DE2406084A1 - Immunodepressives anti-humanlymphozytenserum und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

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Bavariaring 4

Postfach 202403 ⁸' Februar 1974

ß 5828

CHOAY S. Λ.
Paris , Frankreich

Immuno-denressi ves Anti-Humanlymphozytenserum und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Darstellung von "immunodepressiven Anti-Humanlymphozytenseren sowie die nach diesem Verfahren erhaltenen immunodepressiven Anti-Humanlympfcpzytenseren.

Die Anti-Iiumanlymphozytenseren haben die Aufgabe, die Entwicklung gewisser immunologischer Reaktionen bei den Patienten, denen sie verabreicht sind, zu verhindern, indem sie wenigstens zeitweilig denIymphozyten die Fähigkeit zur immunologischen Abwehr des Organismus nelunen, so daß man bei den Patien-. ten, denen ein solches Serum verabreicht wurde, eine Toleranz

gegenüber Haut- und Organverpflanzungen erzeugt. 409833/0968 V/12

Aus dem Stande der Technik ist schon eine gewisse Zahl von Verfahren zur Herstellung antilymphozytischer Seren bekannt. Insbesondere ist es bekannt, Antilyraphozytenseren herzustellen, in—dem man als Antigen Lymphozy.ten menschlichen Ursprungs verwendet, die man einem Tier, beispielsweise dem Pferd, einspritzt, und dann das Tierblut entnimmt, aus dem man Antilymphozytenseren herstellt.

Zur Darstellung von Antilymphozytenseren sind verschiedene Antigenquellen vorgeschlagen worden. Die erste vorgeschlagene Antigenquelle bestand aus dem Menschen entnommenen frischen Lymphozyten, insbesondere Organen entzogenen Lymphozyten, besonders Lymphozyten der Thymusdrüse, der Milz, der lymphatischen Ganglien, und ■ als"zirkulierend" bezeichnete Lymphozyten, d.h. solche aus dem Blutkreislauf und dem lymphatischen Kreislauf.

Die als Antigenquelle verwendeten frischen Lymphozyten waren jedoch von einer gewissen Anzahl von Fremdelementen, wie Erythrozyten und Thrombozyten, begleitet, deren Anwesenheit als Verunreinigungen zur Folge hatten, daß die Antilymphozytenseren gewisse Nebenwirkungen zeigten, insbesondere eine Antierythrozytische und antithrorcbozytische Aktivität, was eine Beschränkung ihrer Anwendungsmöglichkeit zur Folge hatte.

Vessuche zur Darstellung von Antilymphozytenseren aus subcellularen Fraktionen von frischen, aus Organen entzogenen

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Lymphozyten, beispielsweise aus der Thymusdrüse, die wegen ihrer besonders entwickelten immunogenen Eigenschaften ausgewählt wurden, führten auch zu Antilymphozytenseren, deren Nebenwirkungen nur eine Anwendung in engen Grenzen zu-ließ.

Man hat daher versucht, die aus dem Menschen entnommenen,· frischen Lymphozyten erhaltenen, als Antigene verwendeten Antilymphozytenseren in verschiedener Weise zu reinigen, insbesondere durch Adsorption an roten Blutkörperchen, durch Chromatographie an Harzen oder durch Elektrophorese. Die so durchgeführten Reinigungsverfahren machen es jedoch schwierig, für den therapeutischen Einsatz ausreichende Mengen Antilymphozytenserum zu erhalten. Außerdem sind diese Verfahren kostspielig und kompliziert. ' ...

Man hat dann versucht, die Toleranz der Antilymphozytenseren zu verbessern, indem man als Antigenquelle Lymphozyten menschlichen Ursprungs in einer Kultur in geeigneten Medien " und unter geeigneten Bedingungen, insbesondere in ununterbrochener Nachkommenschaft gebildete Lymphozyten, benutzt. Diese KuI-turlymphozyten, die den Vorteil der Sterilität und Verfügbarkeit in großen Mengen entsprechend dem Bedarf haben,- werden den Tieren, beispielstveise den Pferden, eingespritzt, um so zu sehr viel weniger giftigen Antilymphozytenseren zu kommen als wenn man von frischen Lymphozyten als Antigenquelle ausgeht. Der Herstellungspreis von Antilymphozytenseren, die unter Benutzung von Kulturlymphozyten als Antigenquelle dargestellt wurden, ist

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jedoch beträchtlich, und außerdem kann man aus dieser Antigenquelle nur ein Antilymphozytenserum mit begrenzter immunodepressiver Fähigkeit erhalten.

Es ist auch vorgeschlagen worden, Antilymphozytenseren aus dem löslichen Extrakt der Lymphozytenauflösung zu 'gewinnen, wobei die aufgelösten Lymphozyten entweder aus zirkulierendem Blut stammten oder Kulturlymphozyten waren. Der Herstellungspreis ist in diesem Falle ebenfalls hoch, ohne daß die anderen, oben schon genannten Nachteile vermieden werden. Außerdem wird bei diesem Verfahren eine gewisse Zahl von Zellbestandteilen gleichzeitig mit anderen Antigensubstanzen von der Lymphozytenzelle freigegeben . Aus diesem Grunde besteht bei dem erhaltenen Produkt die Gefahr unerwünschter Wirkungen.

Bekanntlich erhält man die als Antigenquelle zur Darstellung von Antilymphozytenserum verwendeten Kulturlymphozyten, indem man sie von dem im Laufe des Trennverfahrens über~ s teilenden. Kulturmedium trennt. Während dieses überstehende Material zunächst verworfen wurde, war es später Gegenstand von Untersuchungen, in deren Verlauf man seine Verbindungen oder wenigstens einige von ihnen identifiziert und das Verhältnis zwischen der biologischen Aktivität in vitro der in dem überstehenden Material enthaltenen löslichen Bestandteile und den immunocellularen Reaktionen der Lymphozyten in vivo aufgrund der Tatsache bestimmt hat, daß - wenn diese Lymphozyten

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durch ein spezifisches Antigen oder in gewissen Fällen durch Mitogene sensibilisiert werden - die Lymphozyten eine ganz.e Reihe löslicher Substanzen erzeugen, die sich in dem überstehenden' Material finden und unterschiedliche biologische Aktivitäten zeigen, von denen man folgende nennen kann: Eine Hemmung der Leukozytenwanderung (der Hemmfaktor der Leukozytenwanderung wird in der einschlägigen Literatur als "HIF" bezeichnet) , eine leukotaktische Wirkung, eine Reaktionswirkung auf die Haut, eine zytotoxische Wirkung, eine blastogenische Wirkung, eine Interferonwirkung, eine chemotaktische Wirkung.

FaIk et al ("Surgery" Juli 1971, Band 70, Nr. 1, Seiten 122-127 und " Transplantation Proceedings", Band III, Nr. 1 (März) 1971, S. 841-843) haben als Antigenquelle zur Darstellung eines Antiserums beim Kanincnen oder Schaf das überstehende ■ Material einer Thymozyten- oder Milzzellenkultur verwendet. Es handelte sich jedoch um Frischzellenkulturen, die in Gegenwart eines sensibilisierenden Antigens hergestellt waren, wobei die Zellen in der Kultur entweder von Tieren, die selbst gegenüber denselben Antigenen sensibilisiert waren, oder im Falle von Vergleichsseren von normalen Tieren stammten. Diese Arbeit, die auf das Studium der in dem überstehenden Material der ' künstlich informierten Frischzellenkultur enthaltenen Substanzen gerichtet war, läßt vermuten, daß die mit dem Informatorantigen reagierenden, spezifischen Quellen durch das Antiserum angegriffen werden, ohne daß man Lymphozytentoxizität beobachtet.

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Die vorliegende Erfindung betrifft die Schaffung eines immunodepressiven. . Anti-Humanlymphozytenserums unter Verwendung einer antigenischen Masse, die aus dem überstehenden ' Material von in ununterbrochender Aufeinanderfolge gebildeten Lyraphozytenkulturen erhalten wurde.

