DE68922358T3

DE68922358T3 - Chromatographische Trennung von Plasmaproteinen, insbesondere von Faktor VIII, von Willebrand Faktor, von Fibronectin und von Fibrinogen.

Info

Publication number: DE68922358T3
Application number: DE68922358T
Authority: DE
Inventors: Thierry Burnouf; Burnouf Myriana Burnouf Myriana
Original assignee: CT REGIONAL DE TRANSFUSION SAN; Centre Regional de Transfusion Sanguine de Lille
Current assignee: Association pour lEssor de la Transfusion Sanguine dans la Region Nord
Priority date: 1988-06-07
Filing date: 1989-02-08
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2009-02-09
Also published as: DK29990A; FI96210C; ES2070919T5; EP0359593B2; JPH03501974A; DK29990D0; DE68922358T2; US5252709A; CA1340742C; EP0359593B1; AU3068289A; KR900701823A; NO900529D0; AU1138392A; AU622436B2; DE359593T1; LT3333B; ATE121750T1; WO1989012065A1; FR2632309A1

Description

Die Erfindung betrifft die Trennung von Proteinen einer Fraktion des menschlichen oder tierischen Plasmas durch Anionenaustauschchromatographie nach einer Technik, die es gestattet, in einem einzigen Schritt einen sehr hohen Reinigungsgrad insbesondere des Faktors VIII, des Fibrinogens und des Von-Willebrand-Faktors zu erhalten.
Die Bereitstellung von Blutproteinen erfordet für ihre Verwendung zu therapeutischen Zwecken Reinigungstechniken, die es erlauben, hochreine und von Verunreinigungen, namentlich mit anderen Proteinen oder Substanzen fremden Ursprungs wie Antikörpern, vollkommen freie Produkte zu erhalten.
So ist es bei der Behandlung der Hämophilie A wichtig, über Konzentrate von Faktor VIII tatsächlich sehr hoher Reinheit zu vertilgen, da die Kranken zahlreiche und wiederholte Injektionen von Faktor-VIII-Konzentraten und gleichzeitig von großen Mengen an Fibrinogen und Immunglobulinen erhalten, die unerwünschte Immunreaktionen bewirken können. Wiederholte Injektionen von ungenügend gereinigtem Faktor VIII können demnach nur mit Plasmakonzentraten der gleichen Blutgruppe erfolgen, um die typischen Transfusionszwischenfälle, die auf Blutgruppenunterschiede zurückgehen und die durch die Gegenwart von Immunglobulinen verursacht werden, zu vermeiden.
Die Faktor-VIII-Konzentrate werden meistens aus einer bei niedriger Temperatur gefällten Fraktion des menschlichen Plasmas hergestellt. Die Reinheit der Faktor-VIII-Konzentrate, die im allgemeinen in den industriellen Zentren der Verarbeitung von Humanplasma erhalten werden, ist oft von der Größenordnung von 1 IE/mg und überschreitet im allgemeinen nicht die Grenzen von 10 bis 20 IE/mg. Die Techniken der klassischen Produktion verlangen Schritte der Ausfällung, die darauf zielen, die Proteinverunreinigungen wie Fibrinogen, Fibronectin und die Immunglobuline – oft sehr unvollkommen – zu entfernen. Diese Techniken können eine Ausfällung bei niedriger Temperatur (10°C) oder die Zugabe von Fällungsmitteln für Proteine benutzen oder kombinieren; es wurden also hydrophile Proteine wie PEG (Newman et al., Br. J. Haematol. 21: 1–20, 1971; Hao et al. in: Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press 1980, S. 57–74), Polyvinylpynolidon (Casillas und Simonetti, Br. J. Haematol. 50: 665–672, 1982), Dextran, Ficoll, Percoll, hydroxyethylierte Stärke und Albumin als Fällungsmittel für Faktor VIII vorgeschlagen (Farrugia et coll., Thromb. Haemostas, 51: 338–342, 1984). Ebenso ist es mit der von Thorell und Blömback empfohlenen Verwendung von Glycin und Natriumchlorid. In gleicher Weise gelang es mehreren Autoren (Ng et al., Thrombosis Res., 42: 825–834, 1986), drei Fällungsmittel, nämlich PEG, Glycin und Natriumchlorid, zu kombinieren, um Faktor-VIII-Konzentrate mit spezifischer Aktivität zwischen 10 und 16 IE/mg zu erhalten.
