DE2323981C3 - Verfahren zur Isolierung des thrombinartig wirkenden Bestandteils aus dem Gift der Otter Agkistrodon rhodostoma - Google Patents

Description

Es ist seit einigen Jahren bekannt, daß das Gift bestimmter Grubenottern, beispielsweise von Agkistrodon rhodostoma, einen als Antikoagulans geeigneten Bestandteil enthält. In jüngerer Zeit wurde gefunden, daß dieser Bestandteil tatsächlich ein Blutkoagulans darstellt. Der thrombinähriiiche Stoff, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, bewirkt die Bildung eines nichtvernetzten Fibrinpolymeren, welches durch das körpereigene retikuloendotheliale und/oder fibrinolytische System rasch beseitigt wird. Dadurch wird der Fibrinogengehalt des Blutes herabgesetzt bzw. erschöpft Der vorgenannte Stoff besitzt daher eine gerinnungshemmende Wirkung (Antikoagulanseffekt).

Die bisher bekannten Verfahren zur Isolierung des vorgenannten Bestandteils sind sehr unbefriedigend. Bei einer dieser Methoden handelt es sich um eine zweistufige chromatographische Arbeitsweise. Diese erfordert in den beiden Stufen zwei Säulen mit verschiedenen Füllmaterialien sowie zwei unterschiedlich gepufferte Lösungen, welche als Extraktionslösungsmittel verschiedenartigen Anforderungen genügen müssen. In der ersten Stufe dieser chromatographischen Methode wird als Träger zumeist Triäthylaminoäthylcellulose verwendet, mit welcher sich jedoch keine verläßlichen oder leicht reproduzierbaren Ergebnisse erzielen lassen. Der gravierendste Nachteil besteht jedoch darin, daß die auf die genannte Weise gereinigte Giftlösung zuweilen noch dem hämorrhagischen Faktor enthält welcher den gefährlichsten Bestandteil des Otterngifts darstellt, gemäß einer weiteren, in jüngerer Zeit beschriebenen Methode wird die Affinitätschromatographie angewendet. Bei diesem Verfahren sind jedoch Ausbeute und Qualität des isolierten thrombinähnlichen Produkts nicht optimal.

Des weiteren ist es aus der DE-AS 21 28 257 bekannt, zum Isolieren des adäquaten Bestandteils aus dem Gift der Otter eine 0,5- bis 5°/oige Lösung des Giftes herzustellen, die einen pH-Wert von 7,5 bis 8,1 hat, und die Lösung auf eine Säule aus AEaroseperlen, an die

Agmatin gebunden ist zu geben.

Es nun die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches Verfahren zur Herstellung des reinen thrombinähnlichen Stoffes aus dem Gift der malaiischen Grubenotter zur Verfügung zu stellen, wobei ein reproduzierbares Verfahren geschaffen werden soll, welches den eine hohe spezifische Aktivität aufweisenden Stoff in hervorragender Ausbeute liefert. Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt nach dem Patentan-

JO sprach.

Unter »an Agmatin gebundenen Agaroseperien« sind hier Agaroseperien zu verstehen, an die 4-Aminobutylguanidin (Agmatin) kovalent gebunden ist Es wurde gefunden, daß Agmatin ein konkurrierender Inhibitor

is des thrombinähnlichen Wirkstoffs des Grubenotterngifts ist; es verhindert die Elution des Wirkstoffs aus der Säule so lange, bis nahezu alle anderen Proteinstoffe eluiert sind. Das »Binden« des Agmatins an die Agarose wird in bekannter Weise unter Verwendung aktivierter Agaroseperien vorgenommen. Die Perlen besitzen vorzugsweise einen Durchmesser von 40 bis 190 χ 10-⁴cm (im nassen Zustand). Eine an Agmatin gebundene Agarose mit einem Agmatingehalt von 60 bis 120 Mikromol pro g Trockengewicht ist für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Bevorzugt wird ein Agmatingehalt von 100 bis 120 Mikromol/g oder von 1,2 bis l,5Gew.-%, wie durch Analyse nach 20stündiger Hydrolyse in 5,7 η-Salzsäure bei 110⁰C bestimmt wird.

