DK175322B1

DK175322B1 - Fremgangsmåde til separation af Faktor VIII, fibrinogen, fibronectin og von Willebrands faktor af humane eller animalske plasma og Faktor VIII opnået ved fremgangsmåden

Info

Publication number: DK175322B1
Application number: DK199000299A
Authority: DK
Inventors: Thierry Burnouf; Myriana Burnouf
Original assignee: Ct Regional De Transfusion San
Priority date: 1988-06-07
Filing date: 1990-02-06
Publication date: 2004-08-23
Also published as: KR970010923B1; US5252709A; RU1837880C; JP2805364B2; DE68922358D1; NO177188C; FI96210B; AU622436B2; NO900529L; NO177188B; DK29990A; EP0359593B2; ES2070919T3; WO1989012065A1; FR2632309A1; ES2070919T5; AU1138392A; LTIP262A; FI96210C; DK29990D0

Description

DK 175322 B1

Den foreliggende opfindelse angår separation af proteiner fra en fraktion af humant plasma eller dyreplasma ved ionbytningskromatografi under anvendelse af en teknik, som gør det muligt i et enkelt trin at opnå en meget høj oprensningsgrad, navnlig for faktor VIII, fibrinogen og Von Willebrands faktor.

5

Tilvejebringelsen af blodproteiner til terapeutiske formål nødvendiggør anvendelsen af oprensningsmetoder, som gør det mulig at opnå produkter, der er meget rene og fuldstændigt frie for kontaminerende forbindelser, navnlig andre proteiner eller substanser af fremmed oprindelse, såsom antistoffer.

10

Ved behandling af f.eks. hæmofili A er det vigtigt at råde over faktor VIIlkoncentrater af meget høj renhed; patienten får talrige gentagne injektioner af faktor Vlll-koncentrater og samtidig væsentlige mængder af fibrinogen og immunoglobuliner, som kan inducere uønskede immunsvar. Gentagne injek-15 tioner af utilstrækkeligt oprenset faktor VIII kan derfor kun udføres med plasmakoncentrater fra den samme gruppe for at undgå typiske transfusionsuheld på grund af forskelle i blodgruppe og fremkaldt ved tilstedeværelsen af immunoglobuliner.

20 Faktor Vlll-koncentrater fremstilles oftest ud fra en fraktion af cryopræcipite-ret humanpjasma. Renheden af faktor Vlll-koncentrater, som almindeligvis opnås fra centre, der fremstiller humanplasma i industriskala, er ofte af størrelsesordenen i international enhed/mg og overstiger almindeligvis ikke grænserne fra 10 til 20 internationale enheder/mg. Traditionelle fremstillings-> 25 metoder gør brug af præcipiteringstrin, hvorved man forsøger, ofte meget utilstrækkeligt, at eliminere proteinkontaminanter, såsom fibrinogen, fibronec-tin og immunoglobuliner. Disse metoder kan anvende eller kombinere præci-pitering ved lav temperatur (10 °C) eller tilsætningen af proteinpræcipiterende midler, hydrofile polymerer, såsom PEG (Newman et al., Br. J. Haematol, 21: 30 1-20,1971, Hao et al., i Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic

Press, 1980, s. 57-74), polyvinylpyrrolidon (Casillas og Simonetti, Br. Haeina-to, 50: 665-672,1982), dextran, Ficoll, Percoll, hydroxyleret stivelse og albumin er således blevet foreslået som faktor Vlll-præcipiterende midler (Farru-

I DK 175322 B1 I

i 2 I

I gia et al., Thromb Haemostas, 51: 338-342, 1984). Det samme gælder an- I

I vendeisen af glycin og natriumchlorid anbefalet af Thorell og Blomback. Nog- I

I le forfattere (Ng et al., Thrombosis Res., 42: 825-834, 1986) har med held I

I kombineret tre præcipiteringsmidler, nemlig: PEG, glycin og natriumchlorid, til I