Die in ununterbrochenem Stamm gebildeten Lymphozyten, d.h. die aus der Gründung von Kulturen unbegrenzter Dauer stammen, zeigen im Vergleich zu frischen Lymphozyten fundamentale Unterschiede:.ienn die ununterbrochenen Stämme sich

eir«S'.itz?n, bewirken sie dabei eine Transformation der Lymphozytenzellen in lymphoblastoidartige Zellen,- und diese Transformation gibt den Zellen der ununterbrochenen Stämme Eigenschaften " ·, durch die. sie sich sehr stark von Frischzellen unterscheiden, nämlich:

a) Auf histochemischen Gebiet: Die Zellen aus ununterbrochenen Stämmen haben zu den Farbstoffen, die sich mit Glykoproteinen verbinden, eine sehr viel größere Affinität als die Frischzellen (Vergleiche hierzu : C. Rosenfeld, A.M. Venuat, M. Paintrand und C.'Choquet" Neue Daten über die in vitro Unterschiede zwischen leukämischen und normalen Leukozyten aus Menschenblut vor, während und nach ihrer Bildung als Zellstämmen" Abstract Nr. 629 im H.Internationalen Kongreß für Hämatologie Band I Sao Paulo 1972 Internationaler Kongreß der Hämatologie Ed.)

b) Auf dem Gebiet der Stoffwechselfunktion: Die Zellen aus ununterbrochenen Stämmen : zeigen eine viel größere

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Durchlässigkeit für Aminosäuren,·insbesondere für Aminoisobuttersäure; der Transport ist bei diesen Zellen im Vergleich zu Frischzellen in sehr charakteristischer Weise verstärkt (vergleiche hierzu: C. Rosenfeld und J.P. Wastiaux "Änderungen in der Durchlässigkeit von Zellmembranen vor, während und. nach der Bildung von leukämischen und nichtleukämischen Menschenblut-Zellstämmen" Proc. Am. Ass. Cane. Res.: 1972, 13,47 Abstract Nr. 188).

c) Auf dem Gebiet der Antigenaktivität: Die Zellen aus ununterbrochenen Stämmen zeigen eine große Affinität zu anti-humanen Immunoglobulinen, die mit Fluoreszein-Isothiozyanat markiert sind; diese Zellen bilden mit den Immunoglubulinen einen Komplex, während die-Affinität der Frischzellen zu den Antihuman-Immunoglobulinen sehr gering ist. (Vergleiche hierzu: "Variation des antigenes de membrane des cellules de lignees permanentes etablies a partir de leucocytes huir.ains norniaux et leucemiques" (Variation der Membranantigene der Zellen aus ununterbrochenen Stämmen aus normalen und leukämischen menschlichen Leukozyten) C. Rosenfeld, J.F. Dore, L. Marholec, C.Choquet, A.M.Venuat, E. Ajuria, M. Paintrand et J.P. Wastiaux. Annales Institat Pasteur, 133, Nr. 1, 1972, p. 143.

Diese unterschiedlichen fundamentalen Eigenschaften der Zellen aus ununterbrochenen Stämmen im Vergleich zu Frischzellen läßt vermuten, daß sie in ihrem Kulturmedium unterschiedliche Bestandteile freisetzen, die die charakteristischen Eigenschaften der Lymphoblastoide bilden könnten.

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Diese Zellen aud ununterbrochenen Stämmen

zeigen außerdem mehrere Vorteile in industrieller Hinsicht, insbesondere eine gleichbleibende Verfügbarkeit, eine bessere Reproduzierbarkeit und daher eine Standardisierungsmöglichkeit und schließlich geringere Kosten.

Di . vorliegende Erfindung hat die Aufgabe, ein neues, immunodepressives , Anti-Humanlymphozytenserum sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung zu schaffen, die besser als die Anti-Humanlymphozytenseren nach dem Stande der Technik den Erfordernissen der Praxis entsprechen, besonders dadurch, daß sie eine außergewöhnlich erhöhte lymphozytotoxische Aktivität, eine ebenfalls erhöhte Aktivität als Immunodepressivum zeigen, eine höhere Toleranz und einen bisher niemals erreichten Standardisierungsgrad haben und einen wesentlich geringeren Selbstkostenpreis verursachen.

Die vorliegende Erfindung hat ein neues immunodepressives Anti-Humanlymphozytenserum zur Aufgabe, das frei von antierythrozytischer und antithrombozytischer,Wirkung ist und dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus einem Serum besteht, das aus der Verabreichung einer antigenischen Masse an ein geeignetes Tier resultiert, wobei diese Masse durch das überstehende , zellfreie Material einer oder mehrerer Kulturen, die in ununterbrochenem Stamm von menschlichen Lymphozyten abstammen, oder durch gewisse Fraktionen des überstehenden Materials gebildet wird.

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Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung . werden die Lymphozyten mit ununterbrochenen Stämmen frei von anderen Informationen als denen kultiviert, die ihnen von Natur aus eigen sind. Diese Kulturen werden in standardisierter Art und Weise ohne Beigabe antigener Anregungsmittel realisiert, wie etwa mitogener Substanzen oder Zellen anderer Spender, wie es bei Mischkulturen der Fall ist.

Nach einer, bevorzugten Ausführungsform des immunodepressiven Anti-Humanlymphozytenserums nach der Erfindung be-' steht dieses aus Anti-Humanlymphozyten-Immunoglobulinen G, die durch Reinigung des oben genannten Anti-Humanlymphozytenserums erhalten wurden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des neuen immunodepressivem Anti-Humanlympho-. zytenserums, das erfindungsgemäß wie folgt gekennzeichnet ist: Man spritzt einem Tier eine antigene Masse ein» die im wesent lichen aus dem überstehenden zellfreien Material der Kulturen von Zellen aus ununterbrochener Abstammungslinie, die aus- Humanlymphozyten angeregt worden sind, wobei die Zellen ohne Bnpfaiganderer* Informationen als derjenigen, die ihnen natürlicherweise eigen sind, kultiviert wurden, oder gewisse Fraktionen davon besteht, so 'daß die antigene Masse eine Immunisierung des Tieres bewirkt; man entnimmt*das Blut des behandeltes Tieres; »in gewinnt daraus das Serum und man entzieht gegebenenfalls diesem Serum die .'■""· ,. Immunoglobuline G. " -

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Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgeinäßen Verfahrens wird die zur Immunisierung eines Tieres,eingesetzte antigene Masse hergestellt durch: Besäen eines ge-,,-eigneten Mährstoffmediums mit von Humanlymphdzyten in ununterbrochener Linie abstammenden Zellen; Pflege der Kultur, bis die Zellvermehrung ein Maß nahe der Zellsättigung des eingesetzten Mediums erreicht hat; Anhalten der Kultur in diesem Stadium; Zentrifugieren,in dessen Verlauf das die antigene Maäse bildende überstehende Material gesammelt wird, damit es in den folgenden Stufen des Prozesses eingesetzt werden kann.

. . Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erhält man das immunodepressive Anti-Humanlymphozytenserum nach der Erfindung aus einer Menge des überstehenden Materials, die kleiner als die Menge ist, . die eine "überschrittene Immunisierung" (immunisation depassee) hervorrufen kann.

Die Bezeichnung "überschrittene Immunisierung" bedeutet, daß eine zu große Menge Antikörper entsteht, die so erhöht ist, daß sie ihrerseits* antigenische Masse wird, so daß der Organismus anfängt, Antikörper, gegen die vorher in zu großer Zahl gebildeten Antikörper zu bilden.

Nach einer anderen Ausführungsform des erfindungsge- ■äßen Verfahrens isoliert man die Anti-Humanlymphozyten-Immunoglobuline G durch Reinigung des Blutplasmas des immunisier-

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ten Tieres durch Einspritzung des vorgenannten überstehenden Materials mit Hilfe eines Acridinsalzes, beispielsweise des Lactats des 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridins, mit einer an-

r ν -

,schließenden Reinigung mit Hilfe von Ammoniumsulfat, einer • Reinigung durch Hindurchlaufen- durch ein. Anionenaustauscher-*? Harz mit hohem Fixiervermögen bei einm pH-Wert zwischen 6,5 und 8,5 und Sterilisation der schließlich erhaltenen Lösung der Immunoglobuline G. .

Die Durchführung des Verfahrens zur Herstellung des neuen Anti-Humanlymphozytenserums nach der Erfindung umfaßt vorteilhafterweise die folgenden Stufen:

I Herstellung der antigenen Masse:

Das Antigen besteht im wesentlichen aus dem überstehenden freien Material einer oder mehrerer von Humanlymphozyten in ununterbrochener Linie abstammenden Kulturen,· die keine anderen Informationen als ihre natureigenen empfangen haben und wobei jede Kultur von. einem· einzigen Stamm abstammt und dem Medium keine spezifischen Antigene zugefügt wurden. ,

Man erhält die ununterbrochenen · Stämme in der Kultur, indem man von normalen Lymphozyten ausgeht. Diese Technik bedarf keines oncogenen oder mitogenen Mittels oder . eines besonderen Antigens, und.die Transformation der Frisch-.'

