DE1442134B2

DE1442134B2 - In vivo antikoagulierend wirkendes und defibrinierendes Enzym

Info

Publication number: DE1442134B2
Application number: DE1442134A
Authority: DE
Inventors: Michael Peter Oxford Esnouf; Hugh Alistair Liverpool Reid
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: National Research Development Corp UK
Priority date: 1964-02-21
Filing date: 1965-02-18
Publication date: 1974-04-25
Also published as: NO119903B; DE1442134A1; DK114995B; BR6567297D0; DE1442134C3; SE336198B; FR4655M; BE659856A; ES309630A1; AT266313B; US3657416A; GB1094301A; NL6502120A; CH453580A; NL139231B

Description

a) seine biologische Aktivität thrombinartig, d. h. Fibrin mit bündelartigem Charakter erzeugend, ist, daß es in vivo jedoch nicht proteolytisch wirkt und daß seine Wirkung in vivo rasch mittels eines spezifischen Antiserums gegen das Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma aufgehoben wird,

b) es an Di- oder Triäthylaminoäthylcellulose adsorbiert wird,

c) es in physiologischer Kochsalzlösung löslich ist.

d) es eine elektrophoretische Mobilität von 3,92 · ΙΟ"⁵ V/cm · see in einem 0,1 mol. Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,0 aufweist.

e) es ein Molekulargewicht, bei der Bestimmung in der Ultrazentrifuge, von etwa 38 000 bis etw? 40 000 hat,

f) es einen Sedimentationskoeffizienten S₂₀ W = 3,40 Svedberg aufweist,

g) es ein partielles spezifisches Volumen von 0,66 besitzt,

h) es bei der Immunelektrophorese gegen ein spezifisches Antiserum gegen das Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma nach dem Agar-Diffusionsverfahren zwei Präcipitatbanden ergibt,

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i) seine biologische Aktivität durch Diisopropylfluorphosphat in einer Konzentration von 10~³ Mol/l bei pH 8 und Zimmertemperatur innerhalb 5 Minuten nicht inhibiert wird und

j) daß es proteinartig und in reinem Zustand weitgehend farblos ist.

Die erwähnten Eigenschaften bzw. Parameter der erfindungsgemäßen neuen Substanz sind hinsichtlich ihrer elektrophoretischen Mobilität bestimmt worden nach der Methode, wie sie von L.G. Longsworth in »Electrophoresis«, Academic Press Inc., New York, 1959, S. 137, beschrieben ist, während das Molekulargewicht und der Sedimentationskoeffizient sowie das partielle spezifische Volumen gemäß den Angaben von H. K. Schachmann in »Methods in Enzymology«, Academic Press Inc., New York, 1957, Bd. 4, S. 32, ermittelt wurden und wobei die Hemmung durch Diisopropylfluorphosphat nach F. F. Jansen und A. K. Balls, J. Biol. Chem. 1952, 194, S. 721, bestimmt wurde.

Das neue in vivo antikoagulierend wirkende und defibrinierende Enzym aus dem Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma ist eine in physiologischer Kochsalzlösung lösliche proteinartige Substanz mit der genannten thrombinartigen Enzymaktivität, das aus dem Schlangengift in hochgereinigter Form, wie nachstehend beschrieben, gewonnen werden kann.

Die aktive Substanz übt rasch nach ihrer intravenösen Verabreichung eine defibrinierende Wirkung aus und verbleibt lange Zeit im Körper, z. B. bis zu 2 Wochen, im Gegensatz zu den bekannten Antikoagulantien der Heparingruppe. Andererseits kann ihre Wirkung in vivo rasch mittels eines spezifischen Antiserums gegen das Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma (Antitoxin) aufgehoben werden. Die Substanz ist nicht toxisch, bereits in sehr niedrigen Konzentrationen hochaktiv und führt zu keinen spontanen hämorrhagischen Komplikationen.

