DE2645993C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel gegen myeloische Leukämie sowie sein Herstellungsverfahren. Das erfindungs­ gemäße Mittel wirkt gegenüber schlechtdifferenzierten, myeloischen leukämischen Zellen im Sinne einer Wiederher­ stellung normaler Funktionen; seine Herstellung erfolgt erfindungsgemäß in einem Humanserumalbumin enthaltenden Medium aus einer Kulturflüssigkeit, die durch Kultivie­ ren von durch Trypsinbehandlung individuell isolierten menschlichen Amnionzellen oder durch mindestens einmaliges Subkultivieren von isolierten Amnionzellen in einem Kälberserum oder Rinderfetalserum enthaltenden Medium erhalten werden.

Die myelogene, sog. myeloische Leukämie stellt eine Erkrankung dar, die durch übermäßige Proliferation myeloischer Zellen und ihrer Zellvorläufer im Knochen­ mark gekennzeichnet ist. Das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung der myeloischen Leukämie wirkt gegen leukämische Zellen, die aufgrund von Störungen im Kno­ chenmark gebildet werden, wobei die normale Funktion der Zellen wiederhergestellt wird.

Die medizinische Forschung zur Behandlung der Leukä­ mie richtete ihr Augenmerk bisher hauptsächlich auf gegen­ über leukämischen Zellen cytotoxische Wirkungen; in jüngster Zeit steht allerdings die Wiederherstellung normaler Funktio­ nen bei disdifferenzierten leukämischen Zellen, d. h. die Entwicklung von Mitteln zur Decarcinogenese in Krebs­ zellen, im Vordergrund (vgl. Chemistry and Biology 13, Nr. 6 [1975] 380-82).

Zur Herstellung von Mitteln zur Erzielung einer der­ artigen Decarcinogenese sind das Verfahren nach Ichikawa et al. zur Kultivierung fetaler Säugerzellen (Journal of Cellular Physiology 74 [1969] 223; 76 [1970] 1975 und Gann 64 [1973] 257) sowie das Verfahren nach Sachs et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 70 [1973] 343) angegeben worden.

Das Verfahren von Ichikawa et al. wird wie folgt durchgeführt:

Ein Mäusefetus wird unter aseptischen Bedingungen ausgenommen und ebenfalls unter aseptischen Bedingungen mit der Schere zerschnitten; zur Isolierung der Fetal­ zellen wird anschließend eine trypsinhaltige Puffer­ lösung zugesetzt. Die isolierten Zellen werden in eine Schale gegeben, worauf zur Kultivierung und Erzielung von Primärkulturzellen ein Kulturmedium zugesetzt wird. Als derartiges Medium wird mit 10 Vol.-% Pferde- oder Kälberserum versetztes Eagle-MEM-Medium verwendet. Die unter Bildung einer Monoschicht gewachsenen Zellen wer­ den mit Trypsin von der Glasoberfläche der Schale ab­ gelöst und auf demselben Medium zur Erzielung von Se­ kundärkulturzellen nochmals kultiviert. In beiden Fäl­ len wird die Kultivierung in einem Kohlendioxid-Kultur­ gefäß, das 5% Kohlendioxid enthält, bei 37°C und einer Feuchte von 100% 3 bis 5 Tage vorgenommen.

Es wird angenommen, daß sich in der Sekundärzellen- Kulturflüssigkeit eine Substanz befindet, die zur Wieder­ herstellung normaler Funktionen gegenüber schlecht­ differenzierten myelogenen Leukämiezellen von Mäusen in der Lage ist, die zur Differenzierung und Reifung von Granulocyten oder Makrophagen führt. Man weiß, daß diese Substanz ein nichtdialysierbares hochmolekulares Protein darstellt, das durch 30 min langes Erwärmen auf 70°C oder durch 2 h lange Behandlung mit einer 0,4 mg/ml Trypsin enthaltenden Lösung bei 37°C inakti­ viert werden kann.

Das Verfahren von Sachs et al. wird wie folgt durchgeführt:

Als Kulturzellinie von Mäuse-Fetalzellen (Swiss-Mäuse) vorliegende E1-Zellen werden in mit 10% Pferdeserum versetztem Eagle-MEM-Medium dispergiert und in eine Kunststoffschale gebracht; nach 3 bis 4 Tage dauernder Kultivierung bei 37°C zur Erzeugung einer Monoschicht von Zellen wird das Medium entfernt und mit phosphat­ gepufferter Dulbecco-Salzlösung (im folgenden als PBS⊖ abgekürzt) drei- bis viermal gewaschen; danach wird nicht mit Serum versetztes Eagle-MEM-Medium zu­ gegeben und 3 bis 4 Tage bei 37°C weiterkultiviert. Es ist bekannt, daß die so erhaltene Kulturflüssigkeit eine Substanz enthält, die zur Wiederherstellung nor­ maler Funktionen bei schlechtdifferenzierten myelogenen Leukämiezellen von Mäusen zur Differenzierung und Rei­ fung von Granulocyten und Makrophagen in der Lage ist. Der Wirkstoff wird durch Ultrafiltration mit Diaflo- Membranen, Säulenchromatographie an Hydroxylapatit, an DEAE-Cellulose sowie anschließend an Sephadex G-150 in der angegebenen Reihenfolge zu einem elektrophoretisch einheitlichen Protein gereinigt. Es ist bekannt, daß diese Substanz ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 68 000 darstellt, das ein Cystin, Cystein, keine Hexosamine und Zucker enthält und durch Pronase­ behandlung inaktiviert wird.

Die genannten herkömmlichen Verfahren weisen jedoch folgende Nachteile auf.

Das Verfahren nach Ichikawa et al. hat den Nachteil, daß die Wirkung der Kulturflüssigkeit auf die Wiederher­ stellung normaler Funktionen bei schlechtdifferenzier­ ten leukämischen Zellen je nach Art des dem Medium zuge­ setzten Tierserums bzw. je nach Ansatz des von der gleichen Tierart stammenden Serums um etwa den Faktor 4 schwankt (vgl. Experimental Research 90 [1975] 20).