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zellen in permanenten Stämmen erfolgt

unter gewissen Bedingungen spontan. Sie erfordert nur das Arbeiten mit einer Kultur mit großer Anfangsbevölkerung. Die sich entwickelnden Zellen verändern sich und 'gehen in den lymphoblastoiden Typ über.

A Erlangung einer ununterbrochenen Abstammung von normalen Lyir.phozyten

Die Technik der Erlangung ununterbrochener

Stämme war Gegenstand zahlreicher Arbeiten. Man kann beispielsweise in folgender V.'eise vorgehen:

Das Blut wird auf einem Lymphozytenseparator unter Bedingungen vollkommender Sterilität entnommen. Die Zellen werden zweimal in einem isotonischen Chloridmedium gewaschen, dann in dem Medium RPMI 1640 (im Handel erhältliches Stand.ärdmedium, das in Frankreich durch das Laboratoire Eutroph-Eurobio in Paris verkauft wird) dispergiert und nach Anfärbung mit Trypan-blau auf Malassez-Zellen gezählt. Diese... Zellen werden bei 37⁰C in einer Konzentration von 3,5 . 10 je ml in 1 cjml des vollständigen Mediums (RPMI 1640 + 20! Kalbfötusserum + 100 u/ml Penicillin + 50 meg Streptomycin je ml) in einer Schraubverschlußflasche von 60 ml kultiviert;.. Die Zählungen erfolgten zweimal je Woche, und das Medium wurde jedesmal zu 20 ο des Ausgangsvolumens während 30 Tagen erneuert. Die Gesamtbevölke-

ser Zeit bis auf

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rung nahm während dieser Zeit bis auf 2,2.10 Zellen/ml ab.

Dann wurde das Medium, während die Zellen ein vergrößertes Volumen hatten, durch sich selbst angesäuert, es traten Anhäufungen in Erscheinung unti die erste feststellbare Vermehrung wurde dam -beobachtet. Anschließend wuchsen die Zellen unter befriedigenden Stoffwechselbedingungen exponentiell. Sie nahmen ein morphologisches Aussehen an, das an Lymphoblasten erinnerte.

Der Stamm ist· so erstellt und kann als ununterbrochener Stamm verwendet werden. Zellproben wurden eingefroren und in flüssigem Stickstoff konserviert.

B Lymphozytenkultur für Gewinnung des aufschwimmenden Materials:

Die unter den im vorigen Absatz beschriebenen Bedingungen erhaltenen Zellen ununterbrochener Abstammung wurden in einem Verhältnis von 2 bis 8.10 Zellen/ml, vorzugsweise 5.10 /ml eingesetzt.

Die Zellen wurden in einen zylindrischen Kolben mit einem Magnetrührer, der eine kontinuierliche Rührung lieferte, eingegeben. Das Kulturmedium ist das gleiche wie .das oben beschriebene Medium, nämlich: RPMI 1640 + 201 Kalbfötusserum+ 100 u/ml Penicillin + SOmcg Streptomycin,je ml.

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Die Kulturtemperatur beträgt 37⁰C, und die Kultur wird fortgesetzt bis man 1 bis 2.10 Zellen/ml erhält.

Während der Kulturzeit beobachtet man den pH-Wert, der sich aus der Veränderung der Farbe der Kultur ergibt, und man nimmt die Zählungen etwa zweimal pro Woche vor. Nach der Entwicklung wird das Medium angereichert, indem man etwa 20 Volumen-* eines irischen Mediums einführt.

Nachdem einmal die Kultur beendet ist, wird die Lösung zentrifugiert. Das erhaltene verbleibende Material wird filtriert und sterilisiert-und ist dann frei.von Zellen. Es wird auf Fläschchen verteilt oder gefriergetrocknet. Gegebenenfalls wird es mit anderen aufschwimmenden Materialien aus unter ähnlichen Bedingungen gehaltenen Kulturen gemischt, um so die
Antigenmasse zu bilden, die in den weiteren Stufen des Verfahrens eingesetzt wird.

II Darstellung des Immunserums

Man führt eine Immunisierung des Tieres durch, indem
man ihm einmal je Woche zunehmende Mengen der Antigenmasse einspritzt.

Diese Masse ist wegen der Tatsache, daß jedes Tier
unterschiedlich reagiert, in mittlerer Höhe zu bestimmen. Man stellt daher die jede Woche einzuspritzende Mengen in Abhängig-

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teit der Ergebnisse der Vergleichsentnahmen, der Werte der Lymphozytotoxizitat und auf jeden Fall in solcher Weise ein, daß man nicht bis an eine "überschrittene Immunisierung" herankommt.

Man läßt das Tier 15 Tage in Ruhe: Nach Aktivitäts- · kontrolle wird das Pferdeblut durch Aderlaß entnommen, und man sammelt das Plasma nach Zentrifugierung des gesammelten Blutes auf Natriumeitrat,dem ein Antiseptikum und ein Proteaseninhibitor, beispielsweise der unter der Handelsbezeichnung "INIPROL" bekannte Inhibitor, zugesetzt ist.

Diese Arbeitsgänge erfolgen bei Umgebungstemperatur und unmittelbar nach dem Aderlaß des Tieres. Das Plasma wird dann 15 Stunden in einer Kühlkammer von +4⁰C gelagert.

III Darstellung der Immunoglobuline G: A.Abtrennung der rohen Immunoglobuline Dieser Arbeitsgang erfolgt bei gewöhnlicher Temperatur. Das bis auf 40g Proteine je Liter verdünnte Plasma wird durch normale Soda unter schwacher Rührung auf einen pH-Wert von 8 eingestellt.

Man fügt langsam unter energischer Rührung etwa ein gleiches Volumen einer Lösung des Lactats von 2-Athoxy-6,9-diaminoacridin (ebenfalls unter der Handelsbezeichnung " ßivanol" bekannt) hinzu, so daß die Endkonzentration zwischen 0,15

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und Ο,4Ο°ό, vorzugsweise bei 0,30% liegt, wobei der pH-Wert auf 8,0 gehalten wird. Man rührt energisch und läßt es dann zur Ruhe kommen. Man schäumt den or-angenen, schäumenden und schleimigen Niederschlag ab, der im allgemeinen obenauf schwimmt. Man klärt das verbleibende, das durch die rohen Immunoglobuline gebildet wird auf einem Filter. Aus dem ent-.fernten Niederschlag kann man leicht das Lactat des 2-Athoxy-6,9-diaminoacridins und gewisse Plasmaproteine zurückgewinnen.

B Entfernung des Überschusses des 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridinlactats

Man fügt dem Filtrat 5og/l NaCl zu, stellt den pH-Wert mit Hilfe von normaler HCl auf 7 ein. Der gelbe klare Niederschlag des Chlorids des 2-Athoxy-6,9-diaminoacridins wird durch Filtration abgetrennt. Aus diesem Niederschlag kann man leicht das Lactat des 2-Äthoxy-6,9- diaminoaciidins zurückgeivinnen. Das Filtrat wird auf +4⁰C gekühlt.

C Fraktionierung mit Ammoniumsulfat ^

Die rohen Immunoglobuline werden durch Zusatz von kristallisiertem (NIk)₂ SO- (wobei _man die Lösung auf das 0,3 bis 0,5 fache, vorzugsweise auf das 0,4 fache des Sättigungswertes bringt) ausgefällt, wobei die Temperatur zwischen +1 und +20⁰C variieren kann und vorzugsweise +4⁰C beträgt. Der pH-Wert kann von 6,0 bis 8,0 variieren.

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Nach 4-stündiger ruhiger Lagerung in einer Kühlkammer wird der Globulin-Niederschlag durch Filtration auf einer Filterpresse gewonnen. Dieser Niederschlag wird in einem Minimum an Wasser gelöst, dem im Verhältnis 1 auf 1000 Merthiolat (Na-äthylmercuritiosalizylat) zugesetzt ist und das je mg Proteine 100 uIP Proteasen-Inhibitor enthält. Man führt eine Dialyse gegen ioncnausgetausches Wasser durch und setzt dies solange fort, bis die Leitfähigkeit konstant etwa 200 bis 400 Mikromhccm beträgt.