I 5 opnåelse af faktor VIIl-koncentrater med en specifik aktivitet på mellem 10 og I

I 16 internationale enheder/mg. I

I Der er også blevet anvendt sterisk eksklusionskromatografi eller gelfiltrering, I

I metoder, som er beregnet til indvinding af en fraktion med høj molekylevægt I

I 10 indeholdende faktor VIII:C-Von Willebrands faktorkompleks delvis fri for fibri- I

I nogen. Med denne teknik tilvejebringes med en lav output-hastighed et pro- I

I dukt, hvis specifikke aktivitet ikke overstiger 30 internationale enheder/mg, og I

I som nødvendiggør tilsætning af albumin som en stabilisator (hvilket fører til I

I fald i specifik aktivitet til ca. 3 til 5 internationale enheder/mg. Denne teknik I

I 15 har en række problemer med hensyn til tilpasning til produktion i stor skala, I

I eftersom det er vanskeligt at holde opløsningsevnen i industrielle gelfiltre- I

I ringssøjlerover en tidsperiode. I

I Der er også blevet produceret faktor VIIl-koncentrater ved i produktionspro- I

I 20 grammet at inkorporere kontakt med mikrokugler af porøs siliciumdioxid ud- I

I formet til at indfange proteinkontaminanter med lav molekylevægt (Margolis I

I et al., Vox Sang., 46: 341-348,1984). Den specifikke aktivitet af produktet I

I forbliver forholdsvis lille: 1 international enhed/mg. I

I 25 Der er for nylig fremkommet nye metoder til fremstilling af meget rene faktor I

I VIIl-koncentrater. Hyland- og Travenol-firmaerne har f.eks. foreslået at opnå r I

I koncentrater ved at anvende immunaffinitetskromatografimetoder (Zimmer- I

I man og Fuicher, Thrombosis Res., suppi. VII, s. 58,1987, Berntorp og Nils- I

I son, Thrombosis Res., suppi. VII, s. 60,1987, Levine et al., Thrombosis I

I 30 Res., suppi. VII, 1987). Disse metoder omfatter oprensning af faktor VIII med I

I antistoffer mod faktor VIII:C eller Von Willebrands faktor immobiliseret på et I

I kromatografisk medium. Disse metoder fungerer godt, men nødvendiggør I

I anvendelsen af drastiske opløsninger til at desorbere faktor VIII fra enten I

DK 175322 B1 3 dets antistoffer eller fra Von Willebrands faktor. Et yderligere ultrafiltreringstrin, som har til hensigt at fjerne de uønskede kemiske midler, er således påkrævet, men det kan være ødelæggende for den biologiske aktivitet af faktor VIII. Den specifikke aktivitet af faktor VIII kan nå fra 1.000 til 3.000 in-5 ternationale enheder/mg i løbet af produktionen, men dens ustabilitet nødvendiggør tilsætning af et stabiliseringsmiddel, såsom albumin, før frysetørringstrinnet, hvilket nedsætter den specifikke aktivitet af faktor VIII til fra 3 til 5 internationale enheder/mg. Den vigtigste ulempe ved oprensning ved immunaffinitet er imidlertid tilstedeværelsen af resterende antistoffer; da disse 10 stammer fra mus, kan de medføre et immunsvar i patienterne rettet mod disse proteiner, som er fremmede for den humane organisme.

lonbytningskromatografimetoder er også blevet anvendt, men på grund af kompleksiteten af driftsprocedurerne og de opnåede lave udbytter er disse 15 metoder begrænset til laboratoriet.

I en artikel af J.J. Morgenthaier (Throinb. Haemostas., Stuttgart, 47 (2) 124-127 (1982)), diskuteres f.eks. oprensningen af faktor VIll:C under anvendelse af et polyethylenglycolpræcipitat ved passage gennem en modificeret Sepha-20 rose-harpiks. Der er ingen oplysninger om udbyttet eller reproducerbarheden ved de forskellige undersøgte metoder.

