DE3686470T2

DE3686470T2 - Verfahren zur herstellung des alpha-1-proteinase-inhibitors.

Info

Publication number: DE3686470T2
Application number: DE8686114461T
Authority: DE
Inventors: Michael H Coan
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1985-11-01
Filing date: 1986-10-18
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2006-10-19
Also published as: DE3686470D1; EP0221426A2; CA1286848C; US4697003A; ATE79633T1; AU6462486A; JPH0764750B2; EP0221426A3; AU591397B2; JPS62108821A; EP0221426B1; ES2051684T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Abtrennung des alpha-1-Proteinase-Inhibitors (PI) aus Blutplasma oder Blutplasmafraktionen. Weitere Gegenstände der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich, worin die Angaben von Teilen und Prozenten auf das Gewicht bezogen sind, wenn nichts anderes angegeben ist.
Der alpha-1-Proteinase-Inhibitor ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 54.000. Das Protein besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette, an die mehrere Oligosaccharideinheiten kovalent gebunden sind. Menschlicher PI spielt eine Rolle bei der Steuerung der Zerstörung von Gewebe durch endogene Serin-Proteinasen. Es ist gezeigt worden, daß ein genetischer Mangel an PI, der 90% der Trypsin-Inhibierung im Blutplasma bedingt, in Zusammenhang zu bringen ist mit einer vorzeitigen Entwicklung von Lungenemphysemen. Die mit Emphysemen einhergehende Schädigung von Elastin rührt wahrscheinlich her von einem örtlichen Ungleichgewicht elastolytischer Enzyme im natürlich vorkommenden Gewebe und Plasma-Proteinase-Inhibitoren. PI inhibiert rasch menschliche Bauchspeicherdrüsen- und Leukozytenelastasen (Biochem. Biophys. Res. Comm., Vol. 72, Nr. 1, Seiten 33-39, 1976; ibid., Vol. 88, Nr.2, S. 346 - 350, 1979).
Eine Anzahl von Verfahren ist angewandt worden, um PI aus Blutplasma zu isolieren. Eine Vielzahl dieser Verfahren ist auf eine Gewinnung im Labormaßstab gerichtet, während andere Verfahren die Produktion auf einer kommerziellen Ebene betreffen.
Pannell et al., Biochemistry, Vol. 13, Seiten 5439-5445, (1974), haben ein Verfahren angewandt, wobei albuminarmes Blutplasma gesammelt und mit festem Ammoniumsulfat (0,60 bis 0,80 Sättigung) fraktioniert wurde. Die entstandene Ausfällung wurde solubilisiert und dialysiert und auf eine DEAE-Zellulose-Säule gegeben. Die Fraktion mit PI, die im 0,05 bis 0,15 M NaCl-Lineargradient eluiert, wird gesammelt, aufkonzentriert und dialysiert und danach erneut auf eine DEAE-Zellulose-Säule gegeben. Die PI-Fraktion, die im Lineargradient von 0,05 bis 0,20 M NaCl eluiert, wurde gesammelt, zusammengefaßt und eingeengt, um PI zu ergeben.
Im Verfahren nach Saklatvala et al., Biochem. J., Vol. 157, S. 339 - 351 (1976), wurde menschliches Plasma unter Verwendung von Ammoniumsulfat (80% Sättigung) fraktioniert, um ein Präzipitat zu ergeben, das wieder aufgelöst, dialysiert und über DEAE-Zellulose chromatographiert wurde. Der Extrakt mit 0,5 M NaCl wurde auf eine Concanavalin-A-Sepharose-Säule gegeben. Das alpha-D-Methylglucopyranosid-Eluat wurde eingeengt und erneut auf eine DEAE-Zellulose-Säule gegeben. Das Eluat mit 0,0 - 0,2 M NaCl enthielt PI.
Die Ausfällung mit zu 50% gesättigtem Ammoniumsulfat wurde von Musiani et al., Biochem., Vol. 15, S. 798-804 (1976), angewandt, um eine PI-reiche Fraktion abzutrennen, die solubilisiert und dann aufeinanderfolgend chromatographiert wurde, und zwar unter Einsatz von DEAE-Ionenaustauscher, Concanavalin-A-Sepharose, Sephadex-G-100 und einer Immunoadsorbenssäule, um gereinigtes PI zu ergeben.
Eine Reinigung von PI aus menschlichem Plasma in großem Maßstab wurde von Kress et al., Preparative Biochemistry, Vol. 3, Nr. 6, S. 541-552 (1973), offenbart. Das Präzipitat aus der Behandlung von menschlichem Plasma mit 80%igem Ammoniumsulfat wurde dialysiert und an DEAE-Zellulose chromatographiert. Das erhaltene Konzentrat wurde erneut dialysiert und an Sephadex-G-100 gelfiltriert. Die PI-enthaltenden Fraktionen wurden zweimal über DE-52-Zellulose chromatographiert, um PI zu ergeben.
Glaser et al., ibid., Vol. 5, Nr. 4, S. 333 - 348 (1975), isolierten PI aus Cohn-Fraktion-IV-1 in 30% Gesamtausbeute. Gelöstes IV-1 wurde über DEAE-Zellulose, QAE-Sephadex, Concanavalin-A-Sepharose und G-150-Sephadex chromatographiert, um PI zu ergeben.
Ein integriertes Plasmafraktionierungssystem auf der Grundlage von Polyethylenglycol (PEG) wurde von Hao et al. offenbart, Proceedings of the International Workshop on Technology for Protein Separation and Improvement of Blood Plasma Fractionation, abgehalten vom 07. bis 09. September 1977, Reston, Virginia. In dem veröffentlichten Verfahren wurde das Cohn-Kryopräzipitat mit PEG in einer Menge von 40 Gramm pro Liter (g/l) vermischt. Alle Verfahrensmaßnahmen wurden bei 5ºC durchgeführt.
Nach Rühren über 60 Minuten wurde die erste Fraktion durch Zentrifugation entfernt. Zum Überstand wurden zusätzliche 60 g/l PEG gegeben (Endkonzentration ca. 10%). Prothrombin-Komplex (PTC) wurde dann aus dem 10% PEG-Überstand durch chargenweise Adsorption an DEAE-Zellulose extrahiert, und es wurden zusätzliche 100 g/l PEG zugefügt, um das 10 - 20% PEG-Präzipitat zu erhalten. Die so erhaltenen vier Fraktionen waren das 0 bis 4% PEG-Präzipitat, 4 bis 10% PEG-Präzipitat, 10 bis 20% PEG-Präzipitat und der 20% PEG-Überstand, diese wurden als Fraktionen A, B, C bzw. D bezeichnet. Dabei sollte herausgestellt werden, daß diese PEG-Konzentrationen auf das Originalvolumen des Kryoüberstands bezogen wurden.
Die Verteilung der Proteine in den vier PEG-Fraktionen war wie folgt: Fibrinogen war das vorherrschende Protein in Fraktion A, mit Albumin als dem überwiegenden Begleitstoff. Das meiste an kontaminierendem Albumin in Fraktionen A, B und C resultierte aus Mitausfällung und/oder Einschluß von Überstand, da Albumin als solches unter diesen Bedingungen nicht ausgefällt wurde. Fraktion B war reich an Plasminogen, C3-Komponente des Komplements IgG und IgM. Zudem lagen eigentlich alle beta-Lipoproteine in dieser Fraktion vor. Fraktion C enthielt deutliche Mengen an alpha&sub2;-Makroglobulin, IgA und war reich an Prothrombin und weiteren Koagulationsfaktoren, welche den sogenannten Prothrombin-Komplex darstellen. Jedoch fanden die Autoren heraus, daß bessere ausbeuten an PTC aus dem 10% PEG-Überstand als aus dem 10 bis 20% PEG-Präzipitat erhalten werden konnten. In Fraktion D lag hauptsächlich Albumin vor. Sie enthielt aber auch alles alpha-1-saures Glycoprotein wie auch das meiste des PI, Antithrombin III (AT III), Ceruloplasmin (Cp), Haptoglobin, Transferrin (Tf) und C1-Esterase-Inhibltor (C1-Inhib.). Mehrere weitere Proteine wurden ebenfalls aus Fraktion D isoliert, einschließlich Präalbumin (PA), Retinol-Bindungsprotein (RBP), Transcortin und Angiotensinogen. Ganz allgemein waren die meisten der kleineren Proteine in Fraktion D.
