DE2450913A1

DE2450913A1 - Entzuendungshemmendes material und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2450913A1
Application number: DE19742450913
Authority: DE
Inventors: Anthony John Colledge; Anthony Willia Ford-Hutchinson; Kent Gillingham; Mervyn John Hillier Smith
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: National Research Development Corp UK
Priority date: 1973-10-26
Filing date: 1974-10-25
Publication date: 1975-04-30
Also published as: JPS5082214A; FR2248851B1; FR2248851A1; NL7413874A

Description

Die Erfindung betrifft ein entzUndumjahcmmundcs Materiai und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die Erfindung betrifft ganz allgemein Substanzen mit entzündungshemmender oder antiinflaminatorischer Wirkung; die zur Behandlung von rheumatischen Zuständen und anderen Entzündungszuständen geeignet sind.

Die Forschung auf dem Gebiet der antirheumatischen Arzneimittel wird seit vielen Jahren betrieben und hat zu einer Reihe von klinisch geeigneten Substanzen geführt, Alle bekannten antirheumatischen Mittel werden in dem Blutkreislauf des Körpers an Plasmaproteine gebunden, wobei keinerlei chemische Beziehung zwischen den geeigneten Substanzen vorliegt, die auf einen Wirkungsmechanismus schließen lassen würde, der durch die chemische Struktur bedingt wäre. Es ist daher die allgemeine Hypothese vorgeschlagen worden, daß, wenn derartige Arzneimittel in den Blutkreislauf eintreten und sich mit Plasmaproteinen verbinden, sie ein vorhandenes, an Protein gebundenes Molekül verdrängen, das einen Teil eines natürlichen Verteidigungssystems gegen die chronischen Entzündungszustände der rheumatischen Erkrankungen darstellt. Experimentell hat sich diese Hypothese in gewissem Umfang durch die Tatsache verifiziere^ lassen, daß alle wirksamen antirheumatischen Mittel, jedoch keine anderen Arzneimittel, L-Tryptophan sowohl in vitro als auch in vivo von den menschlichen Serumproteinen verdrängen, an die es gebunden ist.

Die Suche nach einem verdrängbaren Molekül, das eine der oben beschriebenen natürlichen Schutzfunktionen besitzt, ist fortgesetzt worden, hat jedoch bislang zu keinen nutzbaren Ergebnissen geführt und auch die Spekulationen hinsichtlich der Art eines solchen Moleküls gehen erheblich auseinander.

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Us hat sich nunmehr als möglich erwioaen, eine fraktion aus Serum und Plasma zu gewinnen, die eine sich bei dem Kärrageenan-Rattenpfoten-Ödem-Test verdeutlichende entzündungshemmende Wirkung entfaltet. Das Material kann durch Ultrafiltration des Plasmas oder des Serums oder einer geeigneten Fraktion davon, gefolgt von einer Gelfiltration und dem Eluieren mit einem wässrigen Medium, das keine Puffersalze oder höchstens eine sehr geringe Menge von Puffersalzen enthält , beispielsweise eine Molarität von nicht mehr als 0,02m aufweist, erhalten werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von entzündungshemmendem Material, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Serum, Plasma oder eine geeignete Fraktion davon einer Ultrafiltration und dann einer Gel-Filtration unterzieht und aus dem Gel eine Fraktion eluiert, die bei dem Karrageenan-Rattenpfoten-Ödem-Test eine entzündungshemmende Wirkung entfaltet.

Die Ultrafiltration des Ausgangsmaterials dient dazu, sehr große Moleküle zu entfernen und das aktive Prinzip zu gewinnen, von dem angenommen wird, daß es ein relativ niedriges Molekulargewicht besitzt. Um ein Maximum der Beseitigung der unerwünschten Materialien zu erzielen, können bei der Ultrafiltration Stufenfilter verwendet werden, das heißt Membranen mit einem Trennpunkt bis hinab zu einem Molekulargewicht von etwa 500. Bei Anwendung solcher Membranen ist die Fließgeschwindigkeit jedoch relativ niedrig und in der Praxis ist es daher erwünscht, Membranen zu verwenden, die einen höheren Durchsatz ermöglichen, da in dieser Stufe das Verbleiben gewisser Verunreinigungen , die beispielsweise ein Molekulargewicht von etwa 2OOO oder mehr aufweisen, toleriert werden kann. Bessere Ergebnisse erzielt man jedoch bei der Ultrafiltration durch Hohlfasern. Die Anwendung eines Bündels hohler Fasern führt zu einer leichteren Abtrennung der Makromoleküle und einer schnelleren Filtrationsgeschwindigkeit. Sie besitzen gegenüber den Membranen auch den

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Vorteil der größeren Robustheit und können sehr leicht mit enzymhaltigen Reinigungsmitteln gesäubert werden, die ohne weiteres das makromolekulare Material dispergieren, das mit der Zeit dazu führt, daß die Filtrationsgeschwindigkeit abnimmt.

