DE3402647C2

DE3402647C2 - Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin

Info

Publication number: DE3402647C2
Application number: DE3402647A
Authority: DE
Inventors: Satoshi Katano Funakoshi; Morio Kuboyama; Kazuo Fukuchiyama Morimoto; Muneo Kawasaki Yamada; Nobuya Tokyo Yanai; Hajime Tokyo Yokota
Original assignee: Green Cross Corp Japan; Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1983-01-28
Filing date: 1984-01-26
Publication date: 1986-11-27
Also published as: AU2280683A; GB2134528B; US4482485A; JPS59137417A; GB2134528A; JPS6160049B2; CA1200489A; GB8334220D0; FR2540121B1; DE3402647A1; AU545411B2; FR2540121A1

Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin, z. B. aus einer hinsichtlich der Proteine konzentrierten Lösung von Urin. Die Lösung wird mit einem Stabilisator, wie einem Octylphenoxypolyäthoxyäthanol oder einem Polyäthylenglykol versetzt, die ein Molekulargewicht von 1000 bis 10000 haben, und der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit molekularen Ausschlußgrenzen von 105 bis 5 · 105 - bestimmt mittels eines globulären Proteins - unterworfen.

Description

Koloniestimulierender Faktor (CSF) und Kallikrein sind hochmolekulare, physiologisch aktive Substanzen, die in menschlichem Urin in Spuren vorkommen. CSF ist ein Glykoprotein, das auf granulopoetische Stammzelien im Knochenmark einwirkt und die Proliferation und Differenzierung dieser Zellen unter Bildung von Monocyten-Makrophagen und Granulocyten stimuliert. Die Granulocyten gehören zur Gruppe der Leukocyten; vgl. K. Motoyoshi et al., Blood, Bd. 52 (1978), 1012-1020, y.nd S. K. Das et al., Blood, Bd. 58 (1981), 630-641. Es ist ferner bekannt, daß CSF auch die in vivo-Bildung von CSF stimuliert, wenn es einem Krebspatienten gegeben wird, der an einer ernstlichen Leukopenie aufgrund einer Behandlung mit carcinostatischen Verbindungen oder Röntgenbestrahlung leidet. CSF fördert die Erholung oder die Zunahme der Zahl der Leukocyten, deren Hauptanteil die Granulocyten sind; vgl. K. Motoyoshi et al., Japanese Journal of Medicine, Bd. 21 (1982), 187-191.

Kallikrein ist ein proteolytisches Enzym, das bei der Bildung von Kinin eine Rolle spielt. Kinin ist ein physiologisch aktives Peptid, das sich vom Kininogen ableitet. Kininogen kommt im Säugerplasma vor. Das aus Kallikrein gebildete Kinin wirkt erweiternd auf die peripheren Blutgefäße und erhöht die Permeabilität der Blutgefäße. Kallikrein steuert diese Aktivitäten. Es sind Kallikreinpräparate bekannt, die aus tierischem Pankreas gewonnen und die in der Klinik zur Verbesserung der Blutzirkulation eingesetzt werden. Kallikrein aus menschlichem Urin hat eine physiologische Wirkung, die derjenigen von Kallikrein tierischen Ursprungs gleichwertig ist. Aufgrund seines menschlichen Ursprungs haben solche Kallikreinpräparate geringere Nebenwirkungen.

Sie können daher wiederholt gegeben werden. Somit sind derartige Präparate erheblich wertvoller als die Kallikreinpräparate tierischen Ursprungs.

Zur Herstellung von Präparaten durch Isolierung von CSF und Kallikrein aus menschlichem Urin ist die gegenseitige Verunreinigung der beiden Substanzen unerwünscht im Hinblick auf die Qualität und Sicherheit des Präparates. Bei Verwendung von CSF zur Behandlung von Granulocytopenie wird es intravenös gegeben. Deshalb ist eine Verunreinigung von CSF durch Kallikrein untragbar. Wenn Kallikrein selbst in sehr geringen Mengen intravenös gegeben wird, verursacht es eine starke Senkung des Blutdrucks aufgrund seiner erweiternden Wirkung auf periphere Blutgefäße. Die Verabfolgung größerer Mengen an Kallikrein zusammen mit CSF auf intravenösem Wege kann aufgrund des raschen Blutdruckabfalls zum Schock führen.

