DE2323981C3 - Verfahren zur Isolierung des thrombinartig wirkenden Bestandteils aus dem Gift der Otter Agkistrodon rhodostoma - Google Patents
Verfahren zur Isolierung des thrombinartig wirkenden Bestandteils aus dem Gift der Otter Agkistrodon rhodostomaInfo
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Description
Es ist seit einigen Jahren bekannt, daß das Gift bestimmter Grubenottern, beispielsweise von Agkistrodon
rhodostoma, einen als Antikoagulans geeigneten Bestandteil enthält. In jüngerer Zeit wurde gefunden,
daß dieser Bestandteil tatsächlich ein Blutkoagulans darstellt. Der thrombinähriiiche Stoff, auf den sich die
vorliegende Erfindung bezieht, bewirkt die Bildung eines nichtvernetzten Fibrinpolymeren, welches durch
das körpereigene retikuloendotheliale und/oder fibrinolytische System rasch beseitigt wird. Dadurch wird der
Fibrinogengehalt des Blutes herabgesetzt bzw. erschöpft Der vorgenannte Stoff besitzt daher eine
gerinnungshemmende Wirkung (Antikoagulanseffekt).
Die bisher bekannten Verfahren zur Isolierung des vorgenannten Bestandteils sind sehr unbefriedigend. Bei
einer dieser Methoden handelt es sich um eine zweistufige chromatographische Arbeitsweise. Diese
erfordert in den beiden Stufen zwei Säulen mit verschiedenen Füllmaterialien sowie zwei unterschiedlich
gepufferte Lösungen, welche als Extraktionslösungsmittel verschiedenartigen Anforderungen genügen
müssen. In der ersten Stufe dieser chromatographischen Methode wird als Träger zumeist Triäthylaminoäthylcellulose
verwendet, mit welcher sich jedoch keine verläßlichen oder leicht reproduzierbaren Ergebnisse
erzielen lassen. Der gravierendste Nachteil besteht jedoch darin, daß die auf die genannte Weise gereinigte
Giftlösung zuweilen noch dem hämorrhagischen Faktor enthält welcher den gefährlichsten Bestandteil des
Otterngifts darstellt, gemäß einer weiteren, in jüngerer Zeit beschriebenen Methode wird die Affinitätschromatographie
angewendet. Bei diesem Verfahren sind jedoch Ausbeute und Qualität des isolierten thrombinähnlichen
Produkts nicht optimal.
Des weiteren ist es aus der DE-AS 21 28 257 bekannt, zum Isolieren des adäquaten Bestandteils aus dem Gift
der Otter eine 0,5- bis 5°/oige Lösung des Giftes herzustellen, die einen pH-Wert von 7,5 bis 8,1 hat, und
die Lösung auf eine Säule aus AEaroseperlen, an die
Agmatin gebunden ist zu geben.
Es nun die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches Verfahren zur Herstellung des reinen
thrombinähnlichen Stoffes aus dem Gift der malaiischen Grubenotter zur Verfügung zu stellen, wobei ein
reproduzierbares Verfahren geschaffen werden soll, welches den eine hohe spezifische Aktivität aufweisenden
Stoff in hervorragender Ausbeute liefert. Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt nach dem Patentan-
JO sprach.
Unter »an Agmatin gebundenen Agaroseperien« sind hier Agaroseperien zu verstehen, an die 4-Aminobutylguanidin
(Agmatin) kovalent gebunden ist Es wurde gefunden, daß Agmatin ein konkurrierender Inhibitor
is des thrombinähnlichen Wirkstoffs des Grubenotterngifts
ist; es verhindert die Elution des Wirkstoffs aus der Säule so lange, bis nahezu alle anderen Proteinstoffe
eluiert sind. Das »Binden« des Agmatins an die Agarose wird in bekannter Weise unter Verwendung aktivierter
Agaroseperien vorgenommen. Die Perlen besitzen vorzugsweise einen Durchmesser von 40 bis
190 χ 10-4cm (im nassen Zustand). Eine an Agmatin
gebundene Agarose mit einem Agmatingehalt von 60 bis 120 Mikromol pro g Trockengewicht ist für das
erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Bevorzugt wird ein Agmatingehalt von 100 bis 120 Mikromol/g oder
von 1,2 bis l,5Gew.-%, wie durch Analyse nach 20stündiger Hydrolyse in 5,7 η-Salzsäure bei 1100C
bestimmt wird.