Vorzugsweise wird das ültrafiltrat vor der Gelfiltration eingeengt.. Die Gelfiltration kann mit Hilfe einer großen Vielzahl von Materialien durchgeführt werden, obwohl man besonders gute Ergebnisse durch die Verwendung vernetzter Dextrane erhält, wie den unter der Bezeichnung "Sephadex^" im Handel erhältlichen Materialien. Die Elution des Materials von der mit dem Gel gefüllten Säule unter kontrollierten Bedingungen ist ein besonders wichtiges Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens. Statt Elutionsmittel anzuwenden, die die üblichen Gehalte an Puffersalzen aufweisen, hat es sich als möglich erwiesen, ein erhebliches Ausmaß der Reinigung zu erreichen, wenn die Menge der Puffersalze in dem Elutionsmittel niedriger gehalten wird oder wenn überhaupt keine Puffersalze verwendet werden. Die Elution mit destilliertem Wasser ist daher besonders bevorzugt. Wenn das Gel unter diesen Bedingungen eluiert wird, neigt die aktive Substanz dazu, sich in zwei Banden aufzuteilen, die auf beiden Seiten der Bande auftreten, die die Hauptmenge der vorhandenen toxischen und anderen unerwünschten Substanzen enthält und die für die Haupt-UV-Absorptionspeaks verantwortlich sind. Es wird angenommen, daß das in der ersten Bande auftretende aktive Material aufgrund seiner sauren Natur eluiert wird, da die Sephadex-Säulen normalerweise negativ geladenes Material enthalten, das das Rückhalten des sauren Materials auf der Säule inhibiert. Es wird angenommen, daß der Teil des in dieser Stufe auf der Säule zurückgehaltenen aktiven Materials durch Absorption gebunden wird und, wie oben bereits angegeben, zurückgehalten wird, bis die Hauptmenge der unerwünschten Bestandteile der Serum- oder Plasma-Fraktiori eluiert sind.

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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Trennverfahrens ist es notwendig, das Augenmerk auf die Ultrafiltrationsstufe zu richten, da das Verhalten des aktiven Materials in bislang noch nicht vollständig verstandener Weise mit der Membrangröße, das heißt dem Durchmesser und der Dicke, variiert, so daß vorausgehende Experimente notwendig sind, wenn eine Veränderung der Membrangröße vorgenommen werden soll. Zum Beispiel erhält man mit einer 2-tiiter-Zelle (Amicon Ltd.) mit einer PM-10-Membran mit einem Durchmesser von 150 mm ausgezeichnete Ergebnisse. Für die Verwendung alternativer Membranen, zum Beispiel der Membranen mit den Bezeichnungen UM-10, üM-2 oder UM-05 sind Experimente erforderlich, um die optimalen Werte der verschiedenen Parameter zu ermitteln. Für die Gelfiltrationsstufe sind Sephadex-Membranen der Bezeichnungen G25, G15 oder G1O außergewöhnlich gut geeignet. Erfindungsgemäß können auch Acrylamidgele und andere Substrattypen verwendet werden.

Es hat sich weiterhin gezeigt, daß ein sehr bedeutsames Maß der weiteren Reinigung des sich bei dem obigen Verfahren ergebenden Produktes durch die Anwendung einer Ionenaustauschstufe erreicht werden kann. Die in der nützlichen Fraktion des Serums oder des Plasmas enthaltende aktive Substanz ist sauer, so daß für die verbesserte Reinigung Anipnenaustauschermaterialien verwendet werden. Geeignete Anionenaustauschermaterialien sind schwach basische Materialien, zum Beispiel DEAE-Sephadex oder DEAE-CeIlulose. Vorzugsweise verwendet man zwei derartige Säulen, das heißt man führt einen Anionenaustausch und schließlich eine Gelfiltration durch oder man verfährt umgekehrt. Obwohl die Reihenfolge, in der die Säulen verwendet werden, nicht kritisch ist, ist es von Vorteil, zunächst die Gelfiltrationsstufe durchzuführen, da hierdurch die über die Anionenaustauschersäule zu führenden Volumina kleiner gehalten werden können als im umgekehrten Fall. Als Ergebnis davon ist die Endkonzentration des die Anionenaustauschersäule verlassenden sauren Eluats für das aktive Material schonender (<as »it der Anionenaustauscherslule erhaltene,wesentlich

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reinere Material ist etwaa aaureeiupfindlicher ala ciuH Produkt, das bei der Gelfiltrationsstufe anfällt). Wenn man die Ionenaustauschchromatographie entweder vor oder nach der Gelfiltration durchführt, liegt das gewünschte Material in einer Fraktion vor, die man erhält, nachdem die Produkte eluiert worden sind, die die Haupt-UV-Absorptionsbanden verursachen.