Das Verfahren nach Sachs et al. ist vom Ergebnis her nur dann spezifisch, wenn als Reinkultur vorliegende E1-Zellen eingesetzt werden. Aufgrund von Untersuchun­ gen der Erfinder an verschiedenen in Reinkultur vorlie­ genden Zellen wurden allerdings in derartigen Kultur­ flüssigkeiten im Gegensatz von der von Sachs et al. vertretenen Auffassung keinerlei Substanzen mit einer die normale Funktion von Zellen wiederherstellenden Wir­ kung aufgefunden.

In jüngster Zeit berichteten Maeda et al., daß eine Kulturflüssigkeit mit einer Substanz, die bei schlecht­ differenzierten leukämischen Zellen in hoher Konzentration eine die normale Funktion wiederherstellende Wirkung auf­ weist, durch Kultivieren tierischer Fetalzellen in einem zur Verbesserung der herkömmlichen Verfahren anstelle von Säugerserum mit Rinderserumalbumin versetzten Medium er­ hältlich sind (vgl. The description of the 34th General Meeting of the Cancer Society of Japan, p. 127. 1975). Ichikawa et al. berichteten ferner, daß eine Kulturflüs­ sigkeit derselben Wirksamkeit durch Kultivieren mensch­ licher Fetalzellen in einem mit Kälberserum versetzten Medium erhalten werden kann (vgl. Gann. 64, 3 [1973] 257-63). Diese Verfahren verwenden allerdings tierische und nicht menschliche Zellen oder menschliche Fetalzellen und Serum oder Serumalbumin von Tieren und nicht von Men­ schen. Bei der Verabreichung von Medikamenten, die eine nach diesem Verfahren erhaltene Kulturflüssigkeit enthal­ ten, an Menschen treten entsprechend aufgrund der Anwe­ senheit von tierischem Serum oder Serumalbumin Antigen- Antikörper-Reaktionen auf, so daß derartige Medikamente nicht praktisch verwendbar sind. Es ist ferner aus ethi­ scher bzw. moralischer Sicht sowie im Hinblick auf die öffentliche Meinung abträglich, hierfür menschliche Fetalzellen zu verwenden. Die genannten herkömmlichen Verfahren können entsprechend nicht industriell ange­ wandt werden. Dementsprechend liegen bisher keine Mit­ tel zur Behandlung der myeloischen Leukämie vor, die eine Zellkultur enthalten, die bedenkenlos an Menschen verabreicht werden kann.

Der Erfindung liegen Untersuchungen zur Herstel­ lung eines Mittels zur Behandlung der myeloischen Leukämie zugrunde, das keine Antigen-Antikörper-Reaktion hervorruft, die bei den bisherigen Verfahren das bei weitem gravierendste Problem darstellt; dabei wurde festgestellt, daß eine durch Kultivieren menschlicher Amnionzellen er­ haltene Kulturflüssigkeit, die bisher noch nie zur Her­ stellung von Mitteln zur Behandlung der myeloischen Leu­ kämie herangezogen worden war und in einem Humanserum­ albumin enthaltenden Medium leicht zugänglich ist, eine die normalen Funktionen wiederherstellende Wirkung gegen­ über schlechtdifferenzierten myelogenen leukämischen Zellen aufweist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel gegen myeloische Leukämie und sein Herstellungsverfahren anzugeben, nach dem das Mittel leicht und in hoher Konzen­ tration zugänglich ist, das nicht zum Auftreten von Anti­ gen-Antikörper-Reaktionen bei der Verabreichung an Men­ schen führt und bei myelogenen leukämischen Zellen in spezifischer Weise auf die Wiederherstellung normaler Funktionen hin wirkt.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

Das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung der myeloischen Leukämie wird gemäß der Erfindung nach folgendem Ver­ fahren hergestellt:

• (1) Vorkultivieren menschlicher Amnionzellen, die durch Trypsinbehandlung aus menschlichem Amnion oder durch mindestens einmaliges Subkultivieren isolierter Amnion­ zellen erhalten wurden, in einem Kälberserum oder Rinderfetalserum enthaltenden ersten Medium während 1 bis 5 Ta­ gen zur Erzeugung einer Monoschicht,
• (2) Entfernen des ersten Mediums,
• (3) Zusatz eines 0,5 bis 20 mg/ml Humanserumalbumin enthaltenden zweiten Mediums, zu der Monoschicht,
• (4) Kultivieren während 3 bis 6 Tagen,
• (5) Dialysieren gegen verdünnten Puffer oder Wasser und
• (6) Sterilfiltrieren der so erhaltenen dialysierten Kultur­ flüssigkeit unter aseptischen Bedingungen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand einer bevor­ zugten Ausführungsweise näher erläutert.

1. Herstellung der Amnionzellen

Das erfindungsgemäß verwendete Amnion wird von der Placenta einer Frau gewonnen, die in normaler Weise oder durch Kaiserschnitt von einem Kind entbunden wurde; das Amnion wird in eine 0,3% (G/V) Penicillin enthalten­ de sterilisierte Hanks-Lösung eingebracht und bis zum Beginn der Herstellung des Mittels bei 4°C aufbewahrt. Ein von einer Placenta einer Frau gewonnenes Amnion, die normal entbunden wurde, kann mit einer antiseptischen Lösung zur Sterilisation beim Durchtritt des Kindes wäh­ rend des Geburtsvorgangs kontaminiert sein, so daß die Gefahr besteht, daß die Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels hierdurch ungünstig beeinflußt wird; es ist ent­ sprechend wünschenswert, ein von der Placenta einer Frau gewonnenes Amnion einzusetzen, die wenn möglich durch Kaiserschnitt entbunden wurde. Das von der Placenta ab­ geschnittene Amnion wird wünschenswerterweise zur Her­ stellung des erfindungsgemäßen Mittels so rasch wie mög­ lich verwendet. Auch bei Aufbewahrung bei niedrigen Tem­ peraturen sterben die Amnionzellen innerhalb 24 h nach der Gewinnung ab. Das erhaltene Amnion wird unter asepti­ schen Bedingungen mit einer sterilisierten PBS⊖-Lösung und einem sterilisierten Eagle-MEM-Medium je zweimal gewaschen, zu Stücken von etwa 5 × 5 cm zerschnitten, in eine Scha­ le gebracht, dreimal mit Eagle-MEM-Medium gewaschen, unter aseptischen Bedingungen mit einer Schere zerschnit­ ten, mit einer wäßrigen, 0,25 Gew.-% Trypsin enthalten­ den Lösung versetzt und unter aseptischen Bedingungen bei Raumtemperatur 30 bis 60 min zur enzymatischen Behandlung gerührt.

