DE2645993C2 - - Google Patents
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- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
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Description
Die Erfindung betrifft ein Mittel gegen myeloische
Leukämie sowie sein Herstellungsverfahren. Das erfindungs
gemäße Mittel wirkt gegenüber schlechtdifferenzierten,
myeloischen leukämischen Zellen im Sinne einer Wiederher
stellung normaler Funktionen; seine Herstellung erfolgt
erfindungsgemäß in einem Humanserumalbumin enthaltenden
Medium aus einer Kulturflüssigkeit, die durch Kultivie
ren von durch Trypsinbehandlung individuell isolierten
menschlichen Amnionzellen oder durch
mindestens einmaliges Subkultivieren von isolierten Amnionzellen
in einem Kälberserum oder Rinderfetalserum enthaltenden
Medium erhalten werden.
Die myelogene, sog. myeloische Leukämie stellt eine
Erkrankung dar, die durch übermäßige Proliferation
myeloischer Zellen und ihrer Zellvorläufer im Knochen
mark gekennzeichnet ist. Das erfindungsgemäße Mittel
zur Behandlung der myeloischen Leukämie wirkt gegen
leukämische Zellen, die aufgrund von Störungen im Kno
chenmark gebildet werden, wobei die normale Funktion
der Zellen wiederhergestellt wird.
Die medizinische Forschung zur Behandlung der Leukä
mie richtete ihr Augenmerk bisher hauptsächlich auf gegen
über leukämischen Zellen cytotoxische Wirkungen; in jüngster
Zeit steht allerdings die Wiederherstellung normaler Funktio
nen bei disdifferenzierten leukämischen Zellen, d. h.
die Entwicklung von Mitteln zur Decarcinogenese in Krebs
zellen, im Vordergrund (vgl. Chemistry and Biology 13,
Nr. 6 [1975] 380-82).
Zur Herstellung von Mitteln zur Erzielung einer der
artigen Decarcinogenese sind das Verfahren nach Ichikawa
et al. zur Kultivierung fetaler Säugerzellen (Journal of
Cellular Physiology 74 [1969] 223; 76 [1970] 1975 und
Gann 64 [1973] 257) sowie das Verfahren nach Sachs et al.
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 70 [1973] 343) angegeben worden.
Das Verfahren von Ichikawa et al. wird wie folgt
durchgeführt:
Ein Mäusefetus wird unter aseptischen Bedingungen
ausgenommen und ebenfalls unter aseptischen Bedingungen
mit der Schere zerschnitten; zur Isolierung der Fetal
zellen wird anschließend eine trypsinhaltige Puffer
lösung zugesetzt. Die isolierten Zellen werden in eine
Schale gegeben, worauf zur Kultivierung und Erzielung
von Primärkulturzellen ein Kulturmedium zugesetzt wird.
Als derartiges Medium wird mit 10 Vol.-% Pferde- oder
Kälberserum versetztes Eagle-MEM-Medium verwendet. Die
unter Bildung einer Monoschicht gewachsenen Zellen wer
den mit Trypsin von der Glasoberfläche der Schale ab
gelöst und auf demselben Medium zur Erzielung von Se
kundärkulturzellen nochmals kultiviert. In beiden Fäl
len wird die Kultivierung in einem Kohlendioxid-Kultur
gefäß, das 5% Kohlendioxid enthält, bei 37°C und einer
Feuchte von 100% 3 bis 5 Tage vorgenommen.
Es wird angenommen, daß sich in der Sekundärzellen-
Kulturflüssigkeit eine Substanz befindet, die zur Wieder
herstellung normaler Funktionen gegenüber schlecht
differenzierten myelogenen Leukämiezellen von Mäusen
in der Lage ist, die zur Differenzierung und Reifung
von Granulocyten oder Makrophagen führt. Man weiß, daß
diese Substanz ein nichtdialysierbares hochmolekulares
Protein darstellt, das durch 30 min langes Erwärmen
auf 70°C oder durch 2 h lange Behandlung mit einer
0,4 mg/ml Trypsin enthaltenden Lösung bei 37°C inakti
viert werden kann.
Das Verfahren von Sachs et al. wird wie folgt
durchgeführt:
Als Kulturzellinie von Mäuse-Fetalzellen (Swiss-Mäuse)
vorliegende E1-Zellen werden in mit 10% Pferdeserum
versetztem Eagle-MEM-Medium dispergiert und in eine
Kunststoffschale gebracht; nach 3 bis 4 Tage dauernder
Kultivierung bei 37°C zur Erzeugung einer Monoschicht
von Zellen wird das Medium entfernt und mit phosphat
gepufferter Dulbecco-Salzlösung (im folgenden als
PBS⊖ abgekürzt) drei- bis viermal gewaschen; danach
wird nicht mit Serum versetztes Eagle-MEM-Medium zu
gegeben und 3 bis 4 Tage bei 37°C weiterkultiviert. Es
ist bekannt, daß die so erhaltene Kulturflüssigkeit
eine Substanz enthält, die zur Wiederherstellung nor
maler Funktionen bei schlechtdifferenzierten myelogenen
Leukämiezellen von Mäusen zur Differenzierung und Rei
fung von Granulocyten und Makrophagen in der Lage ist.
Der Wirkstoff wird durch Ultrafiltration mit Diaflo-
Membranen, Säulenchromatographie an Hydroxylapatit, an
DEAE-Cellulose sowie anschließend an Sephadex G-150
in der angegebenen Reihenfolge zu einem elektrophoretisch
einheitlichen Protein gereinigt. Es ist bekannt, daß
diese Substanz ein Protein mit einem Molekulargewicht
von etwa 68 000 darstellt, das ein Cystin, Cystein,
keine Hexosamine und Zucker enthält und durch Pronase
behandlung inaktiviert wird.
Die genannten herkömmlichen Verfahren weisen jedoch
folgende Nachteile auf.
Das Verfahren nach Ichikawa et al. hat den Nachteil,
daß die Wirkung der Kulturflüssigkeit auf die Wiederher
stellung normaler Funktionen bei schlechtdifferenzier
ten leukämischen Zellen je nach Art des dem Medium zuge
setzten Tierserums bzw. je nach Ansatz des von der gleichen
Tierart stammenden Serums um etwa den Faktor 4 schwankt
(vgl. Experimental Research 90 [1975] 20).