Coan und Brockway, US-PSen 4.379.087 und 4.439.358, offenbaren ein Verfahren zur Abtrennung von alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus einer Blutplasmafraktion, z.B. aus der Cohn-Fraktion IV-1, indem man eine wässrige Lösung der Blutplasmafraktion bereitstellt und diese Lösung bei einem pH von ca. 6.5 bis 8.5 und einer Temperatur von ca. 2 bis 50ºC über eine Zeitdauer von ca. 0,2 bis 24 h hält, die Lösung mit einer Menge an polykondensiertem Polyglycol, z.B. polyethylenglycol, in einem Bereich von ca. 8 - 10% bis zu ca. 23% (G/V), bezogen auf Volumen der Lösung, bei einem pH im Bereich von ca. 4.6 bis ca. 7,5 vermischt, wobei der Mengenbereich an polykondensiertem Polyglycol um ca. 2 - 3% pro 0,5 pH-Anstieg gesteigert wird. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden in dem patentierten Verfahren ca. 10 bis 15 g polykondensiertes Polyglycol pro 100 ml wässriger Lösung, enthaltend Cohn-Fraktion IV-1, bei einem pH im Bereich von 4,6 bis 5,7 eingesetzt, wobei das Verhältnis der Anteile an polykondensiertem Polyglycol zu den Anteilen an Blutplasmafaktion ca. 2:1 bis 1:1 beträgt. Der alpha-1-Proteinase-Inhibitor wird aus der sich ergebenden Mischung abgetrennt, indem man die Mischung aus der Behandlung mit dem polykondensierten Polyglycol zentrifugiert und die überstehende Lösung gewinnt, die sich ergebende Überstandslösung mit einem Anionaustauscherharz bei einem pH von ca. 5.5 bis 8.6 in Kontakt bringt und den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem Harz selektiv eluiert. Alternativ dazu, kann der alpha-1-Proteinase-Inhibitor durch weitere Zugabe von polykondensiertem Polyglycol abgetrennt werden, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus der Mischung im Anschluß an die anfängliche Zentrifugation der Mischung auszufällen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Abtrennung des alpha-1-Proteinase-Inhibitors (in der Literatur auch bekannt als "alpha-1-Antitrypsin"), und zwar insbesondere aus bisher hierfür nicht bekannten Quellen sowie in einer höheren Ausbeute und Reinheit, als dies bisher offenbart worden ist.
Die vorliegend beschriebene Erfindung stellt ein Verfahren zur Abtrennung von alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus einer wässrigen Lösung von Plasmaproteinen dar, enthaltend alpha-1-Proteinase-Inhibitor, wobei man:
(a) die wässrige Lösung zur Erniedrigung der Konzentration von darin enthaltenen Salzen mittels mindestens einer Maßnahme behandelt, ausgewählt aus Diafiltration und Gelfiltration,
(b) die in obiger Stufe (a) erhaltene Lösung mit einem Anionaustauscherharz mit selektiver Affinität für den alpha-1-Proteinase-Inhibitor in Kontakt bringt, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor selektiv an das Harz zu binden und die Plasmaproteine, die nicht an das Harz gebunden werden, durch das Harz hindurch in ein erstes Eluat eluieren zu lassen,
(c) das Anionenaustauscherharz, das den aus Stufe (b) erhaltenen alpha-1-Proteinase-Inhibitor selektiv gebunden hält, mit einem Eluierungsmittel in Kontakt bringt, welches eine hinreichende Ionenstärke aufweist, den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem Harz in ein zweites Eluat zu übertragen, und
(d) den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem in Stufe (c) erhaltenen zweiten Eluat gewinnt.
Die neue Quelle des alpha-1-Proteinase-Inhibitors in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine wässrige Lösung von Plasmaproteinen, enthaltend alpha-1-Proteinase-Inhibitor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cohn-Effluens II + III, Cohn-Effluens I und Kryoüberstandslösung.
Der Hauptvorteil des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung besteht in einer höheren Gewinnungsrate an PI, verglichen mit der Ausbeute an PI, die durch viele im Stand der Technik beschriebene Verfahren erhalten wird, wobei die Ausbeute auf die Gesamtmenge an PI im Plasma bezogen ist.
Ein weiterer Vorteil betrifft die Reinheit des gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhaltenen PI, und zwar insofern, als das vorliegende Verfahren eine erhöhte Abtrennung von anderen Plasmaproteinen ermöglicht, die in Verfahren des Standes der Technik häufig gemeinsam mit PI als unerwünschte Begleitsubstanzen mitgewonnen werden.
Wie vorstehend ausgeführt, ist das Augangsmaterial für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine wässrige Lösung von Plasmaproteinen, enthaltend alpha-1-Proteinase-Inhibitor. Vorzugsweise ist die PI-enthaltende wässrige Lösung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cohn-Effluens II + III, Cohn-Effluens I und Kryoüberstandslösung. Cohn-Effluens II + III und Cohn-Effluens I können erhalten werden durch Fraktionierung von Blutplasma gemäß des Cohn-Ethanol-Fraktionierungsverfahrens oder seiner Modifikationen. Siehe z.B. E.J. Cohn et al., J. Amer. Chem. Soc., 68, 459 (1946), E.J. Cohn, U.S. Patent 2.390.074; Oncley et al, J. Amer. Chem. Soc., 71, 541 (1949); und "The Plasma Proteins", 2. Ausgabe, Band III, Seiten 548 - 550, Academic Press, New York, New York (1975).
Kryoüberstandslösung kann erhalten werden, indem man frisch eingefrorenes Plasma bei nicht mehr als 5ºC auftaut, das verbleibende Präzipitat (bezeichnet als "Kryopräzipitat") durch herkömmliche Maßnahmen entfernt, gewöhnlich durch Zentrifugation, und die Überstandslösung ("Kryoüberstandslösung") zur Verwendung im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung heranzieht. Siehe z.B. G. Mitra et al, U.S. 4.306.068. Bevorzugter ist es, die PI enthaltende wässrige Lösung, die als Ausgangsmaterial verwendet wird, aus Cohn-Effluens II + III und Cohn-Effluens I auszuwählen. Am meisten bevorzugt ist als wassrige Ausgangslösung, enthaltend PI, Cohn-Effluens II + III.
Wie vorstehend erwähnt, wird in der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens die wässrige Ausgangslösung von PI enthaltenden Plasmaproteinen behandelt, um die Ionenstärke der Lösung zu erniedrigen, d.h. die Salze der wässrigen Lösung zu entfernen, so daß das PI an das Anionenaustauscherharz gebunden wird. Vorzugsweise sollte die Konzentration der Salze in der wässrige Ausgangslösung ca. 0,02 M oder weniger betragen, noch bevorzugter ca. 0,01 M, und sie kann durch Diafiltration oder Gelfiltration der wässrigen Lösung erniedrigt werden. Am meisten bevorzugt wird die wässrige Lösung einer Diafiltration unterzogen, um die Konzentration der enthaltenen Salze herabzusetzen. Typischerweise wird die wässrige Ausgangslösung in einer Amicon -Zelle unter Anwendung herkömmlicher Verfahrensweisen diafiltriert. Im allgemeinen wird die erste Stufe bei einer Temperatur von ca. 2 bis 10ºC und bei einem pH von 6.0 bis 7.0 durchgeführt. Typische Bedingungen sind 5ºC und ein pH von 6.5.