Um im erfindungsgemäßen Verfahren eine gute Reproduzierbarkeit sowie einen reinen thrombinähnlichen Wirkstoff zu erzielen, soll das Bettvolumen der Agmatin-Agarose mindestens 20 bis 25 ml/g Gift betragen. Natürlich kann man auch größere Bettvolumina anwenden, ohne jedoch durch eine solche Volumerhöhung zusätzliche Vorteile zu erzielen. Die bei/orzugte Eluiergeschwindigkeit beträgt 15 bis 30 ml/Std./cm² Säulenquerschnitt; man arbeitet vorzugsweise bei Raumtemperatur.

Der in der vorliegenden Anmeldung in bezug auf das Gift verwendete Ausdruck »nativ« soll ein Gift bezeichnen, welches nicht zuvor nach anderen chromatographischen oder chemischen Methoden behandelt wurde. Das Gift enthält dementsprechend andere

⁴S Proteinstoffe, welche zuvor als »Fraktionen I bis VIII« bezeichnet wurden. Zu diesen Fraktionen gehört auch der hämorrhagische Faktor sowie die Fraktionen V und VII, welche ähnliche physikochemische Eigenschaften wie der Koagulierungsfaktor aufweisen, mit dem das erfindungsgemäße Isolierverfahren befaßt ist. Diese unerwünschten Fraktionen und Bestandteile werden durch das Verfahren der Erfindung vollständig aus dem nativen Gift entfernt Eine vorangehende lonenaustauscherbehandking ist nicht erforderlich. Andererseits sei festgestellt, daß der vorstehend definierte Ausdruck »nativ« nicht bedeutet, daß das Gift so gut wie unberührt sein muß, bevor es der erfindungsgemäßen einstufigen Trennmethode unterworfen wird. Das Gift kann zur Beseitigung von Sedimenten zentrifugiert und zur Stabilitätsverbesserung lyophilisiert werden; es muß ferner natürlich gelöst sein, damit man es anforderungsgemäß als klare, verdünnte wäßrige Lösung einsetzen kann. Gewünschtenfalls kann die Giftlösung zur Befreiung von bestimmten unerwünschten Proteinen

^hr' mit Ammoniumsulfat vorbehandelt werden. Eine solche Behandlung ist jedoch nicht zwingend, wie nachstehend erläutert wird.

Die wäßrige 0,25-m Natriumchloridlösung des nati-

ven Gifts ist auf einen pH-Wert von 7,5 bis 83 abgepuffert und enthält 0,5 bis 3 Gew.-% des Gifts. Diese Lösung wird bevorzugt mit Hilfe eines nichttoxischen Salzes (wie des Hydrochloride) von Tris-(hydroxymethyl)-aminoniethan gepuffert; anstelle dessen kann man jedoch auch andere Puffersubstanzen verwenden. Die Bevorzugung von nichttoxischen Puffersubstanzen beruht darauf, daß man nach dieser methode Tris-hydroxymethyl)-aminomethan später als Puffer für die Lösung verwendet, mit welcher man die den thrombinähnlichen Wirkstoff enthaltende isolierte Proteinfraktion eluiert

Die als Elutionsmittel verwendete Guanidinhydrochlorid-Lösung ist vorzugsweise in der gleichen Weise wie die als Waschflüssigkeit dienende Natriumchloridlösung abgepuffert Die besten Ergebnisse werden im erfindungsgemäßen Verfahren erzielt, wenn die Konzentration des Guanidinhydrochlorids etwa 0,15molar ist und die Säule bei einer Temperatur von 20 bis 25° C gehalten wird. Die Guanidmhydrochlorid-Lösung ist insbesondere mit Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid auf einen pH-Wert von 8,1 ± 0,1 abgepuffert.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Eluat liegt in hochreiner Form vor. Es muß jedoch in eine medizinisch geeignete Form übergeführt werden, was gewöhnlich durch Filtrieren in dem gewünschten Puffer erreicht wird. Auch diese abschließend erhaltene Lösung kann eine Verdünnung erfordern. Eine brauchbare injizierbare Lösung enthält im allgemeinen 50 bis 200 Einheiten [gemäß der Definition von Owren in »Acta Medica Scandinavia«, Suppl. 194 (1947)] des thrombinähnlichen Wirkstoffs pro ml, während das vorgenannte Eluat 1400 bis 1900 Einheiten/ml enthält