Das Verfahren nach Sachs et al. ist vom Ergebnis
her nur dann spezifisch, wenn als Reinkultur vorliegende
E1-Zellen eingesetzt werden. Aufgrund von Untersuchun
gen der Erfinder an verschiedenen in Reinkultur vorlie
genden Zellen wurden allerdings in derartigen Kultur
flüssigkeiten im Gegensatz von der von Sachs et al.
vertretenen Auffassung keinerlei Substanzen mit einer
die normale Funktion von Zellen wiederherstellenden Wir
kung aufgefunden.
In jüngster Zeit berichteten Maeda et al., daß eine
Kulturflüssigkeit mit einer Substanz, die bei schlecht
differenzierten leukämischen Zellen in hoher Konzentration
eine die normale Funktion wiederherstellende Wirkung auf
weist, durch Kultivieren tierischer Fetalzellen in einem
zur Verbesserung der herkömmlichen Verfahren anstelle von
Säugerserum mit Rinderserumalbumin versetzten Medium er
hältlich sind (vgl. The description of the 34th General
Meeting of the Cancer Society of Japan, p. 127. 1975).
Ichikawa et al. berichteten ferner, daß eine Kulturflüs
sigkeit derselben Wirksamkeit durch Kultivieren mensch
licher Fetalzellen in einem mit Kälberserum versetzten
Medium erhalten werden kann (vgl. Gann. 64, 3 [1973]
257-63). Diese Verfahren verwenden allerdings tierische
und nicht menschliche Zellen oder menschliche Fetalzellen
und Serum oder Serumalbumin von Tieren und nicht von Men
schen. Bei der Verabreichung von Medikamenten, die eine
nach diesem Verfahren erhaltene Kulturflüssigkeit enthal
ten, an Menschen treten entsprechend aufgrund der Anwe
senheit von tierischem Serum oder Serumalbumin Antigen-
Antikörper-Reaktionen auf, so daß derartige Medikamente
nicht praktisch verwendbar sind. Es ist ferner aus ethi
scher bzw. moralischer Sicht sowie im Hinblick auf die
öffentliche Meinung abträglich, hierfür menschliche
Fetalzellen zu verwenden. Die genannten herkömmlichen
Verfahren können entsprechend nicht industriell ange
wandt werden. Dementsprechend liegen bisher keine Mit
tel zur Behandlung der myeloischen Leukämie vor, die
eine Zellkultur enthalten, die bedenkenlos an Menschen
verabreicht werden kann.
Der Erfindung liegen Untersuchungen zur Herstel
lung eines Mittels zur Behandlung der myeloischen
Leukämie zugrunde, das keine Antigen-Antikörper-Reaktion
hervorruft, die bei den bisherigen Verfahren das bei weitem
gravierendste Problem darstellt; dabei wurde festgestellt,
daß eine durch Kultivieren menschlicher Amnionzellen er
haltene Kulturflüssigkeit, die bisher noch nie zur Her
stellung von Mitteln zur Behandlung der myeloischen Leu
kämie herangezogen worden war und in einem Humanserum
albumin enthaltenden Medium leicht zugänglich ist, eine
die normalen Funktionen wiederherstellende Wirkung gegen
über schlechtdifferenzierten myelogenen leukämischen
Zellen aufweist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel
gegen myeloische Leukämie und sein Herstellungsverfahren
anzugeben, nach dem das Mittel leicht und in hoher Konzen
tration zugänglich ist, das nicht zum Auftreten von Anti
gen-Antikörper-Reaktionen bei der Verabreichung an Men
schen führt und bei myelogenen leukämischen Zellen in
spezifischer Weise auf die Wiederherstellung normaler
Funktionen hin wirkt.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung der myeloischen
Leukämie wird gemäß der Erfindung nach folgendem Ver
fahren hergestellt:
- (1) Vorkultivieren menschlicher Amnionzellen, die durch Trypsinbehandlung aus menschlichem Amnion oder durch mindestens einmaliges Subkultivieren isolierter Amnion zellen erhalten wurden, in einem Kälberserum oder Rinderfetalserum enthaltenden ersten Medium während 1 bis 5 Ta gen zur Erzeugung einer Monoschicht,
- (2) Entfernen des ersten Mediums,
- (3) Zusatz eines 0,5 bis 20 mg/ml Humanserumalbumin enthaltenden zweiten Mediums, zu der Monoschicht,
- (4) Kultivieren während 3 bis 6 Tagen,
- (5) Dialysieren gegen verdünnten Puffer oder Wasser und
- (6) Sterilfiltrieren der so erhaltenen dialysierten Kultur flüssigkeit unter aseptischen Bedingungen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand einer bevor
zugten Ausführungsweise näher erläutert.
Das erfindungsgemäß verwendete Amnion wird von der
Placenta einer Frau gewonnen, die in normaler Weise oder
durch Kaiserschnitt von einem Kind entbunden wurde;
das Amnion wird in eine 0,3% (G/V) Penicillin enthalten
de sterilisierte Hanks-Lösung eingebracht und bis zum
Beginn der Herstellung des Mittels bei 4°C aufbewahrt.
Ein von einer Placenta einer Frau gewonnenes Amnion,
die normal entbunden wurde, kann mit einer antiseptischen
Lösung zur Sterilisation beim Durchtritt des Kindes wäh
rend des Geburtsvorgangs kontaminiert sein, so daß die
Gefahr besteht, daß die Herstellung des erfindungsgemäßen
Mittels hierdurch ungünstig beeinflußt wird; es ist ent
sprechend wünschenswert, ein von der Placenta einer Frau
gewonnenes Amnion einzusetzen, die wenn möglich durch
Kaiserschnitt entbunden wurde. Das von der Placenta ab
geschnittene Amnion wird wünschenswerterweise zur Her
stellung des erfindungsgemäßen Mittels so rasch wie mög
lich verwendet. Auch bei Aufbewahrung bei niedrigen Tem
peraturen sterben die Amnionzellen innerhalb 24 h nach
der Gewinnung ab. Das erhaltene Amnion wird unter asepti
schen Bedingungen mit einer sterilisierten PBS⊖-Lösung
und einem sterilisierten Eagle-MEM-Medium
je zweimal gewaschen,
zu Stücken von etwa 5 × 5 cm zerschnitten, in eine Scha
le gebracht, dreimal mit Eagle-MEM-Medium gewaschen,
unter aseptischen Bedingungen mit einer Schere zerschnit
ten, mit einer wäßrigen, 0,25 Gew.-% Trypsin enthalten
den Lösung versetzt und unter aseptischen Bedingungen bei
Raumtemperatur 30 bis 60 min zur enzymatischen Behandlung
gerührt.