Enthält die wässrige Ausgangslösung eine Plasmafraktion, die durch das Cohn-Fraktionierungsverfahren erhalten wurde, d.h. Effluens II + III oder Effluens I, wird die Lösung in einer anfänglichen Zusatzstufe vorzugsweise behandelt, um sie zu konzentrieren und den aufgrund der Anwendung des Cohn-Fraktionierungsverfahrens in der Lösung enthaltenen Alkohol zu entfernen. Ein bevorzugtes Verfahren zur Konzentrierung der wässrigen Lösung von Cohn-Effluens II + III oder Cohn-Effluens I und zur Entfernung von im wesentlichen allem darin enthaltenen Alkohol besteht in der Ultrafiltration der wässrigen Lösung. Die Bedingungen von Temperatur und pH in dieser Ultrafiltration sind im allgemeinen dieselben wie vorher für die Diafiltration beschrieben, wobei die Ultrafiltrationsmembran eine Romicon PM-10-Membran ist.
Die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, die eine erniedrigte Salzkonzentration, und gegebenenfalls eine erniedrigte Alkoholkonzentration, aufweisende Lösung mit einem Anionenaustauscherharz mit selektiver Affinität für das in der Lösung enthaltene PI in Kontakt zu bringen, um PI selektiv an das Harz zu binden und diejenigen Plasmaproteine, die nicht an das Harz gebunden werden, durch das Harz hindurch in ein erstes Eluat eluieren zu lassen. Obwohl diejenigen Plasmaproteine, die nicht an das Anionenaustauscherharz gebunden werden, als Bestandteile in der PI enthaltenden Zusammensetzung unerwünscht sind, wird das erste Eluat im allgemeinen nicht verworfen, sondern vielmehr erneut verarbeitet, um Plasmaproteine zu isolieren, die andere therapeutische oder prophylaktische Verwendungen als diejenigen Verwendungen aufweisen, auf die PI gerichtet ist.
Obwohl ein jedes Anionaustauscherharz verwendet werden kann, ist das Anionaustauscherharz zur Verwendung in der zweiten Stufe im allgemeinen ein Polysaccharid-Adsorbens, ausgewählt aus der Gruppe von Polygalactose-, Polydextran- und Celluloseharzen, worin die Polysaccharidketten eine positiv geladene Gruppe aufweisen, ausgewählt aus durch Etherbindungen an die Glucoseeinheiten der Polysaccharidketten gebundenen Diethylaminoethyl- und quaternären Ethylgruppen. Beispiele geeigneter Polysaccharid-Adsorbentien zur Verwendung als das Anionaustauscherharz in dieser zweiten Stufe schließen im Handel erhältliche Harze wie DEAE-Sepharose, DEAE-Sephadex, DEAE-Cellulose und QAE-Sephadex und dgl. ein, erhältlich von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey. Diese Stufe wird im allgemeinen bei ca. 2 bis 10ºC und einem pH von 6.0 bis 7.0, insbesondere ca. 5ºC und pH 6.5, durchgeführt. Die Konzentrationen der Salze in der wässrigen Ausgangs- und den Waschlösungen sollten nicht mehr als ca. 0,02 M, vorzugsweise ca. 0,01 M, betragen.
Obwohl die Lösung aus der ersten Stufe mit dem Anionaustauscherharz durch jedes geeignete Verfahren wie z.B. ein Masseverfahren und ein Säulenchromatographieverfahren in Kontakt gebracht werden kann, ist die Anwendung eines Säulenchromatographieverfahrens im allgemeinen bequemer.
Nachdem der PI in der wässrigen Ausgangslösung durch Kontakt mit und Bindung an das Anionaustauscherharz aus der Lösung adsorbiert und die in der Lösung vorhandenen weiteren Plasmaproteine durch das Harz hindurch eluiert und das Harz unter Anwendung herkömmlicher Verfahren gewaschen worden sind, wird dann das Anionenaustauscherharz, das den aus der zweiten Stufe (b) erhaltenen alpha-1-Proteinase-Inhibitor selektiv gebunden enthält, mit einem Eluierungsmittel mit hinreichender Ionenstärke in Kontakt gebracht, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem Harz in ein zweites Eluat zu übertragen. Ganz allgemein, stellt das Eluierungsmittel mit einer hinreichenden Ionenstärke zur Entfernung des alpha-1-Proteinase-Inhibitors aus dem Anionenaustauscherharz eine wässrige Pufferlösung dar, enthaltend mindestens einen Bestandteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem wasserlöslichen anorganischen Salz und einem wasserlöslichen organischen Salz mit einer Konzentration im Bereich von mehr als ca. 0,02 M bis ca. 0,3 M und einem pH im Bereich von ca. 5.5 bis ca. 8.6. Bevorzugter stellt im erfindungsgemäßen Verfahren das in der dritten Stufe (c) verwendete Eluierungsmittel eine wässrige Lösung eines anorganischen Salzes dar. Am meisten bevorzugt weist das in dieser Stufe verwendete Eluierungsmittel eine Konzentration im Bereich von ca. 0,02 M bis ca. 0,1 M auf, und der pH beträgt ca. 6.0 bis ca. 7.0. Im allgemeinen beträgt die Temperatur in dieser Stufe ca. 2 bis 10ºC, insbesondere 5ºC.
In der Endstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der PI aus dem in der dritten Stufe, wie oben beschrieben, erhaltenen zweiten Eluat gewonnen, und zwar in relativ hoher Reinheit und Ausbeute. Dies kann durch verschiedene Verfahrensmaßnahmen bewerkstelligt werden, vorzugsweise besteht das zur Gewinnung des PI aus dem zweiten Eluat geeignete Verfahren darin, daß man das zweite Eluat mit einem polykondensierten Polyalkylenglycol in Kontakt bringt, ausgewählt aus Polyethylenglycol (PEG) und Polypropylenglycol (PPG). Obwohl beide verwendet werden können, ist PEG bevorzugt, weil es leichter erhältlich ist, z.B. von Union Carbide Corp. Das PEG kann ein Molekulargewicht im Bereich von ca. 200 bis 20.000, vorzugsweise ca. 2000 bis 10.000, noch bevorzugter ca. 3000 bis 8000, am meisten bevorzugt zwischen 3000 bis 4000, aufweisen.
Somit kann der alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem zweiten Eluat gewonnen werden, indem man (1) zuerst das zweite Eluat mit ca. 10% bis ca. 20% (G/V), bezogen auf Volumen des zweiten Eluats, des polykondensierten Polyalkylenglycols bei einem pH im Bereich von ca. 4,6 bis 5,7 und einer Temperatur von ca. 2 bis ca. 10ºC über einen Zeitraum von ca. 1 Minute bis ca. 1 Stunde in Kontakt bringt und den entstehenden Niederschlag abtrennt und die entstehende Überstandslösung gewinnt, und indem man dann (2) die gewonnene Überstandslösung mit ca. 8% bis ca. 15% (G/V), bezogen auf Volumen des zweiten Eluats, an zusätzlichem polykondensierten Polyalkylenglycol bei einem pH im Bereich von ca. 4,6 bis ca. 5,4 und einer Temperatur von ca. 2 bis ca. 10ºC über eine Zeitdauer von ca. 1 Minute bis ca. 1 Stunde in Kontakt bringt und den entstehenden Niederschlag, der alpha-1-Proteinase-Inhibitor enthält, gewinnt.
Alternativ dazu, anstatt die obige aus der ersten Polyalkylenglycolzugabe gewonnene Überstandslösung mit zusätzlichem Polyalkylenglycol in Kontakt zu bringen, können die sich ergebende gewonnene Überstandslösung oder eine Lösung der entstandenen PI-enthaltenden Ausfällung, die in Pufferlösung wiederaufgenommen ist, mit einem Anionaustauscherharz mit einer Affinität für den alpha-1-Proteinase-Inhibitor in Kontakt gebracht und dann der alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem Anionenaustauscherharz eluiert werden, indem man das Harz mit einem Eluierungsmittel mit hinreichender Ionenstärke in Kontakt bringt, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor zu entfernen und ein sich ergebendes drittes Eluat zu erhalten, das den alpha-1-Proteinase-Inhibitor enthält. Gemäß dieser Alternative können die Anionaustauscherharze und die Bedingungen angewandt werden, die oben bezüglich der Adsorbtion und der Eluierung des PI aus dem Anionaustauscherharz in der zweiten Stufe (b) gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben worden sind.
