spontan (-Globuline produziert.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man die BRI 8 oder BEC 11-Zellinie verwendet.
17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man die LDV/7-Zellinie verwendet.
18. Zell-Kultursystem in einem Nährmedium, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen der Zelllinie identifiziert mit dem Bezugzeichen EDV/7 angehören.
19. Zell-Kultursystem nach Anspruch 18, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß es in Form einer Suspension-Kultur vorliegt.
20. Zell-Kultursystem nach Anspruch 19, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß es als Nährmedium für die Suspension-Kultur RPMI 1640 Medium, enthaltend 5 bis 30% Kälberfötenserum, enthält.
21. Zell-Kultursystem nach Anspruch 20, dadurch g e -k e n n z e ich n e t , dat das RPMI 1640-Medium 10% Kälberfötenserum enthält.
22. Zell-Kultursystem nach Anspruch 19, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß das Nährmedium für die Suspensionekultur McCoy's oder Eagle's Essential Medium ist.

23. Zell-Kultursystem nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch g e k e n n Z e i c h n e t , daß das Kultursystem als mit einem rotierenden, sterilen Magnetrührer bewegte Kultur vorliegt.

24. Zell-Kultursystem nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß es als statische Kultur vorliegt.

25. Zell-Kultursystem nach Anspruch 18, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß das Nährmedium Agar ist.

26. Verfahren zur Vermehrung von Zellen in einem Kultursystem, dadurch g e k e n n z e i c h n e t daß man die Zellen der Zellinie LDV/7 in einer Nährlösung züchtet.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man ein KultuDystem in Form einer Suspensioaskultur verwendet.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch- g e k e n n -z e i c h n e t , daß man als Nährmedium für die Suspensionskultur RPMI 1640-Medium, enthaltend 5 bis 30% Kälberfötenserum, verwendet.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß das RPMI 1640-Medium 10% Kälberfötenserum enthält.

30. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch g e k e n D -z e i c h n e t , daß man als Nährmedium für die Suspensionskultur McCoy's oder Eagle's Essential Medium verwendet.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen in Form einer mit einem rotierenden, sterilen Magnetrührer bewegten Kultur vorliegen.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man die Zellen so lange nachzüchtet bis eine Zellkonzentration von 106 Zellen Je ml erreicht ist.

34. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man die Zellen so lange nachzüchtet, bis eine Zellkonzentration von 1,5 x 106 Zellen je ml erreicht ist.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 oder 34, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man 5 x 105 Zellen je ml zum Animpfen der Tochterkultur verwendet.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 35, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man es bei 3700 durchführt.