Um im erfindungsgemäßen Verfahren eine gute Reproduzierbarkeit sowie einen reinen thrombinähnlichen
Wirkstoff zu erzielen, soll das Bettvolumen der Agmatin-Agarose mindestens 20 bis 25 ml/g Gift
betragen. Natürlich kann man auch größere Bettvolumina anwenden, ohne jedoch durch eine solche Volumerhöhung
zusätzliche Vorteile zu erzielen. Die bei/orzugte
Eluiergeschwindigkeit beträgt 15 bis 30 ml/Std./cm2
Säulenquerschnitt; man arbeitet vorzugsweise bei Raumtemperatur.
Der in der vorliegenden Anmeldung in bezug auf das Gift verwendete Ausdruck »nativ« soll ein Gift
bezeichnen, welches nicht zuvor nach anderen chromatographischen oder chemischen Methoden behandelt
wurde. Das Gift enthält dementsprechend andere
4S Proteinstoffe, welche zuvor als »Fraktionen I bis VIII«
bezeichnet wurden. Zu diesen Fraktionen gehört auch der hämorrhagische Faktor sowie die Fraktionen V und
VII, welche ähnliche physikochemische Eigenschaften wie der Koagulierungsfaktor aufweisen, mit dem das
erfindungsgemäße Isolierverfahren befaßt ist. Diese unerwünschten Fraktionen und Bestandteile werden
durch das Verfahren der Erfindung vollständig aus dem nativen Gift entfernt Eine vorangehende lonenaustauscherbehandking
ist nicht erforderlich. Andererseits sei festgestellt, daß der vorstehend definierte Ausdruck
»nativ« nicht bedeutet, daß das Gift so gut wie unberührt sein muß, bevor es der erfindungsgemäßen
einstufigen Trennmethode unterworfen wird. Das Gift kann zur Beseitigung von Sedimenten zentrifugiert und
zur Stabilitätsverbesserung lyophilisiert werden; es muß ferner natürlich gelöst sein, damit man es anforderungsgemäß
als klare, verdünnte wäßrige Lösung einsetzen kann. Gewünschtenfalls kann die Giftlösung zur
Befreiung von bestimmten unerwünschten Proteinen
hr' mit Ammoniumsulfat vorbehandelt werden. Eine solche
Behandlung ist jedoch nicht zwingend, wie nachstehend erläutert wird.
Die wäßrige 0,25-m Natriumchloridlösung des nati-
ven Gifts ist auf einen pH-Wert von 7,5 bis 83
abgepuffert und enthält 0,5 bis 3 Gew.-% des Gifts. Diese Lösung wird bevorzugt mit Hilfe eines nichttoxischen
Salzes (wie des Hydrochloride) von Tris-(hydroxymethyl)-aminoniethan
gepuffert; anstelle dessen kann man jedoch auch andere Puffersubstanzen verwenden.
Die Bevorzugung von nichttoxischen Puffersubstanzen beruht darauf, daß man nach dieser methode Tris-hydroxymethyl)-aminomethan
später als Puffer für die Lösung verwendet, mit welcher man die den thrombinähnlichen
Wirkstoff enthaltende isolierte Proteinfraktion eluiert
Die als Elutionsmittel verwendete Guanidinhydrochlorid-Lösung
ist vorzugsweise in der gleichen Weise wie die als Waschflüssigkeit dienende Natriumchloridlösung
abgepuffert Die besten Ergebnisse werden im erfindungsgemäßen Verfahren erzielt, wenn die Konzentration
des Guanidinhydrochlorids etwa 0,15molar ist und die Säule bei einer Temperatur von 20 bis 25° C
gehalten wird. Die Guanidmhydrochlorid-Lösung ist insbesondere mit Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid
auf einen pH-Wert von 8,1 ± 0,1 abgepuffert.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Eluat liegt in hochreiner Form vor. Es muß jedoch in
eine medizinisch geeignete Form übergeführt werden, was gewöhnlich durch Filtrieren in dem gewünschten
Puffer erreicht wird. Auch diese abschließend erhaltene
Lösung kann eine Verdünnung erfordern. Eine brauchbare injizierbare Lösung enthält im allgemeinen 50 bis
200 Einheiten [gemäß der Definition von Owren in »Acta Medica Scandinavia«, Suppl. 194 (1947)] des
thrombinähnlichen Wirkstoffs pro ml, während das vorgenannte Eluat 1400 bis 1900 Einheiten/ml enthält
Die an Agmatin gebundenen Agaroseperlen werden
in bekannter Weise aus einer handelsüblichen, in Perlenform vorliegenden Agarose hergestellt. Die
Perlen werden dann in eine Säule gegeben, in welcher sie als Affinitätschromatogramm-Füilmaterial fungieren.