Die an Agmatin gebundenen Agaroseperlen werden in bekannter Weise aus einer handelsüblichen, in Perlenform vorliegenden Agarose hergestellt. Die Perlen werden dann in eine Säule gegeben, in welcher sie als Affinitätschromatogramm-Füilmaterial fungieren. Sie besitzen eine extrem starke Zurückrtaltewirkung gegenüber dem aktiven Giftprotein, während sie die anderen Proteine mit wesentlich geringerer Affinität oder überhaupt nicht zurückhalten. Während des Waschens mit der vorstehend beschriebenen abgepufferten Natriumchloridlösung werden diese anderen Komponenten leicht aus der Säule ausgewaschen, während der auf der Säule zurückbleibende thrombinähnliche Bestandteil nahezu quantitativ mit der abgepufferten Guanidinhydrochlorid-Lösung eluiert wird. Dadurch erhält man einen extrem reinen isolierten thrombinähnlichen Wirkstoff. Man kann diesen Stoff gewünschtenfalls nach einer Gelfiltration und Einstellung seiner Konzentration auf das gewünschte Niveau medizinisch verwenden. Geeignete Verdünnungsmittel sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder eine verdünnte Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid. Die letztere Substanz kann auch dann zugesetzt werden, wenn das erhaltene vereinigte Eluat einen für intravenöse Injektionen ungeeigneten pH-Wert aufweist. Der für diesen Zweck bevorzugte pH-Bereich liegt nahe bei 7.

Zum technischen Fortschritt wird geltend gemacht, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine Ausbeute von etwa 90% oder darüber (bezogen auf den Wirkstoffgehait im nativen Gift) liefert, während man beim Verfahren der DE-AS 21 28 257 nur etwa 80% des thrombinähnlichen Stoffes erhält. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch einfacher durchführbar als das bekannte Verfahren, da man das Gift mit nur einer einzigen Lösung eluieren kann.

Das im erfindungsgemäßen Isolierverfahren eingesetzte Agmatin-Agarose-Bett kann ferner für nachfolgende Giftchargen wiederverwendet werden, wobei lediglich ein einfaches und rasches Regenerierverfahren erforderlich ist Bei dieser Regenerierung wäscht man die Perlen — gewünschtenfalls in der Säule — mit 4 bis 10 Volumteilen 0,5-n-Essigsäure und bringt die Säule

ίο dann mit Hilfe der vorstehend beschriebenen abgepufferten 0,25-m-Natriumchloridlösung wieder in den Gleichgewichtszustand.

Zur Erfindungshöhe wird geltend gemacht, daß das Verfahren der Erfindung Maßnahmen beinhaltet, die in

is der DE-AS 21 28 257 weder offenbart noch angedeutet sind. Diese Maßnahmen bestehen darin, daß man eine Giftlösung einsetzt, die 0,25-molar an NaCl ist zur Entfernung störender Proteine mit natriumchloridlösung einer einzigen Konzentration eluiert, bis die

Μ Absorption bei 280 nm des EJuats auf 0,04 oder darunter abgesunken ist und anschließend mit einer Guanidinhydrochlorid-Lösung mit bestimmter Konzentration und bestimmtem pH-Wert den thrombinähnlichen Bestandteil eluiert Das erfindungsgemäß erhaltene Eluat enthält den Wirkstoff mit einer hohen spezifischen Aktivität, die für ein einfaches Einstufenverfahren außerordentlich überraschend ist

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das nachstehende Beispiel erläutert.