Es wird auch auf Techniken der sterischen Ausschlußchromatographie oder molekularen Filtration hingewiesen, die auf die Wiedergewinnung einer Fraktion mit hohem Molekulargewicht zielen, die den Komplex aus Faktor VIII:C und Von-Willebrand-Faktor, teilweise von Fibrinogen befreit, enthält. Diese Technik liefert mit niedriger Ausbeute ein Produkt, dessen spezifische Aktivität 30 IE/mg nicht überschreitet und das einen Zusatz von Albumin als Stabilisator erfordert (was zu einer Absenkung der spezifischen Aktivität auf ungefähr 3 bis 5 IE/mg führt). Diese Technik bringt einige Probleme der Anpassung an den großen Maßstab, denn es ist schwierig, das Trennvermögen der industriellen Kolonnen für die molekulare Filtration zeitlich konstant zu halten.
Konzentrate von Faktor VIII wurden ebenso hergestellt, indem in das Produktionschema ein Kontakt mit Kugeln von porösem Siliciumdioxid eingefügt wurde, um die Protein-Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht festzuhalten (Margolis et al., Vox Sang. 46: 341–348, 1984). Die spezifische Aktivität des Produkts bleibt vefiältnismäßig niedrig: 1 IE/mg.
Kürzlich erschienen neue Techniken in der Herstellung von Konzentraten des Faktors VIII sehr hoher Reinheit. So haben die Firmen Hyland und Travenol Konzentrate vorgeschlagen, die durch Methoden der Immunaffinitätschromatographie erhalten wurden (Zimmerman und Fulcher, Thrombosis Res., Suppl. VII, S. 58, 1987; Bemtorp und Nilsson, Thrombosis Res., Suppl. VII, S. 60, 1987; Levine et al., Thrombosis Res., Suppl. VII, 1987). Diese Techniken bestehen dann, den Faktor VIII mit Hilfe von auf einem chromatographischen Träger immobilisierten Antikörpern, Anti-Faktor VIII:C oder Anti-von-Willebrand-Faktor, zu reinigen. Diese Techniken sind leistungsfähig, erfordern aber den Gebrauch von drastischen Lösungen, um den Faktor VIII sei es von seinem Antikörper, sei es von dem Von-Willebrand-Faktor zu desorbieren. Ein ergänzender Schritt der Ultrafiltration, der darauf zielt, die unerwünschten chemischen Agenzien zu entfernen, ist also nötig, doch kann er der biologischen Aktivität des Faktors VIII schaden. Die spezifische Aktivität des Faktors VIII kann 1000 bis 3000 IE/mg im Verlauf der Produktion erreichen, aber seine Instabilität verlangt die Zugabe eines Stabilisators, etwa des Albumins, vor dem Schritt der Gefriertrocknung, was die spezifische Aktivität des Faktors VIII auf 3 bis 5 IE/mg verringert. Der größte Nachteil der Reinigung durch Immunaffinität ist nichtsdestoweniger die Anwesenheit von zurückbleibenden Antikörpern; diese können, wenn sie von Nagetier-Ursprung sind, bei den Kranken zum Auftreten von immunologischen Reaktionen gegenüber diesen für den menschlichen Organismus fremden Proteinen führen.
Ebenso wurden Techniken der Ionenaustauschchromatographie benutzt, doch in Hinblick auf die Kompliziertheit der Arbeitsvorgänge und die niedrigen erhaltenen Ausbeuten blieben diese Techniken auf der Stufe des Laboratoriums.
So untersucht der Artikel von J. J. Morgenthaler (Thromb. Haemostas., Stuttgart, 47 (2), 124–127 (1982)) die Reinigung von Faktor VIII:C ausgehend von einem mit Polyethylenglykol ausgefällten Niederschlag durch den Lauf über ein modifiziertes Sepharoseharz. Über die Ausbeute und die Reproduzierbarkeit der verschiedenen getesteten Techniken werden keinerlei Angaben gemacht.