Anschließend wird ein 10 bis 20% Kälber- oder Rinder
fetalserum enthaltendes Eagle-MEM-Medium der durch Trypsin
abgebauten Lösung zur Verhinderung einer weiteren Trypsin
einwirkung zugesetzt und das Gemisch durch ein rostfreies
Stahlsieb von 0,1 bis 0,18 mm (80 bis 150 mesh) zur Entfernung
der Zellbestandteile unter aseptischen Bedingungen hin
durchpassiert.
Die so erhaltene Suspension von Amnionzellen wird
unter aseptischen Bedingungen bei 1000 U/min 10 min
zur Zellgewinnung zentrifugiert, die anschließend im
gleichen sterilisierten Eagle-MEM-Medium suspendiert
werden. Ein Teil der Suspension wird entnommen und darin
die Anzahl lebensfähiger Zellen nach dem nachstehend be
schriebenen Eosin-Färbeverfahren ermittelt; die Amnion
zellen werden darauf in einem sterilisierten Eagle-MEM-
Medium im Bereich von jeweils 5 · 106-107 pro 10 ml
Medium eingeimpft. Eine Eosin-Lösung von in PBS⊖ mit
einer Konzentration von 0,5% (G/V) gelöstem Eosin-Y-
Pulver und die Zellsuspension werden im gleichen Mengen
verhältnis gemischt. Ein Tropfen des Gemischs wird auf
ein Hämacytometer getropft und mikroskopisch untersucht.
Auf diese Weise wird die Anzahl lebensfähiger Zellen
durch Ermittlung der rotgefärbten Zellen als tote Zellen
und der nicht gefärbten Zellen als lebende Zellen bestimmt.
Das beim erfindungsgemäßen Verfahren zum Vorkulti
vieren bzw. der Bildung der Monoschicht eingesetzte Medium
wird durch Zusatz von 10 bis 20% Kälberserum (innerhalb
einer Woche nach Geburt) oder Rinderfetalserum zu einem
(im folgenden als EM-Medium bezeichneten) Medium herge
stellt, das durch Zusatz von MEM-Aminosäure-Vitaminmedium
zu Eagle-MEM-
Medium in der Weise hergestellt wurde, daß der Aminosäure
gehalt und der Vitamingehalt zweifach höher liegen als die
Menge an Eagle-MEM-Medium.
Obgleich zur Kultur der isolierten Amnionzellen
Schalen verwendet werden können, ist die Verwendung
eines größeren Zellkulturgefäßes
zur Erzeugung größerer Mengen des erfindungs
gemäßen Mittels wünschenswert. Dieser Reaktor ist mit
einem spiralförmigen Kunststoffilm versehen, an dem
die Zellen innerhalb eines Zylinders haften.
Die wie oben isolierten menschlichen Amnionzellen
werden in ein Medium von 10 ml pro Schale geimpft
und in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß bei 37°C und
100% relativer Feuchte kultiviert. Nach 3 bis 4 Tagen
wird das Medium zur Entfernung aufschwimmender abgestor
bener Zellen und Erythrocyten gegen ein frisches Medium
ausgetauscht. Die Zellen werden unter denselben Bedingun
gen noch einige Tage weiterkultiviert, bis sie an der
Bodenfläche der Schalen unter Bildung einer Monoschicht
anhaften. Auf diese Weise werden Primärkulturzellen er
halten. Die Primärkulturzellen können zur Herstellung des
erfindungsgemäßen Mittels herangezogen werden.
Nach Erhalt der Primärkulturzellen wird das Medium
entfernt, worauf die Zellen mit PBS⊖-Lösung gewaschen
und von der Bodenfläche der Schale durch Zusatz einer
0,05gew.-%igen wäßrigen Trypsinlösung abgelöst werden.
An den Zellen wird in derselben Weise wie oben nach dem
Eosin-Färbeverfahren die Anzahl lebender Zellen bestimmt;
es wird mit EM-Medium auf eine Zellkonzentration von je
weils etwa 5 · 105 bis etwa 106 pro ml verdünnt; die Zellen
werden anschließend zusammen mit EM-Medium, das mit
Kälberserum oder Rinderfetalserum versetzt ist, in
eine Kunststoffschale gebracht und darin in dergleichen
Weise kultiviert, worauf Sekundärkulturzellen erhalten
werden. Die Sekundärkulturzellen können zur Herstellung
des erfindungsgemäßen Mittels verwendet werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es wünschens
wert, das Mittel unter Verwendung von sekundären mensch
lichen Amnionzellen herzustellen, die in der angegebenen
Weise mindestens einmal nach einem herkömmlichen Verfah
ren subkultiviert wurden. Die Subkulturschritte werden
zur Erzielung von Amnionzellen durchgeführt, die keine
unnötigen Bestandteile wie abgestorbene Zellen und Erythro
cyten enthalten. Wenn die Menge der sekundären mensch
lichen Amnionzellen ferner so gering ist, daß sie nicht
in großer Menge kultiviert werden können, werden eine
oder mehrere Subkulturen zur Erhöhung der Zellzahl wieder
holt, wobei die Zellen der tertiären und weiteren Kultu
ren zur Herstellung des Mittels verwendet werden können.
In einem derartigen Fall wird allerdings die Zellvermeh
rung allmählich mit zunehmender Wiederholung der Subkulti
vierung unterdrückt; dabei wurde festgestellt, daß aus
morphologisch veränderten und immer weiter vermehrten
Zellen keine Substanz mehr gewonnen werden kann, die eine
die normalen Zellfunktionen bei schlechtdifferenzierten
leukämischen Zellen wiederherstellende Wirkung aufweist;
die Subkultivierung ist entsprechend auf etwa 15 Wieder
holungen begrenzt.