Natürlich kann auch der PI-enthaltende Niederschlag aus der zusätzlichen Polyalkylenglycolausfällung in einer geeigneten Pufferlösung wieder aufgelöst werden, die ihrerseits dann der alternativen Anionenaustauscherharzbehandlung unterzogen werden kann.
Obwohl im Stand der Technik die Isolierung von PI durch Behandlung von Plasmafraktionen, einschließlich Cohn-Fraktion IV-1 und Kryopräzipitat, unter Verwendung herkömmlicher Plasmaproteinfällungsmittel und Affinitätschromatographieverfahren alleine oder in spezifischen Kombinationen beschrieben ist, stellt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem man PI in hoher Ausbeute und Reinheit aus einer bisher nicht bekannten Quelle sowie aus bekannten Quellen erhält.
Somit besteht eine weitere Ausgestaltungsform der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Abtrennung von alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus einer wässrigen Lösung einer Blutplasmafraktion, enthaltend alpha-1-Proteinase-Inhibitor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cohn-Effluens II + III und Cohn-Effluens I, wobei man:
(i) die wässrige Lösung enthaltend alpha-1-Proteinase-innhibitor, mit ca. 10% bis ca. 35% (G/V), bezogen auf Volumen der wässrigen Lösung, eines polykondensierten Polyalkylenglycols, ausgewählt aus Poylethylenglycol und Polypropylenglycol, bei einem pH von ca. 4,6 bis ca. 5,7 und einer Temperatur von ca. 2 bis ca. 10ºC über eine Zeitdauer von ca. 1 bis 24 Stunden in Kontakt bringt, um unerwünschte Proteine aus der Lösung selektiv auszufallen, ohne alpha-1-Proteinase-Inhibitor niederzuschlagen, und
(ii) den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus der in Stufe (i) erhaltenen Lösung abtrennt,
wobei die Verbesserung darin besteht, daß man:
(a) die wässrige Lösung der Blutplasmafraktion behandelt, um im wesentlichen den ganzen Alkohol zu entfernen, der vorhanden ist in der wässrigen Lösung aus der Gruppe, bestehend aus Cohn-Effluens II + III und Cohn-Effluens I,
(b) die wässrige Lösung aus Stufe (a) zur Erniedrigung der Konzentration der darin enthaltenen Salze auf weniger als ca. 0,02 M durch mindestens eine Verfahrensmaßnahme behandelt, ausgewählt aus Diafiltration und Gelfiltration,
(c) die Lösung aus Stufe (b) mit einem Anionaustauscherharz mit selektiver Affinität für den alpha-1-Proteinase-Inhibitor in der Lösung in Kontakt bringt, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor selektiv an das Harz zu binden und die Proteine, die nicht an das Harz gebunden werden, durch das Harz hindurch in ein erstes Eluat eluieren zu lassen, und
(d) das Anionenaustauscherharz mit dem selektiv daran gebundenen alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus Stufe (c) mit einem Eluierungsmittel mit hinreichender Ionenstärke in Kontakt bringt, um den alpha-1- Proteinase-Inhibitor aus dem Harz in ein zweites Eluat zu übertragen, wobei das zweite Eluat die wässrige Lösung umfaßt, enthaltend gemäß der obigen Stufen (i) und (ii) behandelten alpha-1- Proteinase-Inhibitor.
Der durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene PI, und zwar als ein Niederschlag und wiederaufgenommen in Pufferlösung oder als eine Lösung oder Konzentrat davon, kann zu pharmazeutischen Zubereitungen, enthaltend eine zur Proteaseinhibierung wirksame Menge an PI und einen pharmazeutisch zulässigen Träger, für therapeutische, diagnostische oder andere Verwendungen formuliert werden. Um diese für die intravenöse Verabreichung herzustellen, werden die Zusammensetzungen gewöhnlich in Wasser gelöst, enthaltend physiologisch verträgliche Substanzen wie Natriumchlorid, Glycin und dgl., welche einen mit physiologischen Bedingungen verträglichen gepufferten pH aufweisen. Im allgemeinen werden Richtlinien für intravenös zu verabreichende Zusammensetzungen durch behördliche Vorschriften angeordnet.
Die PI-Konzentrate sollen nicht-ansteckend bezüglich infektiöser Mikroorganismen, z.B. Hepatitis- und AIDS-Viren, sein. Diesbezüglich können die Konzentrate zur Inaktivierung dieser Mikroorganismen und ebenso zur Herabsetzung der Ansteckungsgefahr durch eines oder mehrere Verfahren behandelt werden, z.B. Sterilfiltration, UV-Bestrahlung, Behandlung mit chemischen viralen Inaktivierungsmitteln, Hitzebehandlung (z.B. 60 bis 85ºC) im lyophilisierten Zustand, oder durch "Pasteurisierung", d.h., indem man eine PI-enthaltende Lösung bei einer Temperatur und über einen Zeitraum behandelt, wie z.B. bei ca. 60ºC oder darüber über eine Zeitdauer bis zu ca. 10 Stunden, was ausreicht, um den PI nicht-ansteckend durch Hepatitis zu machen. Zur Stabilisierung des PI während dieser Pasteurisierung, oder der "nassen" Hitzebehandlung, wird eine Quelle von Citrationen in einer zur Stabilisierung des PI während des Erhitzens hinreichenden Menge zugefügt. Sind im allgemeinen ca. 20 mg an Gesamtprotein im PI-Konzentrat vorhanden, wird die Lösung ca. 0,25 bis 0,5 M an Citration gestellt. Der pH der Mischung sollte während dieser Erhitzungsstufe vorzugsweise 6,0 bis 7,0 betragen.
Um eine maximale Stabilisierung des PI während seiner Erhitzung zu erreichen, ist es erwünscht, ein Kohlenhydrat als das Stabilisierungsmittel entweder alleine oder mit Natriumcitrat zu verwenden. Zu diesem Zweck kann man als das Kohlenhydrat ein Mono-, Di- und Trisaccharid wie Arabinose, Glucose, Galactose, Maltose, Fructose, Ribose, Mannose, Rhamnose, Sucrose usw. oder einen Zuckeralkohol wie Sorbit, Mannit usw. in einer Menge von ca. 0,5 bis 2,4 g/ml PI-Lösung verwenden.
Wie oben bereits erwähnt, können die pasteurisierten Produkte der Erfindung in pharmazeutische Zubereitungen eingearbeitet werden, die therapeutischen Zwecken dienen können. Der Begriff "pharmazeutische Zubereitung" soll hier jedoch in einem breiteren Sinne verstanden sein, um Zubereitungen mit einer Proteinzusammenetzung gemäß der vorliegenden Erfndung einzuschließen, die nicht nur für therapeutische Zwecke, sondern auch als Reagens oder für diagnostische Zwecke, wie im Stand der Technik bekannt, oder für Gewebekulturen verwendet werden. Die auf eine therapeutische Verwendung gerichtete pharmazeutische Zubereitung sollte eine therapeutische Menge an PI enthalten, d.h. diejenige Proteaseinhibierungsmenge, die für vorbeugende oder heilende Gesundheitsmaßnahmen erforderlich ist. Wird die pharmazeutische Zubereitung als ein Reagens oder zur Diagnose angewandt, dann sollte sie Reagens- oder diagnostische Mengen an PI enthalten.

