DE3043409C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats eines Prothrombin-Komplexes, welches praktisch frei von aktiviertem Prothrombin-Komplex ist.
Es wurden bereits verschiedene Herstellungsverfahren für Prothrombin-Komplexe (Komplexe, welche die Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X enthalten) für die Behandlung verschiedener Koagulationsstörungen vorgeschlagen, insbesondere zur Behandlung von Mangelkrankheiten des Faktors IX (Hämophilie B) oder auch zur Behandlung von Leber-Insuffizienzen.
Insbesondere wurde vorgeschlagen, ein Prothrombin-Komplex und Antithrombin III enthaltendes Material an Aluminiumoxidgel zu adsorbieren und anschließend eine Elution des gereinigten Prothrombin-Komplexes mit einer Pufferlösung vom pH-Wert 7,5 bis 8,5 durchzuführen.
Erfindungsgemäß wird nun diesem Ausgangsmaterial vor der Adsorption Heparin zugefügt.
In der US-PS 35 60 475 ist die Adsorption von verschiedenartigen Plasmafraktionen an Tricalciumphosphat und die Elution und anschließende zweistufige Ausfällung des Prothrombin- Komplexes durch Polyethylenglykol bekannt, wobei Heparin am Ende des Verfahrens (vgl. Beispiel 1) zugesetzt wird.
Weiter ist in Thromb. Diath. Haemorrh. 1972, Bd. 27 (3), S. 490-501 (Ref. C.A., Bd. 77, 1972, 124372g) offenbart, daß ein Prothrombin-Komplex an Al(OH)₃-Gel adsorbiert werden kann, jedoch ist an keiner Stelle gezeigt oder angeregt, den Prothrombin-Komplex zusammen mit Antithrombin III und/oder mit Heparin zu adsorbieren oder daß bei einer solchen Adsorption der Prothrombin-Komplex stabilisiert bzw. nicht erheblich denaturiert wird.
In Vox Sang. Bd. 22 (1972) Seite 137-160, ist auf Seite 138, Zeile 17-21 die Zugabe von Heparin und von AT III (als frisches Plasma) am Ende der Herstellung des Prothrombin- Komplexes beschrieben. Dies gibt aber keinerlei Anregung für das erfindungsgemäße Verfahren. Außerdem zeigt die Zugabe des vollen Serums am Ende der Herstellung an, daß hiernach kein reiner Prothrombin-Komplex erhalten werden kann.
Aus Blood Bd. 49 (2) 1977, Seite 159-170 (Ref. C.A. Band 86, 1977, 127 141c) ist die Zugabe von AT III in der Endstufe des Herstellungsverfahrens bekannt. Hierbei wird nicht unterschieden zwischen einer Zugabe von AT III und Heparin entweder am Beginn oder aber am Ende des Reinigungsverfahrens. Vielmehr gibt es keinerlei praktischen Hinweis dafür, daß die Zugabe von AT III und Heparin zu Beginn eines Reinigungsverfahrens durch Adsorption irgendwelche Wirkungen haben könnte. Nirgendwo gibt es einen Hinweis, daß Heparin, Antithrombin III und der Prothrombin- Komplex zusammen an Al₂O₃ adsorbiert werden könnten und daß diese Komponenten gleichzeitig eluiert werden können und was hierzu erforderlich sein könnte. Insbesondere geben die Autoren keinen Hinweis, nach welchem Verfahren der Prothrombin- Komplex überhaupt isoliert werden kann.