Die oben beschriebenen isolierten oder subkultivierten
menschlichen Amnionzellen werden in ein mit demgleichen
Serum wie oben versetztes EM-Medium in einer Menge von
jeweils 5 · 106 bis etwa 107 pro 10 ml Medium eingeimpft und
in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß 1 bis 5 Tage bei 37°C
kultiviert, wobei die Zellen an der Bodenfläche der
Schale haften. Anschließend wird das Medium entfernt,
worauf die Zellen zur vollständigen Entfernung des Serums
zur Beendigung der Vorkultur dreimal mit PBS⊖-Lösung
gewaschen werden. Die Vorkultur wird dabei mit der Ab
sicht durchgeführt, daß die menschlichen Amnionzellen
an der Bodenfläche der Schale haften, wobei nicht ange
strebt ist, eine Kulturflüssigkeit zu erhalten. Die Vor
kulturzeit wurde durch den nachstehend beschriebenen
Test 1 bestimmt.
Von Ichikawa et al. aus dem Knochenmark von S-Mäu
sen mit spontaner myeloblastischer Leukämie reinkulti
vierte M1-Zellen stellen eine Zellinie dar, die myelo
blastische leukämische Zellen enthält, die ihre Vermeh
rung in Medium unter gewöhnlichen Kulturbedingungen wiederholen,
da sie sich in ihrem undifferenzierten Zustand
befinden. Wenn sich allerdings die M1-Zellen bei Zusatz
eines Mittels, das im Sinne einer Wiederherstellung der
normalen Funktionen myelogener Zellen gegenüber leukämi
schen Zellen (M1-Zellen) wirkt, und anschließende Zell
kultur zu Granulocyten oder Makrophagen mit Mobilität
und Phagocytosewirkung differenzieren, ist das entspre
chende Mittel zur Behandlung der myeloischen Leukämie
wirksam.
Von den Erfindern wurde die Phagocytosewirkung
von M1-Zellen untersucht, die mit dem erfindungsgemäßen
Produkt bzw. dem Produkt aus der erfindungsgemäßen Kulti
vierung versetzt worden waren. Dabei wurden in dergleichen
Weise wie in Beispiel 1 fünf Probenarten hergestellt, die
sich darin unterschieden, daß 0, 1, 3, 5 und 7 Tage vor
kultiviert wurde.
Die Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels auf die
Phagocytosewirkung wurde an diesen Proben wie folgt be
stimmt:
Zunächst wurde ein Medium durch Zusatz von 10% Käl
berserum zu EM-Medium hergestellt. Je 5 ml der Testmedien,
die durch Zusatz von jeder der oben beschriebenen Proben
zu dem Medium zu einer Konzentration von 25 Vol.-% herge
stellt worden waren, sowie das nicht mit der Probe ver
setzte Medium (Kontrollversuch 1) wurden mit M1-Zellen
in einer Konzentration von jeweils 5 · 105 geimpft und
in Kunststoffschalen von 6 cm Durchmesser in einem Kohlen
dioxid-Kulturgefäß 3 Tage bei 37°C kultiviert. Nach der
Kultivierung wurden die Zellen mit einem Gummiwischer ge
sammelt, worauf in jedem Medium die Zahl lebensfähiger
Zellen nach dem oben beschriebenen Eosin-Färbeverfahren
bestimmt wurde. Nach der Abtrennung des Mediums durch
Zentrifugieren wurden die von jeder Probe gewonnenen Zel
len getrennt in 2 ml EM-Medium suspendiert, das keinen
Serumzusatz enthielt und mit einer wäßrigen Suspension
von Polystyrollatex mit einem Partikeldurchmesser von
1 µm in einem Verhältnis von 1 Tropfen auf 20 ml Medium
versetzt worden war. Nach 4stündigem Stehenlassen bei
37°C wurden die Zellen zum Auswaschen von nicht durch
die Zellen phagocytierten Teilchen und auf der
Zelloberfläche anhaftender Partikel mit PBS⊖ gewaschen.
Anschließend wurde ein Tropfen der Zellsuspension auf
ein Hämocytometer aufgetropft und ferner ein Tropfen
der Eosin-Lösung zugesetzt; die Gesamtzahl der lebens
fähigen Zellen und die Zahl der Polystyrollatex-Partikel
enthaltenden Zellen wurde mikroskopisch ermittelt. Der
Prozentsatz der Polystyrollatex-Partikel enthaltenden
Zellen bezogen auf die Gesamtzahl der lebensfähigen
Zellen liefert bei der Berechnung entsprechend die
Phagocytosewirkung der Zellen zum Vergleich der Wirkung
des erfindungsgemäßen Mittels. Die erhaltenen Ergebnisse
sind in der Tabelle 1 aufgeführt.
Bei der Probe, bei der keine Vorkultur durchgeführt
wurde, haften fast keine Zellen an der Bodenfläche der
Schale; die Zellen bleiben in der Kulturflüssigkeit suspen
diert; sie weisen ferner nur geringe Phagocytosewirkung
auf. Bei der Probe, die über mehr als 5 Tage vorkulti
viert und ferner 4 Tage in einem mit Serumalbumin ver
setzten Medium weiterkultiviert war, wurde, obgleich
kaum eine Verringerung der Phagocytosewirkung festge
stellt wurde, beobachtet, daß sich die Zellen von der
Bodenfläche der Schale ablösten und eine Suspension bilde
ten, wobei Zellzerstörung auftrat und die intra
cellulären Bestandteile in die Kulturflüssigkeit hinein
eluiert wurden, weshalb die Probe zur Herstellung des
erfindungsgemäßen Mittels ungeeignet war.
Aus den oben angeführten Testergebnissen geht her
vor, daß eine Dauer von 1 Tag für das Vorkultivieren aus
reichend ist; falls sich jedoch eine Monoschicht nur
schwierig bildet, kann die Vorkultivierung bis zu 5 Tage
lang durchgeführt werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird EM-Medium, das
Humanserumalbumin in einer Menge von 0,5 bis 20 mg/ml ent
hält, zu menschlichen Amnionzellen zugegeben, deren Vor
kultivierung wie oben beschrieben beendet ist und die eine
Monoschicht bilden; die menschlichen Amnionzellen werden
in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß 2 bis 6 Tage bei 37°C
kultiviert, wobei eine Kulturflüssigkeit erhalten wird.
Die Menge an dem Medium zugesetztem Humanserumalbumin
sowie die Dauer der Kultivierung in Tagen wurden anhand
der Tests 2 und 3 ermittelt.