Anschließend wird ein 10 bis 20% Kälber- oder Rinder­ fetalserum enthaltendes Eagle-MEM-Medium der durch Trypsin abgebauten Lösung zur Verhinderung einer weiteren Trypsin­ einwirkung zugesetzt und das Gemisch durch ein rostfreies Stahlsieb von 0,1 bis 0,18 mm (80 bis 150 mesh) zur Entfernung der Zellbestandteile unter aseptischen Bedingungen hin­ durchpassiert.

2. Primärkultur

Die so erhaltene Suspension von Amnionzellen wird unter aseptischen Bedingungen bei 1000 U/min 10 min zur Zellgewinnung zentrifugiert, die anschließend im gleichen sterilisierten Eagle-MEM-Medium suspendiert werden. Ein Teil der Suspension wird entnommen und darin die Anzahl lebensfähiger Zellen nach dem nachstehend be­ schriebenen Eosin-Färbeverfahren ermittelt; die Amnion­ zellen werden darauf in einem sterilisierten Eagle-MEM- Medium im Bereich von jeweils 5 · 10⁶-10⁷ pro 10 ml Medium eingeimpft. Eine Eosin-Lösung von in PBS⊖ mit einer Konzentration von 0,5% (G/V) gelöstem Eosin-Y- Pulver und die Zellsuspension werden im gleichen Mengen­ verhältnis gemischt. Ein Tropfen des Gemischs wird auf ein Hämacytometer getropft und mikroskopisch untersucht. Auf diese Weise wird die Anzahl lebensfähiger Zellen durch Ermittlung der rotgefärbten Zellen als tote Zellen und der nicht gefärbten Zellen als lebende Zellen bestimmt.

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren zum Vorkulti­ vieren bzw. der Bildung der Monoschicht eingesetzte Medium wird durch Zusatz von 10 bis 20% Kälberserum (innerhalb einer Woche nach Geburt) oder Rinderfetalserum zu einem (im folgenden als EM-Medium bezeichneten) Medium herge­ stellt, das durch Zusatz von MEM-Aminosäure-Vitaminmedium zu Eagle-MEM- Medium in der Weise hergestellt wurde, daß der Aminosäure­ gehalt und der Vitamingehalt zweifach höher liegen als die Menge an Eagle-MEM-Medium.

Obgleich zur Kultur der isolierten Amnionzellen Schalen verwendet werden können, ist die Verwendung eines größeren Zellkulturgefäßes zur Erzeugung größerer Mengen des erfindungs­ gemäßen Mittels wünschenswert. Dieser Reaktor ist mit einem spiralförmigen Kunststoffilm versehen, an dem die Zellen innerhalb eines Zylinders haften.

Die wie oben isolierten menschlichen Amnionzellen werden in ein Medium von 10 ml pro Schale geimpft und in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß bei 37°C und 100% relativer Feuchte kultiviert. Nach 3 bis 4 Tagen wird das Medium zur Entfernung aufschwimmender abgestor­ bener Zellen und Erythrocyten gegen ein frisches Medium ausgetauscht. Die Zellen werden unter denselben Bedingun­ gen noch einige Tage weiterkultiviert, bis sie an der Bodenfläche der Schalen unter Bildung einer Monoschicht anhaften. Auf diese Weise werden Primärkulturzellen er­ halten. Die Primärkulturzellen können zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels herangezogen werden.

3. Subkultur

Nach Erhalt der Primärkulturzellen wird das Medium entfernt, worauf die Zellen mit PBS⊖-Lösung gewaschen und von der Bodenfläche der Schale durch Zusatz einer 0,05gew.-%igen wäßrigen Trypsinlösung abgelöst werden. An den Zellen wird in derselben Weise wie oben nach dem Eosin-Färbeverfahren die Anzahl lebender Zellen bestimmt; es wird mit EM-Medium auf eine Zellkonzentration von je­ weils etwa 5 · 10⁵ bis etwa 10⁶ pro ml verdünnt; die Zellen werden anschließend zusammen mit EM-Medium, das mit Kälberserum oder Rinderfetalserum versetzt ist, in eine Kunststoffschale gebracht und darin in dergleichen Weise kultiviert, worauf Sekundärkulturzellen erhalten werden. Die Sekundärkulturzellen können zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels verwendet werden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es wünschens­ wert, das Mittel unter Verwendung von sekundären mensch­ lichen Amnionzellen herzustellen, die in der angegebenen Weise mindestens einmal nach einem herkömmlichen Verfah­ ren subkultiviert wurden. Die Subkulturschritte werden zur Erzielung von Amnionzellen durchgeführt, die keine unnötigen Bestandteile wie abgestorbene Zellen und Erythro­ cyten enthalten. Wenn die Menge der sekundären mensch­ lichen Amnionzellen ferner so gering ist, daß sie nicht in großer Menge kultiviert werden können, werden eine oder mehrere Subkulturen zur Erhöhung der Zellzahl wieder­ holt, wobei die Zellen der tertiären und weiteren Kultu­ ren zur Herstellung des Mittels verwendet werden können. In einem derartigen Fall wird allerdings die Zellvermeh­ rung allmählich mit zunehmender Wiederholung der Subkulti­ vierung unterdrückt; dabei wurde festgestellt, daß aus morphologisch veränderten und immer weiter vermehrten Zellen keine Substanz mehr gewonnen werden kann, die eine die normalen Zellfunktionen bei schlechtdifferenzierten leukämischen Zellen wiederherstellende Wirkung aufweist; die Subkultivierung ist entsprechend auf etwa 15 Wieder­ holungen begrenzt.