D Chromatographische Fraktionierung

Die Proteinkonzentration des Dialysats wird durch Verdünnung mit 0,005 bis 0,02 molarer, vorzugsweise 0,01 molarer Phosphatpufferlösung von pH = 8 auf 11 gebracht. Man fügt dann einen Anionenaustauscher, etwa mit Phosphatpuffer unter gleichen Bedingungen ins Gleichgewicht gebrachte DEAE-Cellulose oder QAE-SEPHADEX, im Verhältnis von 10 g feuchter Austauscher auf 1g Proteine zu (10g feuchter Anionenaustauscher entsprechen etwa 3g trockener DEAE-Cellulose und 1g trockenem QAE -SEPHADEX)

Man setzt die Berührung 4 Stunden unter schwacher Rührung fort, dann wird filtriert und der Anionenaustauscher gespült. Man vereinigt das Filtrat und die Spülwässer und behandelt sie wie oben unter C angegeben.

Das Dialysat wird auf einen Proteingehalt zwischen 1

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- 1

und 5% gebracht. Seine Aktivität wird durch verschiedene weiter unten beschreibene Prüfungen gemessen. Man stellt auch die Abwesenheit von antierythrozytischer und antithrombozytischer Aktivität des Dialysats fest.

Eine sterilisierende Filtration über "Millipor" 0,22' u gestattet die sterile Lagerung der Endlösung, die auf Flaschen mit 5jftl Inhalt verteilt wird.

Die auf die 5 ml-Fläschchen verteilte Endlösung hat eine Proteinkonzentration zwischen 3 und 4 per 100 je ml und ein Zytotoxizitätsverhältnis von wenigstens 50 pro 100 bei einer Verdünnung auf 1/1000.

Außer den vorstehenden Ausführungsformen umfaßt die Erfindung noch andere Merkmale, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen.

Die vorliegende Erfindung richtet sich besonders auf neue Anti-Humanlymphozytenseren und ihre Herstellung entsprechend den hier gemachten Darlegungen, auf die geeigneten Maßnahmen zur Durchführung des Verfahrens und die Verwendung der genannten Seren. Die Erfindung wird in detaillierter Weise in der folgenden Beschreibung erläutert, in der ein Herstellungsbeispiel des neuen Anti-Humanlymphozytenserums nach der Erfindung gegeben wird.

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Dieses Beispiel dient einzig zur Erläuterung der Erfindung und in keiner Weise zu ihrer Begrenzung.

Beispiel

A Gewinnung des verbleibenden Materials vor der Ver-' wendung als Antigen

Die Zellen der von Humanlymphozyten ausgehenden ununterbrochenen Stämme wurden unter den oben in Stufe I "Gewinnung eines ununterbrochenen Stammes aus normalen Lymphozyten" beschriebenen Bedingungen gewonnen nach allgemeinen Arbeitsweisen des erfindungsgemäßen Verfahrens.Sie werden verwendet

in einem Verhältnis von 1.10 Zellen in einem Volumen von 200 ml, d.h. in einer Konzentration von 5.10 /ml.

Die Zellen werden in einen Rührbehälter von 1700 ml gegeben. Das Kulturmedium ist das gleiche wie oben beschrieben: RPMI 1640 + 20°o Kallbfötusserum + 100 u/ml Penicillin + 50 meg Streptomycin je ml.

Die Kulturtemperatur ist 37⁰C und die Züchtung wird fortgesetzt, bis man 1.10 Zellen in 1000 ml erhält. Zur Erreichung dieses Ergebnisses wird die Züchtung 5 Wochen fortgesetzt, und das Milieu wird zweimal je Woche, d.h. zehnmal insgesamt, um 20⁰O seines Volumens mit neuem Medium angereichert.

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_ 1

Nach Beendigung der Züchtung wird die Lösung 20 Minuten bei 2000 Umdrehungen zentrifugiert. Man filtriert und sterilisiert das zurückbleibende Material, das dann von Zellen frei ist. Die Abwesenheit von Zellen wird mikroskopisch sichergestellt.

B Darstellung des immunen Serums

Das Serum wurde durch Immunisierung eines Pferdes hergestellt, indem diesem eine Antigenmasse eingespritzt wurde, die'durch Mischen gleicher Volumina der überstehenden Materialien aus der Kultur von fünf verschiedenen ununterbrochenen Stämmen stammten. Die Immunisierung erfolgte unter den folgenden Bedingungen:

50 ml der Antigenmasse in der ersten Woche, 100 ml in der zweiten Woche,
150 ml in der dritten Woche,
200 ml in der vierten Woche,
250 ml in der fünften Woche,
300 ml in der sechsten Woche

Das Tier wurde 15 Tage in Ruhe gelassen und nach Aktivitätskontrolle wurde das Pferdeblut durch Aderlaß entnommen. Man erhielt 20 Liter. Das Blut wurde auf 3,8g/l Natriumeitrat, 1 p.1000 Natriummercurothiolat und einem Proteaseninhibitor (bekannt unter der Handelsbezeichnung "Iniprol") im Verhältnis

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von 400 uIP/1 zentrifugiert. Man erhielt 37 1 verdünntes Plasma, das man IS Stunden in einer Kühlkammer von +4⁰C aufbewahrte.

C Abtrennung der rohen Immunoglobuline

Man setzt langsam 37 Liter O,6Oliges Lactat des 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridins zu, was einer Endkonzentration von 0,30 entspricht. Die Mischung wird durch normale Soda auf pH = 8 eingestellt. Man rührt 10 Minuten. Dann läßt man 1 Stunde stehen. Man filtriert dann auf zwei Faltenfilter. Das Filtratvolumen beträft 37 1 Serum.

D Fällung mit Natriumchlorid zwecks Entfernung des restlichen 2-Äthoxy-6,O-diaminoacridinlactats

Man gibt 3650 g Natriumchlorid hinzu und stellt den pH-Wert mit Hilfe von normaler Chlorwasserstoffsäure auf 7 ein. Man läßt 1 Stunde stehen. Der Niederschlag wird durch Filtration auf zwei Faltenfiltern entfernt. Das Filtratvolumen beträgt 721.

E Fraktionierung mit Ammoniumsulfat

Man fügt diesem Filtrat 17,280 kg Ammoniumsulfat zu, um einen Sättigungsgrad von 0,4 zu erreichen, wobei der pH-Vi'ert auf 7 gehalten wird.

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- Ί Ί _

Man läßt in einer Kühlkammer 4 Stunden stehen. Man filtriert dann auf einer Filterpresse und gewinnt den Globulinniederscnlag der insgesamt 1150 g ausmacht.

Der Niederschlag wird in einer Mindestmenge Wasser gelöst, das im Verhältnis 1 zu 1000 mit Merthiolat versehen ist und je mg Proteine 100 uIP Proteaseninhibitor enthält. Man dialysxert 48 Stunden gegen ionenausgetauschtes Wasser, bis die Leitfähigkeit konstant 200/ikrcaiic ⁱcm beträgt.

F Chromatographie an QAE-SEPHADEX

Das Dialysat wird durch Zugabe einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung von pH= 8 auf ein Volumen von 25 1 gebracht. Das QAE-Sephadex wurde in der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht. Die eingesetzte Menge des wasserhaltigen, an der Luft getrockneten Ionenaustauschers beträgt 1000 g entsprechend 100 g trockener QAE-Sephadex. Man läßt 4 Stunden unter schwacher Rührung in gegenseitigem Kontakt und filtriert dann. Das Volumen des Eluats beträgt 25 1; das Volumen der Waschwässer beträgt ebenfalls 2'5 1.

G Fällung mit Ammoniumsulfat

Man vereinigt das Eluat mit den Waschwässern und gibt 12 kg Ammoniumsulfat bis auf eine Sättigung von 0,35 hinzu. Man läßt 4 Stunden in einer Kühlkammer stehen und filtriert

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dann auf einer Filterpresse ab. Man gewinnt 560 g Niederschlag. Man dialysiert 48 Stunden gegen ionenausgetauschtes Wasser, bis man eine konstante Leitfähigkeit von etwa 300 Mikro^iho . cm erhält.

H Sterilfiltration

Es wird über ein Filter Carlson Ford Pyr und dann über ein Filter Mikropor 0,22 ρ filtriert. Man erhält ein Endvolumen von 2650 ml einer sterilen Lösung von Immunoglobuline]! G, die 3 % Proteine je ml enthält.