Es liegen nur sehr geringe Informationen über wirksame Verfahren zur Isolierung und Trennung von CSF und Kallikrein aus menschlichem Urin vor. Der Grund hierfür ist, daß beide Substanzen sehr ähnliche Eigenschaften aufweisen, obwohl ihre physiologischen Wirkungen verschieden sind. Beispielsweise sind sowohl CSF als auch Kallikrein Proteine mit einer Zuckerkette, und ihr isoelektrischer Punkt liegt im Bereich von pH 3,0 bis 4,5. Es ist deshalb schwierig, sie aufgrund ihrer elektrischen Eigenschaften voneinander zu trennen. In menschlichem Urin haben die beiden Substanzen ein sehr ähnliches Molekulargewicht. CSF hat ein Molekulargewicht von 60000 bis 100000 Dalton und Kallikrein ein Molekulargewicht von 50000 bis 80000 Dalton.

Die bekannten Methoden zur Abtrennung und Reinigung von CSF oder Kallikrein aus menschlichem Urin sind für eine wirksame und gleichzeitige Reinigung dieser Substanzen unbrauchbar. Bei der Gewinnung von CSF in gereinigter Form und frei von Kallikrein ist die Ausbeute an Kallikrein sehr schlecht. Bei der Isolierung von Kallikrein ist die Gewinnung von CSF unmöglich. Ein Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung von Kallikrein und CSF aus menschlichem Urin in gereinigter Form und in hoher Ausbeute ist unter Verwendung der Affinitätschromatographie und der Ionenaustauschchromatographie bekannt; vgl. JP-OS 58629/82.

Dieses bekannte Verfahren befriedigt jedoch noch nicht vollständig. Beispielsweise hat die Affinitätschromatographie zwar eine ausgezeichnete Trennungscharakteristik, jedoch sind die Kosten des Adsorptionsmittels pro Einheitsmenge des zu verarbeitenden Ausgangsmaterials hoch. Der Ionenaustausch andererseits ist zwar sehr wirischafiiich, hai jedoch verfahrenstechnische Nachiciie, insbesondere bei der Konzentrierung durch Giadienteneluierung zur Erzielung einer genauen Fraktionierung. Diese Maßnahme erfordert größte Sorgfalt und ist zeitaufwendig. Eine dritte Methode zur gleichzeitigen Isolierung von CSF und Kallikrein in gereinigtem Zustand ist die Gelfiltrationschromatographie, bei der die Fraktionierung aufgrund der Unterschiede des Molekulargewichts durchgeführt wird. Die bisher verwendeten weichen Gele, hauptsächlich Polysaccharide oder verschiedene Kunststoffe, konnten jedoch eine vollständige Trennung von CSF und Kallikrein nicht bewirken, woil ihre Molekulargewichte so nahe beieinander liegen.

Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Methode, die erst seit kurzem entwickelt worden ist. Diese Methode gestattet es, unter hohem Druck und hoher Strömungsgeschwindigkeit verschiedene Verbindungen in sehr kurzer Zeit extrem genau chromatographisch zu fraktionieren. Insbesondere auf dem Gebiet der Gelfiltration stellt diese Methode eine bedeutende Verbesserung der Fraktionierung hochmolekularer Substanzen aufgrund ihres Molekulargewichts dar. Gleichzeitig wurden harte Gele mit ausgezeichneter Druckbeständigkeit entwickelt, die anstelle der bekannten weichen Gele als Adsorptionsmittel verwendet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor (CSF) und Kallikrein aus menschlichem Urin unter Verwendung einer Gelfiltration mittels HPLC zu entwickeln.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß CSF und Kallikrein ausgezeichnet durch HPLC unter Verwendung eines druckbeständigen Gels getrennt werden können. Dieses Gel besteht hauptsächlich aus Silicagel. Kommerziell erhältliche Gele für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie zeigen eine unspezifische Adsorption von CSF und Kallikrein, und ein Teil dieser Substanzen bleibt auf der Geloberfiäche. Die unspezifische Adsorption auf der Geloberfiäche ist eine Erscheinung, die allgemein bei handelsüblichen Geien beobachtet wird. Es ist jedoch möglich, diese Erscheinung durch Erhöhung der Ionenstärke des für die Chromatographie verwendeten Lösungsmittels zu unterdrücken. Eine Erhöhung der lonenstärke andererseits hat zur Folge, daß die biologische Aktivität des CSF instabil wird und sich die Ausbeute vermindert.