Dansk patent nr. 162896 angår en fremgangsmåde til oprensning af Faktor VIII under anvendelse afen hydrofob harpiks, aminohexylagarose. Den spe-25 cifikke aktivitet af Faktor VIII overskrider ikke 10 lE/mg.

Det er således absolut nødvendigt at råde over nye fremgangsmåder til opnåelse af proteinkoncentrater og navnlig faktor VIII, hvilke metoder kan anvendes i industriskala og give meget rene produkter fuldstændigt frie for pro-30 teiner af fremmed oprindelse, såsom antistoffer af animalsk oprindelse.

Ansøgeren har derfor udviklet en oprensningsmetode under anvendelse af anionbytningskromatografi, hvilken metode takket være det passende valg af

I DK 175322 B1 I

i 4 I

I den anvendte resin muliggør, at de proteiner, som har interesse, separeres I

I med en enkelt kromatografisøjle under betingelser, som er hensigtsmæssigt I

I udformet, så det er muligt at klare sig uden yderligere bearbejdning, såsom I

I ultrafiltrering, hvilket forøger processens kompleksitet og nedsætter aktivite- I

I 5 ten af de oprensede protein. I

I Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til separering af Faktor VIII, I

I fibrinogen, fibronectin og Von Willebrands faktor af humane eller animalske I

I plasma og til fremstilling af koncentrater af disse proteiner til terapeutisk an- I

I 10 vendelse, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter føl- I

I gende trin: I

I - den cryopræcipiterede fraktion af plasma anvendes som udgangsma- I

I teriale I

I 15 - i alt væsentligt bestående af fibrinogen, fibronectin, von Willebrands I

I faktor og Faktor VIII; I

I - hvilket cryopræcipitat i vandig opløsning udsættes for en enkelt sepa- I

I ration ved kromatografi på en anionbytterharpiks, hvis matrix er en gel I

I af den makroretikulære vinylpolymertype, der som følge af sine hydro- I

I 20 fobe og porøse egenskaber er i stand til at tilbageholde Faktor VIIl-von I

I Willebrands faktor komplekset; I

I - og de forskellige proteiner udvindes selektivt ved successiv forøgelse I

I af elueringspufferens ionstyrke. I

I 25 Fremgangsmåden kan også anvendes med et plasma af animalsk oprindel- I

I se, fra svin f.eks., til specielle tilfælde med hæmofili-patienter med hæmmen- I

I de serum, hvilke patienter ikke kan behandles med faktor VIII af human op- I

I rindelse. I

I 30 Som en udgangsfraktion kan man således anvende en fraktion af et cryo- I

I præcipiteret plasma, som kan have været underkastet en foroprensningsbe- I

I handling. Denne forbehandling kan f.eks. bestå af præcipitering med alumi- I

DK 175322 B1 5 niumoxidgel og/eller præcipitering ved lav temperatur i overensstemmelse med de traditionelle metoder til behandling af sådanne fraktioner.

Ved undersøgelsen af de forskellige resiner til kromatografisk separation blev 5 det observeret, at de mest tilfredsstillende resultater blev opnået med DEAE-grupper fastgjort på en vinylpolymergel, såsom Fractogel TSK. En resin af denne type kan fås kommercielt under navnet Fractogel TSK-DEAE 650 (M) (Merck). Dette kromatografiske medium har givet langt bedre resultater end de resultater, der blev opnået med de andre undersøgte geler, såsom DEAE-10 Sepharose CL-6B, DEAE Sepharose CL-6B Fast-Flow (Pharmacia), DEAE-Sepharose 4B eller DEAE-Trisacryl LS (IBF).

Anvendelsen afen gel, som ligner Fractogel-TKS-DEAE (M), er beskrevet af Y. Kato et al., (J. Chromato., 245, 1982, 193-211), og anbefales til kromato-15 grafisk separation af meget store proteiner i industriskala. Denne gels reten-tions-elueringskapacitet er baseret på en lav ionbytningskapacitet og en stor porestørrelse.