Mehrere Proben des neuen Anti-Ilumanlymphozytenserums vorliegender Erfindung wurden nach dem beschriebenen Beispiel hergestellt. Sie erhielten die folgenden Nummern: AU 58, AU 59, AU 61 , AU 62, AU 63.

Es wurde dann die Aktivität dieser Seren gemessen und die Abwesenheit von antierythrozytischen und antithrombozytischen Nebenwirkungen gemäß den nachfolgend beschriebenen Untersuchungen festgestellt.

I Prüfungen bezüglich der Toleranz

Λ Antithrombozytische Aktivität in vitro Test auf Komplementfixierung

Prinzip

Die Fixierung des Komplements durch die Immunkomplexe

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Antigen-Antikörper ist eine sehr empfindliche Methode zur Bestimmung spezifischer Antikörper. Es ist kein sichtbares Phänomen, und man muß sich daher der Hilfe eines "hämolytischen Systems" aus roten Blutkörperchen vom Schaf hedienen, die durch ein hämolytisches Kaninchen-Antischaf-Serum sensibilisiert sind (vergleiche "Immunologie Medical" von G.L.Daguet, S. 123-125").

Methode:

Messung der Ilämolyse roter Blutkörperchen vom Schaf, die für Antigene sensibilisiert sind, mit Lösungen wachsender, hälftig aufeinanderfolgender Verdünnungen beim zu prüfenden Produkt in Gegenwart des Komplements. Auftretende Ilämolyse zeigt die Abwesenheit antithrombozytischer Aktivität des geprüften Serums an.

Man bringt 3 Tropfen der zu prüfenden Lösung in der jeweiligen Verdünnung, 3 Tropfen einer Suspension von 5000 menschlichen Thrombozyten/mm und 3 Tropfen des titrierten Komplements zusammen und überläßt bei 37 C einer Inkubationszeit von 45 Minuten.

Man fügt dann 6 Tropfen der Suspension roter Blutkörperchen vom Schaf zu, die für das Antigen sensibilisiert sind. Die Ergebnisse werden nach 15 Minuten abgelesen.

Ergebnisse

Die Probe AU 58 ergab bei allen Verdünnungen jenseits

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von 1/2 negative Ergebnisse, wodurch fehlende antithrombozytische Aktivität des geprüften Serums bewiesen wird.

Die fehlende ant'ithrombozytische Aktivität wurde in gleicher Weise für die Proben AU 59, AU 61, AU 62 und AU 63 mit folgenden Resultaten bewiesen:

AU 59 : Negatives Ergebnis bei einer Verdünnung von 1/4 AU 61 : Insgesamt negatives Ergebnis AU 62 : Insgesamt negatives Ergebnis AU 63 : Negatives Ergebnis für eine Verdünnung bei 1/4

B Prüfung auf anti-humanthrombozytische Aktivität

bei der Maus.
Prinzip

Dieser Test beruht auf der Tatsache, daß die Thrombozyten der Maus gegen anti-humanthrombozytisches Serum empfindlich sind. .

Methode

Die klassischen Seren mit antithrombozytischer Aktivität rufen bei der Maus Koagulationsstörungen hervor, die sich in peritonealen und mesenterischen hämorrhagischen Suffusionen 24 Stunden nach Injektion einer einzigen Dosis in der Größe von 0,5 ml Immunoglobuline bei einer Maus von 20 -g zeigen.

Ergebnisse:

Die Proben AU-58, AU 59, AU 61, AU 62 und AU 63 wurden 4 0 9 8 3 3/0968

i-t Xj

mit üblichen Dosen von 0,5 ml je Maus, dann von 1 ml und T,5 ml untersucht bei Gruppen von 4 Mäusen.

Bei diesen außergewöhnlich hohen Dosen wurde bei keinem Tier eine hämorragische Suffusion festgestellt.

C Messung des Erythroagglutinationsvermögens in vitro Prinzip

Mit roten Blutkörperchen sensibilisierte Lymphozyten haben gegenüber diesen Letzteren ein Agglutinationsvermögen, wenn sie mit ihnen in Kontakt kommen.

Methode

Man nimmt 3 Spender des Blutes O. Man wäscht die roten Blutkörperchen dreimal in einem isotonischen Chloridmedium. Dann stellt man eine 5&ige Suspension roter Blutkörperchen in isotonischer wässriger Chloridlösung her. Man verdünnt die zu dosierenden Produkte in isotonischer wässriger Chloridlösung in küvettenförmigen Kunststoffplatten nacheinander von 1/2 auf 1/256. Dann bringt man einen Tropfen der Suspension der roten Blutkörperchen mit einem Tropfen der verdünnten Lösung in Kontakt. Man wartet eine Inkubationszeit _{yon 2} Stunden bei +4⁰C ab. Das Auswerten erfolgt auf einer Platte und mit dem Mikroskop. Die Agglutination kann schon +++ bis (+) variieren.

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\Ί -

+++ zahlreiche große Haufen ++ zahlreiche kleine Haufen

+ gerade eben sichtbar mit bloßem Auge (+) nur mit dem Mikroskop sichtbar

Man erachtet ein Erythroagglutinationsvermögen als zuläßig, das 1/32 (spezifische Antikörper) nicht überschreitet

Ergebnisse

Man stellt fest, daß alle gegenwärtig bekannten Antilymphozytenseren eine antierythrozytische Aktivität besitzen, die Ursache bedeutender Nebenwirkungen ist (Abfall der Zahl der roten Blutkörperchen) und nach einer gewissen Zeit die Unterbrechung der Behandlung notwendig macht.

Die Immunoglobuline des Pferdes haben als Antigene das vorstellend beschriebene Überstehende der Kultur erhalten, das. eine praktisch zu vernachlässigende antierythrozytische Aktivität besitzt, wie nachfolgend gezeigt wird:

Probe Verdünnung Ergebnis

negativ negativ negativ negativ negativ

40 9833/0968

AU 58	1/16
AU 59	1/16
AU 61	1/8
AU 62	1/16
AU 63	1/8

II Aktivitätsuntersuchungen

A Lymphozytotoxizität

Man bringt gleiche Mengen Humanlymphozyten mit durch aufeinanderfolgende Verdünnungen auf die Hälfte abnehmenden ■Mengen Antilymphozytenserum und Kaninchenkomplement zusammen, wie es beschrieben ist von J.L. Amiel, Rev.France. Etudes Clin. et Biol. 1969, XIV, S. 428 und 429.

Man prüft bei jeder Verdünnung den Prozentsatz der abgetöteten Lymphozyten (Zellen, die den Farbstoff Trypan blau annehmen) ..

1. Darstellung antilymphozytischer Produkte

Die zu prüfenden Präparate werden· unmittelbar nach der Titrierung in Hanks-Flüssigkeit von 1/256 auf 1/2048 verdünnt.

2. Titrierung

Man bringt 2 Tropfen antilymphozytisches Präparat von jeder der betrachteten Verbindungen und 1 Tropfen der Lymphozytensuspension in einen Versuchsplattenbecher. Man überläßt eine 1/2 Stunde bei 37⁰C der Inkubation. Man fügt 1 Tropfen

Kaninchenkomplöment hinzu, das vorher durch einen test auf Humanlymphozyten mit einem polyvalenten, zytotoxischen Humanserum (positiv bei mehr als 90°a der normalen Subjekte) titriert wurde. Man überläßt eine Stunde und 1/2 bei 37°C der Inkubation.

Man dekantiert dann sorgfältig das gesamte Überstehende

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und fügt T. -Tropfen-. Trypanblau »Farbstoff zu, der gerade auf der Stelle durch Zusatz von 4 Teilen einer 1 ,4⁰Oigen Trypanblau-Lösung in destilliertem Wasser zu einem. Teil einer 4,25%igen NaCl-Lösung hergestellt wurde.

Man mischt den Bodensatz mit Trypanblau mit d,er Pasteur.-Pipette und wertet sogleich in der Malassez—Zelle aus.

Ergebnisse

Die Lymphozytotoxizität der verschiedenen Proben bei den betrachteten Verdünnungen in Prozent der abgetöteten Zeilen, die man bei diesen Versuchen erhielt, ist nachfolgend angegeben:

Lymphozytotoxizität, in Prozent abgetötete Zellen

Verdünnung T/512 T/1024 T/2048

Probe

AU 5 8 100%. 7 7%

AU 59 AU 6 t AU 62. AU 63

Folgerung . "

Man stellt fest,, daß die Proben AU 58 und AU 62 bei starken. Verdünnungen lymphozytotoxisch sind.