Die Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen über die Bedingungen der Hochleistungs-Flüssigkeitsgelfiltration zur wirksamen Abtrennung und Reinigung von CSF und Kallikrein sowie der unspezifischen Adsorption an dem Gel und der Abnahme der CSF-Aktivität durchgeführt. Die Lösung der erfindüngsgemäßen Aufgabe beruht auf dem Befund, daß ein Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (OPPE) oder ein PoIyäthyienglykol, die als Stabilisator für die CSF-Aktivität bekannt sind, für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet sind.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung aus koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin oder aus einer koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin enthaltenden Lösung, bei dem man den Urin oder die Lösung zunächst hinsichtlich des Proteingehalts in an sich bekannter Weise konzentriert, dadurch gekennzeichnet, daß man das erhaltene Konzentrat mit einer Pufferlösung äquilibriert, die eine lonenstärke von 0,05 bis 0,5 und einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0 aufweist, und die 0,01 bis 0,1 Gewichtsprozent pro Volumen Octylphenoxypolyäthoxyäthanol oder Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10000 Dalton als Stabilisator enthält, die Flüssigkeit einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) durch Einleiten in eine Säule, die mit einem Gel mit einer molekularen Ausschlußgrenze - bestimmt mit einem globulären Protein - von 10⁵ bis 5 x 10* gefüllt ist und die mit der Pufferlösung äquilibriert worden ist, unterwirft, und die den koloniestimulierenden Faktor enthaltende Fraktion als Fraktion mit einem einzigen Elutionspeak bei einem Molekulargewicht von 85 000 Dalton sowie die Kallikrein-Fraktion als eine Fraktion mit einem Elutionspeak bei einem Molekulargewicht von 60000 Dalton einzeln isoliert.

Die F i g. 1 und 2 zeigen das Fraktionierungsmuster von CSF und Kallikrein durch Gelfiltration nach dem bekannten Verfahren und durch HPLC nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. In beiden Figuren ist auf der linken Ordinate die CSF-Aktivität und die optische Dichte bei 280 nm aufgetragen. Auf der rechten Ordinate ist die Kallikrein-Aktivität aufgetragen. Auf der Abszisse ist die Nummer der Fraktion aufgetragen. Die Symbole -, -O- und -·- zeigen die optische Dichte, die CSF-Aktivität und die Kallikrein-Aktivität.

Menschlicher Urin oder eine koloniestimulierenden Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin enthaltende Lösung wird mit verdünnter Säure oder Alkali auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt und nach einer geeigneten bekannten Methode zum Konzentrieren von Proteinen konzentriert, beispielsweise durch Adsorption an einem anorganischen Adsorptionsmittel, wie Kieselgel oder an einem Ionenaustauscher, Aussalzen unter Verwendung eines Neutralsalzes, wie Ammoniumsulfat, Ultrafiltration oder einer Kombination derartiger Maßnahmen. Der Proteingehalt in der erhaltenen konzentrierten Lösung beträgt vorzugsweise 2 bis 10 Gewichtsprozent pro Volumen.

Gewichtsprozent pro Volumen bzw. Volumenprozent pro Volumen bedeutet die Gewichtsmenge (g) oder Volumenmenge (ml) an Material in 100 ml der Flüssigkeit.

Zweckmäßig werden im erfindungsgemäßen Verfahren bekannte Methoden bei der Konzentrierungsstufe verwendet, um verunreinigende hochmolekulare Substanzen so gut wie möglich innerhalb eines Bereiches abzutrennen, der sich auf die Gewinnung von CSF und Kallikrein nicht schädlich auswirkt.