Ansøgeren har vist, at denne type gel gjorde det muligt fortrinsvis at adsorbe-20 re de meget store komplekser, som dannes mellem faktor VIII og Von Wille-brands faktor. Ved valg af påsætnings- og elueringspuffer har ansøger endvidere undersøgt de let hydrofobe bindinger, som dannes på grund af den forlængede retention af de store komplekser på polyvinylmediet. Denne fordel ved gelen er ikke tidligere blevet belyst.

25

Ved at anvende en sådan resin til at behandle en fraktion af plasma indeholdende faktor VIII, f.eks. en foroprenset opløsning af cryopræcipitatet, opnåede vi under passende pufferbetingelser et faktor VIII koncentrat af meget høj renhed og hvis kvalitet kan sammenlignes med den for et plasmakoncentrat 30 af en enkelt gruppe ved en koncentration på størrelsesordenen 50 internationale enheder/mg (specifik aktivitet højere end 100 internationale enhe-der/mg), uden at der er behov for et ultrafiltreringstrin, og med høj stabilitet, dvs., det ikke er nødvendigt at tilsætte et stabiliseringsmiddel af proteintypen.

DK 175322 B1 I

Ved den samme kromatografi er det også muligt at opnå fibrinogen-, fibro- I

nectin- og Von Willebrands faktorberigede fraktioner, som opfylder de fysiske I

kemiparametre, der tilfredsstiller kravene for terapeutiske formål og for an- I

vendeisen som et reagens. Endvidere kan fibrinogenet koncentreres til brug

5 som en biologisk lim i overensstemmelse med europæisk patentansøgning I

nr. 88 401961.3. I

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse udføres på følgende I

måde. Plasmafraktionen, som er foroprenset og indeholder hovedproteinerne I

10 i cryopræcipitatet, dvs. fibrinogen, faktor VIII, fibronectin og Von Willebrands I

faktor, føres over en anionbytningsresin, såsom den ovenfor specificerede; I

faktor VIII, Von Willebrands faktor (alt eller en væsentlig del afhængigt af I

mængden af det oprindelige materiale) og fibronectinet adsorberes på resi- I

nen, medens fibrinogenet findes i filtratet med ikke-adsorberede proteiner.

15 I

Ved en første forøgelse af ionstyrken i pufferen elueres fibronectinet og en væsentlig del af Von Willebrands faktor.

Ved en yderligere forøgelse af ionstyrken i pufferen elueres faktor VIII i nær- I

20 værelse af små mængder af Von Willebrands faktor og kan frysetørres direk- I

te, uden at der er behov for at tilsætte et stabiliseringsmiddel eller udsætte I

det for et ultrafiltreringstrin. I

Den anvendte puffer indeholder fordelagtigt lysin i en mængde på fra ca. 2 til I

25 4 g/l såvel som glycin i en mængde på fra ca. 8 til 11 g/l. Anvendelsen af an- I

dre aminosyrer eller endog anvendelsen af kun én af disse to aminosyrer I

giver langt mindre tilfredsstillende resultater. I

lonstyrken af pufferen forøges ved tilsætning af natriumchlorid. Anvendelsen

30 af denne enkelte resin, der er moderat ionisk og let hydrofobisk, gør det mu- I

ligt at anvende dette salt til at desorbere Von Willebrands faktor, før faktor I

VIII elueres, hvorved det er unødvendigt at anvende calciumchlorid, hvilket I

DK 175322 B1 7 derefter skulle fjernes ved ultrafiltrering for at dissociere faktor VIII og Von Willebrands faktor.

Der kan selvfølgelig udføres en virusinaktiverende behandling under anven-5 delse af en kendt metode på et hvilket som helst trin i processen. Hvis der anvendes et kemisk virusinaktiverende middel, vil det være hensigtsmæssigt at udføre denne inaktivering umiddel bart før plasmafraktionen føres gennem resinen. På denne måde vil det kromatografiske trin effektivt fjerne de inakti-verende midler.