Sie besitzen eine extrem starke Zurückrtaltewirkung gegenüber dem aktiven Giftprotein, während sie
die anderen Proteine mit wesentlich geringerer Affinität oder überhaupt nicht zurückhalten. Während des
Waschens mit der vorstehend beschriebenen abgepufferten Natriumchloridlösung werden diese anderen
Komponenten leicht aus der Säule ausgewaschen, während der auf der Säule zurückbleibende thrombinähnliche
Bestandteil nahezu quantitativ mit der abgepufferten Guanidinhydrochlorid-Lösung eluiert
wird. Dadurch erhält man einen extrem reinen isolierten thrombinähnlichen Wirkstoff. Man kann diesen Stoff
gewünschtenfalls nach einer Gelfiltration und Einstellung seiner Konzentration auf das gewünschte Niveau
medizinisch verwenden. Geeignete Verdünnungsmittel sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder eine
verdünnte Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid.
Die letztere Substanz kann auch dann zugesetzt werden, wenn das erhaltene vereinigte
Eluat einen für intravenöse Injektionen ungeeigneten pH-Wert aufweist. Der für diesen Zweck bevorzugte
pH-Bereich liegt nahe bei 7.
Zum technischen Fortschritt wird geltend gemacht, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine Ausbeute
von etwa 90% oder darüber (bezogen auf den Wirkstoffgehait im nativen Gift) liefert, während man
beim Verfahren der DE-AS 21 28 257 nur etwa 80% des thrombinähnlichen Stoffes erhält. Das erfindungsgemäße
Verfahren ist auch einfacher durchführbar als das bekannte Verfahren, da man das Gift mit nur einer
einzigen Lösung eluieren kann.
Das im erfindungsgemäßen Isolierverfahren eingesetzte Agmatin-Agarose-Bett kann ferner für nachfolgende
Giftchargen wiederverwendet werden, wobei lediglich ein einfaches und rasches Regenerierverfahren
erforderlich ist Bei dieser Regenerierung wäscht man die Perlen — gewünschtenfalls in der Säule — mit 4 bis
10 Volumteilen 0,5-n-Essigsäure und bringt die Säule
ίο dann mit Hilfe der vorstehend beschriebenen abgepufferten
0,25-m-Natriumchloridlösung wieder in den
Gleichgewichtszustand.
Zur Erfindungshöhe wird geltend gemacht, daß das Verfahren der Erfindung Maßnahmen beinhaltet, die in
is der DE-AS 21 28 257 weder offenbart noch angedeutet
sind. Diese Maßnahmen bestehen darin, daß man eine Giftlösung einsetzt, die 0,25-molar an NaCl ist zur
Entfernung störender Proteine mit natriumchloridlösung einer einzigen Konzentration eluiert, bis die
Μ Absorption bei 280 nm des EJuats auf 0,04 oder darunter
abgesunken ist und anschließend mit einer Guanidinhydrochlorid-Lösung mit bestimmter Konzentration und
bestimmtem pH-Wert den thrombinähnlichen Bestandteil eluiert Das erfindungsgemäß erhaltene Eluat
enthält den Wirkstoff mit einer hohen spezifischen Aktivität, die für ein einfaches Einstufenverfahren
außerordentlich überraschend ist
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das nachstehende Beispiel erläutert.