Die erhaltene konzentrierte Flüssigkeit wird mit einer Pufferlösung mit einer Ionenstärke von mindestens 0,05 und weniger als 0_:5, vorzugsweise von 0,1 bis 0,3 und mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0, beispielsweise einer Natriumphosphatpufferlösung äquilibriert. Sodann wird OPPE, z. B. Triton X-100®, oder ein Polyäthylenglykol zugegeben. Beide Substanzen sollen ein Molekulargewicht von 1000 bis 10000 haben. Diese Substanzen werden als Stabilisator in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 Gewichtsprozent pro Volumen zur Lösung gegeben. Sodann wird die erhaltene Flüssigkeit einer HPLC unterworfen. Zu diesem Zweck wird die Flüssigkeit in eine Säule eingeleitet, die mit einem Gel für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gefüllt ist. Das Gel hat eine molekulare Ausschlußgrenze von 10^s bis 5 x IC? Dalton, bestimmt mit einem globulären Protein. Ein derartiges Gel ist beispielsweise TSK-GeI 3000 SW, Zorbax" PSM-1000 oder Shim-pack® HSG-40. Das Gel wird mit der vorgenannten Pufferlösung äquili^riert, die die gleiche Menge an Stabilisator enthält. Zu diesem Zweck wird die Lösung vorher durch das Gelbett geleitet. Die Flüssigkeit wird durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 5 ml X cm"² X min"¹ mittels einer Hochdruckpumpe geleitet. Der Druck der Pufferlösung, die durch die Säule geleitet wird, hängt vom Durchmesser der Säule ab. Normalerweise beträgt der Druck bei einem Säulendurchmesser von 5 mm vorzugsweise mindestens 10 kg/cm² (10 bar).

Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wird aus der Säule CSF als Fraktion mit einem einzigen ^! Elutionspeak bei einem Molekulargewicht von 85000 Dalton und Kallikrein als eine Fraktion mit einem <' Elutionspeak bei einem Molekulargewicht von 60000 Dalton einzeln isoliert. Sowohl CSF als auch Kallikrein ί_ή können noch der Dialyse und dem Entsalzen unterworfen werden, sie können mit einem pharmazeutisch ver- \< träglichen, den pH-Wert einstellenden Salz vermischt, einem Hilfsmittel zur Verbesserung der Auflösung oder ψ einem Exzipient versetzt und anschließend zur Sterilisation z. B. der Membranfiltration unterworfen werden. *' Danach werden die Präparate abgefüllt oder unter aseptischen Bedingungen lyophilisiert. Das auf die vorstehend beschriebene Weise isolierte CSF und Kallikrein kann einzeln nach an sich bekannten Methoden noch weiter gereinigt werden.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Versuche und Beispiele weiter erläutert.

Versuch 1
Vergleich der HPLC nach dem Verfahren der Erfindung mit einem bekannten Verfahren

Eine konzentrierte Flüssigkeit aus menschlichem Urin, die auf die nachstehend in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt worden ist, wird der Gelfiltrationschromatographie an Sephacryl S-300 nach dem bekannten Verfahren sowie der Hochleistungs-Fiüssigkeitschromatographie (HPLC) an TSK-GeI 3000 SW nach dem Vcrfahren der Erfindung unterworfen, um die Abtrennungscharakteristika der beiden Methoden zu vergleichen. In die Sephacryl S-300-Säule (Durchmesser 20 X 1200 mm) werden 1,4 ml der konzentrierten Flüssigkeit gegeben, während in die TSK-GeI 3000 SW-Säule (Durchmesser 7,5 x 1200 mm) 0,2 ml der gleichen Flüssigkeit gegeben werden. Zur Chromatographie wird die gleiche Pufferlösung wie in Beispiel 1 in einer Strömungsgeschwindigkeit in der erstgenannten Säule von 5 ml/cm²/Stunde mittels einer Perista-Pumpe und in der zweitgenannten

