DE2605576C3 - Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain,,Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft von Carica papya und Verwendung der isolierten Proteasen zur Herstellung von sterilisierten und Iyophilisirten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparaten - Google Patents
Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain,,Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft von Carica papya und Verwendung der isolierten Proteasen zur Herstellung von sterilisierten und Iyophilisirten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen PräparatenInfo
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Description
eines Tris-HCl- oder Phosphatpuffers, äquilibriert werden.
Das erfindungsgemäBe Verfahren wird in der Weise durchgeführt, daß roher getrockneter Milchsaft
von Carica papaya in einer ausreichenden Menge in dem Anfangspuffer gelöst und die durch Zentrifugieren
erhaltene klare Lösung in den Kopf einer mit dem oben genannten Chromatographiematerial gefüllten Chromatographiekolonne
aufgegeben wird. Mit dem gleichen Puffer wird so lange eluiert, bis die nicht-aktiven
Bestandteile des Gemisches vollständig entfernt sind, was durch Messung der UV-Absorption bei einer
bestimmten Wellenlänge festgestellt wird. Anschließend wird mit einer von 0,01 M bis 1,0M steigenden
Ionenkonzentraticn der Tris-HCI- oder Phosphatpufferlösung
chromatographiert, so daß in den dabei erhaltenen aufeinander folgenden Eluaten die einzelnen
Proteasen enthalten sind. Zuerst werden Papain und Chimopapain, danach Lysozym und Proteinase X
eluiert Zur Entfernung der Salze, die in der Pufferlösung enthalten sind, wird zweckmäßig zwischen Kolonne und
Detektor ein Dialysator vorgesehen. Die einzelnen Lösungen der proleolytisch aktiven Enzyme werden
dann durch Ultrafiltration eingeengt und danach durch Lyophilisieren getrocknet Das getrocknete Enzym wird
durch Elektrophorese kontrolliert und es wird seine spezifische Aktivität bestimmt. Die Elektrophorese wird
mit Celluloseacetat in einem Veronalpuffer bei einem pH-Wert von 8,6 und einer konstanten Spannung von
170 V durchgeführt. Die Elektrophoresezeit beträgt im
allgemeinen 40 Minuten. Die Bänder werden in einer l%igen Lösung von Naphthalinschwarz 12 B (vgl.
Fig. 1) entwickelt. Die spezifische Aktivität der einzelnen Proteasen wird nach dem Verfahren von
Anson, beschrieben im »The Journal of General Physiology«, 1939, mit einem Hämoglobinsubstrat bei
pH 7 und 37° C bestimmt. Parallel dazu wird die Aktivität auf einem synthetischen Substrat BEAE
(N-a-Benzoyl-L-arginin-äthylester-hydrochlorid) kontrolliert
(vgl. A. Lauwers und R. Ruyssen, »Journal de Pharmacie de Belgique«, 20,1965, Seiten 1 bis 2, und N.
Hennrich und W. Brummer, »Pharm. Ind.« 35, Nr. 4, 1973).
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Proteasen werden einzeln oder im Gemisch zur
Herstellung eines sterilisierten und lyophilisierten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen
Präparats verwendet, indem man die einzelnen Proteasen oder ein Gemisch davon mit Natriumchlorid
in einem Verhältnis von Protease : Salz von 1 :1 bis 1 :3
versetzt Die eingesetzte Menge an Protease bzw. Proteasengemisch sollte der geforderten Wirkungsdosis
entsprechen und vorzugsweise wird das Salz, in einer solchen Menge verwendet, daß beim Auflösen des
Präparats eine physiologische Lösung entstent. Diese Lösung wird dann filtriert und die erhaltene sterile
Lösung wird in Penicillinflaschen dosiert und lyophilisiert.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Eine chromatographische Kolonne mit einem Durchmesser von 30 mm und einer Länge von 1000 mm wird
mit dem am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Sephadex SP-50 bekannten Chromatographiematerial
gefüllt, das in einem 0,01 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 (6 Teile Dinatriumhydrogenphosphat
und 4 Teile Kaliumdihydrogenphosphat) suspendiert ist Danach werden auf den Kopf der Kolonne 5 g Milchsaft
von Carica papaya, gelöst in 3 bis 5 ml des Phosphatpuffers, aufgegeben. Die Kolonne wird so
lange eluiert, bis die nicht aktiven Komponenten des Gemisches entfernt worden sind, bestimmt unter
Verwendung eines UV-Absorptionsdetektors (vgl. in der F i g. 1 den mit N bezeichneten Maximalwert bei
λ = 280 nm). Danach wird mit allmählich steigender Konzentration der Pufferlösung eluiert, wobei am
Schluß mit einem 1 M Puffer eluiert wird. Die in der beiliegenden Zeichnung (Fig. 1) angegebenen Maxima
A, B, C und D der elektrophoretischen Kontrolle
entsprechen den Proteasen, Papain, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X. Die Ausbeute der einzelnen
Fraktionen beträgt 40 Gew.-% nicht-aktive Komponenten, 8 Gew.-% Papain, 32 Gew.-% Chimopapain, 5
Gew.-% Lysozym und 15Gew.-% Proteinase X.
Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei diesmal ein 0,01 M Tris-HCl-Puffer
mit einem pH-Wert von 7 verwendet wird. Mit dem anfänglichen Puffersystem werden die nicht-aktiven
Komponenten (Maximum N der Fi g. 2) eluiert und dann wird durch allmähliche Zugabe einer 1 M
Natriumchloridlösung die Auftrennung in Papain (A), Chimopapain und Lysozym (B) und Proteinase X (C)
erzielt.
Die in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen proteolytisch aktiven Komponenten werden in einer wäßrigen
Natriumchloridlösung in der Weise gelöst, daß die Konzentration an Natriumchlorid in Wasser 1,8% und
die Konzentration an aktivem Enzym 200 mAnson-Einheiten auf 1 ml Salzlösung betragen. In eine Penicilinflasche
wird 1 ml der Enzym-Salzlösung eingefüllt und steril lyophilisiert. Das Lyophilysat enthält 0,01 g NaCl
und 200 mAnson-Einheiten Enzym. Vor der Verwendung wird die Zubereitung in 2 ml bidestilliertem
Wasser gelöst.
In Abhängigkeit von der Aktivität des proteolytisch aktiven Enzyms bzw. des proteolytisch aktiven Enzymgemisches
beträgt das Verhältnis von Enzym zu Salz 1 :1 bis 1 :3. In dem Beispiel 1 beschriebenen Verfahren
beträgt das Gewichtsverhältnis von Salz zu Enzym 1 :1,8, bei der oben angebenen Aktivität von 100 mAnson-Einheiten
auf 1 ml physiologische Lösung. Ein in der Weise hergestelltes Präparat ist in der Orthopädie für
die Behandlung von Hernia disci, in der Neurochirurgie und der Ophthalmologie verwendbar.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (2)
1. Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus de.n
Milchsaft von Carica papaya, dadurch gekennzeichnet, daß roher Milchsaft von Carica
papaya bei einem pH-Wert von 7 an einer mit einem am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung
Sephadex SP erhältlichen Chromatographiematerial gefüllten Kolonne mit Tris-HCl- oder Phosphatpufferlösuiig
mit einer von 0,01 M bis 1,0 M steigenden Ionenkonzentration chromatographiert wird.
2. Verwendung der nach Anspruch 1 isolierten Proteasen einzeln oder im Gemisch zur Herstellung
von sterilisierten und lyophilisierten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparaten
durch Versetzen der Proteasen mit Natriumchlorid in einem Verhältnis von Protease : Salz
von 1 : 1 bis 1:3.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain, Chimopapain, Lysozym und
Proteinasf1 X aus dem Milchsaft von Carica papaya
sowie die Verwendung der dabei erhaltenen isolierten Proteasen einzeln oder im Gemisch zur Herstellung von
sterilisierten und lyophilisierten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparaten.
Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Isolierung und Reinigung der oben genannten proteolytischen
Enzyme (Proteasen) Papain, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft von Carica papaya
bekannt, beispielsweise durch Ausfällung der proteolytisch aktiven Fraktionen mit einem Salz (US-Patentschrift
32 10 257) oder durch partielle Ausfällung mit Alkoholen (US-Patentschrift 30 11 952). Bei diesen
Isolierungs- und Reinigungsverfahren sind die proteolytisch aktiven Enzyme stets von einem Teil der
nicht-aktiven Bestandteile begleitet und alle Enzymfraktionen liegen in Form eines Gemisches vor.