Beispiel

Agmatin wird an ein perlförmiges Agarosematerial mit einer nassen Perlengröße von 40 bis 190 Mikrometern und einem Agarosegehalt von etwa 4%, welches Proteine mit Molekulargewichten oberhalb 20-10* zurückhält, nach der Methode von Cuatrecasas et al. [beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sei., U.S. 61 (1968), Seite 636] gebunden. Dabei wird der pH-Wert jedoch während der CN Br-Aktivierung der Agarose 30 Minuten bei 11,0 gehalten und die Bindungsreaktion wird in einem 0,1 n-NaHCCVNaOH-Puffer bei einem pH-Wert von 10,0 unter Verwendung von 22,9 mg Agmatinsulfat pro ml abgesetztes Agarosevolumen vorgenommen. Der Agmatingehalt der auf diese Weise hergestellten Agmatin-Agarose beträgt 115Mikromol/g Trockengewicht.

Eine Lösung von 1 g lyophilisiertsm nativem Gift der malaiischen Grubenotter in 50 ml 0,25-m wäßriger Natriumchloridlösung, welche mit 0.01 -m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid auf einen pH-Wert von 8,1 abgepuffert wurde und 0,1 Gew.-% Chlorbutanol als Konservierungsmittel enthält, wird auf eine Chromatographiesäule gegeben, welche einen Durchmesser von 1,9 cm aufweist und bis zu einer Höhe von 14 cm mit den vorgenannten Agmutin-Agarose-Perlen gefüllt ist. Durch die Säule wird dann bei Raumtemperatur 0,25-m wäßrige Natriumchloridlösung, welche 0,1 % Chlorbutanol enthält und mit Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid auf einen pH-Wert von 8,1

μ abgepuffert wurde, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 70 bis 90mI/Std. perkoliert. Das Eluat wird automatisch in Form von Fraktionen von 10 bis 11 ml aufgefangen und die Absorption (Ai₈onm) des Ausflusses bestimmt. Man fährt mit dem Perkolieren bzw. Waschen

*>■■> fort, bis ein großes »Durchbruchw-Maximum von bei 280 mn absorbierendem Material eluiert ist und der A28Onm-Wert des Säulenausflusses auf 0,04 abgesunken ist. Dazu sind etwa 300 ml der vorgenannten Waschlö-

sung erforderlich. Die gesammelten Fraktionen sind nahezu frei von der gewünschten thrombinähnlichen Substanz und werden verworfen.

Die Waschflüssigkeit wird dann durch das Elutionsmittel, welches zur Eluierung des thrombinähnlichen Bestandteils bestimmt ist, ersetzt Man verwendet für diesen Zweck eine wäßrige 0,15-m Lösung von Guanidinhydrochlorid, welche mit 0,01-m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid auf einen pH-Wert von 8,1 abgepuffert wurde und 0,1% Chlorbutanol enthält Der thrombinähnliche Bestandteil wird in Form eines ziemlich scharfen Maximums eluiert wobei die dem Maximum entsprechende Konzentration bei einem Säulen-Leervolumen nach Elutionsbeginn erreicht wird. Die Säule wird mit insgesamt 200 ml der vorgenannten abgepufferten Guanidinlösung eluiert Der thrombinähnliche Stoff wird in etwa 90%iger Ausbeute in einem Volumen von 100 bis 120 ml gewonnen.

Das den thrombinähnlichen Stoff enthaltende Eluat wird anschließend durch Ultrafiltration zehnfach konzentriert. Man gibt das erhaltene Konzentrat auf eine Chromatographiesäule, die mit einem handelsüblichen, in Perlenform vorliegenden, teilweise vernetzten und regellos angeordnete Ätherbindungen aufweisenden Dextrangel, welches Substanzen mit Molekulargewichten von weniger als 10⁵ abtrennt, gefüllt ist Das Dextrangel wurde mit 0,1 -m Natriumchlorid in 0,1-m Natriumphosphat, welches einen pH-Wert von 6,8 aufweist und 0,1% Chlorbutanol enthält, in den Gleichgewichtszustand versetzt. Die Füllung besitzt eine Höhe von 95 cm und einen Durchmesser von 2,5 cm. Mit Hilfe dieser Säule werden das Guanidinhydrochlorid und der im vorgenannten Konzentrat enthaltene Puffer entfernt.