Aus Thromb. Reasearch Bd. 12 (4), 1978, Seite 571-582 (Ref. C.A. Bd. 89, 1978, 55 381 t) ist die Herstellung eines nicht-thrombinogenen Prothrombin-Komplexes durch Adsorption an Kaolin, Fraktionierter Elution mit Polyethylenglykol, Adsorption an DEAE-Cellulose und Elution mit einer Pufferlösung, die eine kleine Menge Antithrombin-III enthält, bekannt. Das Eluat wird dann über einen Sephadex-Säule filtriert. Dieses Verfahren entspricht nicht demjenigen der Erfindung. Vielmehr waren offenbar die Verfasser der Meinung, daß Antithrombin-III keinen günstigen Einfluß ausübt und daß die Abwesenheit von thrombogenen Wirkungen im Endprodukt Folge der Fällung mit Polyethylglykol ist (Seite 576, Zeile 2-1 von unten, Seite 577, Zeilen 11 und 12 nach Tabelle III)
Verschiedene Produkte haben sich als instabil erwiesen, weil sich bestimmte Koagulationsfaktoren im aktivierten oder wirksamen Zustand vorfinden und weil es sich heraus­ gestellt hat, daß etwa 11% der mit den Konzentraten behandelten Patienten Thrombosen entwickeln.
Um diese Nachteile zu beseitigen hat M. Wickerhauser vorgeschlagen, den in der Fraktion III von COHN vorhandenen aktiven Faktor IX durch Zugabe eines Konzentrats zu inaktivieren, das nach Elution, mittels Heparin und des Co-Faktors, getrennt über die Fraktion IV von COHN erhalten worden ist.
Hieraus ergab sich die Empfehlung eines internationalen Komitees, daß weniger gefährliche Präparate durch Zugabe von Heparin zum Endprodukt entwickelt werden sollten, um die unheilvollen Wirkungen der Antikoagulationswirkung zu vermeiden.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren nach Anspruch 1.
Gegenüber dem Stand der Technik haben die erfindungsgemäß hergestellten Konzentrate einen erheblichen Anteil an dem wirksamen Faktor, trotz der am Schluß erfolgenden Zugabe von Heparin. Erfindungsgemäß wird unmittelbar ein Konzentrat erhalten, daß nicht "aktiviert" ist, d. h. welches stabil und ohne Risiko für die Patienten ist. Auch ist das erfindungsgemäße Verfahren einfach und mit wenig Aufwendung durchführbar.
Das Heparin aktiviert das Antithrombin III. Das Antithrombin III, das aktiviert ist, schützt und stabilisiert den Prothrombin- Komplex. In dem Fall, daß das den Prothrombin- Komplex enthaltende Material auch AT III in ausreichender Menge enthält, werden die beiden Ausgangsmaterialien zu einem einzigen verschmolzen.
In dem Fall, in dem die Quelle für den Prothrombin-Komplex kein AT III enthält oder eine zur Stabilisierung unzureichende Menge enthält, ist es zweckmäßig, eine ausreichende Menge AT III vor der Elution zuzugeben. Vorzugsweise gibt man AT III der Quelle für den Prothrombin-Komplex vor der Adsorption zu.
Die Zugabe von Heparin wird vor der Elution durchgeführt. Somit ist es möglich, das Heparin dem Elutionsmittel zuzugeben und im Anschluß daran eine Elution durchzuführen. Vorzugsweise wird jedoch das Heparin zur Quelle für den Prothrombin-Komplex oder der Quelle für das AT III vor der Adsorption zugegeben. Man kann auch das Heparin in Kontakt mit dem Adsorptionsmittel bringen und danach dieses in Kontakt mit dem oder den Ausgangsstoffen bringen.
Wenn es notwendig ist, das AT III zur Quelle für den Prothrombin- Komplex zuzugeben, erfolgt diese Zugabe vorzugsweise gleichzeitig mit der Zugabe von Heparin.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform, besteht darin, den Prothrombin-Komplex während der Dauer des Verfahrens zu schützen.
Als Ausgangsmaterial verwendet man vorzugsweise eine Fraktion, die von einem von Gerinnungsprodukten befreiten Plasma nach dem Eliminieren von Ausfällungen bei der Tiefkühlung erhaltenen Plasma erhalten worden ist, welche Fraktion als "cryo poor plasma" (CPP) bezeichnet wird.
In gleicher Weise kann man ein frisches Plasma verwenden, das gegebenenfalls geronnen ist. Man kann auch als Ausgangsprodukt die Fraktion III von COHN verwenden, welcher man zweckmäßig das Antithrombin AT III zufügt, z. B. in der Form der Fraktion IV von COHN. Man kann in gleicher Weise als Ausgangsprodukt die Fraktion IV allein verwenden, denn diese Fraktion IV ist auch eine Quelle für den Prothrombin-Komplex.