10

Der er opnået gode resultater ved at anvende opløsningsmiddel-detergent-inaktiveringsmetoden, som er beskrevet i europæisk patentansøgning nr.

0 131 740.

15 Til fremstilling af faktor VIII kan det kromatografiske trin udføres på en hvilken som helst proteinfraktion, som indeholder faktoren, f.eks. på en foroprenset, cryopræcipiteret plasmafraktion, som har været udsat for en behandling med aluminiumgel, eventuelt efterfulgt af præcipitering ved lav temperatur, i overensstemmelse med de traditionelle metoder til produktion af faktor Vlll-kon-20 centrater, som er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 86 104297.6.

Den specifikke aktivitet af faktor VIII:C i den initielle fraktion kan være så lav som 0,1 internationale enheder/mg. Den opnåede oprensningsfaktor ved et enkelt anionbytningskromatografitrin ifølge den foreliggende opfindelse er af 25 størrelsesordenen fra 400 til 700 gange. Udbyttet ved dette trin ligger mellem 75% og 90%.

Det opnåede faktor Vlll-koncentrat er af meget høj renhed, idet dets specifikke aktivitet er større end 100 internationale enheder/mg protein. Det er fri for 30 fibrinogen og immunoglobuliner G, og det er væsentligt udtømt for fibronec-tin. Dette produkt er fri for humane blodgruppeantistoffer eller indeholder dem kun i meget små mængder, og det kan således sammenlignes med en koncentrat af enkeltgruppekvalitet i overensstemmelse med de standarder, som

DK 175322 B1 I

anbefales af den europæiske farmakopé, selv når der som et initielt materiale I

anvendes en plasma, som ikke er udvalgt efter blodgruppe. Det kan således I

med stor fordel anvendes ved terapier og navnlig ved behandling af hæmofili I

A, der nødvendiggør gentagne rutineinjektioner. Det kan også anvendes som I

5 et reagens ved en hvilken som helst test eller analyse, hvor der skal anven- I

des en meget rent faktor VIII. I

De andre fraktioner, som separeres med denne kromatografisøjle, har også I

interesse på grund af de proteiner, som de indeholder, nemlig på den ene I

10 side fibrinogen, der indvindes i det første filtrat, og på den anden side fibro- I

nectin og Von Willebrands faktor, som elueres ved den første forøgelse af I

ionstyrken i pufferen. I

De efterfølgende eksempler illustrerer opfindelsen. I

15 I

EKSEMPEL 1 I

A) Foroprensninq oo virusinaktivering I

20 Som et udgangsmateriale anvendtes et cryopræcipitat af humanplasma re- I

suspenderet i en vandig opløsning af natriumheparin (ved 2 enheder/ml) og I

indeholdende faktor VIII med en specifik aktivitet på mellem 0,6 og 1,1 inter- I

nationale enheder/mg. Suspensionens pH-værdi blev indstillet til 7-7,1 med I

0,1 M eddikesyre. I

25 I

Denne suspension af cryopræcipitatet blev udsat for oprensning ved behand- I

ling med aluminiumoxidgel og kold præcipitering. Der blev tilsat aluminium- I

hydroxid til suspensionen (108 g 2% AI(OH)3 pr. 1 kg cryopræcipitat) under I

omrøring i 5 minutter ved omgivelsestemperatur. pH-værdien blev indstillet til I

30 6,5-6,6 med 0,1 M eddikesyre, og suspensionen blev derefter afkølet til 14- I

16 °C under omrøring. Så snart den ønskede temperatur var blevet nået, I

blev centrifugering udført ved 14-16 °C, supematanten blev høstet, og den I

blev steriliseret ved filtrering. I

DK 175322 B1 9

Denne foroprensede opløsning blev udsat for en virus-inaktiveringsbehandling under anvendelse af opløsningsmiddel-detergent i nærværelse af Tween-TNBP i overensstemmelse med den metode, som er beskrevet i eu-5 ropæisk patentansøgning nr. 0 131 740.