Beispiele

Die vorstehend beschriebene Erfindung wird nun anhand der folgenden erläuternden Beispiele dargelegt.
Cohn-Effluens II + III und Cohn-Effluens I wurden durch Fraktionierung gemäß der oben genannten Cohn-Fraktionierungsverfahren erhalten.

Assays

PI wird durch sein Elastase-Inhibierungsvermögen bewertet, und zwar durch Verwendung eines chromogenen Substrats für Elastase. Die Hydrolyse von N-Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanyl-p-nitroanilid (SA&sub3;pNA) durch Elastase verursacht einen Anstieg der Absorption bei 405 nm. Dieser Anstieg wird kontinuierlich im allgemeinen bei 37ºC verfolgt und aufgezeichnet. Es werden Vergleiche der linearen Änderungen der Absorption im Zeitverlauf in der Gegenwart und Abwesenheit von Probe (PI) gezogen. Die Menge an Inhibitor wird dann berechnet, bezogen auf die bekannten Molekulargewichte von Elastase und PI, auf der Grundlage der bekannten 1:1-Stöchiometrie und der bekannten Menge an eingesetzter Elastase.
PI kann auch durch sein Trypsin-Inhibierungsvermögen in ähnlicher Weise bewertet werden.

Beispiel 1

Dieses Beispiel verdeutlicht die ersten drei Stufen, wobei man (a) die Konzentration an Salzen von Cohn-Effluens II + III-Lösungen erniedrigt, (b) die PI-enthaltende Lösung aus Stufe (a) mit einem Anionaustauscherharz in Kontakt bringt und (c) PI selektiv aus den Harz im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eluiert.
Cohn-Effluens II + III wurde gegen 5 Volumen 0,02 M Natriumphosphatpufferlösung bei pH 6.5 und bei einer Temperatur von 5ºC diafiltriert.
Verschiedene Mengen des diafiltrierten Cohn-Effluens II + III, nachfolgend in Tabelle I angegeben, wurden jeweils auf Säulen gegeben, enthaltend eine konstante Menge DEAE-Sepharose CL6B Fast Flow (Pharmacia Fine Chemical, Inc.) ins Gleichgewicht gesetzt mit 0,02 M Natriumphosphatpuffer-Lösung bei pH 6.5, 5ºC. Nachdem die Säule mit einem Volumen 0,02 M Natriumphosphatpuffer-Lösung bei pH 6,5, 5ºC, gewaschen wurde, wurde das 0,02 M Natriumphosphatpuffer-Eluat zur weiteren Behandlung verworfen.
Dann wurde die Säule mit 0,05 M Natriumphosphatpuffer- Lösung bei pH 6,5, 5ºC, eluiert, um den im Ausgangs-Cohn- Effluens II + III enthaltenen PI, der an das DEAE-Sepharose -CL6B-Harz gebunden war, freizusetzen.
Die nachfolgende Tabelle I faßt die Meßergebnisse aus sieben Durchläufen aus dem oben beschriebenen Versuch zusammen. Die Menge an PI, die auf das DEAE-Sepharose CL6B gegeben wurde, ist, bezogen auf das Absorptionsvermögen der Probe, bei 280 mu mal dem Volumen in ml pro ml DEAE ausgedrückt. Die Produktausbeute in % wird ermittelt, indem man die Menge an PI in dem zweiten oben beschriebenen Eluat mit 100 multipliziert, dividiert durch die Menge an PI im Ausgangs-Cohn-Effluens II + III. Die relative Reinheit ist die Inhibitormenge im zweiten oben beschriebenen PI-enthaltenden Eluat, bestimmt durch das oben beschriebene Assayverfahren, pro Gesamtmenge an Protein im Eluat. Tabelle I Ergebnisse aus Beipsiel 1 Versuch Menge Diafiltrat, gegeben auf DEAE-Säule (A&sub2;&sub8;&sub0;- Einheiten/ml DEAE) Ausbeute(%) (aus Effl.) (II + III) Relative Reinheit nicht ermittelt