Es wurden sieben Arten von Proben in der gleichen Weise
wie in Beispiel 1 mit dem Unterschied hergestellt, daß
die Menge an dem Medium zugesetztem Humanserumalbumin
0 mg (Kontrollversuch 2), 0,25 mg, 0,5 mg, 1 mg, 5 mg,
20 mg und 40 mg pro ml Medium betrug. Die Phagocytose
wirkung der M1-Zellen wurde an diesen Proben nach den
gleichen Verfahren wie in Test 1 gemessen, wobei die Wir
kung des erfindungsgemäßen Mittels in Abhängigkeit von
der zugesetzten Menge an Serumalbumin untersucht wurde.
Daneben wurde als Kontrollversuch 1 eine Probe ver
wendet, die nicht mit der wie bei
Kontrollversuch 1 von Test 1 hergestellten Kulturflüssig
keit versetzt war. Die erhaltenen Ergebnisse sind in
der Tabelle 2 aufgeführt.
Bei dem Kontrollversuch 1 und einer Probe (Kontroll
versuch 2), die ohne Zusatz von Serumalbumin kultiviert
wurde, wurde keine Phagocytosewirkung festgestellt. Fer
ner ergab sich, daß eine unter Zusatz von 0,25 mg/ml
Humanserumalbumin kultivierte Probe eine niedrige Phago
cytosewirkung aufwies. In einer mit 40 mg/ml kultivier
ten Probe waren die Zellen zerstört und die Zellinhalts
stoffe ausgetreten; derartige Verhältnisse sind zur
Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels entsprechend
nicht günstig. Beim erfindungsgemäßen Verfahren beträgt
die günstige Menge an dem Medium zugesetztem Serumalbumin
entsprechend 0,5 bis 20 mg pro ml Medium.
Es wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 sechs
Arten von Proben mit dem Unterschied hergestellt, daß die
Amnionzellen nach einer Vorkultivierung von 1, 2, 3, 5, 6
und 8 Tagen kultiviert wurden. Die Phagocytosewirkung von
M1-Zellen wurde an diesen Proben nach den gleichen Verfahren
wie in Test 1 zur Bestimmung der Wirksamkeit des Mittels
untersucht.
Daneben wurde eine wie in Kontroll
versuch 1 von Test 1 hergestellte und nicht mit der Kultur
flüssigkeit versetzte Probe als Kontrollversuch 1 verwen
det.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 auf
geführt.
Eine nur 1 Tag lang kultivierte Probe weist nur
geringe Phagocytosewirkung auf. Auf der anderen Seite
zeigen durch 8tägiges Kultivieren erhaltene Proben
zwar eine hohe Phagocytoseaktivität, jedoch zugleich
auch den Befund, daß sich menschliche Amnionzellen von
der Bodenfläche der Schale als Schicht ablösen und zer
stört werden; es ist daher nicht günstig, die Kultur
flüssigkeit von derartigen Proben zur Herstellung des
erfindungsgemäßen Mittels einzusetzen.
Die geeignete Kulturdauer beträgt erfindungsgemäß
entsprechend etwa 2 bis 6 Tage; zur Verkürzung der Kultur
dauer ist eine Kultivierungszeit von 3 Tagen besonders
günstig.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die wie oben
beschrieben hergestellte Kulturflüssigkeit zur Entfernung
der Bestandteile des Mediums gegen PBS⊖ dialysiert, keim
frei filtriert und unter aseptischen Bedingungen zur direk
ten Verwendung als flüssiges Mittel in Gefäße abgefüllt.
Das durch Dialyse der Kulturflüssigkeit gegen verdünntes
PBS⊖ erhaltene dialysierte Kulturmedium kann keimfrei
filtriert und zur Gewinnung eines pulverförmigen Mittels
weiter unter aseptischen Bedingungen lyophilisiert werden.
Die Kulturflüssigkeit kann ferner auch ultrafiltriert
werden, wobei eine Fraktion mit einem Protein von 30 000 bis
100 000 Molekulargewicht als Hauptbestandteil erhalten
wird; die Fraktion kann zur Verwendung als flüssiges Mit
tel keimfrei filtriert oder zur Verwendung als Mittel
in Pulverform gefriergetrocknet werden. Das pulverför
mige Mittel wird zur Verwendung für Injektionszwecke
geeigneterweise in sterilem Wasser, sterilisierter
physiologischer Salzlösung, Dextroselösung o. dgl. ge
löst. Das erfindungsgemäße flüssige Mittel kann ferner
auch in der vorliegenden Form selbst zur Injektion ver
wendet werden.
Das erfindungsgemäß hergestellte Mittel wird den
Patienten i. v. in einer Dosierung von 13-640 mg/kg
Körpergewicht pro Tag durch Injektion verabreicht; die
Dosierung beruht dabei auf den in Test 5 angegebenen
Ergebnissen von Tierversuchen an Mäusen.
Es wurde geprüft, ob Mäuse, die mit dem erfindungs
gemäßen, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen
Mittel behandelt worden waren, nach der Transplantation
von M1-Zellen an myeloischer Leukämie erkranken oder
nicht.
Durch Zusatz der wie in Beispiel 1
erhaltenen Kulturflüssigkeit in einer Menge von 6,25 Vol.-%,
12,5 Vol.-% und 25 Vol.-% zu EM-Medium wurden drei Arten
von Medien hergestellt, ferner ein nicht mit der Kultur
flüssigkeit versetztes EM-Medium (Kontrollversuch). Auf
jede der vier Arten von Medien wurden M1-Zellen in einer
Menge von 3 · 105/ml Medium eingeimpft und in einem Kohlen
dioxidgefäß 3 Tage bei 37°C kultiviert. Nach der Kulti
vierung wurde ein Teil der M1-Zellen zur Untersuchung
der Phagocytosewirkung in derselben Weise wie in Test 1
entnommen. Die verbliebenen M1-Zellen wurden zweimal
mit PBS⊖ gewaschen, worauf die Zahl der lebensfähigen
Zellen nach dem oben beschriebenen Eosin-Färbeverfahren
ermittelt wurde; anschließend wurden die Zellen in einer
Menge von 1 · 105/ml, 1 · 10⁶/ml und 1 · 107/ml zur Her
stellung von M1-Zellsuspensionen in PBS⊖ suspendiert.