Es ist auch bereits bekannt, daß die oben genannten Proteasen durch Säulenchromatographie unter Verwendung
bestimmter Kationenaustauscher isoliert und gereinigt werden können. Damit ist es möglich, die
nicht-aktiven Bestandteile von den aktiven Proteasen zu trennen, wobei die aktiven Proteasen in zwei verschiedene
Fraktionen, nämlich in Chimopapain A und Chimopapain B, getrennt werden (französische Patentschrift
19 52 192). Jede dieser Fraktionen enthält jedoch immer noch ein Gemisch aus zwei proteolytisch aktiven
Proteinen.
Da für die Anwendung in der Humanmedizin die oben genannten Proteasen einzeln in Bezug auf ihre Toxizität,
ihre spezifische und immunologische Aktivität untersucht werden müssen, genügt die bisher erzielbare
Isolierung und Reinigung der oben genannten Proteasen den heutigen Anforderungen nicht, da in den dabei
erhaltenen Produkten stets Gemische der Proteasen vorliegen.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein neues. Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain, Chimopapain,
Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft
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65 von Carica papaya zu entwickeln, mit dessen Hilfe es möglich ist, auf technisch einfache und dennoch
wirksame Weise die genannten Proteasen voneinander zu trennen, ohne daß eine Ausfällung erforderlich ist, so
daß diese zur Herstellung von orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparaten
verwendet werden können.
Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst werden kann durch ein
Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft
von Carica papaya, das dadurch gekennzeichnet ist, daß roher Milchsaft von Carica papaya bei einem pH-Wert
von 7 an einer mit einem am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Sephadex SP erhältlichen Chromatographiematerial
gefüllten Kolonne mit Tris-HCl- oder Phosphatpufferlösung mit einer von 0,01 M bis
I1OM steigenden Ionenkonzentration chromatographiert
wird.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich die einzelnen oben genannten Proteasen in reiner,
proteolytisch aktiver Form aus dem Milchsaft von Carica papaya isolieren, so daß die dabei erhaltenen
Produkte zum Abbau von lokalen Gewebedeformationen, wie zum Beispiel Hernia disci, eingesetzt werden
können.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten
Proteasen einzeln oder im Gemisch zur Herstellung von sterilisierten und lyophilisierten orthopädischen, neurochirurgischen
oder ophthalmologischen Präparaten durch Versetzen der Proteasen mit Natriumchlorid in
einem Verhältnis von Protease : Salz von 1 :1 bis 1 :3.
Die dabei erhaltenen Präparate haben gegenüber bekannten, vergleichbaren Präparaten, beispielsweise
gegenüber dem Präparat »Disease« (vgl. die französische Patentschrift 19 52 192) den Vorteil, daß sie stabiler
sind als das bekannte Präparat, da sie Lyophilisate aus dem Gemisch Enzym/Nateriumchlorid darstellen, daß
ihr Anwendungsgebiet breiter ist als dasjenige des bekannten Präparats, das nur in der Ophthalmologie
einse'.zbar ist, und daß durch Zugabe von Proteinase X zu jedem der erfindungsgemäßen Präparate die
Möglichkeit besteht, die enzymatische Wirkung der Präparate in hohem Maße zu steigern und die
therapeutische Dosis herabzusetzen.
Bei dem in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Chromatographiematerial handelt es sich
um ein am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Sephadex SP erhältliches, durch Sulfopropylgruppen
substituiertes, polymerisiertes Dextran. Es hat die Fähigkeit, Moleküle verschiedener Größe voneinander
zu trennen. Durch eine geeignete Auswahl der Vernetzung eines solchen Dextrans ist es möglich,
Moleküle mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 50 000 von anderen zu trennen, wobei die freien
Sulfopropylgruppen als Kationenaustauscher wirken. Durch Veränderung der Bedingungen während der
Chromatographie werden an ein solches Chromatographiematerial einzelne Bestandteile des Enzymgemisches
aufgrund ihrer verschiedenen chemischen und physikalischen Eigenschaften gebunden und danach durch
Eluieren wieder abgetrennt. Durch abwechselndes Auswaschen mit 0,5 η Salzsäure und 0,5 η Natronlauge
kann das Chromatographiematerial aktiviert bzw. nach seiner Verwendung regeneriert werden. Vor seiner
Verwendung kann es innerhalb der Kolonne durch Verwendung eines geeigneten Puffersystems, wie z. B.
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