Säule in einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,0 ml/cm²/Minute mittels einer Hochdruck-Flüssigkeitspumpe LC-3 A geleitet. Es werden jeweils 5-ml-Fraktionen aus der erstgenannten Säule bzw. 2-ml-Fraktionen aus der zweitgenannten Säule aufgefangen und auf ihre CSF-und Kallikrein-Aktivität folgendermaßen untersucht. Die CSF-Aktivität wird nach der Koloniebildungsmethode mit C₅₇BLA)N Mäuseknochenmarkszellen unter Verwendung der Monolayer-Weichagar-Kultur-Technik bestimmt. Jede Fraktionsprobe wird mit destilliertem Wasser verdünnt, das 2 Volumenprozent pro Volumen Rinderserum enthält, und durch Filtration sterilisiert. Es wird ein 0,45-Mikron-Filter verwendet. Jeweils 0,1 ml Anteile des Filtrats werden in drei Petrischalen gegeben, die mit 1 ml Mc-Coy's-5 Α-Medium (enthaltend 0,3 Gewichtsprozent pro Volumen Agar und 20 Volumprozent pro Volumen fetales Kälberserum) sowie 1 x 10^s C₅₇BL/6N Mäuseknochenmarkzellen versetzt. Nach gründlichem Mischen wird das Gemisch 7 Tage in einem Inkubator bei 37⁰C in vollständig angefeuchteter, 7,5 Volumprozent pro Volumen Kohlendioxid enthaltender Atmosphäre inkubiert. Nach dem Inkubieren wird die Anzahl der entstandenen Kolonien unter einem Mikroskop gezählt. Der Ausdruck »Kolonie« bedeutet ein Zeliaggregat, das mehr als 50 Zellen enthält. Die CSF-Aktivität wird ausgedrückt durch die Zahl (Einheiten) der gebildeten Kolonien. Eine Einheit bedeutet eine gebildete Kolonie. Die Reinheit der erhaltenen CSF-Probc wird ausgedrückt durch die spezifische Aktivität. Dies zeigt die Zahl der Kolonien die durch 1 mg der Protcinprobe gebildet worden ist.

Die Kallikrein-Aktivität wird enzymatisch mit H-D-Val-Leu-Arg-paranitroanilin (nachstehend als Peptid-PNA bezeichnet), einem synthetischen Substrat für Kallikrein, bestimmt. 0,1 ml der Probe wird mit 2 ml einer 0,2 M tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) vermischt, 5 Minuten bei 37°C vorinkubiert, sodann mit 0,2 ml einer 0,2 mM Lösung des Peptid-PNA vermischt und 30 Minuten bei 37°C umgesetzt. Anschließend werden 0,2 ml 50 Gewichtsprozent pro Volumen Essigsäurelösung zum Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktion abzubrechen. Hierauf wird die freigesetzte Menge an PNA bei 405 nm bestimmt. Eine Probe, die Aprotinin, einen Kallikrein-Inhibitor, enthält, wird als Kontrolle verwendet. Die Kallikrein-Aktivität wird ausgedrückt durch die pro Minute bei 37°C gebildete Menge an PNA. Eine PNA-Einheit bedeutet 1 Mikromol PNA, das in 1 Minute gebildet wird.

Die Trennungsmuster nach dem bekannten Verfahren und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sind in Fig. 1 bzw. Fig. 2 wiedergegeben.

In beiden Figuren sind auf der linken Ordinate die CSF-Aktivität und die optische Dichte bei 280 nm und auf der rechten Ordinate die Kallikrein-Aktivität aufgetragen. Auf der Abszisse ist die Nummer der Fraktion aufgetragen. Die Symbole -, -O- und -·- zeigen die optische Dichte, die CSF-Aktivität und die Kallikrein-Aktivität an.