44 6 Wochen alte SL-Mäuse wurden in 11 Gruppen von
jeweils 4 Mäusen aufgeteilt; jeder Maus wurde 0,1 ml der
obigen M1-Zellsuspension einmal über die Schwanzvene in
jiziert. Die Mäuse wurden 1 Monat mit Wasser und Nahrung,
die frei zur
Verfügung stand, aufgezogen. Zur Untersuchung der de
carcinogenen Wirkung des Mittels auf M1-Zellen wurden
die Mäuse im Anschluß daran getötet und zerlegt, um festzustellen,
ob ein Ausbrechen myeloischer Leukämie am Zustand der
Vergrößerung der Lymphknoten und der Milz nachgewiesen
werden konnte.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 an
gegeben.
Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, nimmt die Anzahl der
an Leukämie erkrankten Tiere mit steigender Konzentration
des einem M1-Zellen-Kulturmedium zugesetzten Mittels ab.
Insbesondere wenn die Kulturflüssigkeit in einer Konzen
tration <12,5% zugesetzt wird, fällt die Anzahl der
erkrankten Tiere im Vergleich mit dem Kontollversuch
bemerkenswert ab.
Daraus geht hervor, daß die Funktion der M1-Zellen
durch ihre Kultivierung in einem mit dem erfindungsgemäßen
Mittel in einer Menge <12,5% versetztem Medium normali
siert wurde.
Zur Untersuchung der Wirkung in Fällen, in denen das
erfindungsgemäße Mittel an SL-Mäusen durch Injektion ver
abreicht wurde, die durch vorherige Transplantation von
M1-Zellen an myeloischer Leukämie litten, wurden ferner
die im folgenden angegebenen Tierversuche durchgeführt.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene
Mittel enthält hochmolekulare Proteine; wenn dieses Mit
tel infolgedessen Tieren injiziert wird, kommt es zu
einer Antigen-Antikörper-Reaktion, so daß die Mittel nicht
wiederholt verabreicht und die Wirkung entsprechend nicht
geprüft werden kann. Aus diesem Grund wurden in gleicher
Weise wie gemäß der Erfindung Mittel für Tierversuche un
ter Verwendung von Zellen und Serumalbumin der gleichen Tier
art hergestellt, die in den Versuchen verwendet wurde,
worauf die Tiere damit getestet wurden. Das für dieses
Experiment herangezogene Mittel wurde entsprechend durch
Kultivieren von Mäusefetalzellen in einem mit Mäuseserum
albumin versetzten Medium hergestellt und Mäusen zur Be
stimmung der akuten Toxizität sowie der zu verabreichen
den wirksamen Dosis injiziert.
Da sich das in dieser Weise aus Mäusefetalzellen er
haltene Mittel für die entsprechenden Tierversuche hin
sichtlich der Phagocytosewirkung aufgrund des Tests
wie in Test 1 als dem erfindungsgemäß erhaltenen Mittel
äquivalent erwies, wird angenommen, daß die aus den Tier
versuchen in dieser Weise erhaltene akute Toxizität und
wirksame Dosis auf das zur Behandlung von Menschen vor
gesehene erfindungsgemäße Mittel übertragen werden können
und entsprechend gleiche Werte gelten.
3 SL-Mäusen wurden am 14. Tag der Trächtigkeit 26 Feten
unter aseptischen Bedingungen entnommen und unter asepti
schen Bedingungen mit der Schere zerschnitten; anschließend
wurden 60 ml einer wäßrigen Trypsinlösung in einer Konzen
tration von 0,25 Gew.-% zugesetzt, worauf zur Isolierung
der Fetalzellen etwa 15 min bei 37°C enzymatisch be
handelt wurde. Die Fetalzellen in einer Konzentration
von 2 · 106 wurden in jeweils 30 Schalen von 10 cm Durch
messer mit 10 ml sterilisiertem EM-Medium geimpft, das
in einer Konzentration von 10% mit Kälberserum versetzt
worden war, und
in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß 6 Tage kultiviert,
wobei das Medium zur Erzeugung einer Monoschicht primä
rer Fetalzellen jeden zweiten Tag ersetzt wurde. Danach
wurde das Medium abgetrennt und 1,5 ml einer wäßrigen,
0,05gew.-%igen Trypsinlösung pro Platte zugegeben, worauf
die Monoschicht zur Ablösung der Zellen 15 min bei 37°C
enzymatisch behandelt wurde. Die abgelösten Zellen wurden
in je 35 Kulturschalen von 15 cm Durchmesser, die 22,5 ml
desselben Mediums wie oben enthielten, in einer Menge von
2,25 · 106 pro Platte eingeimpft und unter gleichen Be
dingungen 48 h kultiviert. Anschließend wurde das Medium
in jeder Schale entfernt, worauf die Zellen dreimal mit
PBS⊖ gewaschen wurden. Anschließend wurden jeder Schale
22,5 ml EM-Medium zugesetzt, in dem Mäuseserumalbumin
(Fraktion V) in einer Konzen
tration von 1 mg/ml gelöst war, worauf 4 Tage in einem
Kohlendioxid-Kulturgefäß bei 37°C kultiviert wurde; von
den 35 Platten wurden etwa 780 ml einer Kulturflüssigkeit
erhalten, die einen Proteingehalt von 1,8 mg/ml aufwies.
Die Kulturflüssigkeit wurde unter Verwendung von
Diaflo-Ultrafiltrationsmembranen (Typ XM-100),
ultrafiltriert, wobei eine Fraktion mit einem Molekular
gewicht unter 100 000 erhalten wurde. Diese Fraktion
wurde unter Verwendung von Abcor-Ultrafiltrationsmembranen (Typ HFA-300),
ultrafiltriert, worauf
eine Fraktion mit einem Molekulargewicht über 50 000 er
halten wurde; nach der Gefriertrocknung ergab die Fraktion
etwa 600 ml eines weißen, pulverförmigen Mittels für Tier
versuche.
Das so erhaltene Mittel wurde zu einer Konzentration
von 10% in PBS⊖ gelöst und auf seine akute Toxizität
durch intraperitoneale Verabreichung nach dem Verfahren
von Lichfield und Wilcoxon (Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics 90 [1949] 99) geprüft.
Die akute Toxizität (LD50) des Mittels ergab sich so
zu 3200 mg/kg.