Es ist also überaus wichtig, über neue Methoden zur Gewinnung von Proteinkonzentraten, insbesondere Faktor-VIII-Konzentraten, zu vertilgen, die im industriellen Maßstab anwendbar sind und die hochreine und von Proteinen fremden Ursprungs wie den Antikörpern tierischen Ursprungs vollkommen freie Produkte liefern.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 88108458.6, veröffentlicht am 29. November 1989, beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Faktor VIII ausgehend von einem bei niedriger Temperatur Gefällten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man vor der Virusinaktivierungsbehandlung das bei niedriger Temperatur Gefällte, das wieder aufgetaut wurde, mit Wasser, das 1 bis 3 E/ml Heparin bei pH 6,5–7,5 enthält, extrahiert, daß man mit einer Suspension von Aluminiumhydroxid reagieren läßt und daß man nach dem Abkühlen auf 10–18°C und Einstellen des pH auf 6–7 zentrifugiert oder filtriert, daß man dann die Reinigung durch eine weitere Behandlung, insbesondere durch Gelpermeationschromatographie auf einem Ionenaustauscherharz des hydrophilen Typs wie Fractogel-DEAE fortsetzt.
Dieses Dokument beschreibt also die Reinigung allein von Faktor VIII durch die Verbindung einer sehr speziellen Vorstufe, die insbesondere durch die völlige Abwesenheit einer ethanolischen Behandlung gekennzeichnet ist, mit einer Ionenaustauschchromatographie auf einem hydrophilen Harz wie Fractogel-DEAE.
Die Anmelderin hat nun ein Verfahren zur Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie dargelegt, das es dank einer sinnvollen Wahl des verwendeten Harzes erlaubt, auf einer einzigen chromatographischen Kolonne die gesuchten Proteine unter Bedingungen zu trennen, die genügen, um weitere Behandlungen wie die Ultrafiltration, die die Kompliziertheit des Verfahrens erhöhen und die Aktivität des gereinigten Proteins verringem, überflüssig zu machen.
Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Trennung der Proteine Faktor VIII, Fibrinogen, Fibronectin und Von-Willebrand-Faktor des menschlichen oder tierischen Plasmas, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine in Wasser wieder in Lösung gebrachte Fraktion eines bei niedriger Temperatur Gefällten des menschlichen Plasmas einer einzigen Trennung auf chromatographischem Wege auf einem Anionenaustauscherharz unterzieht, dessen Matrix ein Gel vom Typ eines makroreticularen Vinylpolymeren ist, das durch seine Porositätsund Hydrophobieeigenschaften fähig ist, den Komplex aus Faktor VIII und Von-Willebrand-Faktor zurückzuhalten, und daß man selektiv die verschiedenen Proteine durch aufeinanderfolgende Erhöhungen der Ionenstärke des Elutionspuffers zurückgewinnt, nach Anspruch 1.
Das Verfahren ist auf ein Plasma tierischen Ursprungs ebenfalls anwendbar, beispielsweise auf Plasma vom Schwein für den speziellen Fall von Hämophiliekranken mit inhibierendem Serum, die mit Faktor VIII menschlichen Ursprungs nicht behandelt werden können.
Man kann also als Ausgangsfraktion eine Fraktion von bei niedriger Temperatur ausgefälltem Plasma benutzen, die gegebenenfalls eine Vorreinigung erfahren hat. Diese vorherige Behandlung kann beispielsweise in einer Fällung mit Aluminiumoxidgel und/oder in einer Fällung bei niedriger Temperatur nach den klassischen Techniken der Behandlung derartiger Fraktionen bestehen.
Beim Vergleich der verschiedenen für die chromatographische Trennung getesteten Harze wurde beobachtet, daß die am meisten zufriedenstellenden Ergebnisse bei Benutzung von DEAE-Gruppen erhalten werden, die auf eine Matrix gepfropft sind, welche die oben angegebenen, zur Fixierung des Komplexes aus Faktor VIII und Von-Willebrand-Faktor nötigen Eigenschaften besitzt. Ein Harz dieses Typs ist im Handel unter der Bezeichnung Fractogel^® TSK-DEAE (Merck) erhältlich.
Die Anmelderin hat tatsächlich festgestellt, daß diese Art von Harz, bekannt wegen seiner hydrophilen Eigenschaften, worauf in der Patentanmeldung Nr. 88 108458.6 hingewiesen wird, unter geeigneten Anwendungsbedingungen ebenfalls ausreichende Eigenschaften der Hydrophobie besitzt, um den Komplex aus Faktor VIII und Von-Willebrand-Faktor in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zurückhalten zu können.