Die späteren Stufen des Verfahrens, das heißt die Anionenaustauschchromatographie und die Chromatographie über geeignete Gele, ermöglichen eine wesentlich schärfere Reinigung des aktiven Materials, als es ohne die Anwendung eines Anionenaustausches mögligh ist und man erhält ein Produkt mit einem breiteren Wirkungsbereich. Nach der Durchführung dieser Reinigungsstufen, zeigt die aktive Fraktion eine Wirkung bei der Maus und beim Meerschweinchen bei dem Karrageenan-Test. Das Material ist äußerst wirksam bei dem Adjuvans-Arthritistest bei Ratten und ebenfalls gegenüber dem UV-Erythem-Test bei Meerschweinchen. Das gewünschte Material zeigt sich bei dem passiven Hautanaphylaxis-Test als unwirksam, ist jedoch in dem umgekehrten passiven Arthus-Test aktiv. Der Wirkstoff ist ebenfalls aktiv bei dem Terpentin-Pleuritis- und Karrageenan-Pleuritis-Test bei der Ratte und bei der Ansammlung von Exudat und der zellulären Infiltration in nicht-resorbierbare Schwämme, die der Ratte unter die Haut eingepflanzt werden. Das erfindungsgemäße aktive Material zeigt keine analgetische oder antipyretische Wirkung.

Die folgenden Beispiele, die die Verarbeitung von Humanserumfraktionen und einer Rinderserumfraktion betreffen, sollen die Erfindung weiter erläutern. Die gleichen Maßnahmen können auch auf andere Säugetiersera oder -plasma angewendet werden, die im Handel erhältlich sind, zum Beispiel Schweine-, Schaf- und Pferde-Sera. ,

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Beispiel 1

Man zentrifugiert gesammeltes, citratbehandeltes menschliches Plasma (1 D# das man von dem Blood-Transfusions-Centre, Tooting, London, S.W.17, erhalten hat, während 30 Minuten bei 4⁰C und 2000 g in einer Ultrazentrifuge (MSE Mistral 4L) und filtriert die überstehende Flüssigkeit sofort bei 20⁰C unter einer Stickstoffatmosphäre bei einem Druck von 3,52 a-tü (50 psi) in einer Amicon 2L-ZeIIe unter Verwendung einer Filtermembran (Diaflo PM 10), bis man 500 ml des ültrafiltrats gewonnen hat. Dann engt man 200 ml dieses Ültrafiltrats bei 37°C unter vermindertem Druck auf 20 ml ein, trägt das Konzentrat auf eine feines Sephadex^ G25 enthaltende Säule (55 χ 5 cm) auf und eluiert bei 20°C mit destilliertem Wasser. Das UV-Spektrum des (mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml pro Minute austretenden) Eluats wird bei 254 nm mit Hilfe eines UV-Sp.ektrographen (Uvieord 1, L.K.B. Instruments, Croydon) überwacht. Es werden 20 ml-Portionen aufgefangen und zu den Fraktionen I, II, III, IV und V vereinigt, die in der Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen angegeben sind.

Die Fraktionen II und IV enthalten das aktive Material. Diese Fraktionen werden vereinigt und ergeben ein Volumen von etwa 500 ml. Die Fraktionen werden dann im Vakuum zur Trockene eingeengt. Das in dieser Weise erhaltene gereinigte Material wird, gelöst in einer Salzlösung, parenteral oder vorzugsweise intravenös verabreicht und hinsichtlich seiner entzündungshemmenden Wirkung untersucht.

Gegebenenfalls kann eine weitere Reinigung des in dieser Weise erhaltenen Materials durch Lösungsmittel-Ektraktions-Verfahren einschließlich einer Flüssigkeits/Flüssigkeits-Extraktion, gefolgt von einer Reextraktion in ein wässriges Lösungsmittel, durchgeführt werden.