Im Gegensatz zu dem unter der Bezeichnung »Reptilase« bekannten thrombinartigen Mittel (Wiener Med. Wochenschrift, 1954, S. 833 und 834), welches aus dem Gift der Schlange Bothrops Atrox gewonnen wird und das die Blutgerinnung fördert, wird bei dem erfindungsgemäßen Mittel das Fibrinogen zwar ebenfalls in Fibrin umgewandelt, das jedoch dann in einer andersartigen Modifikation entsteht, die nicht zur Blutpfropfenbildung neigt. Auch ergeben Heparin, Dicumarol sowie das als »Reptilase« bekannte thrombinartige Mittel keine Präcipitatbanden, wenn man diese Substanzen bei der Immunelektrophorese mit dem spezifischen Antiserum gegen das Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma nach der Arbeitsweise, wie sie in Brit. J. Haemat., Vol. 13, S. 582, angegeben ist, einsetzt, während das erfindungsgemäße Mittel eine deutliche Präcipitation ergibt, wenn man diese Immunelektrophorese anwendet. Die Ursache für die zweite Bande, die insbesondere bei Reinigung an Triäthylaminoäthylcellulose beobachtet wurde, dürfte auf einer geringen Verunreinigung beruhen.

Das Enzym ist in seiner Wirkung hochspezifisch und scheint keine Wirkung auf andere Faktoren des Blutgerinnungsmechanismus als auf das Fibrinogen auszuüben. Infolge dieser Kombination von Eigenschaften ist die Substanz zur Behandlung von Thrombosen sehr geeignet, insbesondere in dem Zeitraum, in dem beim Patienten eine hohe Wahrscheinlichkeit für einen zweiten und möglicherweise fatalen Anfall besteht. Die reine Substanz bleibt bei —20° C sehr lange stabil, so daß sie in der ärztlichen Praxis und in Kliniken vorrätig gehalten werden kann.

Dies antikoagulierend wirkende Enzym kann erfindungsgemäß dadurch erhalten werden, daß man das Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma in einer Säule eines schwach basischen Anionenaustauschermaterials chromatographiert und man beim Eluieren der Säule eine, das aktive Material enthaltende Fraktion weitgehend frei von proteolytischen Enzymen auffängt. Es kann aus dem Eluat selbstverständlich in an sich bekannter Weise isoliert werden. In der Praxis sind Diäthylaminoäthylcellulose und Triäthylaminoäthylcellulose (DÄÄ-cellulose and TÄÄ-cellulose) zur erfindungsgemäßen Verwendung sehr geeignet. Letzteres Material wird insbesondere bevorzugt, da mit diesem das aktive Material von der im Gift enthaltenen Aminosäureoxydase leichter getrennt werden kann. Die Basenstärke des Materials hängt von dem Ausmaß der Substitution durch Aminoäthylgruppen ab. Sie ist ein wichtiger Faktor zur Bewahrung der Stabilität des aktiven Proteins und sollte nicht zu hoch sein. Von der Basizität des Materials, üblicherweise ausgedrückt als Milliäquivalent/g, hängt teilweise die Molarität der zum Eluieren verwendeten Puffer ab; optimale Zusammenstellungen werden leicht durch das Experiment gefunden. Andere Austauschersubstanzen haben Basizitäten, die von der Basizität der Diäthylaminoäthylcellulose verschieden sind und erfordern die Wahl eines geeigneten Puffersystems und geeigneter Konzentrationen, die leicht ermittelt werden können. Das aktive Material wird wie üblich durch Eluieren der Anionenaustauschersäule gewonnen. Bei Säulen aus Diäthylaminoäthylcellulose und Triäthylaminoäthylcellulose ergab das stufenweise Eluieren mit Puffern von steigender Molarität, z. B. mit Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Puffern, ausgezeichnete Ergebnisse. So wurden von Triäthylaminoäthylcellulose einer Kapazität von 0,7 Milliäquivalent/g die unerwünschten Bestandteile des Giftes mit einem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Puffer bei einem pH-Wert von 6,0 in stufenweise bis zu 0,04 m ansteigenden Konzentrationen die unerwünschten Bestandteile des Giftes eluiert, worauf man das aktive Material mit demselben Puffer in 0,09 bis 0,1 m oder etwas höherer Konzentration eluieren konnte. Die »Lösung des die Säule verlassenden aktiven Materials kann gegebenenfalls nach Dialyse gegen aqua dest. gefriergetrocknet werden, wobei man ein leichtes Pulver erhält, das bei tiefer Temperatur in Masse oder in Dosierungseinheiten in Ampullen gelagert werden kann. Man kann jedoch auch die Lösung durch Einstellung ihres Elektrolytgehaltes in bekannter Weise isotonisch machen, worauf man sie durch Filtration sterilisieren und so eine Zubereitung erhalten kann, die direkt zur parenteralen Verabreichung verwend-