99%	98%	89%
9.5%	9 8%	72%
99%.	86%	54%
100% ■	100%	97%

40 9 8 33/0,96

B Immunodepressive Wirkung

1) Hemmung der Bildung natürlicher Rosetten Diese Prüfung auf Immunozyto-Haftung benutzt rote Blutkörperchen vom Schaf, die die Eigenschaft haben, Humanlymphozyten in Rosetten zu aggluti-iieren. Die beobachtete Hemmung muß wenigsten 5Oi betragen im Verhältnis zur Xaturrosettenbildung beim Vergleichstier.

Methode

Titrierunn

1.) Man stellt eine Anfangsverdünnung des Anti-Lymphozytenserums von 1/1000 in Hanks-Flüssigkeit her.

2.) Man bringt nacheinander folgende Bestandteile in Hämolyseröhrchen:

a) 0,2 ml einer Lymphozytensuspension (1000/mm ), die wie für die Bestimmung der Lymphozytotoxizität (siehe oben) iso- ' liert und durch Hämolyse von den roten Blutkörperchen befreit wurden, die durch das Nylonfiltcr gelangen konnten.

b) 0,5 ml von jeder der Verdünnungen, die aus der Anfangs-· Verdünnung des Antilymphozytenserums von 1/1000 (Bereiche von 1/1000 bis 1/25600) durch Halbierung erhalten wurden.

c) 0,05 ml (1 Tropfen Duclos) Meerschweinchenkomplement (Institut Pasteur), das von den menschlichen roten Blutkörperchen der Gruppe A bei mehrmaligem Rühren (1 Stunde bei +4 C) absorbiert wurde.

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3.) Man überläßt einer Inkubationszeit von 1,5 Stunden bei 37 C.

setzt dann jedem Röhrchen 0,25 ml rote Blutkörperchen von Schaf (Institut Pasteur) in Suspension in Hanks-Flüssigkeit (100 000/mm³) zu.

5.) Man zentrifugiert 7 Minuten bei 1200 Umdrehungen in einer kleinen gekühlten Versuchszentrifuge.

6.) Man suspendiert erneut mit einem Drehrührer "Apelab" (Handelsbezeichnung);(20 Umdrehungen je Minute).

7.) Man liest jede Suspension an einer Malassez-Zelle mit quadratischem Liniennetz ab; man zählt die Rosetten in der Hälfte jeder Quadrierung und bildet aus beiden Ergebnissen den Mittelwert. _o

8.) Man stellt einen Vergleich ohne immunodepressives Serum her, das- 0,2- ml Lymphozytensuspcnsion, 0,5 ml Kanks-Lösung und 0,05 ml Meerschweinschenkomplement enthält.

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Verdünnungen Ergebnisse an der Probe AU

Zahl der gebildeten Rosetten

1/1 000 0

1/2 000 5

1/4 000 13

1/8 000 15

1/16 000 25

1/32 000 34

1/64 000 42

1/128 000 50

1/256 000 75 (Vergleich) T = 72

Man betrachtet die Reaktion als positiv, wenn das Produkt bei der jeweiligen Verdünnung die Bildung von wenigstens 50°a der natürlichen Rosetten der Vergleichsprobe inhibiert. Die Probe AU 58 gibt bis 1/32 000 eine positive Reaktion.

Prüfung auf Inhibierung der Bildung natürlicher Rosetten auf Lymphozyten T.

Die B-und T- abhängigen Lymphozyten sind zwei Arten von lymphoiden Zellen, deren Spezifität unterschiedlich ist. Die nichtunterschiedlichen Zellvorstufen v/erden im Knochenmark gebildet, aber die Stelle der späteren funktionellen Reifung ist unterschiedlich: Bei den Zell-en B wird diese Stelle wahrscheinlich durch gewisse lymphoide Formationen gebildet

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2405054

C Fortsatz,· Mandeln, Folliculi.. .) während die Stelle für die Zellen T durch den Thynios gebildet wird.

Auf peripherem Niveau wirken die Stämme B und T in dem immunologischen System zusammen, wobei die Zellen T bei der Abstoßung von Transplantationen eine mehr spezifische Rolle spielen und die Zellen B bei den "autoimmunen" Krankheiten eine mehr spezifische Rolle spielt.

Die Verbesserung der Technik der Darstellung von reaktionsfähigen liumanzellen gestattet es, gegenwärtig,diesen Versuch an T-abhängigen Lymphozytenzellen durchzuführen - die bei dem in Frage kommenden immunologischen Prozess bei den Transplantationen sehr viel repräsentattiver sind - und nicht mehr wie bisher nur an den Lymphozytenzellen B, und insbesondere wie es bei der ersten erfindungsgemäßen Serumprobe, der Probe AU 58 der Fall war.

Die Proben AU 59, AU 61, AU 62 und AU 63 inhibieren mehr als 5O°s der natürlichen Rosetten des Vergleichstiers bis auf eine Verdünnung von 1/1000. Es ist daher wahrscheinlich,-daß die Probe AU 58 eine Reaktion gleicher Große gegeben hätte; es war aber wegen des Alters der Probe unmöglich, mit ihr einen Vergleichsversuch durchzufuhren.

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2) Verzögerung der Abstoßung von Ilauttransplantaten beim Affen.

Arbeitstechnik

Mit der Probe AU 5-8 wurde der Test ari drei Affen durchgeführt. Jedes Tier erhielt 3 kreisförmige HauttransplaT-t£^te mit einem Durchmesser von 10 mm:

a) 2 Tier.e erhielten ein Autotransplantat und 2 Ileterotransplantate von dem gleichen Spender

b) 1 Tier erhielt die gleichen Transplantate ohne immunodepressive Behandlung.

Dosierung

80 mg Proteine/kg werden täglich den 2 subkutanbehandelten Affen verabreicht. Die Behandlung beginnt am Vorabend der Transplantation und wird bis zum Zeitpunkt der Abstoßung des Transplantats fortgesetzt. Die Abstoßung wird als positiv angesehen, wenn die Hälfte der Oberfläche des Transplantats nekrotisch wird.

Ergebnisse : Bei der Probe ALI 58:

Vergleichstier: Abstoßung am achten Tag (gewöhnliche Abstoßungsspanne einer Transplantation bei einem unbehandelten Tier) Behandeltes Tier Nr. 1: Abstoßung am achtzehnten Tag)

) Mittelwert Behandeltes Tier Nr. 2: Abstoßung am neunzehnten Tag) 18,S

Man stellt fest, daß die Abstoßung des Transplantats in sehr bedeutsamer Weise verzögert wird.

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Die Proben AU 59 und AU 61 wurden auch am Affen nach der Technik von Bainer untersucht, die oben bei der Untersuchung mit der Probe AU 58 angegeben wurde, jedoch mit dem Unterschied, daß jeder Affe zwei Transplantationen erhielt:

Die an diesen Proben erhaltenen Resultate sind wie

⁰ & Verzögerung'

Probe Behandelte I.Transplantation 2. Transplan- Verzögerung Tiere tation bei dem

Vergleich

AU 59 2+1 Ver- 15 Tage 16 Tage 11 Tage

gleich .12 Tage 12 Tage 11 Tage

AU 61 2 10 Tage 11 Tage 11 Tage

13 Tage 14 Tage

C. Wirkung des Anti-Humanlymphozytcnserums nach der Erfindung auf Kulturen von krebsartigen Humanzellen. Es ist bekannt, daß Kulturen aus chirurgisch entnommenen, menschlichen Tumorzellen nie zur Bildung ununterbrochener Stämme führen in allen Fallen, in denen man nach der Explantation eine kräftige Reaktion der lymphoiden Zellen beobachtet, die zu einer Eliminierung der Tumor zellen führt.

Es ist jedoch von größtem Interesse, über Kulturen von Tumorzellen in ununterbrochenen Stämmen zu verfügen, um grundlegende Untersuchungen auf dem Gebiet des Krebses beim Menschen durchzuführen wie auch im Hinblick auf die Untersuchung von Medikamenten, die im Kampf gegen den Krebs'eingesetzt werden sollen.

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Es hat sich gezeigt, daß die Einführung des neuen erfindungsgemäßen Serums in eine Tumorzellenkultur die von den lymphoiden Zellen ausgeübte IVirkung der Zerstörung der Tumorzellen inhibiert, selbst wenn diese Wirkung sehr stark ist, so daß es möglich ist, ununterbrochene Stämme von Tumorzellen zu bilden.