4. Vorkultur

Die oben beschriebenen isolierten oder subkultivierten menschlichen Amnionzellen werden in ein mit demgleichen Serum wie oben versetztes EM-Medium in einer Menge von jeweils 5 · 10⁶ bis etwa 10⁷ pro 10 ml Medium eingeimpft und in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß 1 bis 5 Tage bei 37°C kultiviert, wobei die Zellen an der Bodenfläche der Schale haften. Anschließend wird das Medium entfernt, worauf die Zellen zur vollständigen Entfernung des Serums zur Beendigung der Vorkultur dreimal mit PBS⊖-Lösung gewaschen werden. Die Vorkultur wird dabei mit der Ab­ sicht durchgeführt, daß die menschlichen Amnionzellen an der Bodenfläche der Schale haften, wobei nicht ange­ strebt ist, eine Kulturflüssigkeit zu erhalten. Die Vor­ kulturzeit wurde durch den nachstehend beschriebenen Test 1 bestimmt.

Test 1

Von Ichikawa et al. aus dem Knochenmark von S-Mäu­ sen mit spontaner myeloblastischer Leukämie reinkulti­ vierte M1-Zellen stellen eine Zellinie dar, die myelo­ blastische leukämische Zellen enthält, die ihre Vermeh­ rung in Medium unter gewöhnlichen Kulturbedingungen wiederholen, da sie sich in ihrem undifferenzierten Zustand befinden. Wenn sich allerdings die M1-Zellen bei Zusatz eines Mittels, das im Sinne einer Wiederherstellung der normalen Funktionen myelogener Zellen gegenüber leukämi­ schen Zellen (M1-Zellen) wirkt, und anschließende Zell­ kultur zu Granulocyten oder Makrophagen mit Mobilität und Phagocytosewirkung differenzieren, ist das entspre­ chende Mittel zur Behandlung der myeloischen Leukämie wirksam.

Von den Erfindern wurde die Phagocytosewirkung von M1-Zellen untersucht, die mit dem erfindungsgemäßen Produkt bzw. dem Produkt aus der erfindungsgemäßen Kulti­ vierung versetzt worden waren. Dabei wurden in dergleichen Weise wie in Beispiel 1 fünf Probenarten hergestellt, die sich darin unterschieden, daß 0, 1, 3, 5 und 7 Tage vor­ kultiviert wurde.

Die Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels auf die Phagocytosewirkung wurde an diesen Proben wie folgt be­ stimmt:

Zunächst wurde ein Medium durch Zusatz von 10% Käl­ berserum zu EM-Medium hergestellt. Je 5 ml der Testmedien, die durch Zusatz von jeder der oben beschriebenen Proben zu dem Medium zu einer Konzentration von 25 Vol.-% herge­ stellt worden waren, sowie das nicht mit der Probe ver­ setzte Medium (Kontrollversuch 1) wurden mit M1-Zellen in einer Konzentration von jeweils 5 · 10⁵ geimpft und in Kunststoffschalen von 6 cm Durchmesser in einem Kohlen­ dioxid-Kulturgefäß 3 Tage bei 37°C kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen mit einem Gummiwischer ge­ sammelt, worauf in jedem Medium die Zahl lebensfähiger Zellen nach dem oben beschriebenen Eosin-Färbeverfahren bestimmt wurde. Nach der Abtrennung des Mediums durch Zentrifugieren wurden die von jeder Probe gewonnenen Zel­ len getrennt in 2 ml EM-Medium suspendiert, das keinen Serumzusatz enthielt und mit einer wäßrigen Suspension von Polystyrollatex mit einem Partikeldurchmesser von 1 µm in einem Verhältnis von 1 Tropfen auf 20 ml Medium versetzt worden war. Nach 4stündigem Stehenlassen bei 37°C wurden die Zellen zum Auswaschen von nicht durch die Zellen phagocytierten Teilchen und auf der Zelloberfläche anhaftender Partikel mit PBS⊖ gewaschen. Anschließend wurde ein Tropfen der Zellsuspension auf ein Hämocytometer aufgetropft und ferner ein Tropfen der Eosin-Lösung zugesetzt; die Gesamtzahl der lebens­ fähigen Zellen und die Zahl der Polystyrollatex-Partikel enthaltenden Zellen wurde mikroskopisch ermittelt. Der Prozentsatz der Polystyrollatex-Partikel enthaltenden Zellen bezogen auf die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen liefert bei der Berechnung entsprechend die Phagocytosewirkung der Zellen zum Vergleich der Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Bei der Probe, bei der keine Vorkultur durchgeführt wurde, haften fast keine Zellen an der Bodenfläche der Schale; die Zellen bleiben in der Kulturflüssigkeit suspen­ diert; sie weisen ferner nur geringe Phagocytosewirkung auf. Bei der Probe, die über mehr als 5 Tage vorkulti­ viert und ferner 4 Tage in einem mit Serumalbumin ver­ setzten Medium weiterkultiviert war, wurde, obgleich kaum eine Verringerung der Phagocytosewirkung festge­ stellt wurde, beobachtet, daß sich die Zellen von der Bodenfläche der Schale ablösten und eine Suspension bilde­ ten, wobei Zellzerstörung auftrat und die intra­ cellulären Bestandteile in die Kulturflüssigkeit hinein­ eluiert wurden, weshalb die Probe zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels ungeeignet war.

Aus den oben angeführten Testergebnissen geht her­ vor, daß eine Dauer von 1 Tag für das Vorkultivieren aus­ reichend ist; falls sich jedoch eine Monoschicht nur schwierig bildet, kann die Vorkultivierung bis zu 5 Tage lang durchgeführt werden.

5. Kultivieren

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird EM-Medium, das Humanserumalbumin in einer Menge von 0,5 bis 20 mg/ml ent­ hält, zu menschlichen Amnionzellen zugegeben, deren Vor­ kultivierung wie oben beschrieben beendet ist und die eine Monoschicht bilden; die menschlichen Amnionzellen werden in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß 2 bis 6 Tage bei 37°C kultiviert, wobei eine Kulturflüssigkeit erhalten wird. Die Menge an dem Medium zugesetztem Humanserumalbumin sowie die Dauer der Kultivierung in Tagen wurden anhand der Tests 2 und 3 ermittelt.

Test 2

Es wurden sieben Arten von Proben in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 mit dem Unterschied hergestellt, daß die Menge an dem Medium zugesetztem Humanserumalbumin 0 mg (Kontrollversuch 2), 0,25 mg, 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 20 mg und 40 mg pro ml Medium betrug. Die Phagocytose­ wirkung der M1-Zellen wurde an diesen Proben nach den gleichen Verfahren wie in Test 1 gemessen, wobei die Wir­ kung des erfindungsgemäßen Mittels in Abhängigkeit von der zugesetzten Menge an Serumalbumin untersucht wurde.