Agmatin wird an ein perlförmiges Agarosematerial mit einer nassen Perlengröße von 40 bis 190
Mikrometern und einem Agarosegehalt von etwa 4%, welches Proteine mit Molekulargewichten oberhalb
20-10* zurückhält, nach der Methode von Cuatrecasas et al. [beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sei., U.S. 61
(1968), Seite 636] gebunden. Dabei wird der pH-Wert jedoch während der CN Br-Aktivierung der Agarose 30
Minuten bei 11,0 gehalten und die Bindungsreaktion wird in einem 0,1 n-NaHCCVNaOH-Puffer bei einem
pH-Wert von 10,0 unter Verwendung von 22,9 mg Agmatinsulfat pro ml abgesetztes Agarosevolumen
vorgenommen. Der Agmatingehalt der auf diese Weise hergestellten Agmatin-Agarose beträgt 115Mikromol/g
Trockengewicht.
Eine Lösung von 1 g lyophilisiertsm nativem Gift der
malaiischen Grubenotter in 50 ml 0,25-m wäßriger Natriumchloridlösung, welche mit 0.01 -m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid
auf einen pH-Wert von 8,1 abgepuffert wurde und 0,1 Gew.-% Chlorbutanol
als Konservierungsmittel enthält, wird auf eine Chromatographiesäule gegeben, welche einen Durchmesser
von 1,9 cm aufweist und bis zu einer Höhe von 14 cm mit den vorgenannten Agmutin-Agarose-Perlen
gefüllt ist. Durch die Säule wird dann bei Raumtemperatur 0,25-m wäßrige Natriumchloridlösung, welche 0,1 %
Chlorbutanol enthält und mit Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid auf einen pH-Wert von 8,1
μ abgepuffert wurde, mit einer Durchflußgeschwindigkeit
von 70 bis 90mI/Std. perkoliert. Das Eluat wird automatisch in Form von Fraktionen von 10 bis 11 ml
aufgefangen und die Absorption (Ai8onm) des Ausflusses
bestimmt. Man fährt mit dem Perkolieren bzw. Waschen
*>■■> fort, bis ein großes »Durchbruchw-Maximum von bei
280 mn absorbierendem Material eluiert ist und der A28Onm-Wert des Säulenausflusses auf 0,04 abgesunken
ist. Dazu sind etwa 300 ml der vorgenannten Waschlö-
sung erforderlich. Die gesammelten Fraktionen sind nahezu frei von der gewünschten thrombinähnlichen
Substanz und werden verworfen.
Die Waschflüssigkeit wird dann durch das Elutionsmittel,
welches zur Eluierung des thrombinähnlichen Bestandteils bestimmt ist, ersetzt Man verwendet für
diesen Zweck eine wäßrige 0,15-m Lösung von Guanidinhydrochlorid, welche mit 0,01-m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid
auf einen pH-Wert von 8,1 abgepuffert wurde und 0,1%
Chlorbutanol enthält Der thrombinähnliche Bestandteil wird in Form eines ziemlich scharfen Maximums eluiert
wobei die dem Maximum entsprechende Konzentration bei einem Säulen-Leervolumen nach Elutionsbeginn
erreicht wird. Die Säule wird mit insgesamt 200 ml der
vorgenannten abgepufferten Guanidinlösung eluiert Der thrombinähnliche Stoff wird in etwa 90%iger
Ausbeute in einem Volumen von 100 bis 120 ml gewonnen.
Das den thrombinähnlichen Stoff enthaltende Eluat wird anschließend durch Ultrafiltration zehnfach konzentriert.
Man gibt das erhaltene Konzentrat auf eine Chromatographiesäule, die mit einem handelsüblichen,
in Perlenform vorliegenden, teilweise vernetzten und regellos angeordnete Ätherbindungen aufweisenden
Dextrangel, welches Substanzen mit Molekulargewichten von weniger als 105 abtrennt, gefüllt ist Das
Dextrangel wurde mit 0,1 -m Natriumchlorid in 0,1-m Natriumphosphat, welches einen pH-Wert von 6,8
aufweist und 0,1% Chlorbutanol enthält, in den Gleichgewichtszustand versetzt. Die Füllung besitzt eine
Höhe von 95 cm und einen Durchmesser von 2,5 cm. Mit Hilfe dieser Säule werden das Guanidinhydrochlorid
und der im vorgenannten Konzentrat enthaltene Puffer entfernt.