B) Kromatografisk separation på Fractogel TSK-DEAE

Der blev fremstillet en kromatografisøjle med Fractogel TSK-DEAE 650 (M) 10 (Merck) harpiks. Der blev anvendt 0,5 liter Fractogel pr. kg cryopræcipitat.

Søjlen blev vasket med 5 voluminer 0,1 M NaCI-opløsning og blev derefter balanceret med en puffer, som indeholdt: trinatriumcitrat (2,94 g/liter), cal-ciumchlorid (1 mM), natriumchlorid (0,11 M), glycin (9 g/liter) og lysin (3 g/liter). Den foroprensede cryopræcipitatopløsning beskrevet i A) blev sat på 15 søjlen.

Det efterfølgende filtrat og eluater blev opsamlet, og deres proteinindhold blev overvåget ved at måle absorption ved 280 nm (herefter kaldet OD).

20 Det første filtrat viste en top af proteiner, som ikke blev adsorberet af søjlen, hvilket hovedsageligt svarer til fibrinogen (se eksempel 3).

Efter at denne top havde passeret, og CD-værdien var faldet tilbage til basislinien, blev søjlen elueret med den samme puffer, hvis ionstyrke var blevet 25 forøget en første gang ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 0,15 M. Denne puffer desorberer en proteintop indeholdende bulk-mængden af Von Willebrands faktor og fibronectin (se eksempel 4).

Efter at denne top havde passeret, når OD-værdien var faldet tilbage til ba-30 sislinien, blev ionstyrken af pufferen forøget en anden gang ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 0,25 M. Under disse betingelser elueres faktor VIII ved en koncentration på fra 30 til 40 internationale enheder/mi.

I DK 175322 B1 I

I 10 I

I EKSEMPEL 2 I

I Fremstilling af faktor VIIl-koncentratet I

I 5 Den faktor Vlll-opløsning, der blev opnået ved den kromatografiske metode, I

I som er beskrevet i eksempel 1, var tilstrækkelig ren og koncentreret til at bli- I

I ve anbragt direkte i flasker og frysetørret uden nogen yderligere ultrafiltre- I

I ringstrin. I

I 10 Koncentrationen kan, om nødvendigt, justeres ved fortyndinger med den I

I samme elueringspuffer for at indstille den specifikke aktivitet pr. flaske i over- I

I ensstemmelse med gældende legale standarder. I

I Den gennemsnitlige sammensætning af de opnåede opløsninger er følgen- I

I 15 de: I

I Proteiner (g/l) 0,16-0,25 I

I Faktor VIII:C (internationale enheder/ml) 30-4 5 I

I Specifik aktivitet af faktor I

I (internationale enheder/mg) 120-250 I

I Fibrinogen (g/l) <0,1 I

I Von Willebrands faktor: Ag (enhed/ml) 11-23 I

I Von Willebrands faktor: RCO (enhed/ml) 10-20 I

I Faktor VIII: Ag (enhed/ml) 35-60 I

I IgG (mg/ml) (nephelometri) <0,011 I

I Naturlige og immune anti-A-antistoffer 0-2 I

I Fibronectin (mg/l) 15-40 I

I Efter frysetørring er produktet klart og øjeblikkeligt opløseligt. Mængden af I

I faktor VIII:C er stabil over 24 timer ved omgivelsestemperatur. I

I 20 I

DK 175322 B1 11

Injektioner i mennesker indicerer, at faktor VIII:C-indvinding er sammenlignelig med den, der opnås med mindre rene produkter. På lignende måde er halveringstiden ækvivalent med halveringstiden for de andre produkter.

5 Dette koncentrat viser sig at være et produkt med meget stor terapeutisk værdi, og det er navnlig egnet til de gentagne injektioner, som er nødvendige ved behandling af hæmofili A.