Daneben wurde als Kontrollversuch 1 eine Probe ver­ wendet, die nicht mit der wie bei Kontrollversuch 1 von Test 1 hergestellten Kulturflüssig­ keit versetzt war. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Bei dem Kontrollversuch 1 und einer Probe (Kontroll­ versuch 2), die ohne Zusatz von Serumalbumin kultiviert wurde, wurde keine Phagocytosewirkung festgestellt. Fer­ ner ergab sich, daß eine unter Zusatz von 0,25 mg/ml Humanserumalbumin kultivierte Probe eine niedrige Phago­ cytosewirkung aufwies. In einer mit 40 mg/ml kultivier­ ten Probe waren die Zellen zerstört und die Zellinhalts­ stoffe ausgetreten; derartige Verhältnisse sind zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels entsprechend nicht günstig. Beim erfindungsgemäßen Verfahren beträgt die günstige Menge an dem Medium zugesetztem Serumalbumin entsprechend 0,5 bis 20 mg pro ml Medium.

Test 3

Es wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 sechs Arten von Proben mit dem Unterschied hergestellt, daß die Amnionzellen nach einer Vorkultivierung von 1, 2, 3, 5, 6 und 8 Tagen kultiviert wurden. Die Phagocytosewirkung von M1-Zellen wurde an diesen Proben nach den gleichen Verfahren wie in Test 1 zur Bestimmung der Wirksamkeit des Mittels untersucht.

Daneben wurde eine wie in Kontroll­ versuch 1 von Test 1 hergestellte und nicht mit der Kultur­ flüssigkeit versetzte Probe als Kontrollversuch 1 verwen­ det.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 auf­ geführt.

Tabelle 3

Eine nur 1 Tag lang kultivierte Probe weist nur geringe Phagocytosewirkung auf. Auf der anderen Seite zeigen durch 8tägiges Kultivieren erhaltene Proben zwar eine hohe Phagocytoseaktivität, jedoch zugleich auch den Befund, daß sich menschliche Amnionzellen von der Bodenfläche der Schale als Schicht ablösen und zer­ stört werden; es ist daher nicht günstig, die Kultur­ flüssigkeit von derartigen Proben zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels einzusetzen.

Die geeignete Kulturdauer beträgt erfindungsgemäß entsprechend etwa 2 bis 6 Tage; zur Verkürzung der Kultur­ dauer ist eine Kultivierungszeit von 3 Tagen besonders günstig.

6. Dialyse und Filtration

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die wie oben beschrieben hergestellte Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Bestandteile des Mediums gegen PBS⊖ dialysiert, keim­ frei filtriert und unter aseptischen Bedingungen zur direk­ ten Verwendung als flüssiges Mittel in Gefäße abgefüllt. Das durch Dialyse der Kulturflüssigkeit gegen verdünntes PBS⊖ erhaltene dialysierte Kulturmedium kann keimfrei filtriert und zur Gewinnung eines pulverförmigen Mittels weiter unter aseptischen Bedingungen lyophilisiert werden. Die Kulturflüssigkeit kann ferner auch ultrafiltriert werden, wobei eine Fraktion mit einem Protein von 30 000 bis 100 000 Molekulargewicht als Hauptbestandteil erhalten wird; die Fraktion kann zur Verwendung als flüssiges Mit­ tel keimfrei filtriert oder zur Verwendung als Mittel in Pulverform gefriergetrocknet werden. Das pulverför­ mige Mittel wird zur Verwendung für Injektionszwecke geeigneterweise in sterilem Wasser, sterilisierter physiologischer Salzlösung, Dextroselösung o. dgl. ge­ löst. Das erfindungsgemäße flüssige Mittel kann ferner auch in der vorliegenden Form selbst zur Injektion ver­ wendet werden.

Das erfindungsgemäß hergestellte Mittel wird den Patienten i. v. in einer Dosierung von 13-640 mg/kg Körpergewicht pro Tag durch Injektion verabreicht; die Dosierung beruht dabei auf den in Test 5 angegebenen Ergebnissen von Tierversuchen an Mäusen.

7. Wirksame Menge Test 4

Es wurde geprüft, ob Mäuse, die mit dem erfindungs­ gemäßen, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Mittel behandelt worden waren, nach der Transplantation von M1-Zellen an myeloischer Leukämie erkranken oder nicht.

Durch Zusatz der wie in Beispiel 1 erhaltenen Kulturflüssigkeit in einer Menge von 6,25 Vol.-%, 12,5 Vol.-% und 25 Vol.-% zu EM-Medium wurden drei Arten von Medien hergestellt, ferner ein nicht mit der Kultur­ flüssigkeit versetztes EM-Medium (Kontrollversuch). Auf jede der vier Arten von Medien wurden M1-Zellen in einer Menge von 3 · 10⁵/ml Medium eingeimpft und in einem Kohlen­ dioxidgefäß 3 Tage bei 37°C kultiviert. Nach der Kulti­ vierung wurde ein Teil der M1-Zellen zur Untersuchung der Phagocytosewirkung in derselben Weise wie in Test 1 entnommen. Die verbliebenen M1-Zellen wurden zweimal mit PBS⊖ gewaschen, worauf die Zahl der lebensfähigen Zellen nach dem oben beschriebenen Eosin-Färbeverfahren ermittelt wurde; anschließend wurden die Zellen in einer Menge von 1 · 10⁵/ml, 1 · 10⁶/ml und 1 · 10⁷/ml zur Her­ stellung von M1-Zellsuspensionen in PBS⊖ suspendiert.

44 6 Wochen alte SL-Mäuse wurden in 11 Gruppen von jeweils 4 Mäusen aufgeteilt; jeder Maus wurde 0,1 ml der obigen M1-Zellsuspension einmal über die Schwanzvene in­ jiziert. Die Mäuse wurden 1 Monat mit Wasser und Nahrung, die frei zur Verfügung stand, aufgezogen. Zur Untersuchung der de­ carcinogenen Wirkung des Mittels auf M1-Zellen wurden die Mäuse im Anschluß daran getötet und zerlegt, um festzustellen, ob ein Ausbrechen myeloischer Leukämie am Zustand der Vergrößerung der Lymphknoten und der Milz nachgewiesen werden konnte.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 an­ gegeben.