Vorzugsweise fügt man, wenn man von einem Plasma ausgeht, so viel Heparin wie möglich hinzu und ebenso, falls möglich, vor der Gerinnung.
Die zuzufügende Heparinmenge ist eine Funktion der Qualität der Quelle für den Prothrombin-Komplex. Diese Menge schwankt im allgemeinen von 0,1 I.E. bis 1 I.E., berechnet ungefähr auf einen cm³ der Quelle.
Die Adsorption erfolgt auf Aluminiumhydroxid-Gel, das sich als besonders zweckmäßig für die Adsorption und nachfolgende Elution des geschützten Prothrombin-Komplex herausgestellt hat.
Die Adsorption erfolgt bei einer Temperatur unterhalb der Umgebungstemperatur (20° bis 22°C), z. B. bei 0 bis 15°C, vorzugsweise um etwa 2° bis 8°C.
Man führt die Elution mit jedem Mittel durch, das in der Lage ist, gleichzeitig den Prothrombin-Komplex und das AT III zu eluieren. Im allgemeinen verwendet man einen Puffer mit zweckmäßiger Ionenstärke.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird die Quelle für den Prothrombin-Komplex, z. B. eine Fraktion CPP, welcher Heparin zugefügt worden ist, an das Aluminiumhydroxid- Gel adsorbiert und anschließend die Elution zwischen 0°C und Umgebungstemperatur (20-22°C) durchgeführt.
Die eluierte Fraktion kann etwa beim pH-Wert 7 mittels einer oder mehrerer Zugaben von Polyäthylenglykol (PEG) (5 bis 10%) gereinigt werden, welche die unerwünschten Proteine ausfällt. Vorzugsweise bewirkt man die Ausfällungen mittels PEG bei einer Temperatur unterhalb der Umgebungstemperatur, z. B. bei 0 bis 8°C und insbesondere bei etwa 2 bis 4°C.
Nachdem man durch Zentrifugieren den Niederschlag der verunreinigenden Proteine entfernt hat, stellt man den pH-Wert der Flüssigkeit auf einen Wert in der Größenordnung von 4,8 bis 5,2 ein, fügt das PEG hinzu bis zu einer Konzentration von 12 bis 20% und isoliert den Niederschlag, der den Prothrombin-Komplex enthält. Diese Ausfällung wird ebenfalls bei niedriger Temperatur durchgeführt. Der erhaltene Prothrombin-Komplex wird danach erneut gelöst und danach wird diese letzte Lösung gegebenenfalls einer Filtration, einer Verteilung (Gegenstromverteilung oder einem chromatographischen Verteilungsverfahren) und der Gefriertrocknung unterworfen.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Konzentrat des Prothrombin-Komplexes erhalten, das sich dadurch auszeichnet, daß es praktisch frei von aktiven Prothrombin-Komplexen ist.
Das Konzentrat des Prothrombin-Komplexes gemäß der Erfindung ist als Arzneimittel brauchbar, insbesondere zur Behandlung von Koagulationsstörungen, besonders bei Mangelerscheinungen an Faktor IX, aber auch bei der Erkrankung der Hämorragie beim Neugeborenen, bei Überdosierungen von kumarinhaltigen Arzneimitteln und bei Leberkrankheiten im fortgeschrittenen Zustand. Es wird auf den gewöhnlichen Wegen und Verabreichungsweisen verabreicht.
Der Komplex besitzt pharmakologische Eigenschaften und die gewöhnliche Unschädlichkeit anderer gereinigter Konzentrate von Prothrombin-Komplexen.
Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert anhand eines Beispiels, das jedoch nicht als Beschränkung aufzufassen ist.
Beispiel
Das Ausgangsmaterial ist die Fraktion, die CPP genannt wird, d. h. die auf einem geronnenen und anschließend von der Gerinnung befreiten Plasma beruht, von welchem man anschließend den Niederschlag bei Tiefkühlung entfernt hat.