EKSEMPEL 3 10

Oprensning af et fibrinoqen-koncentrat

Det første kromatografifiltrat på DEAE-Fractogel beskrevet i eksempel 1 indeholder hovedsagelig fibrinogen, men også albumin, immunoglobuliner og 15 virusinaktiverende midler (Tween og TNBP).

Fibrinogenet oprenses fra denne opløsning ved et yderligere kromatografitrin på en heparin-Sepharose resinsøjle.

20 Dette kromatografitrin udføres i den samme puffer som det foregående indstillet til 0,06 M NaCI, hvorved det undgås at udføre dialyse mellem de to kromatografitrin.

Filtratet fra det første kromatografitrin fortyndes til opnåelse af en osmolaritet 25 på 280 mOsm ved en pH-værdi på 6,5, før det påsættes den anden søjle.

Det andet filtrat indeholder albumin, immunoglobuliner, Tween og TNBP. Fibrinogenet er adsorberet på søjlen.

Når filtratets OD-værdi er faldet tilbage til basislinien, elueres søjlen med den 30 samme puffer, efter at dens ionstyrke er blevet forøget ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 0,16 M.

I DK 175322 B1 I

I 12 I

I Den opsamlede fibrinogenfraktion koncentreres derefter og dialyseres i et I

I kassettesystem. Det koncentrerede produkt fyldes på flasker og frysetørres. I

I Dette koncentrerede fibrinogen opfylder de kvalitetsstandarder, der kræves I

I ifølge den europæiske farmakopé. I

I 5 I

I Endvidere kan det tjene som et substrat til fremstilling af biologisk lim ifølge I

I europæisk patentansøgning nr. 88 401961.3. I

I EKSEMPEL 4 I

I 10 I

I Fremstilling af et koncentrat af Von Willebrands faktor I

I Den eluerede fraktion opnået ved kromatografi med DEAE-Fractogel i nær- I

I værelse af 0,15 M NaCI, beskrevet i eksempel 1, er betragteligt beriget med I

I 15 Von Willebrands faktor og fibronectin. Den indeholder stadig noget Tween og I

I TNBP. I

I Denne fraktion blev fortyndet til en osmolaritet på 385-390 mOsm med kro- I

I matografibasispufferen (trinatriumcitrat, calciumchlorid, lysin, glycin, pH 7, I

I 20 osmolaritet 18 mOsm) I

I Det påsættes derefter en anden søjle af DEAE-fractogel, ækvilibreret med I

I den samme puffer som før indeholdende NaCI ved en slutkoncentration på I

I 0,11 M indstillet til pH 7 og 387 mOsm. Under disse betingelser kan Tween I

I 25 og TNBP fjernes meget effektivt. I

I Eftersom den initielle opløsning allerede indeholdt en meget høj koncentrati- I

I on af Von Willebrands faktor, fæstnes sidstnævnte i langt højere grad til søj- I

I len end under passagen gennem den første søjle. Søjlens bindingskapacitet I

I 30 er mindst 160 enheder Ag/ml (antigenenhed af Von Willebrands faktor) eller I

I 100 RCO/ml (ristocetin co-faktorenheder) I

DK 175322 B1 13

Den fraktion, som indeholder Von Willebrands faktor, elueres ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 0,15 M til pufferen.

Den eluerede Von Willebrands faktor er tilstrækkelig koncentreret til, at yder-5 ligere ultrafiltrering er nødvendig; den fyldes på flasker og frysetørres.

Det opnåede koncentrat er meget rent og har en specifik aktivitet på over 100 enheder RCO/mg. Det indeholder stadig noget fibronectin, men det er ikke ødelæggende for dets aktivitet.

10 EKSEMPEL 5

Fremstilling af et fibronectin koncentrat 15 Et fibronectinkoncentrat kan også fremstilles ud fra det samme initielle eluat som i eksempel 4.

i

Von Willebrands faktor og fibronectin kan faktisk adskilles på basis af forskel i molekylevægt. Ved gelfiltrering på en søjle af Sephacryl S-400 (R) (Phar-20 macia) separeres f.eks. den første fraktion med høj molekylevægt indeholdende Von Willebrands faktor fra en fraktion indeholdende fibronectin, der kan fyldes direkte, på flasker og frysetørres.