Bei der Gelfiltrationschromatographie mit Sephacryl S-300 nach dem bekannten Verfahren lassen sich CSF und Kallikrein nicht vollständig voneinander trennen; die Ausbeute an kallikreinfreierCSF-Fraktion liegt unter 30%. Bei der Hochleistungs-FIüssigkeitschromatographie nach dem Verfahren der Erfindung lassen sich CSF und Kallikrein nahezu vollständig voneinander trennen; die Ausbeute an kallikreinfreiem CSF beträgt mindestens 90%. Die Ergebnisse der Ausbeute an CSF und Kallikrein sowie des Gehalts an Kallikrein in CSF nach den beiden vorstehend beschriebenen Methoden sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Ausbeuten an CSF und Kallikrein nach dem bekannten Verfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren

CSF-Fraktion	Kallikrein-	Kallikrein-
Ausbeute, %	Gehall	Ausbeule, %
	(PNA-Einheiten)

Ki

Sephacryl S-300 26,5 0,0019 38

Erfindungsgemäßes Verfahren 92,5 0,0001 >*) 90

Anmerkung: *) Unterhalb der Nachweisgrenze.

Versuch 2

Vergleich der Ausbeute unter verschiedenen Bedingungen der Ionenstärke der Pufferlösung und der Konzentration des Stabilisators

Zur Untersuchung der Adsorption von CSF und Kallikrein auf dem Gelfiltrationsträger für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie sowie des Einflusses der Ionenstärke der Pufferlösung und der Konzentration des Stabilisators wird die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt, und die CSF- und Kallikrein-Aktivität wird in gleicher Weise wie im Versuch 1 bestimmt, um die Ausbeuten zu vergleichen.

Die bei diesem Versuch verwendete konzentrierte Flüssigkeit aus menschlichem Urin wird in gleicher Weise hergestellt, wie dies nachstehend in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wird mit einer TSK-GeI 3000 SW-Säule (Durchmesser 7,5 X 1200 mm) und einer LC-3 Α-Pumpe bei Raumtemperatur und einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/Minute durchgeführt.

Als Stabilisator wird ein Polyäthylenglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 6000 Dalton verwendet. Es werden 0,01 bis 0,5 M Natriumphosphat-Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 7,0 verwendet. Die loncnstärke beträgt etwa 0,02 bis 1,14. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle II und Tabelle III zusammengefaßt. Bei der Chromatographie mit einer Pufferlösung unterschiedlicher Konzentration, die keinen Stabilisator enthält, ist in jedem Fall die Ausbeute niedrig. Insbesondere bei niedriger Ionenstärke ist sowohl die Ausbeute an CSF als auch die von Kallikrein niedrig.

Tabelle II

Konzentration einer stabilisatorfreien Pufferlösung und Ausbeute an CSF und Kallikrein

'45

Kallikrein-Ausbeute, %

59,8 so

60,8

84,6

Natriumphosphat- Konzentration, M	CSF-Ausbeute, %
0,01	20,6
0,05	38,3
0,1	42,9
0,2	40,3
0,3	39,5
0,4	29,6
0,5	28,8

80,5 79,4 81,8

Anmerkung:
Die Ausbeute bezieht sich auf die Aktivität der konzenirierten Flüssigkeit vor der Behandlung.

Beim Vergleich der Ausbeuten an CSF bei Verwendung einer 0,1 M Natriumphosphat-Pufferlösung (Ionenstarke 0,20), die Polyäthylenglykol oder Triton X-100 in unterschiedlichen Konzentrationen enthält, wie dies in Tabelle III angegeben ist, zeigte sich, daß die Ausbeute an CSF deutlich verbessert ist, wenn Polyäthylenglykol oder Triton X-100 als Stabilisator in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 % verwendet wird. Der Stabilisator wird

vorzugsweise in niedriger Konzentration verwendet. Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß eine Konzentralion von 0,01 Gewichtsprozent pro Volumen des Stabilisators gute Ergebnisse liefert. Bei Erhöhung der Konzentralion des Stabilisators über den erforderlichen Wert erfolgt unvollständige Trennung von CSF und Kallikrcin, und die Viskosität der Probe nimmt zu. Konzentrationen oberhalb 0,1 Gewichtsprozent pro Volumen sind nicht bevorzugt.