Tabelle 4

Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, nimmt die Anzahl der an Leukämie erkrankten Tiere mit steigender Konzentration des einem M1-Zellen-Kulturmedium zugesetzten Mittels ab. Insbesondere wenn die Kulturflüssigkeit in einer Konzen­ tration <12,5% zugesetzt wird, fällt die Anzahl der erkrankten Tiere im Vergleich mit dem Kontollversuch bemerkenswert ab.

Daraus geht hervor, daß die Funktion der M1-Zellen durch ihre Kultivierung in einem mit dem erfindungsgemäßen Mittel in einer Menge <12,5% versetztem Medium normali­ siert wurde.

Zur Untersuchung der Wirkung in Fällen, in denen das erfindungsgemäße Mittel an SL-Mäusen durch Injektion ver­ abreicht wurde, die durch vorherige Transplantation von M1-Zellen an myeloischer Leukämie litten, wurden ferner die im folgenden angegebenen Tierversuche durchgeführt.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Mittel enthält hochmolekulare Proteine; wenn dieses Mit­ tel infolgedessen Tieren injiziert wird, kommt es zu einer Antigen-Antikörper-Reaktion, so daß die Mittel nicht wiederholt verabreicht und die Wirkung entsprechend nicht geprüft werden kann. Aus diesem Grund wurden in gleicher Weise wie gemäß der Erfindung Mittel für Tierversuche un­ ter Verwendung von Zellen und Serumalbumin der gleichen Tier­ art hergestellt, die in den Versuchen verwendet wurde, worauf die Tiere damit getestet wurden. Das für dieses Experiment herangezogene Mittel wurde entsprechend durch Kultivieren von Mäusefetalzellen in einem mit Mäuseserum­ albumin versetzten Medium hergestellt und Mäusen zur Be­ stimmung der akuten Toxizität sowie der zu verabreichen­ den wirksamen Dosis injiziert.

Da sich das in dieser Weise aus Mäusefetalzellen er­ haltene Mittel für die entsprechenden Tierversuche hin­ sichtlich der Phagocytosewirkung aufgrund des Tests wie in Test 1 als dem erfindungsgemäß erhaltenen Mittel äquivalent erwies, wird angenommen, daß die aus den Tier­ versuchen in dieser Weise erhaltene akute Toxizität und wirksame Dosis auf das zur Behandlung von Menschen vor­ gesehene erfindungsgemäße Mittel übertragen werden können und entsprechend gleiche Werte gelten.

Test 5

3 SL-Mäusen wurden am 14. Tag der Trächtigkeit 26 Feten unter aseptischen Bedingungen entnommen und unter asepti­ schen Bedingungen mit der Schere zerschnitten; anschließend wurden 60 ml einer wäßrigen Trypsinlösung in einer Konzen­ tration von 0,25 Gew.-% zugesetzt, worauf zur Isolierung der Fetalzellen etwa 15 min bei 37°C enzymatisch be­ handelt wurde. Die Fetalzellen in einer Konzentration von 2 · 10⁶ wurden in jeweils 30 Schalen von 10 cm Durch­ messer mit 10 ml sterilisiertem EM-Medium geimpft, das in einer Konzentration von 10% mit Kälberserum versetzt worden war, und in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß 6 Tage kultiviert, wobei das Medium zur Erzeugung einer Monoschicht primä­ rer Fetalzellen jeden zweiten Tag ersetzt wurde. Danach wurde das Medium abgetrennt und 1,5 ml einer wäßrigen, 0,05gew.-%igen Trypsinlösung pro Platte zugegeben, worauf die Monoschicht zur Ablösung der Zellen 15 min bei 37°C enzymatisch behandelt wurde. Die abgelösten Zellen wurden in je 35 Kulturschalen von 15 cm Durchmesser, die 22,5 ml desselben Mediums wie oben enthielten, in einer Menge von 2,25 · 10⁶ pro Platte eingeimpft und unter gleichen Be­ dingungen 48 h kultiviert. Anschließend wurde das Medium in jeder Schale entfernt, worauf die Zellen dreimal mit PBS⊖ gewaschen wurden. Anschließend wurden jeder Schale 22,5 ml EM-Medium zugesetzt, in dem Mäuseserumalbumin (Fraktion V) in einer Konzen­ tration von 1 mg/ml gelöst war, worauf 4 Tage in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß bei 37°C kultiviert wurde; von den 35 Platten wurden etwa 780 ml einer Kulturflüssigkeit erhalten, die einen Proteingehalt von 1,8 mg/ml aufwies.

Die Kulturflüssigkeit wurde unter Verwendung von Diaflo-Ultrafiltrationsmembranen (Typ XM-100), ultrafiltriert, wobei eine Fraktion mit einem Molekular­ gewicht unter 100 000 erhalten wurde. Diese Fraktion wurde unter Verwendung von Abcor-Ultrafiltrationsmembranen (Typ HFA-300), ultrafiltriert, worauf eine Fraktion mit einem Molekulargewicht über 50 000 er­ halten wurde; nach der Gefriertrocknung ergab die Fraktion etwa 600 ml eines weißen, pulverförmigen Mittels für Tier­ versuche.

Das so erhaltene Mittel wurde zu einer Konzentration von 10% in PBS⊖ gelöst und auf seine akute Toxizität durch intraperitoneale Verabreichung nach dem Verfahren von Lichfield und Wilcoxon (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 90 [1949] 99) geprüft.

Die akute Toxizität (LD₅₀) des Mittels ergab sich so zu 3200 mg/kg.