Das Harz Fractogel^®TSK-DEAE 650 mit der Porosität vom Typ M lieferte also deutlich bessere Ergebnisse als die anderen getesteten Gele wie DEAE-Sepharose^® CL-6B, DEAE-Sepharose CL-6B Fast-Flow (Pharmacia), DEAE-Sepharose 4B oder DEAE-Tris-acryl LS (IBF).
Die Verwendung eines mit Fractogel-TSK-DEAE (M) vergleichbaren Gels wurde von Y. Kato et al. (J. Chromatogr. 245, 1982, 193–211) beschrieben und für chromatographische Trennungen mit mittlerer Leistung und im industriellen Maßstab von Proteinen sehr großer Dimension empfohlen. Die Retentions-Elutions-Kapazität dieses makroreticularen Gels beruht auf einer geringen Fähigkeit zum Ionenaustausch und auf der großen Dimension der Poren.
Die Anmelderin hat also gezeigt, daß dieser Typ Gel es erlaubt, bevorzugt die Komplexe sehr großer Dimension zu adsorbieren, die sich zwischen dem Faktor VIII und dem Von-Willebrand-Faktor bilden. Außerdem hat die Anmelderin durch die Wahl der Äquilibrienangs- und Elutionspuffer die schwach hydrophoben Bindungen, die sich dank der verlängerten Retention der Komplexe großer Dimension auf dem Polyvinylträger bilden, ausgenützt. Dieser Vorteil des Gels wurde vorher nicht gezeigt Durch Verwendung eines derartigen Harzes zur Verarbeitung einer Faktor VIII enthaltenen Plasmafraktion, beispielsweise einer vorgereinigten Lösung des bei niedriger Temperatur Gefällten, erhält man unter geeigneten Pufferbedingungen ein Konzentrat von Faktor VIII sehr hoher Reinheit und einer Qualität, die mit der eines Konzentrats von Plasma gleicher Blutgruppe vergleichbar ist, in einer Konzentration von 50 IE/mg (spezifische Aktivität größer als 100 IE/mg), ohne daß man auf einen Schritt der Ultrafiltration zurückgreifen muß, und mit großer Stabilität, d. h. das Konzentrat erfordet nicht die Zugabe eines Stabilisators mit Proteincharakter. Man erhält überdies durch die gleiche Chromatographie an Fibrinogen, an Fibronectin und an Von-Willebrand-Faktor angereicherte Fraktionen, die den physikochemischen Parametern entsprechen, welche für einen therapeutischen Gebrauch oder als Reaktiv genügen. Außerdem kann das Fibrinogen weiter konzentriert werden, um als biologischer Klebstoff gemäß der europäischen Patentanmeldung 88 401961.3 verwendet zu werden.
Die Ausführung des Verfahrens nach der Erfindung geschieht wie folgt. Die vorgereinigte Plasmafraktion, welche die größeren Proteine des bei niedriger Temperatur Gefällten enthält, d. h. Fibrinogen, Faktor VIII, Fibronectin und Von-Willebrand-Faktor, läuft über ein Anionenaustauscherharz, wie es oben spezifiziert wurde; der Faktor VIII, der Von- Willebrand-Faktor (die Gesamtheit oder ein großer Teil, je nach der Menge an Ausgangsmaterial) und das Fibronectin werden am Harz adsorbiert, während sich das Fibrinogen im Filtrat der nicht adsorbierten Proteine wiederfindet.
Durch eine erste Erhöhung der Ionenstärke des Puffers wird das Fibronectin und ein großer Teil des Von-Willebrand-Faktors eluiert.
Durch eine zusätzliche Erhöhung der Ionenstärke des Puffers wird der Faktor VIII in Gegenwart von geringen Mengen von Von-Willebrand-Faktor eluiert und kann direkt gefriergetrocknet werden, ohne daß es notwendig ist, ihm einen Stabilisator zuzugeben oder ihn einem Schritt der Ultrafiltration zu unterziehen.
Der benutzte Puffer enthält vorteilhaft Lysin in einer Menge von der Größenordnung 2 bis 4 g/l sowie Glycin in einer Menge von der Größenordnung 8 bis 11 g/l. Die Verwendung anderer Aminosäuren oder nur einer einzigen dieser beiden Aminosäuren gibt deutlich weniger zufriedenstellende Ergebnisse.