Tabelle III

CSF-Ausbeute mit Pufferlösungen unterschiedlicher Stabilisatorkonzentration

Triton-X-100

40,3 68,2 90,6 91,8 93,4 -*)

Stabilisatorkonzentration, "A, Gewicht pro Volumen	CSF-Ausbeute, % Polyäthylenglykol
0	40,3
0,005	72,6
0,01	88,4
0,05	92,4
0,1	94,5
0,5	-*)

Anmerkung:

*) Unvollständige Trennung von CSF und Kallikrein.

Die in Tabelle III zusammengefaßten Ergebnisse wurden mit einer 0,2 M Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7 erhalten. Selbst wenn die Ionenstärke der Pufferlösung durch Zugabe eines Neutralsalzes, wie Natriumchlorid, verändert wurde, konnte eine ähnliche Verbesserung der Ausbeute in Gegenwart des Stabilisators beobachtet werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Hier ist die Ausbeute an CSF und Kallikrein bei Verwendung verschiedener Pufferlösungen in Gegenwart von 0,01 % Polyäthylenglykol angegeben.

Tabelle IV

Ausbeute an CSF und Kallikrein mit verschiedenen Pufferlösungen

Pufferlösung

CSF-Ausbeute, %

Kallikrein-Ausbeutc, %

0,1 M NaCl + 0,02 M Natriumphosphat 90,8

(pH 7,0)

0,2 M KCl + 0,01 M tris-HCl 91,2

(pH 7,0)

92,4 92,8

Der pH-Wert der bei der Chromatographie verwendeten Pufferlösung hat keinen Einfluß auf die Trennung von CSF und Kallikrein. Sofern die Pufferlösung alkalisch reagiert und ein im wesentlichen aus Kieselgel bestehendes Gel verwendet wird, erfolgt Auflösung des Gels. Bei Verwendung von Pufferlösungen im sauren pH-Bereich können Korrosionsprobleme auftreten. Der bevorzugte pH-Bereich liegt im nahezu neutralen pH-Bereich, d. h. von 6,0 bis 8,0.

Beispiell

Etwa 20 1 menschlicher Urin werden mit 10 η Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule mit den Abmessungen 4,0 x 50 cm gegeben. Die Proteine werden an der Füllung adsorbiert. Sodann wird die Säule mit 500 ml 5prozentiger wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird mit 1 η Schwefelsäure neutralisiert und danach zur Abtrennung unlöslicher Substanzen 30 Minuten bei 8000 X g zentrifugiert. Der Überstand wird sodann mit Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt Es bildet sich eine Fällung, die bei 4°C während 30-Minuten bei 8000 X g abzentrifugiert wird. Die entstandene Fällung wird in 100 ml einer 0,02 M Phosphatpufferlösung pH 7 gelöst und mit der gleichen Pufferlösung auf das Zehnfache verdünnt. Danach wird die erhaltene Lösung mit 40 g DEAE-Cellulosc versetzt, die vorher mit dieser Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die Lösung und die DEAE-Cellulosc werden 1 Slundc bei 4°C gemischt Nach dem Mischen wird die DEAE-Ccllulose abfiitriert, gründlich mit 0,02 M Phosphatpufferlösung pH 7, die 0,1 M an Natriumchlorid ist, gewaschen und danach mit 500 ml einer 0,02 M Phosphat-

pufferlösung pll 7 eluiert, die 0,4 M an Natriumchlorid ist. Das Eluat wird durch ein Glasfilter filtriert und sodann mittels einer Ultrafiltrationsmembran (HC-I) konzentriert und gleichzeitig mit 0,1 M Phosphatpufferlösung pll 7 äquilibriert. Es wird eine konzentrierte Flüssigkeit von menschlichem Urin erhalten.

20 ml der erhaltenen konzentrierten Flüssigkeit (Proteinkonzentration 4,2 Gewichtsprozent pro'Volumen) werden mit Polyäthylenglykol 6000 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gewichtsprozent pro Volumen versetzt. Das Gemisch wird durch ein 0,4 Mikron Filter filtriert.