bar ist. Diese oder eine durch Wiederauflösen des gefriergetrockneten Pulvers hergestellte Lösung kann intravenös oder intramuskulär in einer Dosierung von z. B. 0,2 bis 2 ^ig aktiver Substanz/kg verabreicht werden. Von Hunden wurden sogar Dosierungen von 1500 μg/kg ohne schädliche Wirkungen vertragen und so wurde dort das Blut für lange Zeit nicht koagulierbar gemacht.

Das Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Enzyms wird an Hand nachstehender Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Triäthylaminoäthylcellulose-Pulver der Kapazität 0,71 Milliäquivalent/g wurde in einer 2-m-Natriumchloridlösung, die mit 0,l-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Puffer auf einen pH-Wert von 6,0 gepuffert war, suspendiert und der Schlamm in eine Glaskolonne von 3,6 cm Durchmesser bis zu einer Höhe von 20 cm eingefüllt. Die Säule wurde mit weiteren 2 1 des zur Herstellung des Schlammes verwendeten Lösungsmittels gewaschen und anschließend mit einem 0,01-m-Tris-hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Puffer vom pH-Wert 8,5 äquilibriert.

350 mg des rohen Giftes von Ancistrodon Rhodostoma wurden in 20 ml eines 0,01-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Puff ers vom pH-Wert 8,5 gelöst und zur Entfernung von unlöslichem Material zentrifugiert. Die klare überstehende Flüssigkeit wurde auf die Kolonne aufgebracht. Die Fraktionierung wurde bei Raumtemperatur mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 90 bis 100 ml/h durchgeführt. Die Proteinkonzentration in dem Eluat wurde durch die Extinktion der Lösung bei 280 ΐημ in 1-cm-Zellen bestimmt.

Das Chromatogramm wurde mit nachstehenden Pufferlösungen entwickelt. In allen Fällen ist die Molarität der Pufferlösungen in bezug auf Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan angegeben, wobei mit Phosphorsäure der gewünschte pH-Wert eingestellt wurde.

Zunächst wurde das Gift mit 500 ml 0,01-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 8,5 auf die Kolonne aufgewaschen und dabei die Fraktionen 1, 2, 3 erhalten. Mit 1175 ml 0,01-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminornethanphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 wurde die Fraktion 4 erhalten und dann die Kolonne mit 600 ml 0,02-m-Tris- (hydroxymethyl) - aminomethanphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 gewaschen, worauf mit 500 ml 0,04-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 die Fraktion 5 und dann mit 275 ml 0,10-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 die Fraktion 6 und anschließend mit 500 ml 0,10-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Puffer + 0,10-m-NaCl-Lösung vom pH-Wert 6,0 die Fraktion 7 gewonnen wurde.

Die auf diese Weise erhaltenen Proteinfraktionen wurden auf ihre koagulierende Wirkung geprüft.

Weniger als 1 % der in der aufgebrachten Lösung enthaltenen koagulierenden Wirkung wurde in den Fraktionen 1, 2, 3, 4 wiedergefunden. Fraktion 1 besaß jedoch proteolytische Aktivität, durch welche in konzentrierten Lösungen Fibrinpfropfen aufgelöst wurden. Das Auftreten der thrombinartigen Aktivität wird in nachstehender Tabelle gezeigt:

Fraktion	E/ml	E280	Spezifische Aktivität
- rohes Gift ⁵ 5 6 7	100 9 78 35	0,174 0,085 0,0125 0,0540	574 106 6240 648

Die Einheiten sind willkürlich gewählt, wobei sich 100 Einheiten auf die Gerinnungszeit des im Verhältnis 1: 100 verdünnten ursprünglichen Giftes beziehen. E,₈₀ ist die Extinktion einer Fraktion bei der zur Bestimmung der thrombinartigen Aktivität angewendeten Verdünnung von 1:100.