Aufgrund der so erhaltenen akuten Toxizität wurden
folgende Versuche zu Ermittlung der wirksamen Menge durch
geführt:
42 6 Wochen alten SL-Mäusen wurden jeweils 1 · 106
M1-Zellen intraperitoneal injiziert. Die Mäuse wurden
in sieben Gruppen zu je 6 Mäusen aufgeteilt. Die 6 Mäuse
der ersten Gruppe erhielten kontinuierlich 5 Tage vom
folgenden Tag ab 0,5 ml sterilisierte physiologische Salz
lösung pro Tag und Maus intraperitoneal injiziert; die
Mäuse der zweiten Gruppe erhielten 0,5 ml einer 0,001gew.-%igen
wäßrigen Lösung von Mitomycin C injiziert, das bisher als
Mittel zur Behandlung von Leukämie eingesetzt wird (die
Darreichungsmenge wurde im Tierversuch unter Verwendung
von Leukämiezellen L 1210 als wirksam angesehen), die
Mäuse der dritten bis siebenten Gruppe erhielten 0,5 ml
der wäßrigen Lösung des oben beschriebenen Mittels für
Tierversuche in einer Menge von 1/500, 1/250, 1/50, 1/5
bzw. 1/3 der akuttoxischen Menge injiziert. Die Mäuse
wurden dabei jeweils mit Wasser und frei zur Verfügung
stehendem Futter aufgezogen. Im Anschluß daran wurde
die mittlere Überlebensdauer in Tagen für jede Gruppe
von Mäusen berechnet und der Index jeder Gruppe für
100 mittlere Überlebenstage der Kontrollgruppe daraus
berechnet, um so die prozentuale Lebensdauerverlänge
rung zu bestimmen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 5
aufgeführt.
Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, zeigt die mit Mitomycin C
als im Handel erhältlichem Mittel zur Behandlung von Leukä
mie behandelte Gruppe eine gegenüber der Kontrollgruppe
um etwa 10% verlängerte Lebenszeit.
Im Gegensatz dazu liegt die prozentuale Verlängerung
der Lebenszeit bei den Gruppen, die mit dem Mittel für
Tierversuche behandelt wurden, das nach dem erfindungs
gemäßen Verfahren hergestellt war, ins
besondere bei der vierten bis sechsten Gruppe, bemerkens
wert höher.
Daraus geht hervor, daß die vierte bis sechste Gruppe
eine 1,2fach höhere Steigerung der prozentualen Lebens
dauer als die mit Mitomycin C behandelte zweite Gruppe
aufweist.
Die den Tieren der vierten bis sechsten Gruppe verab
reichte Menge des Mittels für Tierversuche, d. h. 13 bis 640 mg/kg
Körpergewicht und Tag, ist entsprechend eine wirksame Menge.
Bei den vorstehenden Tests 1 bis 4 wurde ferner ein
Mittel durch Impfen vorkultivierter menschlicher Amnion
zellen in ein Medium in einer Konzentration von 1 · 105/ml
hergestellt und getestet. Wenn die Mittel durch Impfen der
Zellen in anderen Konzentrationen hergestellt wurden, wur
den dieselben Ergebnisse wie in den Tests 1 bis 4 erzielt.
Aus den Placenten von drei durch Kaiserschnitt
entbundenen Frauen wurde jeweils das Amnion
herausgeschnitten und in sterilisierter Hanks-Flüssigkeit,
die Penicillin in einer Konzentration von 0,3% (G/V) ent
hielt, etwa 6 h bei 4°C aufbewahrt. Die Amnionen wurden
je zweimal mit sterilisierter PBS⊖-Lösung und Eagle-MEM-
Medium gewaschen, zu Stücken von etwa 5 × 5 cm zerschnit
ten, in eine Schale gebracht, dreimal mit sterilisiertem
EM-Medium gewaschen und unter aseptischen Bedingungen
mit der Schere zerschnitten; anschließend wurden 120 ml
einer wäßrigen Trypsinlösung in einer Konzentration von
0,25% (G/V) zugegeben, worauf zur Isolierung der Zel
len etwa 30 min bei 37°C enzymatisch behandelt wurde.
Zu der trypsinbehandelten Suspension wurde 10% Kälber
serum enthalten
des EM-Medium zugesetzt, worauf die Suspension zur Ab
trennung der Zellmasse unter aseptischen Bedingungen
durch Edelstahlsiebe von 0,18 und 0,1 mm (80 und 150 mesh)
passiert wurde.
Die suspendierten menschlichen Amnionzellen wurden
in einer Konzentration von 1 · 107 Zellen auf 30 Kunst
stoffschalen von 10 cm Durchmesser geimpft, die 10 ml
mit 10% Kälberserum versetztes sterilisiertes EM-Medium
enthielten, und zur Erzeugung einer Monoschicht primärer
menschlicher Amnionzellen in einem Kohlendioxidgefäß
10 Tage bei 37°C kultiviert, wobei das Medium jeden
3. Tag ersetzt wurde. Nach der Abtrennung des Mediums
wurden 1,5 ml einer 0,05%igen (G/V) wäßrigen Trypsin
lösung pro Platte zugesetzt und die Monoschicht zur Ab
lösung der Zellen 15 min bei 37°C enzymatisch behandelt.
Die abgelösten Zellen wurden in einer Menge von jeweils
2,25 · 107 auf 35 Kulturschalen von 15 cm Durchmesser
geimpft, die 22,5 ml des oben beschriebenen Mediums ent
hielten, und unter den beschriebenen Bedingungen 3 Tage
kultiviert; nach der Entfernung des Mediums wurde die
kultivierte Monoschicht dreimal mit PBS⊖ gewaschen.
Anschließend wurden 22,5 ml EM-Medium, das
Humanserumalbumin
in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst enthielt, pro
Platte zugegeben, worauf 4 Tage in einem Kohlendioxid-
Kulturgefäß bei 37°C kultiviert wurde; danach wurden
aus den 35 Schalen 780 ml Kulturflüssigkeit erhalten,
die 1,8 mg Protein/ml enthielt.
Die Kulturflüssigkeit wurde zur Entfernung der Mediums
bestandteile gegen PBS⊖ dialysiert. Die obige Kultur
flüssigkeit wurde im Anschluß daran unter Verwendung
eines
0,45-µm-Membranfilters,
das 15 min
im Autoklaven bei 120°C sterilisiert worden war, unter
aseptischen Bedingungen mit Hilfe einer Vakuumpumpe sterilfil
triert. Je 350 ml des aseptischen Filtrats wurden in eine
sterilisierte gläserne 500-ml-Infusionsflasche ge
geben und verschlossen, worauf zwei flüssige Mittel
zur Infusion erhalten wurden.