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Das in der obigen Weise gewonnene aktive Material zeigt eine Wirkung gegen das durch Karrageenan oder in anderer Weise in der Rattenpfote hervorgerufene ödem. Es wirkt nicht als Antagonist für Histamin, 5-Hydroxytryptamin oder die Kinine. Es besitzt ein offenbares Molekulargewicht unter 1000 und ist gegenüber proteolytisehen Enzymen bemerkenswert resistent. Behandelt man das Material mit nicht-spezifischer Protease, Trypsin oder Papain während 24 Stunden bei 36⁰C, so führt dies zu praktisch keinem Aktivitätsverlust.

Beispiel 2

Man zentrifugiert gesammeltes, citratbehandeltes menschliches Plasma (4 1), das man von dem Blood Transfusion Centre, Tooting, Londin, S.W.17, erhalten hat, während 45 Minuten bei 4⁰C bei 2000 g in einer Ultrazentrifuge (M.S.E. Mistral 4L) und filtriert die überstehende Flüssigkeit bei 20°C in einer Hohlfaser-Ultrafiltrations-Zelle (Amicon DC2) mit einem Molekülabtrennpunkt von 10 000. Nachdem man 2 1 des Ultrafiltrats gewonnen hat, trägt man dieses auf eine Sephadex*& A25-Anionenaustauscherharz enthaltende Säule (5x10 cm) auf. Die Säule wird dann mit 400 ml Wasser, 400 ml 5%iger Essigsäure und schließlich mit 5%iger Essigsäure in 0,45%iger Salzlösung eluiert. Das UV-Spektrum des (mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Min austretenden) Eluats wird bei 254nm mit einem UV-Spektrographen (Uvicord II, L.K.B. Instruments, Croydon) überwacht. Es werden 15 ml-Portionen gesammelt und zu den in der Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen angegebenen Fraktionen A, B, C, D und E vereinigt.

Die ein Volumen von 450 ml aufweisende Fraktion E wird dann im Vakuum zur Trockene eingeengt, wonach der Rückstand in 5 ml Wasser gelöst und die Restsäure mit NaOH neutralisiert wird. Dann trägt man diese Lösung auf eine mit feinem Sephadex®G25 gefüllte Säule (55 χ 5 cm) auf und eluiert bei 20⁰C mit

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dcBLilliortcm Wasaur. Dua UV-Spuktruni deu (mil: einer l'ließgeschwindigkeit von 2 ml/Min austretenden) Eluats wird bei 254 nm mit Hilfe eines UV-Spektrographen (Uvicord 1, L.K.B. Instruments, Croydon) überwacht. Es werden 20 ml-Portionen aufgefangen und zu den in der Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen wiedergegebenen Fraktionen F, G, H und J vereinigt.

Die Fraktion G enthält das aktive Material. Diese Fraktionen werden vereinigt und ergeben ein Volumen von 200 ml, wonach man das Material im Vakuum zur Trockene einengt.

Das erfindungsgemäße aktive Material wird durch Erhitzen mit alkalischen Reagenzien, zum Beispiel verdünntem Ammoniak, und durch heftiges Schütteln mit ungereinigten organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther, der Spuren von Peroxid enthält, zerstört. Es wird nicht zerstört, wenn es mit gereinigten organischen Lösungsmitteln geschüttelt wird.

Beispiel 3

Man läßt 4 1 gesammeltes, frisches Rinderblut während 2 Stunden bei 37⁰C ausklumpen. Dann zentrifugiert man das Blut während 60 Minuten bei 2000 g und 4⁰C in einer Ultrazentrifuge (MSE Mistral 4L) und filtriert die überstehende Flüssigkeit bei 20°C in einer Hohlfaser-Ultrafiltrationszelle (Amicon DC2) mit einer Molekültrenngrenze von 10 000. 200 ml dieses Ultrafiltrats engt man bei 37⁰C unter vermindertem Drück auf 5 ml ein, trägt das Konzentrat auf eine mit feinem Sephadex^v-^/G25 gefüllte Säule (55 χ 5 cm) auf und eluiert bei 20°C mit destilliertem Wasser. Das UV-Spektrum des (mit einer Flxeßgeschwindigkeit von 2 ml/Min austretenden) Eluats wird bei 254 nm mit einem UV-Spektrographen (Uvicord 1, L.K.B. Instruments, Croydon) überwacht. Es werden 20 ml-Portionen aufgefangen und zu Fraktionen I, II, III, IV und V vereinigt, die den in der Fig, 1 angegebenen Fraktionen entsprechen. Die Fraktionen II und IV werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in 6 ml einer

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9,0'4icjon (Gewicht/Volumen) Salzlösung gelöst. Injiziert man aliquote Anteile von 1 ml dieser Lösung intravenös in die Schwanzvene der Ratte, nachdem man bei dieser durch eine 4 Stunden zuvor durchgeführte Injektion von Karrageenan ein ödem in der Pfote verursacht hat, so führt dies zu einer wesentlichen Verminderung des Volumens der geschwollenen Rattenpfote.