Die Erhöhung der Ionenstärke des Puffers geschieht durch Zugabe von Natriumchlorid. Tatsächlich erlaubt die alleinige Benutzung dieses Harzes von gemäßigt ionischem Charakter und leicht hydrophober Natur die Verwendung dieses Salzes für die Desorption des Von-Wllebrand-Faktors vor der Elution des Faktors VIII, was den Rückgriff auf Calciumchlorid vermeidet, das anschließend durch Ultrafiltration entfernt werden müßte, um den Faktor VIII:C und den Von-Willebrand-Faktor zu dissoziieren.
Man kann selbstverständlich in jedem beliebigen Stadium des Verfahrens eine Virusinaktivierungsbehandlung nach einer bekannten Technik vorsehen. In dem Fall, daß man ein chemisches Agens zur Virusinaktivierung benutzt, wird es sinnvoll sein, diese Inaktivierung unmittelbar vor dem Lauf der Plasmafraktion über das Harz durchzuführen. Auf diese Art kann der chromatographische Arbeitsschritt der wirkungsvollen Entfernung der Inaktivierungsagenzien dienen. Es wurden gute Ergebnisse unter Verwendung der Technik der Inaktivierung durch Solvens-Detergens, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0131 740 beschrieben, erhalten.
Für die Herstellung von Faktor VIII kann der Schritt der Chromatographie an jeder Proteinfraktion, die diesen Faktor enthält, ausgeführt werden, beispielsweise an einer vorgereinigten, bei niedriger Temperatur gefällten Plasmafraktion, die einer Behandlung mit Aluminiumoxidgel, gegebenenfalls gefolgt von einer Fällung bei niedriger Temperatur, unterworfen wurde, gemäß klassischen Methoden der Herstellung von Faktor-VIII-Konzentraten, die in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 238 701 beschrieben wurden.
Die spezifische Aktivität des Faktors VIII:C in der Ausgangsfraktion kann so niedrig wie 0,1 IE/mg sein. Der durch einen einzigen Schritt der Anionenaustauschchromatographie erhaltene Reinigungsfaktor ist gemäß der Erfindung von der Größenordnung 400 bis 700. Die Ausbeute dieses Schritts liegt zwischen 75 und 90%.
Das erhaltene Konzentrat von Faktor VIII ist von sehr hoher Reinheit, wobei seine spezifische Aktivität größer als 100 IE pro mg Protein ist. Er ist frei von Fibrinogen und Immunglobulinen G, und er ist an Fibronectin deutlich verarmt. Dieses Produkt ist frei von menschlichen Blutgruppenantikörpem oder enthält nur geringste Mengen davon, ist also einem Konzentrat von der Qualität einheitlicher Blutgruppe nach den von der Europäische Phannakopöe empfohlenen Normen vergleichbar, und dies selbst dann, wenn als Ursprungsmaterial ein nicht nach der Blutgruppe ausgewähltes Plasma verwendet wird. Es kann also in der Therapie, insbesondere in der Behandlung der Hämophilie A, die laufend wiederholte Injektionen erfordert, sehr vorteilhaft verwendet werden. Es kann ebenso als Reaktiv in jedem Test oder jeder Analyse verwendet werden, die Faktor VIII sehr hoher Reinheit erfordem.
Die anderen durch diese chromatographische Kolonne getrennten Fraktionen sind ebenfalls wegen der Proteine, die sie enthalten, interessant, nämlich einerseits Fibrinogen, das im ersten Filtrat wiedergewonnen wird, und andererseits Fibronectin und Von-Willebrand-Faktor, die durch die erste Erhöhung der Ionenstärke des Puffers eluiert werden.
Die folgenden Beispiele schildern die Erfindung, ohne freilich ihre Tragweite zu begrenzen.
Beispiel 1
A) Vorreinigung und Virusinaktivierung
Man gebraucht als Ausgangsmaterial einen bei niedriger Temperatur gefällten Niederschlag von Humanplasma, der durch eine wäßrige Lösung von Natrium-Heparin (mit 2 E/ml) wieder in Suspension gebracht wurde und der Faktor VIII in einer spezifische Aktivität enthält, die zwischen 0,6 und 1,1 IE/mg liegt
Der pH der Suspension wird mit 0,1 M Essigsäure auf 7,0–7,1 eingestellt.