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert weitere Abänderungen für die ersten drei Stufen im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei man (a) die Ionenstärke von Cohn-Effluens II + II-Lösungen erniedrigt, (b) die PI-enthaltende Lösung aus Stufe (a) mit einem Anionaustauschharz in Kontakt bringt und (c) PI aus dem Harz selektiv eluiert.
In diesem Beispiel wurde eine festgesetzte Menge an Cohn-Effluens II + III, 230 A&sub2;&sub8;&sub0; Einheiten/ml DEAE, auf Säulen gegeben, enthaltend eine konstante Menge an DEAE-Sepharose CL6B, Fast Flow-Harz (100 g Harz pro 100 ml Puffer-Lösung), ins Gleichgewicht gesetzt mit 0,02 M Natriumphosphatpuffer-Lösung bei pH 6,5, 5ºC. Nachdem die Säule mit 1 Volumen 0,02 M Natriumphosphatpuffer-Lösung bei pH 6,5, 5ºC, gewaschen wurde, wurde das 0,02 M Natriumphosphatpuffer-Eluat zur Weiterbehandlung verworfen.
Dann wurde die Säule mit 0,05 M Natriumphosphatpuffer-Lösung bei pH 6,5, 5ºC, eluiert, um den im Ausgangs-Cohn-Effluens II + III enthaltenen PI, der an das DEAE-Sepharose-CL6B-Harz gebunden war, freizusetzen.
In der nachfolgenden Tabelle II sind die Ergebnisse aus dem oben beschriebenen Versuch zusammengefaßt. Prozentausbeute und relative Reinheit wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Tabelle II Ergebnisse aus Beispiel 2 Versuch Behandlungsverfahren %Ausbeute (aus Eff. II + III) Relative Reinheit Diafilter (DF) vs. 5 Volumen 0,02 M Natriumphosphat, pH 6,5 DF vs. 5 Volumen H&sub2;O DF vs. 3 Volumen H&sub2;O, dann 2 Volumen 0,02 M Phosphat Konzentrat durch Ultrafiltration 2fach, dann DF vs 3 Volumen 0,02 M Phosphat Konzentrat 2fach, DF vs. 4 Volumen Phosphat Konzentrat 2fach, DF vs. 5 Volumen Phosphat Konzentrat 3-fach, DF vs. 4 Volumen Phosphat Konzentrat 3-fach, DF vs. 5 Volumen Phosphat

Beispiel 3

Dieses Beispiel verdeutlicht die vierte Stufe im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei PI aus dem Eluat gewonnen wurde, das erhalten wurde, indem man PI aus dem Harz in der dritten Stufe im Verfahren gemäß der Erfindung selektiv freisetzt.
Ein Pool des Eluats aus Stufe (c), erhalten durch Eluierung der DEAE-Sepharose-CL6B-Säule mit daran gebundenem PI, wurde in 6 gleiche Teile aufgeteilt. Zu jedem Teil wurde PEG 3350 (Union Carbide Corp.) in hinreichender Menge gegeben, um 20% (G/V) an PEG in der Lösung vorliegen zu haben. Der pH wurde, wie in nachfolgender Tabelle III angegeben,eingestellt, die Temperatur wurde bei 5ºC gehalten, und die Mischung wurde ca. 1 h lang gerührt und dann zentrifugiert.
Die klare Überstandslösung wurde bezüglich der PI-Aktivität einem Assayverfahren unterzogen. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle III zusammengefaßt, worin Prozentausbeute und relative Reinheit, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt wurden. Tabelle III Ergebnisse aus Beispiel 3 Versuch pH-Einstellung %Ausbeute an alpha-1-PI Relative Reinheit pH w/Essigsäure

Beispiel 4

Dieses Beispiel verdeutlicht die vierte Stufe im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wie in Beispiel 3.
Ein Pool des Eluats aus Stufe (c), enthaltend PI, der wie in Beispiel 3 erhalten wurde, wurde in 6 gleiche Teile aufgeteilt, und es wurde PEG 3350 zugefügt, um 11.5% (G/V) zu ergeben, bezogen auf Ursprungsvolumen von DEAE-Eluat. Der pH und die Temperatur wurden auf pH 6.5 und 5ºC eingestellt, und die Mischung wurde ca. 1 h lang gerührt und dann zentrifugiert. Die klare Überstandslösung wurde bezüglich der PI-Aktivität einem Assayverfahren unterzogen. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle IV zusammengefaßt, worin Prozentausbeute und relative Reinheit, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt wurden. Tabelle IV Ergebnisse aus Beispiel 4 Versuch pH-Einstellung %Ausbeute an alpha-1-PI Relative Reinheit pH w/Essigsäure

Beispiel 5

Dieses Beispiel verdeutlicht die weitere Reinigung von PI in der vierten Stufe im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
Ein Säulen-Eluat, enthaltend PI, wurde wie in Beispiel 3 beschrieben erhalten, um eine PI-enthaltende Überstandslösung zu ergeben, enthaltend 20% (G/V) an PEG 3350 bei einem auf 6.0 eingestellten pH. Die Überstandslösung wurde in 5 gleiche Teile aufgeteilt, und es wurde zu jedem Teil ein weiterer Anteil an PEG in den in der nachfolgenden Tabelle V angegebenen Anteilsmengen zugefügt. PI wurde aus der PEG-enthaltenden Überstandslösung niedergeschlagen. Der PI wurde in Puffer-Lösung wiederaufgenommen und auf PI-Aktivität einem Assayverfahren unterzogen. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der nachfolgenden Tabelle V angegeben, worin die Prozentausbeute ermittelt wurde, indem man die PI-Aktivität der wiederaufgenommenen Lösung mit 100 multiplizierte, dividiert durch diejenige der Ausgangs-Überstandslösung. Tabelle V Ergebnisse aus Beipsiel 5 Versuch Zusätzliches PEG (% G/V) % Ausbeute an alpha-1-PI