Aufgrund der so erhaltenen akuten Toxizität wurden folgende Versuche zu Ermittlung der wirksamen Menge durch­ geführt:

42 6 Wochen alten SL-Mäusen wurden jeweils 1 · 10⁶ M1-Zellen intraperitoneal injiziert. Die Mäuse wurden in sieben Gruppen zu je 6 Mäusen aufgeteilt. Die 6 Mäuse der ersten Gruppe erhielten kontinuierlich 5 Tage vom folgenden Tag ab 0,5 ml sterilisierte physiologische Salz­ lösung pro Tag und Maus intraperitoneal injiziert; die Mäuse der zweiten Gruppe erhielten 0,5 ml einer 0,001gew.-%igen wäßrigen Lösung von Mitomycin C injiziert, das bisher als Mittel zur Behandlung von Leukämie eingesetzt wird (die Darreichungsmenge wurde im Tierversuch unter Verwendung von Leukämiezellen L 1210 als wirksam angesehen), die Mäuse der dritten bis siebenten Gruppe erhielten 0,5 ml der wäßrigen Lösung des oben beschriebenen Mittels für Tierversuche in einer Menge von 1/500, 1/250, 1/50, 1/5 bzw. 1/3 der akuttoxischen Menge injiziert. Die Mäuse wurden dabei jeweils mit Wasser und frei zur Verfügung stehendem Futter aufgezogen. Im Anschluß daran wurde die mittlere Überlebensdauer in Tagen für jede Gruppe von Mäusen berechnet und der Index jeder Gruppe für 100 mittlere Überlebenstage der Kontrollgruppe daraus berechnet, um so die prozentuale Lebensdauerverlänge­ rung zu bestimmen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5

Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, zeigt die mit Mitomycin C als im Handel erhältlichem Mittel zur Behandlung von Leukä­ mie behandelte Gruppe eine gegenüber der Kontrollgruppe um etwa 10% verlängerte Lebenszeit.

Im Gegensatz dazu liegt die prozentuale Verlängerung der Lebenszeit bei den Gruppen, die mit dem Mittel für Tierversuche behandelt wurden, das nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren hergestellt war, ins­ besondere bei der vierten bis sechsten Gruppe, bemerkens­ wert höher.

Daraus geht hervor, daß die vierte bis sechste Gruppe eine 1,2fach höhere Steigerung der prozentualen Lebens­ dauer als die mit Mitomycin C behandelte zweite Gruppe aufweist.

Die den Tieren der vierten bis sechsten Gruppe verab­ reichte Menge des Mittels für Tierversuche, d. h. 13 bis 640 mg/kg Körpergewicht und Tag, ist entsprechend eine wirksame Menge.

Bei den vorstehenden Tests 1 bis 4 wurde ferner ein Mittel durch Impfen vorkultivierter menschlicher Amnion­ zellen in ein Medium in einer Konzentration von 1 · 10⁵/ml hergestellt und getestet. Wenn die Mittel durch Impfen der Zellen in anderen Konzentrationen hergestellt wurden, wur­ den dieselben Ergebnisse wie in den Tests 1 bis 4 erzielt.

Beispiel 1

Aus den Placenten von drei durch Kaiserschnitt entbundenen Frauen wurde jeweils das Amnion herausgeschnitten und in sterilisierter Hanks-Flüssigkeit, die Penicillin in einer Konzentration von 0,3% (G/V) ent­ hielt, etwa 6 h bei 4°C aufbewahrt. Die Amnionen wurden je zweimal mit sterilisierter PBS⊖-Lösung und Eagle-MEM- Medium gewaschen, zu Stücken von etwa 5 × 5 cm zerschnit­ ten, in eine Schale gebracht, dreimal mit sterilisiertem EM-Medium gewaschen und unter aseptischen Bedingungen mit der Schere zerschnitten; anschließend wurden 120 ml einer wäßrigen Trypsinlösung in einer Konzentration von 0,25% (G/V) zugegeben, worauf zur Isolierung der Zel­ len etwa 30 min bei 37°C enzymatisch behandelt wurde. Zu der trypsinbehandelten Suspension wurde 10% Kälber­ serum enthalten­ des EM-Medium zugesetzt, worauf die Suspension zur Ab­ trennung der Zellmasse unter aseptischen Bedingungen durch Edelstahlsiebe von 0,18 und 0,1 mm (80 und 150 mesh) passiert wurde.

Die suspendierten menschlichen Amnionzellen wurden in einer Konzentration von 1 · 10⁷ Zellen auf 30 Kunst­ stoffschalen von 10 cm Durchmesser geimpft, die 10 ml mit 10% Kälberserum versetztes sterilisiertes EM-Medium enthielten, und zur Erzeugung einer Monoschicht primärer menschlicher Amnionzellen in einem Kohlendioxidgefäß 10 Tage bei 37°C kultiviert, wobei das Medium jeden 3. Tag ersetzt wurde. Nach der Abtrennung des Mediums wurden 1,5 ml einer 0,05%igen (G/V) wäßrigen Trypsin­ lösung pro Platte zugesetzt und die Monoschicht zur Ab­ lösung der Zellen 15 min bei 37°C enzymatisch behandelt. Die abgelösten Zellen wurden in einer Menge von jeweils 2,25 · 10⁷ auf 35 Kulturschalen von 15 cm Durchmesser geimpft, die 22,5 ml des oben beschriebenen Mediums ent­ hielten, und unter den beschriebenen Bedingungen 3 Tage kultiviert; nach der Entfernung des Mediums wurde die kultivierte Monoschicht dreimal mit PBS⊖ gewaschen.

Anschließend wurden 22,5 ml EM-Medium, das Humanserumalbumin in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst enthielt, pro Platte zugegeben, worauf 4 Tage in einem Kohlendioxid- Kulturgefäß bei 37°C kultiviert wurde; danach wurden aus den 35 Schalen 780 ml Kulturflüssigkeit erhalten, die 1,8 mg Protein/ml enthielt.

Die Kulturflüssigkeit wurde zur Entfernung der Mediums­ bestandteile gegen PBS⊖ dialysiert. Die obige Kultur­ flüssigkeit wurde im Anschluß daran unter Verwendung eines 0,45-µm-Membranfilters, das 15 min im Autoklaven bei 120°C sterilisiert worden war, unter aseptischen Bedingungen mit Hilfe einer Vakuumpumpe sterilfil­ triert. Je 350 ml des aseptischen Filtrats wurden in eine sterilisierte gläserne 500-ml-Infusionsflasche ge­ geben und verschlossen, worauf zwei flüssige Mittel zur Infusion erhalten wurden.