Diese Suspension des bei niedriger Temperatur Gefällten wird einer Vorreinigung durch Behandlung mit Aluminiumoxidgel und Ausfällung in der Kälte unterzogen. Man fügt zu der Suspension Aluminiumhydroxid (108 g 2%-iges Al(OH)₃ auf 1 kg des bei niedriger Temperatur Gefällten) unter Rühren während 5 Minuten bei gewöhnlicher Temperatur. Man stellt den pH mit 0,1 M Essigsäure auf 6,5–6,6 ein, dann kühlt man die Suspension wieder unter Rühren auf 14–16°C ab. Sobald die gewünschte Temperatur erreicht ist, zentrifugiert man bei 14–16°C, nimmt den Überstand ab und sterilisiert ihn durch Filtration.
Diese vorgereinigte Lösung wird einer Virusinaktivienangsbehandlung durch Solvens-Detergens in Gegenwart von Tween^®-TNBP nach der in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 131 740 beschriebenen Methode unterzogen.
B) Chromatographische Trennung auf Fractogel TSK-DEAE
Man stellt eine chromatographische Kolonne mit dem Harz Fractogel^® TSK-DEAE 650 (M) (Merck) her. Man sieht eine Menge von 0,5 l Fractogel^® pro kg des bei niedriger Temperatur Gefällten vor. Die Kolonne wird mit 5 Volumina 0,1 M NaCl-Lösung gewaschen, dann mit dem folgenden Puffer äquilibriert:
Trinatriumcitrat (2,94 g/l), Calciumchlorid (1 mM), Natriumchlorid (0,11 M), Glycin (9 g/l) und Lysin (3 g/l).
Die im Abschnitt A) beschriebene vorgereinigte Lösung des bei niedriger Temperatur Gefällten wird in die Kolonne injiziert.
Das Filtrat und die folgenden Eluate werden auffangen, und ihr Proteingehalt wird durch Messung der Absorption bei 280 nm (nachfolgend mit OD bezeichnet) registriert.
Das erste Filtrat zeigt einen Peak von durch die Kolonne nicht adsorbierten Proteinen, der im wesentlichen dem Fibrinogen entspricht (siehe Beispiel 3).
Nach der Elution dieses Peaks, wenn die OD auf die Basislinie zurückgefallen ist, eluiert man die Kolonne mit dem gleichen Puffer, dessen Ionenstärke man ein erstes Mal durch Zugabe von NaCl bis zur einer Endkonzentration von 0,15 M erhöht. Dieser Puffer desorbiert einen Peak von Proteinen, der den größten Teil des Von-Willebrand-Faktors und des Fibronectins erhält (siehe Beispiel 4).
Nach der Elution dieses Peaks, wenn die OD auf die Grundlinie zurückgefallen ist, erhöht man ein zweites Mal die Ionenstärke des Puffers durch Zugabe von NaCl bis zur Endkonzentration von 0,25 M.
Unter diesen Bedingungen wird der Faktor VIII in einer Konzentration von 30 bis 40 IE/mg eluiert.
Beispiel 2: Herstellung des Konzentrats von Faktor VIII
Die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen chromatographischen Verfahren erhaltene Lösung von Faktor VIII ist genügend rein und konzentriert, um direkt, ohne einen zusätzlichen Schritt der Ultrafiltration in Fläschchen konditioniert und gefriergetrocknet zu werden.
Die Konzentration kann gegebenenfalls durch Verdünnung mit dem gleichen Elutionspuffer eingestellt werden, um die spezifische Aktivität pro Fläschchen gemäß den gesetzlichen Bestimmungen einzustellen.

Die mittlere Zusammensetzung der gewonnenen Lösungen ist die folgende:

Proteine (g/l)	0,16–0,25
Faktor VIII:C (IE/ml)	30–45
Spezifische Aktivität des Faktors VIII:C (IE/mg)	120–250
Fibrinogen (g/l)	< 0,1
Von-Willebrand-Faktor:Ag (E/ml)	11–23
Von-Willebrand-Faktor:RCO (E/ml)	10–20
Faktor VIII:Ag (E/ml)	35–60
IgG (mg/ml) (Nephelometrie)	< 0,011
natürliche und immune anti-A-Antikörper	0–2
Fibronectin (mg/l)	15–40

Das Produkt ist nach Gefriertrocknung sofort löslich, und das Produkt ist klar. Der Anteil an Faktor VIII:C ist über 24 h bei Umgebungstemperatur stabil.