Es wurde ein Test angesetzt, der die durch das erfindungsgemäße Serum ausgeübte Inhibicrungswirkung auf die Zellen und Faktoren zeigt, die gewöhnlich die Bildung kontinuierlicher Stämme verhindern, und zwar bei Kulturen chirurgisch entnommener, menschlicher Tumorzellen.

Dieser Test zeigt sehr deutlich, in welchem Punkt sich das erfindungsgemäße Serum von den bekannten Seren unterscheidet, wobei seine spezifischen Aktivitäten im wesentlichen auf die Tatsache zurückzuführen sind, daß das neue Serum unter Verwendung des zellfreien Überstehenden der Kulturen ununterbrochener. Lymphozytenstämme als Antigenemasse hergestellt wurde.

1. Abschätzung der Reaktion der lymphoiden Zellen "in vitro"

Bei systematischer Durchführung der Zyto-

toxizitätsreaktion der Lymphozyten auf Stichzellen aus menschlichen Gehirntumoren vor dem chirurgischen Eingriff hat man erkannt, daß allein die Entnahmen aus Patienten, die keine

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Zytotoxizität der Lymphozyten gegenüber Tumor-Stichzellen zeigen, zur Bildung von Tumorzellklonen Anlaß gibt.

Wenn die Zytotoxizität der Lymphozyten sehr ausgeprägt ist, werden die Kulturen schnell von den lymphoiden Zellen überfallen, die sich zu Zellen umformen, die morphologische und funktionelle Eigenschaften von Makrophagen zeigen.

Parallel dazu verschwinden am vierten Tag nach der Explantation in zunehmendem Maße die Tumorzellen der Kultur. Diese Zellen weichen den lymphoiden Zellen, dann im Falle von Gehirntumoren einem in fibroplastischer oder neuroglialer Hinsicht undifferenzierten Stroma. Die Erscheinung wird bei Unterzüchtung (Repiquases) von Kulturen ir-.it Trypsin verstärkt.

In dem von lymphatischer Zirkulation freien Gehirn können sich die Tumor zellen eine gewisse Zeit entwickeln, ohne daß die Reaktion der lymphoiden Zellen sehr ausgeprägt ist. Das erklärt den Verhaltensunterschied "in vitro" zwischen den Tumorzellen von ursprünglichen Gehirntumoren und den Zellen, die von Gehirnkrebsmetastasen stammen, deren ursprünglicher . Ort außerhalb des Gehirns war. In diesem Fall beobachtet man immer eine starke Reaktion lymphoider Zellen, die zu.einer Eliminierung krebsartiger Tumorzellen führt.

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Diese "Abstoßreaktion" in vitro wird objektiviert durch die Existenz eines die Scheibenzellen 18,0 zerstörenden Zellgiftes in dem Kulturmedium und durch die morphologischen Beobachtungen im Fasenkontrast: Im Zeitpunkt der Zerstörung beobachtet man am Rande der Fläche der epithelialen Tumorzellen ^akrophagen, die an ihrer gewellte Membran erkennbar sind. Diese Zellen, die manchmal das Aussehen von Riesenzellen annehmen, durchdringen die Tumorzellenkolonnien, zerstören sie wahlweise und lassen die nichtkrebsartigen Zellen des Trägerstromas unberüitrt.Diese Resultate sind in der folgenden. Tabelle angegeben.

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ORIGINAL INSPECTED

Tabelle
Reaktion Von lymphoiden Zellen von Krebsträgerkranken

1) Gehirntumore

Name Diagnose Cytotoxi- Lympho- ' Tumorstamme

zität der idc Reak- " Lympho- tion in zyten der Kultur

260	Bar..	. Glioblastom	4 7 °p +	nein
261	CoI. .	. Glioblastom	2 8 °o +	nein
267	Cho. .	. Astrozytom bösartig	42 % ' +	nein
271	Bre..	. Glioblastom	0(-45°o)	ja
274	Lah. .	. Glioblastom	57 % +	nein

276 Duf... Astrozytom bösartig

2) Metastasen und nicht auf das Gehirn bezogene Tumore

ja (SAL)

249 AIa... Karzinom,

metast. 71 % (Nebenniere)

263	Sam. .	. Karzinom, metast. (Brust)	6 7°6
265	Roζ. .	. Karzinom, metast. (Brust)	26 I
268	Eng. .	. Karzinom, metast. (Brust)	23 I
270	Lao. .	. Sarkom	22 %
272	Oud. .	. Karzinom metast. (Nebenschild drüse)	16 °o
2 73	Vor. .	. Rabdomyoar- kome *	0

nein

nein

ja (SAL)

nein

ja (SAL)

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-ytotoxizität der Lyr.iphozyten in der Kultur

2. Wirkung der Antilymphozytenseren Anti-Humanlymphozytenseren wurden in drei Fällen an Gehirnmetastasen von Karzinomen geprüft, wobei sich positive Lymphoydreaktionen mit den Turr.orstichzellen zeigten:

Gehirnmetastase eines Xebennierenkrebses (T249) Zytotoxizität von 701

Gehirnmetastase eines Brustkrebses (T 268) Zytotoxizität von 23 %

Gehirnmetastase eines Nebenschilddrüsenkrebses (T 272) Zytotoxizität von 16 %

Versuch mit Anti-Humanlymphozytenseren Die Zellen eines Fläschchens mit Karzinomkultur wurden Trypsin abgetrennt und in dem Moore-Medium RPMI 1640 mit 2 % entkomplementierten Kalbseruin suspendiert. Diese Zellen wurden in gleichen Anteilen entsprechend 5 . 10 Zellen in 0,5 ml Medium verteilt. Man setzt hierzu während 30 Minuten 1 ml Antilymphozytenserum, das in Kulturmedium auf 1/100 verdünnt ist, und dann während 90 Minuten 0,5 ml gefriergetrocknetes Kaninchen-Komplement, daß in Kulturmedium auf 1/10 verdünnt wurde. Die Gläser werden im Wasserbad auf 37 C gehalten, und der pH-Wert wird zwischen 7,2 und 7,4 eingestellt. Jeder Versuch wird von einem Kontrollversuch ohne Komplement begleitet.

Die Reagenzgläser werden dann zentrifugiert. Die Zellen werden in 2 ml Kulturmedium, dem 15 % Kalbs embryos er^uin· zugesetzt wurde, suspendiert. Jede Probe wird auf Macrotest-Platten (Greiner) kultiviert.

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Die Kulturen werden einer Inkubationszeit- von 24 und 48 Stunden in feuchter Atmosphäre mit 5 % CO₀ ausgesetzt. Die Kulturen werden dann unter einem Mikroskop mit umgekehrtem Phasenkontrast (Phasenobjektiv Wild 6X) beobachtet.

Es wurden vier Seren getestet. Die Ablesungen erfolgten blind:

1) AU 55,Antipferdeserum, immunisiert mit normalen Humanthymuslymphozyten.

2) AU 56, Antipferdeserum, immunisiert mit Lymphozyten aus peripherem Blut, die in kontinuierlichem Stamm kultiviert wurden (Mischung von fünf verschiedenen Stämmen).

3) AU 59, Antipferdeserum, immunisiert mit dem erfindungsgemäß hergestellten Überstehenden dieser fünf Lymphozytenkulturen.

4) AU 61, Antipferdeserum, das in gleicher Weise wie AU 59 hergestellt wurde.

Bei diesen in Gegenwart des Komplements mit Antilymphozytenserum behandelten Kulturen stellt man bei Behandlungen mit den erfindungsgemäßen Seren AU 59 und AU 61 Verschwinden der · Macrophagen fest. Die Wirkung ist sehr viel schwächer und anscheinend· nicht sehr spezifisch bei den beiden anderen geprüften Seren (AU 55 und AU 56). Man beobachtet in der Tat eine

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gewisse Zytotoxizität bei den Tumorzellen.

Bei den Kontrollversuchen cane Komplement' gab es bei den zwei Zellentypcn keine Zytotoxizität. Die von Antilymphozytenserum freien Kulturen mit Komplement bewiesen, daß das verwendete Komplement bei der angewendeten Verdünnung nicht zytotoxisch ist.

Die Wirkung des erfindungsgemäßen Serums ist sehr schnell. Bei schon eingesetzten Kulturen auf Glasplatten beobachtet man 15 bis 20 Minuten, nachdem die mit diesem Serum behandelten Kulturen mit dem Komplement in Kontakt gebra-cht wurden, die typische Zy-totoxizitätreaktion auf Macrophagen. Es tritt eine plötzliche Zusammenziehung des Kerns ein, der sich von dem Zytoplasma zu trennen scheint.