Beispiel 6

Dieses Beispiel erläutert zusätzlich die weitere wie in Beispiel 5 beschriebene Reinigung von PI mit der Ausnahme, daß in diesem Beispiel zwei Teilmengen von Säulen-Eluat, erhalten wie in Beispiel 3 beschrieben, dem Assayverfahren unterzogen wurden, um die relative Reinheit des PI im Säulen-Eluat zu bestimmen. Dann wurde der PI aus dem Säulen-Eluat durch eine 2-stufige PEG 3350-Zugabe (20% plus 10%, G/V), wie in den obigen Beispielen beschrieben, abgetrennt, und das sich ergebende PI-Präzipitat in Puffer-Lösung wiederaufgenommen und dem Assayverfahren auf PI-Aktivität unterzogen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle VI angegeben. Tabelle VI Ergebnisse aus Beispiel 6 Versuch Relative Reinheit des Säulen-Eluats Relative Reinheit des wiederaufgenommenen Präzipitats

Beispiel 7

Dieses Beispiel verdeutlicht noch eine weitere Reinigung von PI, erhalten wie in Beispiel 5 und 6 beschrieben, und zwar durch Chromatographie an einem DEAE-substituierten Polysaccharidharz, d.h. durch DEAE-Anionaustauscherharz- Chromatographie. Das DEAE-Sepharose CL6B Fast Flow Harz wird in einer Säule (im Duplikat) mit 0,02 M Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 ins Gleichgewicht gesetzt, und die Probe des PI-enthaltenden Präzipitats, erhalten gemäß Beispielen 5 und 6, wiederaufgenommen in Puffer-Lösung, wurde auf die Säule gegeben. Nachdem die Säule mit 1 Volumen Pufferlösung gewaschen wurde, wurde der PI, der an das Anionenaustauscherharz gebunden war, mit 0,05 M Natriumphosphat-Pufferlösungen bei pH 6,5 aus dem Harz eluiert. Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in der nachfolgenden Tabelle 7 angegeben. Tabelle VII Ergebnisse aus Beispiel 7 Versuch Relative Reinheit des Säulen-Eluats Relative Reinheit des wiederaufgenommenen Präzipitats

Beispiel 8

Es wurde im wesentlichen dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 wiederholt, ausser daß Cohn-Effluens I anstatt Cohn-Effluens II + III eingesetzt wurde.
Cohn-Effluens I wurde gegen 5 Volumen 0,02 M Natriumphosphatpuffer-Lösung bei pH 6.5 und einer Temperatur von 5ºC diafiltriert.
Das diafiltrierte Cohn-Effluens I wurde auf eine Säule gegeben, enthaltend DEAE-Sepharose CL6B Fast Flow, ins Gleichgewicht gesetzt mit 0,02 M Natriumphosphatpuffer-Lösung bei pH 6,5 und 5ºC. Nachdem die Säule mit 1 Volumen 0,02 M Natriumphosphatpuffer- Lösung bei pH 6,5 und 5ºC gewaschen wurde, wurde das Puffer-Eluat zur weiteren Behandlung verworfen.
Dann wurde die Säule mit 0,075 M Natriumphosphatpuffer- Lösung bei pH 6,5 und 5ºC eluiert, um den im Ausgangs- Cohn-Effluens I enthaltenen PI, der an das DEAE-Sepharose-CL6B-Harz gebunden war, freizusetzen.
PI wurde im sich ergebenden Eluat mit einer 30-fachen Reinheit gewonnen, bezogen auf Ausgangs-Cohn-Effluens I.

Claims

1. Verfahren zur Abtrennung von alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus einer wässrigen Lösung von Plasmaproteinen, enthaltend alpha-1-Proteinase-Inhibitor, wobei man

(a) die wässrige Lösung zur Erniedrigung der Konzentration der darin enthaltenen Salze auf ca. 0,02 M oder weniger durch mindestens eine Maßnahme behandelt, ausgewählt aus Diafiltration und Gelfiltration,

(b) die in obiger Stufe (a) erhaltene Lösung mit einem Anionaustauscherharz mit selektiver Affinität für den alpha-1-Proteinase-Inhibitor in Kontakt bringt, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor selektiv an das Harz zu binden und die Plasmaproteine, die nicht an das Harz gebunden werden, durch das Harz hindurch in ein erstes Eluat eluieren zu lassen,

(c) das Anionenaustauscherharz, das den aus Stufe (b) erhaltenen alpha-1-Proteinase-Inhibitor selektiv gebunden hält, mit einem Eluierungsmittel in Kontakt bringt, welches eine hinreichende Ionenstärke aufweist, den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem Harz in ein zweites Eluat zu übertragen, und