Wie in Beispiel 1 mit Trypsin
behandelte und abgelöste sekundäre menschliche Amnion
zellen wurden auf sterilisiertes EM-Medium geimpft, das
10% Kälberserum enthielt, wobei die Menge 108 Zel
len/l Medium betrug. Die Kulturflüssigkeit wurde in
einer Menge von 1,6 l pro Gefäß in 5 große Zellkultur
gefäße eingebracht und im
Anschluß daran unter gleichen Bedingungen wie in Bei
spiel 1 3 Tage unter Rotation der zylindrischen Gefäße
mit 2 U/h vorkultiviert; nach der Entfernung des Mediums
wurde die Vorkultur dreimal mit 400 ml PBS⊖ gewaschen,
pro Kulturgefäß mit 18 l sterilisiertem EM-Medium ver
setzt, in dem Humanserumalbumin (Fraktion V),
in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst
war, und 4 Tage bei 37°C in einem Kohlendioxid-Kultur
gefäß kultiviert, worauf aus fünf großen Zellkulturge
fäßen insgesamt 9 l Kulturflüssigkeit gewonnen wurden,
die einen Proteingehalt von 2,0 mg/ml aufwies. Die
Kulturflüssigkeit wurde in einen Dialysierbeutel
eingebracht und in einem mit 100 l 50fach ver
dünnter PBS⊖-Lösung gefüllten Metallgefäß unter Kühlung
auf 4°C 12 h dialysiert, worauf anschließend in gleicher
Weise 12 h gegen 100 l 8,7fach verdünnter PBS⊖-Lö
sung dialysiert wurde; das dialysierte Kulturmedium wurde
schließlich gefriergetrocknet, worauf 21 g eines weißen
Pulvers erhalten wurden. 20,6 g des Pulvers wurden in 1 l
bidestilliertem Wasser gelöst und
wie in Beispiel 1 keimfrei filtriert, anschschließend
unter aseptischen Bedingungen auf 20 Ampullen aufgeteilt
und verschlossen. Jede Ampulle enthielt 50 ml injizier
bares Mittel, das gegenüber physiologischer Salzlösung
isotonisch war.
Wie in Beispiel 1 erhaltene se
kundäre menschliche Amnionzellen wurden zu tertiären
menschlichen Amnionzellen weiter subkultiviert, die da
rauf in acht großen Zellkulturgefäßen in gleicher Wei
se wie in Beispiel 2 kultiviert wurden, wodurch etwa
14 l Kulturflüssigkeit erhalten wurden. Die Kulturflüssig
keit wurde wie in Beispiel 1 dialysiert
mit dem Unterschied, daß 30fach bzw. 8
fach verdünntes PBS⊖ verwendet wurde. Das so erhaltene
dialysierte Kulturmedium wurde wie
in Beispiel 1 keimfrei filtriert sowie ferner unter
aseptischen Bedingungen in herkömmlicher Weise lyophili
siert, worauf etwa 33,2 g eines weißen Pulvers erhalten
wurden. 1,0 kg dieses Pulvers wurden unter aseptischen
Bedingungen auf 33 Ampullen aufgeteilt und verschlossen.
Zur Verwendung wurde das Mittel in 50 ml sterilem, bi
destilliertem Wasser gelöst.
Etwa 14 l einer wie in Beispiel 3 erhaltenen
Kulturflüssigkeit von menschlichen
Amnionzellen,
wurden unter Verwendung von Diaflo-Ultrafiltrationsmem
branen (Typ XM-100) zur Ab
trennung einer Fraktion mit einem Molekulargewicht unter
100 000 ultrafiltriert, worauf die Fraktion mit Abcor-Ultrafiltrations
membranen (Typ HFA-300)
nochmals ultrafiltriert und zugleich aufkonzentriert wurde;
dabei wurden etwa 300 ml einer Fraktion mit einem Mole
kulargewicht über 50 000 erhalten. Die so erhaltene
Fraktion wurde wie in Beispiel 1
keimfrei filtriert, worauf je 12 ml des Filtrats unter
aseptischen Bedingungen in 25 Ampullen eingebracht und
unter aseptischen Bedingungen gefriergetrocknet wurden; danach
wurden die Ampullen verschlossen. Jede Ampulle
enthielt 640 mg des weißen Pulvers. Zur Verwendung wurde
das Mittel in 20 ml sterilisierter PBS⊖-Lösung gelöst.
Claims (4)
1. Mittel zur Behandlung der myeloischen Leukämie, das
erhalten worden ist durch
- a) Vorkultivieren fetaler Zellen, die durch Trypsin behandlung oder durch Subkultivieren fetaler Zellen in einem Serum enthaltenden Medium er halten wurden, während 1 bis 5 Tagen zur Er zeugung einer Monoschicht,
- b) Entfernen des Mediums,
- c) Zusatz eines Serumalbumin enthaltenden Mediums,
- d) Kultivieren während 3 bis 6 Tagen,
- e) Dialysieren gegen verdünnten Pfeffer oder Wasser und
- f) Sterilfiltrieren der so erhaltenen dialysierten Kulturflüssigkeit,
erhältlich durch
Verwendung von
- - menschlichen Amnionzellen als fetale Zellen
und von Kälber- oder Rinderfetalserum als
Serum in Schritt a)
und
- Humanserumalbumin als Serumalbumin in einer Menge von 0,5 bis 20 mg/ml in Schritt c).
2. Verfahren zur Herstellung des Mittels nach Anspruch 1
durch
- a) Vorkultivieren fetaler Zellen, die durch Trypsinbe handlung oder durch Subkultivieren fetaler Zellen in einem Serum enthaltenden Medium erhalten wurden, während 1 bis 5 Tagen zur Erzeugung einer Mono schicht,
- b) Entfernen des Mediums,
- c) Zusatz eines Serumalbumin enthaltenden Mediums,
- d) Kultivieren während 3 bis 6 Tagen,
- e) Dialysieren gegen verdünnten Pfeffer oder Wasser und
- f) Sterilfiltrieren der so erhaltenen dialysierten Kulturflüssigkeit,
gekennzeichnet durch
Verwendung von
- - menschlichen Amnionzellen als fetale Zellen und
von Kälber- oder Rinderfetalserum als Serum
in Schritt a)
und
- Humanserumalbumin als Serumalbumin in einer Menge von 0,5 bis 20 mg/ml in Schritt c).
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