Dieser Fraktion gibt man Heparin derart zu, daß man in der Mischung etwa 0,5 Einheiten je cm³ des Plasmas CPP hat.
Anschließend bewirkt man bei niedriger Temperatur, nämlich zwischen 0 und 8°C und vorzugsweise zwischen 2 und 4°C die Adsorption in einem Aluminiumhydroxid-Gel unter Verwendung von 10 bis 20 cm³ des Aluminiumhydroxid-Gels/l des mit Heparin versetzten Plasmas.
Das Gel wird gerührt, danach zentrifugiert und gesammelt.
Anschließend wird das Gel mit Hilfe eines klassischen zweckmäßig gepufferten Elutionsmittels eluiert. Beispielsweise kann man einen Puffer verwenden, der 0,25 m Kaliumphosphat, 0,17 m Trinatriumcitrat × 5 H₂O und 0,003 m Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält. Der pH-Wert wird auf einen Wert von 7,5 bis 8,5 eingestellt und anschließend wird mit einem Puffervolumen in der Größenordnung von 1/30 des Volumens des Plasma CPP eluiert. Die Elution wird in üblicher Weise durchgeführt, indem man das Gel mit dem zum Eluieren verwendeten Puffer in eine Suspension bringt und rührt. Anschließend wird zentrifugiert und das Eluat gesammelt.
Danach wird der pH-Wert des Eluats auf einen Wert von etwa 7 eingestellt, auf eine Temperatur in der Gegend von 2 bis 4°C gebracht und anschließend mit 5 bis 10 Gew.-% je Volumen PEG (Polyäthylenglykol) versetzt. Es wird gerührt und anschließend zentrifugiert und der Niederschlag eliminiert und die überstehende Flüssigkeit gesammelt.
Der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wird auf einen relativ geringen Wert in der Größenordnung von 4,8 bis 5,2 gesenkt und danach PEG zugeführt bis zu einem Gehalt von 12 bis 20% PEG, wobei dies auf die anfangs zugefügte Menge und die Volumenhöhe angerechnet wird, wonach gerührt und zentrifugiert wird, um den Niederschlag zu isolieren. Dieses Stadium wird in gleicher Weise bei niedriger Temperatur durchgeführt.
Der Niederschlag wird anschließend vorzugsweise bei Raumtemperatur in einer Lösung wieder angelöst, die beispielsweise Natriumchlorid oder Trinatriumcitrat enthält, wobei das Volumen der zum Auflösen verwendeten Flüssigkeit etwa 1/2 bis 1/3 des Eluats beträgt. Nach dem Auflösen wird der pH-Wert so eingestellt, bis eine klare Lösung erhalten wird, die eine vollständige Lösung anzeigt und die einen pH-Wert in der Nähe von 7 zeigt.
Schließlich wird noch filtriert, vorzugsweise durch eine Membran, wobei die letzte Filtration mindestens in steriler Weise durchgeführt wird.
Das erhaltene Produkt wird unter sterilen Bedingungen in aliquote Anteile in gewünschter Weise aufgeteilt und anschließend gefriergetrocknet, und zwar sofort nach der Gerinnung.
Es wird ein Konzentrat des Faktors IX erhalten, das praktisch von unerwünschten Aktivitäten befreit ist.
Die Verabreichung des gefriergetrockneten Konzentrats wird parenteral durchgeführt. Das Konzentrat ist in üblichen wirksamen Dosierungen nicht toxisch.
Vergleichsbeispiel
Im folgenden Vergleichsversuch wird gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur eine willkürliche Abänderung bekannter Verfahrensweisen ist, sondern ein besseres gereinigtes Endprodukt ergibt. Insbesondere zeigt der Vergleich mit dem bekannten Adsorptionsmittel Sephadex, daß nicht alle Adsorptionsmittel gleichzeitig den Prothrombin-Komplex, AT III und Heparin adsorbieren.