(d) den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem in Stufe (c) erhaltenen zweiten Eluat gewinnt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die wässrige Lösung von alpha-1-Proteinase-Inhibitor enthaltenden Plasmaproteinen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cohn-Effluens II + III, Cohn-Effluens I und Kryoüberstandslösung.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die wässrige Lösung von alpha-1-Proteinase- Inhibitor enthaltenden Plasmaproteinen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cohn-Effluens II + III und Cohn-Effluens I.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die wässrige Lösung von alpha-1-Proteinase- Inhibitor enthaltenden Plasmaproteinen Cohn-Effluens II + III ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, worin vor der Stufe (a) die wässrige Lösung behandelt wird, um im wesentlichen den gesamten Alkohol zu entfernen, der in der wässrigen Lösung aus der aus Cohn-Effluens II + III und Cohn-Effluens I bestehenden Gruppe vorhanden ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin in Stufe (b) das Anionaustauscherharz ein Polysaccharid-Adsorbens ist, ausgewählt aus der Gruppe von Polygalactose-, Polydextran- und Celluloseharzen, worin die Polysaccharidketten eine positiv geladene Gruppe aufweisen, ausgewählt aus Diethylaminoethyl- und quaternären Ethylgruppen, die durch Etherbindungen an die Glucoseeinheiten der Polysaccharidketten gebunden sind.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin in Stufe (c) das Eluierungsmittel mit hinreichender Ionenstärke zur Freisetzung des alpha-1-Proteinase-Inhibitors aus dem Anionaustauschharz eine wässrige Puffer-Lösung ist, enthaltend mindestens ein Salz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem wasserlöslichen anorganischen Salz und einem wasserlöslichen organischen Salz, mit einer Konzentration im Bereich von ca. 0,02 M bis ca. 0,3 M und mit einem pH im Bereich von ca. 5.5 bis ca. 8.6.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin in Stufe (d) der alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem zweiten Eluat gewonnen wird, indem man das zweite Eluat mit einem polykondensierten Polyalkylenglycol in Kontakt bringt, ausgewählt aus Polyethylenglycol und Polypropylenglycol.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin in Stufe (d) der alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem zweiten Eluat gewonnen wird, indem man (1) zuerst das zweite Eluat mit ca. 10% bis ca. 20% (G/V), bezogen auf Volumen des zweiten Eluats, des polykondensierten Polyalkylenglycols bei einem pH im Bereich von ca. 4.6 bis 5,7 und einer Temperatur von ca. 2 bis ca. 10ºC über eine Zeitdauer von ca. 1 Minute bis ca. 1 Stunde in Kontakt bringt, den sich ergebenden Niederschlag abtrennt und die sich ergebende Überstandslösung gewinnt und dann (2) die gewonnene Überstandslösung mit ca. 8% bis ca. 15% (G/V), bezogen auf Volumen des zweiten Eluats, an zusätzlichem polykondensierten Polyalkylenglycol bei einem pH im Bereich von ca. 4.6 bis ca. 5,4 und einer Temperatur von ca. 2 bis ca. 10ºC über eine Zeitdauer von ca. 1 Minute bis 1 Stunde in Kontakt bringt und den sich ergebenden Niederschlag gewinnt, der alpha-1-Proteinase-Inhibitor enthält.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, einschließlich der zusätzlichen Stufen, wobei man (3) den sich ergebenden Niederschlag, der alpha-1-Proteinase-Inhibitor enthält, in einer Puffer-Lösung wiederaufnimmt, (4) als nächstes die Lösung aus Stufe (3) mit einem Anionaustauscherharz mit einer Affinität für alpha-1-Proteinase-Inhibitor in Kontakt bringt und dann (5) den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem Anionaustauscherharz eluiert, indem man das Harz mit einem Eluierungsmittel mit hinreichender Ionenstärke in Kontakt bringt, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor freizusetzen, um ein sich ergebendes drittes Eluat zu erhalten, das alpha-1-Proteinase-Inhibitor enthält.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin in Stufe (d) der alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem zweiten Eluat gewonnen wird, indem man (1) zuerst das zweite Eluat mit ca. 10% bis ca. 20% (G/V) polykondensiertem Polyelkylenglycol, ausgewählt aus Polyethylenglycol und Polypropylenglycol, bei einem pH von ca. 4,6 bis ca. 5,7 und einer Temperatur von 2 bis ca. 10ºC über eine Zeitdauer von ca. 1 Minute bis ca. 1 Stunde in Kontakt bringt, um unerwünschte Proteine auszufällen, ohne den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem zweiten Eluat niederzuschlagen, die entstehende Ausfällung abtrennt und die sich ergebende Überstandslösung gewinnt, (2) als nächstes die erhaltene Überstandslösung mit einem Anionaustauscherharz mit einer Affinität für den alpha-1-Proteinase-Inhibitor in Kontakt bringt und dann (3) den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus dem Anionaustauscherharz eluiert, indem man das Harz mit einem Eluierungsmittel mit hinreichender Ionenstärke in Kontakt bringt, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor freizusetzen, um ein sich ergebendes drittes Eluat zu erhalten, das alpha-1-Proteinase-Inhibitor enthält.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, einschließlich der weiteren Stufe, wobei man den aus Stufe (d) erhaltenen alpha-1-Proteinase-Inhibitor behandelt, um ihn zu inaktivieren und die Ansteckung durch infektiöse Mikroorganismen herabzusetzen, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor nicht-infektiös durch diese infektiösen Mikroorganismen zu machen und dadurch den alpha-1-Proteinase-Inhibitor verwendbar zu machen für therapeutische und prophylaktische Zwecke.

13. Verfahren zur Abtrennung von alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus einer wässrigen Lösung einer Blutplasmafraktion, enthaltend alpha-1-Proteinase-Inhibitor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cohn-Effluens II + III und Cohn Effluens I, wobei man:

(i) die wässrige Lösung, enthaltend alpha-1-Proteinase-Inhibitor, mit ca. 10% bis ca. 35% (G/V), bezogen auf Volumen der wässrigen Lösung, eines polykondensierten Polyalkylenglycols, ausgewählt aus Poylethylenglycol und Polypropylenglycol, bei einem pH von ca. 4,6 bis ca. 5,7 und einer Temperatur von ca. 2 bis ca. 10ºC über eine Zeitdauer von ca. 1 bis 24 Stunden in Kontakt bringt, um unerwünschte Proteine aus der Lösung selektiv auszufällen, ohne alpha-1-Proteinase-Inhibitor niederzuschlagen, und

(ii) den alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus der in Stufe (i) erhaltenen Lösung abtrennt,

wobei die Verbesserung darin besteht, daß man:

(a) die wässrige Lösung der Blutplasmafraktion behandelt, um im wesentlichen den ganzen Alkohol zu entfernen, der vorhanden ist in der wässrigen Lösung aus der Gruppe, bestehend aus Cohn-Effluens II + III und Cohn-Effluens I,

(b) die wässrige Lösung aus Stufe (a) zur Erniedrigung der Konzentration der darin enthaltenen Salze auf weniger als ca. 0,02 M durch mindestens eine Verfahrensmaßnahme behandelt, ausgewählt aus Diafiltration und Gelfiltration,

(c) die Lösung aus Stufe (b) mit einem Anionaustauscherharz mit selektiver Affinität für den alpha-1-Proteinase-Inhibitor in der Lösung in Kontakt bringt, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor selektiv an das Harz zu binden und die Proteine, die nicht an das Harz gebunden werden, durch das Harz hindurch in ein erstes Eluat eluieren zu lassen, und

(d) das Anionenaustauscherharz mit dem selektiv daran gebundenen alpha-1-Proteinase-Inhibitor aus Stufe (c) mit einem Eluierungsmittel mit hinreichender Ionenstärke in Kontakt bringt, um den alpha-1- Proteinase-Inhibitor aus dem Harz in ein zweites Eluat zu übertragen, wobei das zweite Eluat die wässrige Lösung umfaßt, enthaltend gemäß der obigen Stufen (i) und (ii) behandelten alpha-1- Proteinase-Inhibitor.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, worin in Stufe (c) das Anionaustauscherharz ein Polysaccharid-Adsorbens ist, ausgewählt aus der Gruppe von Polygalactose-, Polydextran- und Celluloseharzen, worin die Polysaccharidketten eine positiv geladene Gruppe aufweisen, ausgewählt aus Diethylaminoethyl- und quaternären Ethylgruppen, die durch Etherbindungen an die Glucoseeinheiten der Polysaccharidketten gebunden sind.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13, worin in Stufe (d) das Eluierungsmittel mit hinreichender Ionenstärke zur Freisetzung des alpha-1-Proteinase-Inhibitors aus dem Anionaustauscherharz eine wässrige Pufferlösung ist, enthaltend eines aus einem wasserlöslichen anorganischen Salz und einem wasserlöslichen organischen Salz mit einer Konzentration im Bereich von ca. 0,02 M bis ca. 0,3 M und mit einem pH im Bereich von ca. 5,5 bis ca. 8.6.

16. Verfahren gemäß Anspruch 13, einschließlich der weiteren Stufe, wobei man den aus Stufe (ii) erhaltenen alpha-1-Proteinase-Inhibitor behandelt, um ihn zu inaktivieren und die Ansteckung durch infektiöse Mikroorganismen herabzusetzen, um den alpha-1-Proteinase-Inhibitor nicht-infektiös durch diese infektiösen Mikroorganismen zu machen und dadurch den alpha-1-Proteinase-Inhibitor verwendbar zu machen für therapeutische und prophylaktische Zwecke.