In Fraktion 6 wurden etwa 50 bis 65 % des thrombinartigen Materials gewonnen, während der Rest in den Fraktionen 5 und 7 auftrat.

Das aktivste Eluat wurde gefriergetrocknet, wobei man ein leichtes, pulverförmiges Produkt erhielt. Die Ausbeute betrug 18 bis 20 mg Protein bezogen auf 350 mg trockenes Gift als Ausgangsmaterial.

Falls man die reine Substanz gewinnen möchte, so wird zunächst noch gegen aqua dest. dialysiert und dann gefriergetrocknet.

Beispiel 2

Das Verfahren nach Beispiel 1 erfordert etwa 36 Stunden bis zu seiner Beendigung. Nachstehend wird ein Fraktionierungsverfahren beschrieben, das nur 14 Stunden erfordert.

Die Höhe der Säule wurde auf 15 cm vermindert und diese mit einer 0,01-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 äquilibriert. 350 mg rohes Gift wurden in 20 ml eines 0,01-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminornethanphosphat-Puffers vom pH-Wert 6,0 gelöst und nach dem Zentrifugieren auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 400 ml derselben Pufferlösung eluiert, bis kein Protein mehr eluiert wurde und anschließend mit nachstehenden Pufferlösungen eluiert: 300 ml 0,02-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,0, '
300 ml 0,035-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,0,
300 ml 0,09-m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,0.

Die Reinheit des mit dem letztgenannten Lösungsmittel erhaltenen Materials ist ebensogut wie im Beispiel 1, und in manchen Fällen wird die Ausbeute auf fast 70% erhöht.

Wie im Beispiel 1 konnte das Produkt in gefriergetrockneter Form gewonnen werden, oder die Lösung wurde durch Zusatz von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Pufferlösung auf einen physiologischen pH-Wert eingestellt und isotonisch gemacht und anschließend durch Filtration sterilisiert.

Verfahren zur Bestimmung der thrombinartigen
Aktivität

0,1 ml mit Oxalat versetztes Rinderplasma wurde bei 37° C mit 0,1 ml einer 0,15molaren Natriumchloridlösung, die mit einer 0,01molaren Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-(tris) - Cl- -/Pufferlösung auf einen pH-Wert von 7,5 gepuffert war, inkubiert. Dieser Lösung wurden 0,1 ml einer 0,025-m-CaCl₂-Lösung und anschließend 0,1 ml der betreffenden Gift-

fraktion hinzugefügt und die Gerinnungszeit des Gemisches vermerkt. Die für eine Reihe von Giftkonzentrationen erhaltenen Gerinnungszeiten wurden in einem doppellogarithmischen Koordinatensystem aufgetragen, wobei man eine gerade Linie erhielt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Extraktionsverfahrens des aktiven Materials durch Chromatographie an Diäthylaminoäthylcellulose oder Triäthylaminoäthylcellulose stehen der pH-Wert, die Molarität und die übrigen Bedingungen untereinander

in Beziehung und werden am besten durch einfache Versuche bestimmt. Als Richtlinie kann jedoch festgestellt werden, daß nach der Eluierung der proteolytisch wirksamen Fraktion das gewünschte Material mit einer Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Pufferlösung im pH-Bereich von 5,5 bis 7,5 und mit einer Molarität von 0,04 m aufwärts eluiert werden kann, wobei gegebenenfalls die Gesamtmolarität der Lösung mit Natriumchlorid oder einem anderen ίο geeigneten Salz auf zumindest 0,08 m eingestellt wird.