1. Freies Thrombin
Es wurde ein Test auf Anwesenheit in freiem Thrombin verwendet, der darauf beruht, daß der Prothrombin-Komplex, sofern er keinen aktiven Komplex enthält und damit frei von freiem Thrombin ist, in Gegenwart von Fibrinogen nach 6 h oder längerem Inkubieren bei 37°C nicht kuagulieren soll. Es wurden 5 Proben angesetzt, wobei Probe 1 und 2 erfindungsgemäß hergestellt waren, Probe 3 erfindungsgemäß, aber unter Verwendung von DEAE-Sephadex als Adsorptionsmittel anstelle von Al₂O₃-Gel verwendet wurde, (Heparin zu Beginn zugesetzt), Probe 4 und 5 ähnlich wie Probe 3, aber unter Zugabe von Heparin am Ende des Verfahrens hergestellt wurden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.
Tabelle I
Antithrombin-Messung in Konzentration von Prothrombin-Komplex
Es wurde ein Test verwendet, der darauf beruht, daß an Al₂O₃- Gel Heparin, Antithrombin III und Prothrombin-Komplex gleichzeitig adsorbiert werden, während dies bei anderen Adsorptionsmitteln, insbesondere Polysacchariden, wie DEAE-Sephadex, nicht der Fall ist.
A) A.T. III wird durch Immuno-Diffusion im Produkt nach der Elution gemessen. Es werden die folgenden Ergebnisse erhalten.
AdsorptionsmittelEluatmenge mit A.T.III-Gehalt
Al₂O₃-Gel5-10 mg A.T.III/1000 Einheiten Prothrombin-Komplex DEAE-Sephadexkein A.T.III
B) Weiter wurde die Aktivität von A.T.III auf dem synthetischen Substrat (reaktives KABI) gemessen. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten.
Tabelle III
Ergebnisse:
  • a) In der Probe mit DEAE-Sephadex als Adsorptionsmittel fehlt A.T.III.
  • b) In der Probe mit Al₂O₃-Gel als Adsorptionsmittel ist A.T.III enthalten.
  • c) Nach Aktivierung durch Heparin-Zugabe ist in den mit Al₂O₃-Gel hergestellten Proben funktionelles A.T.III noch enthalten. Ohne Heparin-Aktivierung ist ein Heparin- A.T.III-Komplex (-aktives Antithrombin III) enthalten, der die Proteasen inhibiert, wenn Al₂O₃-Gel verwendet wurde.

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats eines Prothrombin-Komplexes, welcher praktisch frei von aktiviertem Prothrombin-Komplex ist, und bei welchem, ausgehend von einem den Prothrombin-Komplex und Antithrombin III enthaltenden Material, eine Adsorption an Aluminiumhydroxidgel und anschließend eine Elution des gereinigten Prothrombin-Komplexes mit einer Pufferlösung vom pH-Wert 7,5 bis 8,5 durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Ausgangsmaterial vor der Adsorption Heparin zufügt.
2. Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Adsorptionsmittel mit dem Heparin in Kontakt bringt, bevor man dieses mit dem oder den Ausgangsmaterialien in Kontakt bringt.
3. Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Elution das Heparin und das Elutionsmittel vermischt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Heparin mit einem Titer zwischen 0,1 und 1 I.E. je cm³ Ausgangsmaterial einsetzt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als den Prothrombin-Komplex enthaltendes Material eine Plasmafraktion verwendet, die nach der Eliminierung des nach Tiefkühlung erhaltenen Niederschlags erhalten worden ist.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Adsorption bei einer Temperatur von 9 bis 15°C durchführt.
7. Verfahren nach jedem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Elution das Eluat durch Behandeln mit 5 bis 10% Polyäthylenglykol bei einem pH-Wert von etwa 7 bei einer Temperatur unterhalb der Umgebungstemperatur reinigt, daß man nach der Entfernung des Protein-Niederschlags den pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit auf einen Wert von 4,8 bis 5,2 einstellt und danach den Prothrombin-Komplex durch Erhöhung der Polyäthylen­ glykolkonzentration auf 12 bis 20% ausfällt.
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