Die auf diese Weise erhaltene isolierte thrombinähnliche Substanz wird mit einer zuvor identifizierten,
hochreinen Probe des aus dem Grubenotterngift isolierten thrombinähnlichen Materials verglichen. Die
beiden Proben erweisen sich aufgrund der nachstehenden Tests als identisch. Die unter Verwendung von
7%igen Gelen bei einem pH-Wert von 8,9 durchgeführte Gel-Elektrophoresemethode [beschrieben von O r η stein
in »Annals of N.Y. Acad. of Science«, 121 (1964), Seite 321] ergibt identische elektrophoretische Beweglichkeiten.
Die Gelfiltration auf dem vorgenannten Dextrangel ergibt dasselbe Molekulargewicht und die
gleiche Spezifität, jedoch eine höhere Wirksamkeit (spezifische Aktivität). Beide Proben sind vollständig
frei vom hämorrhagischen Faktor und bewirken die Gerinnung von gereinigtem Plasmafibrinogen.
Die spezifische Aktivität des nach dem vorliegenden neuen Verfahren erhaltenen thrombinähnlichen Stoffes
liegt im gerinnungshemmenden Wirkungsbereich zwischen 1800 und 2000 Einheiten/ml/A28orm- Die Homogenität
wird mit Hilfe identifizierender Kriterien, z. B. durch Gelfiltration und anhand des Verhaltens in der
Ultrazentrifuge, durch Natriumdodecylsulfat-Scheiben-Gel-Elektrophorese
[vgl. Weber und Osborn, J. Biol. Chem. 244 (1969), 4406] und Immunodiffusion,
festgestellt.
Bei einer im größeren Maßstab durchgeführten Wiederholung der vorgenannten Arbeitsweisen wird
eine 20-g-Giftprobe auf ein entsprechend größeres Säulenbett (6,5 χ 14 cm) gegeben. Die Giftprobe ist
dabei in 1000 m! der vorgenannten Natriumchloridlösung gelöst. Durch die Säule werden in der vorstehend
beschriebenen Weise 4 bis 6 Liter der vorgenannten Waschflüssigkeit und anschließend 2 bis 2$ Liter der
beschriebenen abgepufferten Guanidinhydrochlorid-Lösung perkoliert Die thrombinähnliche Substanz wird
im genannten Puffer in einem Volumen von 1,4 bis 1,8 Liter eluiert Nachdem die gewünschte Substanz auf
diese Weise aus der Säule ausgezogen wurde, wird das Agarosebett in der vorstehend beschriebenen Weise
regeneriert Die Säule wird für eine neue Giftcharge verwendet Auf diese V/eise wird die gewünschte
te Substanz bei jeder von vier Chargen, welche durch
dieselbe, Agmatin-Agarose enthaltende Säule geführt werden, in der vorgenannten hohen Reinheit und
Ausbeute aufgefangen. Die Gelfiltration wird in diesem Falle mit einer einen Durchmesser von 9,5 cm
ts aufweisenden und bis zu einer Höhe von 115 cm mit
dem vorgenannten Dextrangel gefüllten Säule unter Verwendung des vorgenannten Puffers durchgeführt
Wenn man das bei der vorgenannten Arbeitsweise eingesetzte Agarosematerial durch ein Agarosegel mit
einer nassen Korngröße von 149 bis 297 Mikrometern, das Substanzen eines Molekulargewichts von mehr als
15 ■ 10* zurückhält ersetzt, zeigen die erhaltenen
vereinigten Fraktionen dieselbe Wirksamkeit und denselben Reinheitsgrad wie vorstehend angegeben ist
Man erkennt daß das erfindungsgemäße Verfahren die Isolierung des aktiven Koagulansbestandteils aus
Schlangengift stark vereinfacht. Insbesondere sei festgestellt, daß erfindungsgemäß ein einziges Affinitätschromatogramm
für die Erzielung eines Produkts von höchster Reinheit ausreicht. Dieses Ziel konnte
zuvor lediglich mit Hilfe von Methoden erreicht werden, die zweistufig und damit komplizierter waren, ein
weniger wirksames Produkt ergaben oder mit einer beträchtlichen Einbuße an wertvoller Aktivität verbunden
waren. Das neue Verfahren liefert ein Produkt von höchster Wirksamkeit, welches dieselbe Molekülgröße
und gerinnungshemmende Aktivität wie ein nach älteren Methoden erhaltenes, aufwendiger raffiniertes
Produkt aufweist und diesem Produkt auch hinsichtlich anderer physikalischer und chemischer Identifikationsmerkmale gleichkommt. Es ist besonders bemerkenswert
und überraschend, daß ein einfaches Affinitätschromatogramm das einzige Erfordernis für die
Isolierung eines gereinigten, hochwirksamen thrombinähnlichen Stoffes aus vorher nicht behandeltem
Schlangengift darstellt und daß dieses Chromatogramm die gesamte wertvolle Fraktion in nahezu theoretischer
Ausbeute liefert.