Die erhaltene konzentrierte Flüssigkeit (0,2 ml), wird auf eine Säule mit den Abmessungen 7,5 x 1200 mm gegeben, die mit TSK-GeI 3000 SW gefüllt ist. Die Füllung wird vorher mit 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) äquilibriert, die 0,01 Gewichtsprozent pro Volumen Polyäthylenglykol enthält. Zur Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wird die Pufferlösung durch die Säule in einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min mittels einer Hochdruckpumpe geführt. Dabei erfolgt eine Trennung von CSF und Kallikrein. Es werden jeweils 10 ml einer Fraktion von CSF und Kallikrein gewonnen, die durch Dialyse entsalzt und sodann unter aseptischen Bedingungen lyophilisiert werden. Auf diese Weise werden etwa 1 mg CSF und 2,4 mg Kallikrein erhalten. Die Ausbeute an CSF, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität, beträgt etwa 94 %. Die spezifische Aktivität des erhaltenen CSF beträgt 4 X 10^s Einheiten pro mg Protein. Es konnte keine Verunreinigung durch Kallikrein festgestellt werden. Die Ausbeute an Kallikrein, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität, beträgt etwa 78% und das Präparat hat eine spezifische Aktivität von 0,325 PNA Einheiten pro mg Protein.

Beispiel 2

20 I Urin von gesunden Menschen werden mit einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) mittels einer Ultrafiltrationsmembran (HIOPIO) äquilibriert. Sodann werden 40 g DEAE-Cellulose zugegeben, die vorher mit der Pufferlösung äquilibriert worden ist. Nach 1 stündigem Mischen bei 4° C wird die DEAE-Cellulose abfiltricrl, gründlich mit der Pufferlösung gewaschen und sodann mit 1 1 einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) cluicrt, die 0,4 M an Natriumchlorid ist. Es wird eine konzentrierte Flüssigkeit erhalten. Die konzentrierte Flüssigkeit wird mittels einer Ultrafiltrationsmembran weiter konzentriert, gegen eine 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) dialysiert, die 0,01 Gewichtsprozent pro Volumen Triton X-100 enthält, und sodann auf eine TSK-GeI 3000 SW Säule gegeben, die vorher mit der Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die weitere Behandlung und Aufarbeitung erfolgt gemäß Beispiel 1. Es werden etwa 0,9 mg CSF und etwa 2,5 mg Kallikrein erhalten. Die Ausbeute an CSF und Kallikrein, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität, beträgt 92 bzw. 94%.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat folgende Vorzüge:

(1) Die Ausbeuten an CSF und Kallikrein sind etwa 3,5- bzw. 2,5mal höher als nach den bekannten Verfahren;

(2) CSF und Kallikrein können gleichzeitig gewonnen werden;

(3) das CSF kann praktisch kallikreinfrei gewonnen werden;

(4) CSF und Kallikrein können in wesentlich kürzerer Zeit als bisher gewonnen werden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

40

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin oder aus einer koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin enthaltenden Lösung, bei dem man den Urin Oder die Lösung zunächst hinsichtlich des Proteingehalts in an sich bekannter Weise konzentriert, dadurch gekennzeichnet, daß man das erhaltene Konzentrat mit einer Pufferlösung äquilibriert, die eine Ionenstärke von 0,05 bis 0,5 und einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0 aufweist, und die 0,01 bis 0,1 Gewichtsprozent pro Volumen Octylphenoxypolyäthoxyäthanol oder Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10000 Dalton als Stabilisator enthält, die Flüssigkeit einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie durch Einleiten in eine Säule, die mit einem Gel mit einer molekularen Ausschlußgrenze - bestimmt mit einem globulären Protein - von 10⁵ bis 5 X10³ gefüllt ist und die mit der Pufferlösung äquilibriert worden ist, unterwirft, und die den koloniestimulierenden Faktor enthaltende Fraktion als Fraktion mit einem einzigen Elutionspeak bei einem Molekulargewicht von 85 000 Dalton sowie die Kallikrein-Fraktion als eine Fraktion mit einem Elutionspeak bei einem Molekulargewicht von 60000 Dalton einzeln isoliert.