Beispiel 2

Wie in Beispiel 1 mit Trypsin behandelte und abgelöste sekundäre menschliche Amnion­ zellen wurden auf sterilisiertes EM-Medium geimpft, das 10% Kälberserum enthielt, wobei die Menge 10⁸ Zel­ len/l Medium betrug. Die Kulturflüssigkeit wurde in einer Menge von 1,6 l pro Gefäß in 5 große Zellkultur­ gefäße eingebracht und im Anschluß daran unter gleichen Bedingungen wie in Bei­ spiel 1 3 Tage unter Rotation der zylindrischen Gefäße mit 2 U/h vorkultiviert; nach der Entfernung des Mediums wurde die Vorkultur dreimal mit 400 ml PBS⊖ gewaschen, pro Kulturgefäß mit 18 l sterilisiertem EM-Medium ver­ setzt, in dem Humanserumalbumin (Fraktion V), in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst war, und 4 Tage bei 37°C in einem Kohlendioxid-Kultur­ gefäß kultiviert, worauf aus fünf großen Zellkulturge­ fäßen insgesamt 9 l Kulturflüssigkeit gewonnen wurden, die einen Proteingehalt von 2,0 mg/ml aufwies. Die Kulturflüssigkeit wurde in einen Dialysierbeutel eingebracht und in einem mit 100 l 50fach ver­ dünnter PBS⊖-Lösung gefüllten Metallgefäß unter Kühlung auf 4°C 12 h dialysiert, worauf anschließend in gleicher Weise 12 h gegen 100 l 8,7fach verdünnter PBS⊖-Lö­ sung dialysiert wurde; das dialysierte Kulturmedium wurde schließlich gefriergetrocknet, worauf 21 g eines weißen Pulvers erhalten wurden. 20,6 g des Pulvers wurden in 1 l bidestilliertem Wasser gelöst und wie in Beispiel 1 keimfrei filtriert, anschschließend unter aseptischen Bedingungen auf 20 Ampullen aufgeteilt und verschlossen. Jede Ampulle enthielt 50 ml injizier­ bares Mittel, das gegenüber physiologischer Salzlösung isotonisch war.

Beispiel 3

Wie in Beispiel 1 erhaltene se­ kundäre menschliche Amnionzellen wurden zu tertiären menschlichen Amnionzellen weiter subkultiviert, die da­ rauf in acht großen Zellkulturgefäßen in gleicher Wei­ se wie in Beispiel 2 kultiviert wurden, wodurch etwa 14 l Kulturflüssigkeit erhalten wurden. Die Kulturflüssig­ keit wurde wie in Beispiel 1 dialysiert mit dem Unterschied, daß 30fach bzw. 8­ fach verdünntes PBS⊖ verwendet wurde. Das so erhaltene dialysierte Kulturmedium wurde wie in Beispiel 1 keimfrei filtriert sowie ferner unter aseptischen Bedingungen in herkömmlicher Weise lyophili­ siert, worauf etwa 33,2 g eines weißen Pulvers erhalten wurden. 1,0 kg dieses Pulvers wurden unter aseptischen Bedingungen auf 33 Ampullen aufgeteilt und verschlossen. Zur Verwendung wurde das Mittel in 50 ml sterilem, bi­ destilliertem Wasser gelöst.

Beispiel 4

Etwa 14 l einer wie in Beispiel 3 erhaltenen Kulturflüssigkeit von menschlichen Amnionzellen, wurden unter Verwendung von Diaflo-Ultrafiltrationsmem­ branen (Typ XM-100) zur Ab­ trennung einer Fraktion mit einem Molekulargewicht unter 100 000 ultrafiltriert, worauf die Fraktion mit Abcor-Ultrafiltrations­ membranen (Typ HFA-300) nochmals ultrafiltriert und zugleich aufkonzentriert wurde; dabei wurden etwa 300 ml einer Fraktion mit einem Mole­ kulargewicht über 50 000 erhalten. Die so erhaltene Fraktion wurde wie in Beispiel 1 keimfrei filtriert, worauf je 12 ml des Filtrats unter aseptischen Bedingungen in 25 Ampullen eingebracht und unter aseptischen Bedingungen gefriergetrocknet wurden; danach wurden die Ampullen verschlossen. Jede Ampulle enthielt 640 mg des weißen Pulvers. Zur Verwendung wurde das Mittel in 20 ml sterilisierter PBS⊖-Lösung gelöst.

Claims (4)

1. Mittel zur Behandlung der myeloischen Leukämie, das erhalten worden ist durch

• a) Vorkultivieren fetaler Zellen, die durch Trypsin­ behandlung oder durch Subkultivieren fetaler Zellen in einem Serum enthaltenden Medium er­ halten wurden, während 1 bis 5 Tagen zur Er­ zeugung einer Monoschicht,
• b) Entfernen des Mediums,
• c) Zusatz eines Serumalbumin enthaltenden Mediums,
• d) Kultivieren während 3 bis 6 Tagen,
• e) Dialysieren gegen verdünnten Pfeffer oder Wasser und
• f) Sterilfiltrieren der so erhaltenen dialysierten Kulturflüssigkeit,

erhältlich durch Verwendung von

• - menschlichen Amnionzellen als fetale Zellen und von Kälber- oder Rinderfetalserum als Serum in Schritt a) und
  - Humanserumalbumin als Serumalbumin in einer Menge von 0,5 bis 20 mg/ml in Schritt c).

2. Verfahren zur Herstellung des Mittels nach Anspruch 1 durch

• a) Vorkultivieren fetaler Zellen, die durch Trypsinbe­ handlung oder durch Subkultivieren fetaler Zellen in einem Serum enthaltenden Medium erhalten wurden, während 1 bis 5 Tagen zur Erzeugung einer Mono­ schicht,
• b) Entfernen des Mediums,
• c) Zusatz eines Serumalbumin enthaltenden Mediums,
• d) Kultivieren während 3 bis 6 Tagen,
• e) Dialysieren gegen verdünnten Pfeffer oder Wasser und
• f) Sterilfiltrieren der so erhaltenen dialysierten Kulturflüssigkeit,

gekennzeichnet durch Verwendung von

• - menschlichen Amnionzellen als fetale Zellen und von Kälber- oder Rinderfetalserum als Serum in Schritt a) und
  - Humanserumalbumin als Serumalbumin in einer Menge von 0,5 bis 20 mg/ml in Schritt c).