Die auf diese Weise erhaltene isolierte thrombinähnliche Substanz wird mit einer zuvor identifizierten, hochreinen Probe des aus dem Grubenotterngift isolierten thrombinähnlichen Materials verglichen. Die beiden Proben erweisen sich aufgrund der nachstehenden Tests als identisch. Die unter Verwendung von 7%igen Gelen bei einem pH-Wert von 8,9 durchgeführte Gel-Elektrophoresemethode [beschrieben von O r η stein in »Annals of N.Y. Acad. of Science«, 121 (1964), Seite 321] ergibt identische elektrophoretische Beweglichkeiten. Die Gelfiltration auf dem vorgenannten Dextrangel ergibt dasselbe Molekulargewicht und die gleiche Spezifität, jedoch eine höhere Wirksamkeit (spezifische Aktivität). Beide Proben sind vollständig frei vom hämorrhagischen Faktor und bewirken die Gerinnung von gereinigtem Plasmafibrinogen.

Die spezifische Aktivität des nach dem vorliegenden neuen Verfahren erhaltenen thrombinähnlichen Stoffes liegt im gerinnungshemmenden Wirkungsbereich zwischen 1800 und 2000 Einheiten/ml/A28o_rm- Die Homogenität wird mit Hilfe identifizierender Kriterien, z. B. durch Gelfiltration und anhand des Verhaltens in der Ultrazentrifuge, durch Natriumdodecylsulfat-Scheiben-Gel-Elektrophorese [vgl. Weber und Osborn, J. Biol. Chem. 244 (1969), 4406] und Immunodiffusion, festgestellt.

Bei einer im größeren Maßstab durchgeführten Wiederholung der vorgenannten Arbeitsweisen wird eine 20-g-Giftprobe auf ein entsprechend größeres Säulenbett (6,5 χ 14 cm) gegeben. Die Giftprobe ist dabei in 1000 m! der vorgenannten Natriumchloridlösung gelöst. Durch die Säule werden in der vorstehend beschriebenen Weise 4 bis 6 Liter der vorgenannten Waschflüssigkeit und anschließend 2 bis 2$ Liter der beschriebenen abgepufferten Guanidinhydrochlorid-Lösung perkoliert Die thrombinähnliche Substanz wird im genannten Puffer in einem Volumen von 1,4 bis 1,8 Liter eluiert Nachdem die gewünschte Substanz auf diese Weise aus der Säule ausgezogen wurde, wird das Agarosebett in der vorstehend beschriebenen Weise regeneriert Die Säule wird für eine neue Giftcharge verwendet Auf diese V/eise wird die gewünschte

te Substanz bei jeder von vier Chargen, welche durch dieselbe, Agmatin-Agarose enthaltende Säule geführt werden, in der vorgenannten hohen Reinheit und Ausbeute aufgefangen. Die Gelfiltration wird in diesem Falle mit einer einen Durchmesser von 9,5 cm

ts aufweisenden und bis zu einer Höhe von 115 cm mit dem vorgenannten Dextrangel gefüllten Säule unter Verwendung des vorgenannten Puffers durchgeführt

Wenn man das bei der vorgenannten Arbeitsweise eingesetzte Agarosematerial durch ein Agarosegel mit einer nassen Korngröße von 149 bis 297 Mikrometern, das Substanzen eines Molekulargewichts von mehr als 15 ■ 10* zurückhält ersetzt, zeigen die erhaltenen vereinigten Fraktionen dieselbe Wirksamkeit und denselben Reinheitsgrad wie vorstehend angegeben ist Man erkennt daß das erfindungsgemäße Verfahren die Isolierung des aktiven Koagulansbestandteils aus Schlangengift stark vereinfacht. Insbesondere sei festgestellt, daß erfindungsgemäß ein einziges Affinitätschromatogramm für die Erzielung eines Produkts von höchster Reinheit ausreicht. Dieses Ziel konnte zuvor lediglich mit Hilfe von Methoden erreicht werden, die zweistufig und damit komplizierter waren, ein weniger wirksames Produkt ergaben oder mit einer beträchtlichen Einbuße an wertvoller Aktivität verbunden waren. Das neue Verfahren liefert ein Produkt von höchster Wirksamkeit, welches dieselbe Molekülgröße und gerinnungshemmende Aktivität wie ein nach älteren Methoden erhaltenes, aufwendiger raffiniertes Produkt aufweist und diesem Produkt auch hinsichtlich anderer physikalischer und chemischer Identifikationsmerkmale gleichkommt. Es ist besonders bemerkenswert und überraschend, daß ein einfaches Affinitätschromatogramm das einzige Erfordernis für die Isolierung eines gereinigten, hochwirksamen thrombinähnlichen Stoffes aus vorher nicht behandeltem Schlangengift darstellt und daß dieses Chromatogramm die gesamte wertvolle Fraktion in nahezu theoretischer Ausbeute liefert.