Das vorgeschlagene neue Serum zeigt abgesehen von den mit jeder Serumbehandlung verbundenen Nachteilen eine stark erhöhte generelle Toleranz, insbesondere wegen fehlender Wirkung auf die roten und plattenförmigen Stämme. Seine lymphozytotoxische Aktivität erweist sich'als beachtlich, ebenso seine immunodepressive Wirkung.

Dieses neue Produkt erlaubt es, die Anwendung dieser Behandlungsart auf immunitäre Störungen in früheren Entwicklungsstadien ins Auge zu fassen, und zwar aufgrund der Tatsache, daß dieses Produkt ohne größere Unverträglichkeit

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in stärkeren Dosen in kürzeren Zeitspannen verabreicht werden kann. Diese Behandlung kann abgesehen von den gewöhnlichen Fällen der zeitlichen Verlängerung von Haut- oder Organtransplantationen insbesondere in Fällen von multipler Sklerose, Hepatitis, chronischen Nierenleiden und generell bei autoimmunen Krankheiten angewendet werden.

Klinische Untersuchungen

Ein Versuch wurde durchgeführt an Kranken, die von aktiver chronischer Hepatitis befallen, seit mehreren Jahren in Behandlung waren und auf keine der gewöhnlichen Behandlungen reagiert hatten.

10 Kranke wurden im Rahmen eines ersten Versuches behandelt: Sie erhielten eine Dosis von 20 ml/Tag erfindungsge-"mäßes Serum in einem ununterbrochenen venösen Einlauf während eines Zeitraums, von einem Monat. Bei 9 von 10 Fällen war die Verträglichkeit bei diesen in einem stark geschwächten Zustand befindlichen Kranken ausgezeichnet. Der zehnte Kranke zeigte eine Unverträglichkeit gegenüber häterologem Globulin.

Bei den 9 Kranken, für welche die Behandlung bis zum Ende vorteilhaft war, waren die Ergebnisse besonders gut, da man eine sehr schnelle Normalisierung (etwa 10 Tage) der biologischen Tests und eine sehr merkliche klinische Verbesserung des Allgemeinbefindens beobachtete. In allen diesen Fällen konnten die Kranken in den auf die Behandlung folgenden

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Monaten ein normales Leben wieder aufnehmen.

Die klinischen Untersuchungen des erfindungsgemäßen Serums werden fortgesetzt.

Verwendete Dosierung

Die Lösungen des erfindungsgemäßon immunodepressiven Serums können beispielsweise in Fläschchen von 5 ml dargereicht werden. Das immunodepressive Serum wird mit Vorteil während der Phase der aktiven Behandlung in einer Menge von 20 ml/Tag verabreicht, woran sich eine Zwischenbehandlung mit 5 ml/Tag von einer Dauer anschließt, die in Abhängigkeit von dem generellen Erfolg der Therapie variiert.

Aus der vorstehenden Beschreibung folgt, daß unabhängig von der gewählten Durchführung, Verwirklichung und Anwendung neue immunodepressive Anti-Humanlymphozytenseren sowie auch Verfahren zur ihrer Herstellung geschaffen werden, die gegenüber den bekannten Anti-IIumanlymphozytenseren wesentliche Vorteile zeigen, zu denen man die Möglichkeit zählt, ein Serum mit den folgenden Eigenschaften zu erhalten: Es ist normiert, was bei den bekannten Methoden - selbst wenn man von Kulturlymphozyten ausging - nicht möglich war. Es hat einen geringeren Selbstkostenpreis als das Serum, das man nach dem bekannten Verfahren herstellen konnte. Die Herstellung ist in industriellem Maßstab möglich. Das Serum zeigt eine erhöhte lymphozytotoxische Aktivität und eine immunodepressive Wirkungskraft.

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- "1406084 HS

Das Serum ist praktisch frei von antierythrozytischer und antithrombozytischer Aktivität und damit frei von Nebenwirkungen, die gewöhnlich den Einsatz von llumanantilymphozytenseren einschränken.

Aus vorstehendem folgt, daß die Erfindung keinesfalls auf die Durchführungsformen, die Verwirklichung und Anwendung beschränkt ist, die oben in ausführlicherer Weise beschrieben sind. Die Erfindung umfaßt vielmehr alle Ausführungsformen, die dem Fachmann ohne Abweichung vom Gegenstand und Umfang der Erfindung zugänglich sind.

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ORIGINAL INSPECTED

Claims (12)

Patentansprüche

1. Neues immunodepressives Anti-IIumanlymphozytenserum, das frei von antierythrozytischer und antithrombozytischer Wirkung ist, dadurch gekennzeichnet, daß es durch ein Serum· gebildet wird, das bei Verabreichung einer Antigenmasse an ein geeignetes Tier entsteht, wobei diese Antige"nmasse im wesentlichen aus dem zellfreien Überstehenden einer oder mehrerer Kulturen von ununterbrochenen, von Humanlymphozyten ausgehenden Stämmen oder aus gewissen Fraktionen dieses Überstehende^ besteht.

2. Serum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jede Kultur aus einem einzigen Stamm gebildet ist.

3. Serum nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in ununterbrochenen Stämmen gebildeten Lymphozyten ohne Empfang anderer Informationen als der ihnen in natürlicher Weise eigenen Informationen gezüchtet sind.

4. Serum nach einem der .Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Antihunianlymphozyten-Ininunoglobulinen G besteht, die durch Reinigung des genannten Ani-i-Humanlymphozytenserums erhalten wurden.

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- 4

5. Verfahren zur Herstellung eines Human-Antilymphozytenserums nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einem Tier eine Antigenmasse einspritzt, die im wesentlichen aus dem zellfreien Überstehenden von Zellkulturen von aus Ilumanlympho-zyten ausgehenden, ununterbrochenen Stämmen, die ohne andere Informationen als ihre Natureigenen kultiviert wurden, oder aus gewissen Fraktionen dieses Überstehenden gebildet wird und so durch die Antigenmasse die Immunisierung des Tieres hervorruft, daß man das Blut des behandelten Tieres entnimmt, das Serum gewinnt und gegebenenfalls die Immunoglobuline G diesem Serum entzieht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung der Antigenmasse ein geeignetes Nährmedium mit Zellen von ununterbrochenen,aus Ilumanlymphozyten ausgehenden Stämmen besät, die ohne andere Informationen als die Natureigenen gezüchtet wurden, die Züchtung fortsetzt, bis die Zellvermehrung ein Ausmaß in der Nähe der Zellsättigung des eingesetzten Milieus erreicht hat, 'die Züchtung in diesem Stadium unterbricht und dann zentrifugiert, in deren Verlauf man das die Antigenmasse darstellende Überstehende zum Zwecke des Einsatzes in den folgenden Verfahrensstufen sammelt.

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ORIGINAL INSPgCTEO

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antihumanlymphozyten-Iminunoglobuline G in der Keise isoliert, daß man das durch Einspritzung des genannten Überstehenden immunisierte Blutplasma mit Hilfe eines Acridinsalzes, beispielsweise, des Lactats des 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridins, reinigt, dann mit Hilfe von Ammoniumsulfat reinigt und dann durch Hindurchtritt durch ein mit erhöhtem Fixierungsvermögen ausgestattetes Anionenaustauscherharz bei einem pH-Wert z\\'ischen 6,5 und 8,5 reinigt und die schließlich erhaltene Lösung der Immunoglobuline G sterilisiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Acridinsalz in einer Endkonzentration zwischen 0,15 und 0,40 "<,, vorzugsweise in der Größenordnung von 0,30 %. einsetzt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die unter Verwendung von Acridinsalz durchgeführte Reinigungsstufe bei einem pH-Wert von 8,0 durchführt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ammoniumsulfat in solcher Menge einsetzt, daß seine Lösung eine Sättigung von 0,30 bis 0,50, vorzugsweise eine Sättigung von 0,40 aufweist.

Λ Π q P Q ^ /flQRfi

^406084 HS

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß" man die Reinigung unter Verwendung von Ammoniumsulfat bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 0,8 durchführt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Anionenaustauscherharz in einer molaren Konzentration zwischen 0,005 und 0,02, vorzugsweise in einer molaren Konzentration der Größenordnung von 0,01, einsetzt.

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