Die Injektionen am Menschen zeigen eine Rückgewinnung des Faktors VIII an, die der mit den Produkten geringerer Reinheit erhaltenen vergleichbar ist. Ebenso ist die Halbwertszeit äquivalent zu jener der anderen Produkte.
Dieses Konzentrat erweist sich als ein Produkt von sehr hohem therapeutischem Wert, das insbesondere an die wiederholten Injektionen, die in der Behandlung der Hämophilie A nötig sind, angepaßt ist.
Beispiel 3: Reinigung eines Konzentrats von Fibrinogen
Das erste Filtrat der Chromatographie auf DEAE-Fractogel, beschrieben in Beispiel 1, enthält hauptsächlich Fibrinogen, aber auch Albumin, Immunglobuline und Agenzien zur Virusinaktivierung (Tween^® und TNBP).
Ausgehend von dieser Lösung wird das Fibrinogen durch einen neuen Schritt der Chromatographie auf einer Kolonne mit Heparin-Sepharose-Harz gereinigt.
Diese chromatographische Behandlung erfolgt in dem gleichen Puffer wie die vorherige, der auf 0,06 M an NaCl eingestellt ist, was erlaubt, eine Dialyse zwischen den zwei chromatographischen Behandlungen zu vermeiden.
Das Filtrat der ersten Chromatographie wird verdünnt, um eine Osmolarität von 280 mosm bei einem pH von 6,5 zu erhalten, bevor es in die zweite Kolonne injiziert wird. Man findet im zweiten Filtrat Albumin, Immunglobuline, Tween^® und TNBP. Das Fibrinogen wird auf der Kolonne adsorbiert.
Wenn die OD des Filtrats wieder auf das Basisniveau gefallen ist, eluiert man die Kolonne mit dem gleichen Puffer, nachdem man dessen Ionenstärke durch Zugabe von NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,16 M erhöht hat.
Die aufgefangene Fraktion von Fibrinogen wird dann konzentriert und über einem Kassettensystem dialysiert. Das konzentrierte Produkt wird in Fläschchen verteilt und gefriergetrocknet.
Dieses konzentrierte Fibrinogen entspricht den durch die Europäische Phannakopöe festgelegten Qualitätsnormen.
Außerdem kann es als Grundlage zur Darstellung von biologischem Klebstoff nach der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 305 243 dienen.
Beispiel 4: Herstellung eines Konzentrats des Von-Willebrand-Faktors
Die von der Chromatographie über DEAE-Fractogel^® in Gegenwart von 0,15 M NaCl eluierte Fraktion, beschrieben in Beispiel 1, ist stark mit Von-Willebrand-Faktor und mit Fibronectin angereichert. Sie enthält ferner Tween^® und TNBP.
Diese Fraktion wird verdünnt, um ihre Osmolarität mit dem Basispuffer der Chromatographie (Trinatriumcitrat, Calciumchlorid, Lysin, Glycin, pH 7, Osmolarität 18 mosm) auf 385–390 mosm einzustellen.
Sie wird dann in eine zweite Kolonne von DEAE-Fractogel injiziert, die mit dem gleichen Puffer wie vorher, der NaCl in einer Endkonzentration von 0,11 M enthält und auf pH 7 und 387 mosm eingestellt ist, äquilibriert ist.
Unter diesen Bedingungen ist eine sehr gute Entfernung von Tween^® und TNBP sichergestellt.
Da die Ausgangslösung an Von-Willebrand-Faktor bereits konzentriert ist, ist dessen Fixierung auf der Kolonne deutlich größer als während des Laufs über die erste Kolonne. Die Fixierungskapazität der Kolonne ist mindestens 160 E Ag/ml (Einheit des Antigens des Von-Willebrand-Faktors) oder 100 E RCO/ml (Einheit des Cofactors von Ristocetin).
Die Elution der Fraktion, die den Von-Willebrand-Faktor enthält, geschieht durch Zugabe von NaCl zum Puffer bis zu einer Endkonzentration von 0,15 M.
Die eluierte Lösung des Von-Willebrand-Faktors ist ausreichend konzentriert, um keine zusätzliche Ultrafiltration zu benötigen; sie wird in Fläschchen verteilt und gefriergetrocknet.
Das erhaltene Konzentrat ist von sehr hoher Reinheit und besitzt eine spezifische Aktivität größer als 100 E RCO/mg. Es enthält ferner Fibronectin, doch schadet dieses nicht seiner Aktivität.