Im Hinblick auf die überraschende Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Reinigungs- und Isoliermethode soll die Puffer- und Salzkonzentration der Giftlösung mit pyrogenfreien Substanzen erreicht werden. Gewünschtenfalls kann man der Giftlösung von Beginn an ein Konservierungsmittel zusetzen oder aber ein solches Mittel später der gereinigten, isolierten Koagulansfraktion einverleiben, wenn die Lösung lagerfähig oder langzeitig gebrauchsfähig sein soll. Es sind zahlreiche Konservierungsmittel für diesen Zweck geeignet, beispielsweise Benzylalkohol, Methyl- und/

wi oder Propyl-p-hydroxybenzoat und Chlorbutanol. Im allgemeinen werden sämtliche Anforderungen, die eine normale Lagerung mit sich bringt, mit Hilfe von 0.05 bis 1 % eines solchen Konservierungsmittels erfüllt.

Die aus der Affinitätschromatographiestufe erhaltene

•'S abgepufferte Lösung wird vorzugsweise durch Ultrafiltration konzentriert und durch eine Gclfiltiations-Säulc in einem physiologisch geeigneten Puffer hindurchgeführt, welcher dann mit der gewünschten gereinigten,

isolierten Substanz vereint bleibt. Diese Substanz besitzt nunmehr einen genügenden Reinheitsgrad, um Warmblütern zur Verhinderung der Blutgerinnung oder zur Auflösung von bereits gebildeten Blutklumpen verabfolgt zu werden. Molekularsiebe, wie das vorgenannte Dexu angel, stellen hervorragende, den richtigen Vernetzungsgrad aufweisende Materialien für die

Gelfiltration dar. Anstelle des vorgenannten Dextrangels kann man auch andere vernetzte Dextrangele oder vernetzte Polyacrylamide verwenden. Weitere Methoden zur Entfernung des Guanidinhydrochlorids und des Puffers der Elutionsstufe beruhen auf einer einfachen Dialyse gegen das gewünschte Puffer- und Lösungsmittelsystem.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Isolierung des thrombinartig wirkenden Bestandteils aus dem Gift der Otter Agkistrodon rhodostoma durch Aufgeben einer 04-3 Gew.-% Gift enthaltenden wäßrigen, klaren, auf einen pH-Wert von 7,5—8,3 abgepufferten Lösung auf eine Säule aus Agaroseperien, an die Agmatin gebunden ist, und Eluieren der Säule mit einer auf einen pH-Wert von 7,5 - 8,3 abgepufferten, wäßrigen Natriumchloridlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßrige Lösung für das native Gift eine 0,25molare wäßrige Natriumchloridlösung einsetzt die Säule zunächst mit 0,25-molarer Natriumchloridlösung eluiert, bis die Absorption in einer gegebenen Eluatfraktion bei 280 nm auf einen wert von 0,04 oder darunter abgesunken ist darauf die Säule mit einer auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,3 abgepufferten, 0,1- bis 0,25inolaren, wäßrigen Guanidinhydrochlorid-Lösung eluiert und aus dem so erhaltenen Eluat, das den thrombinartig wirkenden Bestandteil enthält, das Guanidinhydrochlorid entfernt