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Claims

Patentansprüche:

1. In vivo antikoagulierend wirkendes und defibrinierendes Enzym aus dem Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma, dadurch gekennzeichnet, daß

b) es an Di- oder Triäthylaminoäthylcellulose adsorbiert wird,

c) es in physiologischer Kochsalzlösung löslich ist,

d) es eine elektrophoretische Mobilität von 3,92 · ΙΟ"⁵ V/cm · see in einem 0,1 mol. Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,0 aufweist,

e) es ein Molekulargewicht, bei der Bestimmung in der Ultrazentrifuge, von etwa 38 000 bis etwa 40 000 hat,

f) es einen Sedimentationskoeffizienten S₀₀ W = 3,40 Svedberg aufweist,

g) es ein partielles spezflsches Volumen von 0,66 besitzt,

j) daß es proteinartig und in reinem Zustand weitgehend farblos ist.

2. Verfahren zur Gewinnung des Enzyms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma an einer Säule eines schwach basischen Anionenaustauschermaterials, wie Diäthylaminoäthyl- oder Triäthylaminoäthylcellulose, chromatographiert und die das aktive Material enthaltende Fraktion weitgehend frei von unerwünschten proteolytischen Enzymen auffängt und daraus das Enzym isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Säule des Anionenaustauschermaterials stufenweise mit Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanphosphat-Pufferlösungen steigender Molarität eluiert und die aktive Fraktion sammelt, nachdem die proteolytisch wirksamen Bestandteile des Giftes weitgehend eluiert wurden.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die proteolytisch wirksamen und anderen unerwünschten Bestandteile bei einem pH-Wert von 6 mit bis zu 0,04molaren Pufferlösungen eluiert, worauf man die wirksame Fraktion mit 0,09- bis über etwa 0,10molaren Pufferlösungen eluiert.

Das Gerinnen des menschlichen und tierischer. Blutes erfolgt nach einem komplizierten Mechanismus, der in getrennten Stufen vor sich geht. In der letzten Stufe dieses Prozesses wird Blutfibrinogerj durch das Enzym Thrombin in »Fibrinmonomer« umgewandelt, welches anschließend zu Fibrin polymerisiert wird, wodurch eine Koagulierung des Blutes eintritt unter Bildung eines Blutpfropfens. Derartige Blutpfropfen können, wenn sie in den Blutgefäßen entstehen, Thrombosen und Embolien hervorrufen.

Zur Verhinderung derartiger Krankheitsbilder hat man daher bereits blutgerinnungshemmende Mittel appliziert. Die bekannten Mittel Heparin und Dicumarol haben aber zahlreiche Nachteile. Heparin wirkt nicht zuverlässig und wird z. B. relativ schnell inaktiv, weshalb es in kurzen Abständen appliziert werden muß, um einen sicheren Gerinnungsschutz zu gewährleisten. Dicumarol, das auch als Rattengift Verwendung findet, besitzt dagegen eine sehr langdauernde Wirkung, was bei eventuell eintretenden Blutungen zu einer ernsthaften Gefahr für den Patienten werden kann.

Es wurde nun festgestellt, daß in dem Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma ein Enzym vorhanden ist, das eine thrombinartige Wirkung aufweist, jedoch Blutfibrinogen derart verändert, daß das entstandene Fibrin von dem des normalen, durch Thrombin erzeugten Blutpfropfens verschiedene Eigenschaften aufweist. Das unter der Wirkung dieses Enzyms des Schlangengifts entstandene Fibrin hat einen bündelartigen Charakter und wird durch der, kontinuierlichen Blutstrom in vivo indifferent so in den Blutwegen verteilt, daß keine Bildung eines Pfropfens erfolgt. Es wurde gefunden, daß das Gift von Ancistrodon Rhodostoma durch Entfernung proteolytisch wirksamer Bestandteile, die ernste, lokale Reaktionen und andere unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, gereinigt werden und so eine gereinigte Zubereitung hergestellt werden kann, deren Eigenschaften eines defibrinierenden, antikoagulierend wirkenden Enzyms in der Therapie, d. h. in vivo, und für Forschungszwecke nutzbar gemacht werden können.

Das erfindungsgemäße neue in vivo antikoagulierend wirkende und defibrinierende Enzym aus dem Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma ist dadurch gekennzeichnet, daß