Beispiel 5: Darstellung eines Konzentrats von Fibronectin Man kann ausgehend von dem gleichen Ausgangseluat wie in Beispiel 4 ebenso ein Fibronectin-Konzentrat darstellen.
Man kann tatsächlich den Von-Willebrand-Faktor und Fibronectin auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Molekulargewichte trennen. Durch molekulare Filtration auf beispielsweise einer Kolone von Sephacryl S-400 (R) (Pharmacia) trennt man eine erste Fraktion von hohem Molekulargewicht ab, die den Von-Willebrand-Faktor enthält, und dann eine Fraktion, die das Fibronectin enthält, das direkt konditioniert und gefriergetrocknet werden kann.

Claims

Verfahren zur Trennung von Proteinen Faktor VIII, Fibrinogen, Fibronectin und von Willebrand-Faktor des menschlichen oder tierischen Plasmas und zur Herstellung von Konzentraten dieser Proteine zum therapeutischen Gebrauch, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte aufweist: – als Ausgangsmaterial wird die bei niedriger Temperatur gefällte Plasmafraktion, die im wesentlichen aus Fibrinogen, Fibronectin, Von-Willebrand-Faktor und Faktor VIII besteht verwendet, – das besagte bei niedriger Temperatur Gefällte, das wieder in wäßrige Lösung gebracht wurde, wird einer einzigen Trennung durch Chromatographie auf einem Anionenaustauscherharz unterworfen, dessen Matrix ein Gel von der Art eines makroreticularen Vinylpolymeren ist, das durch seine Porositäts- und Hydrophobieeigenschaften fähig ist, den Komplex aus Faktor VIII und von Willebrand-Faktor zurückzuhalten, – durch aufeinanderfolgende Erhöhungen der Ionenstärke des Elutionspuffers werden selektiv die verschiedenen Proteine gewonnen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel von der Art des Vinylpolymeren Fractogel^® – TSK ist
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Anionen austauschende Charakter des Harzes von auf die Matrix gepfropften Gruppen vom DEAE-Typ herrührt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsfraktion Faktor VIII enthält, der eine spezifische Aktivität größer oder gleich 0,1 I. E. pro mg an Proteinen aufweisen kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsfraktion eine Vorreinigungsbehandlung erfahren hat, die – eine Behandlung mit Aluminiumhydroxid, – eine Abkühlung auf 14–16°C, – ein Zentrifugieren und die Wiedergewinnung des Überstands umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographie mit einem Puffer durchgeführt wird, der Lysin und Glycin enthält und dessen Ionenstärke mit Hilfe von Natriumchlorid in zunehmender Konzentration erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer 2 bis 4 g/l Lysin und 8 bis 11 g/l Glycin enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Natriumchlorid-Konzentration des Puffers – bei der Äquilibrierung der Kolonne und beim Beladen der Probe 0,11 M ist, was die Adsorption des Fibronectins, des Von-Willebrand-Faktors und des Faktors VIII erlaubt und das Fibrinogen in das Filtrat durchlaufen läßt, – auf 0,15 M erhöht wird, um das Fibronectin und den größten Teil des von Willebrand-Faktors zu eluieren, – auf 0,25 M erhöht wird, um den Faktor VIII zu eluieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß mit der Plasmafraktion, bevor sie dem Schritt der chromatographischen Trennung unterworfen wird, eine Behandlung zur Virusinaktivierung in Gegenwart von chemischen Inaktivierungsagentien durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es das Auffangen des Filtrats der Chromatographie und dessen Lauf über eine Chromatographie über Heparin-Sepharose-Harz einschließt, um ein Fibrinogen-Konzentrat zu gewinnen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es das Auffangen des ersten Eluats der Chromatographie und dessen Lauf über eine zweite, mit der ersten identische Kolonne einschließt, mit dem gleichen, auf 0,15 M eingestellten Natriumchlorid-Puffer, um ein Konzentrat des Von-Willebrand-Faktors zu gewinnen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es das Auffangen des ersten Eluats der Chromatographie und dessen Lauf über eine Molekularsieb-Chromatographie einschließt, um ein Fibronectin-Konzentrat zu gewinnen.
Konzentrat von Faktor VIII, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine spezifische Aktivität von wenigstens 100 I. E. pro mg an Proteinen besitzt und daß es von einer Qualität vergleichbar mit der eines Konzentrats gleicher Blutgruppe ist