Beispiel 4

Man zentrifugiert gesammeltes, citratbehandeltes menschliches Plasma (2 1), das man von dem Blood Transfusion Centre, Tooting, London, S.W.17, erhalten hat, während 45 Minuten bei 4⁰C bei 2000 g in einer Ultrazentrifuge (MSE Mistral 4L) und filtriert die überstehende Flüssigkeit bei 20°C in einer Hohlfaser-Ultrafiltrationszelle (Amicon DC2) mit einem Molekültrennpunkt von 10 000. Nachdem man 1 1 des Ultrafiltrats gewonnen hat, engt man dieses im Vakuum auf 100 ml ein und trägt es auf eine feines Sephadex^-'G25 enthaltende Säule (90x300 mm) auf. Dann eluiert man die Säule mit destilliertem Wasser bei 20°C und überwacht das UV-Spektrum des (mit einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/Min austretenden) Eluats bei 254 nm mit Hilfe eines UV-Spektrographen (Uvicord 1, L.K.B. Instruments, Croydon). Man fängt 50ml-Portionen auf und engt die der in der Fig. 1 dargestellten Fraktion II entsprechende Fraktion im Vakuum bei 37⁰C zur Trockene ein. Der Rückstand wird mit 25 ml destilliertem Wasser aufgenommen und auf eine mit Sephadex^ A25-Anionenaustauscherharz gefüllte Säule (12x80 mm) auf. Die Säule wird dann mit 10 ml destilliertem Wasser, 40 ml 5%iger Essigsäure und schließlich 100 ml einer 5%igen Essigsäure' in Ö,45%iger Salzlösung eluiert. Das (mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,25 ml/Min austretende) Eluat wird mit einem UV-Spektrographen (Uvicord 2, L.K.B. Instruments, Croydon) bei 254 nm überwacht. Es werden 15 ml-Portionen aufgefangen und zu Fraktionen A, B, C, D und E vereinigt, die

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dem in der Fig. 2 wiedergegebenen Muster entsprechen. Die ein Volumen von 40 ml aufweisende Fraktion E kann entweder direkt mit NaOH neutralisiert und gelagert werden, oder man kann sie mit 200 ml destilliertem Wasser versetzen. Die erhaltene Lösung wird im Vakuum zur Trockene eingeengt, in 25 ml destilliertem Wasser gelöst, wonach man die restliche Säure mit NaOH neutralisiert.

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Claims

PatenLunaprüchu

(Π Verfahren zur Herstellung von entzündungshemmendem Material, dadurch gekennzeichnet, daß man Serum, Plasma oder eine geeignete Fraktion davon einer Ultrafiltration und dann einer Gel-Filtration unterzieht und aus dem Gel eine Fraktion eluiert, die bei dem Karrageenan-Rattenpfoten-ödem-Test eine entzündungshemmende Wirkung entfaltet.
2. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennz e i c h ne t, daß man die aktive Fraktion mit einem wässrigen Medium geringer Ionenstärke aus dem Gel eluiert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution mit destilliertem Wasser

erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution mit einem Medium mit einer Ionenstärke bewirkt wird,die einer Molarität von weniger als 0,2 entspricht. ' ^l
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis A; dadurch gekennz eichnet, daß die Gel-Filtration über ein vernetztes Dextran erfolgt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Ultrafiltrat vor der Durchführung der Gel-Filtration eingeengt wird.

7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine

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zusätzliche Reinigungsstufe mit Hilfe der Anionenaustauscherchromatographie durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Anxonenaustauscherrexnxgung nach der Gel-Filtration durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafiltration mit Hilfe einer ültrafxl.trationsmembran bewirkt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafiltration mit Hilfe eines Bündels hohler Fasern durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial ein von menschlichem Blut abgeleitetes Material verwendet.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial ein von Rinderblut abgeleitetes Material einsetzt.

13. Entzündungshemmendes Material, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.

14. Entzündungshemmende Serum- oder Plasma-Fraktion, die im wesentlichen frei ist von Bestandteilen mit einem Molekulargewicht oberhalb 1000 und die bei dem Karrageenan-Rattenpfoten-ödem-Test aktiv ist.

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