Im Hinblick auf die überraschende Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Reinigungs- und Isoliermethode
soll die Puffer- und Salzkonzentration der Giftlösung mit pyrogenfreien Substanzen erreicht werden. Gewünschtenfalls
kann man der Giftlösung von Beginn an ein Konservierungsmittel zusetzen oder aber ein
solches Mittel später der gereinigten, isolierten Koagulansfraktion einverleiben, wenn die Lösung
lagerfähig oder langzeitig gebrauchsfähig sein soll. Es sind zahlreiche Konservierungsmittel für diesen Zweck
geeignet, beispielsweise Benzylalkohol, Methyl- und/
wi oder Propyl-p-hydroxybenzoat und Chlorbutanol. Im
allgemeinen werden sämtliche Anforderungen, die eine normale Lagerung mit sich bringt, mit Hilfe von 0.05 bis
1 % eines solchen Konservierungsmittels erfüllt.
Die aus der Affinitätschromatographiestufe erhaltene
•'S abgepufferte Lösung wird vorzugsweise durch Ultrafiltration
konzentriert und durch eine Gclfiltiations-Säulc
in einem physiologisch geeigneten Puffer hindurchgeführt, welcher dann mit der gewünschten gereinigten,
isolierten Substanz vereint bleibt. Diese Substanz besitzt nunmehr einen genügenden Reinheitsgrad, um
Warmblütern zur Verhinderung der Blutgerinnung oder zur Auflösung von bereits gebildeten Blutklumpen
verabfolgt zu werden. Molekularsiebe, wie das vorgenannte Dexu angel, stellen hervorragende, den richtigen
Vernetzungsgrad aufweisende Materialien für die
Gelfiltration dar. Anstelle des vorgenannten Dextrangels
kann man auch andere vernetzte Dextrangele oder
vernetzte Polyacrylamide verwenden. Weitere Methoden zur Entfernung des Guanidinhydrochlorids und des
Puffers der Elutionsstufe beruhen auf einer einfachen Dialyse gegen das gewünschte Puffer- und Lösungsmittelsystem.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Isolierung des thrombinartig wirkenden Bestandteils aus dem Gift der Otter Agkistrodon rhodostoma durch Aufgeben einer 04-3 Gew.-% Gift enthaltenden wäßrigen, klaren, auf einen pH-Wert von 7,5—8,3 abgepufferten Lösung auf eine Säule aus Agaroseperien, an die Agmatin gebunden ist, und Eluieren der Säule mit einer auf einen pH-Wert von 7,5 - 8,3 abgepufferten, wäßrigen Natriumchloridlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßrige Lösung für das native Gift eine 0,25molare wäßrige Natriumchloridlösung einsetzt die Säule zunächst mit 0,25-molarer Natriumchloridlösung eluiert, bis die Absorption in einer gegebenen Eluatfraktion bei 280 nm auf einen wert von 0,04 oder darunter abgesunken ist darauf die Säule mit einer auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,3 abgepufferten, 0,1- bis 0,25inolaren, wäßrigen Guanidinhydrochlorid-Lösung eluiert und aus dem so erhaltenen Eluat, das den thrombinartig wirkenden Bestandteil enthält, das Guanidinhydrochlorid entfernt
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