Claims

1. Fremgangsmåde til separation af Faktor VIII, fibrinogen, fibronectin og von I I 5 Willebrands faktor af humane eller animalske plasma og til fremstilling af kon- I I centrater af disse proteiner til terapeutisk anvendelse, kendetegnet I I ved, at den omfatter følgende trin: I I - den cryopræcipiterede fraktion af plasma anvendes som udgangsma- I I- 10 teriale I I - i alt væsentligt bestående af fibrinogen, fibronectin, von Willebrands I I faktor og Faktor VIII; I I - hvilket cryopræcipitat i vandig opløsning udsættes for en enkelt sepa- I I ration ved kromatografi på en anionbytterharpiks, hvis matrix er en gel I I 15 af den makroretikulære vinyfpolymertype, der som følge af sine hydro- I I fobe og porøse egenskaber er i stand til at tilbageholde Faktor Vlll-von I I Willebrands faktor komplekset; I I - og de forskellige proteiner udvindes selektivt ved successiv forøgelse I I af elueringspufferens ionstyrke. I I 20 I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at vinyl polymerty- I I pe-gelen er "Fractogel-TSK". I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, k e n d e t e g-n e t ved, at harpik- I I 25 sens anionbytterkarakter er til vejebragt af grupper af DEAE typen podet på I I matrixen. I

4. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 3, kendetegnet I I ved, at udgangsfraktionen indeholder Faktor VIII, der kan have en specifik I I 30 aktivitet større end eller lig med 0,1 ΙΕ/mg protein. I DK 175322 B1

5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 4, k e n d e t e g n e t ved, at udgangsfraktionen har været underkastet en rensende forbehandling omfattende: 5. behandling med aluminiumhydroxid, - afkøling til 14 - 16 °C, - centrifugering og udvinding af supernatanten.

6. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 5, kendetegnet 10 ved, at kromatografien udføres med en puffer, der indeholder lysin og glycin, og hvis ionstyrke forøges ved hjælp af natriumchlorid i stigende koncentrationer.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at pufferen inde-15 holder fra 2 til 4 g/liter lysin og fra 8 til 11 g/liter glycin.

8. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 7, kendetegnet ved, at koncentrationen af natriumchlorid i pufferen: 20. er 0,11 M for ækvilibreringen af søjlen og prøven, hvilket tillader ad sorption af fibronectin, von Willebrands faktor og Faktor VIII og tillader, at fibrinogen passerer gennem i eluatet; - forøges til 0,15 M for at eluere fibronectinet og størstedelen af von Willebrands faktor; 25. forøges til 0,25 M for at eluere Faktor VIII.

9. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 8, k e n d e t e g n e t ved, at der på plasmafraktionen umiddelbart før udsættelse deraf for det kromatografiske separationstrin udføres en virusinaktiveringsbehandling i 30 nærværelse af kemiske inaktiveringsmidler. I DK 175322 B1 I i 16 I

10. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 9, kendetegnet I I ved, at den omfatter udvinding af kromatografieluatet og dets kromatografi på I I heparin-"Sepharose'’®-harpiks for at udvinde et fibrinogenkoncentrat. I I I I 5

11. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 9, k e n d e t e g n e t I I ved, at den omfatter udvinding af det første eluat fra kromatografien og pas- I I sage deraf gennem en anden søjle, der er identisk med den første, med I I samme puffer indstillet til 0,15 M natriumchlorid for at udvinde et koncentrat I I af von Willebrandts faktor. I I 10 I

12. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 9, kendetegnet I I ved, at den omfatter udvinding af det første eluat fra kromatografien og un- I I derkastelse deraf for molekylsigte-kromatografi for at udvinde et fibronectin- I I koncentrat. I I 15 I

13. Koncentrat af Faktor VIII opnåeligt ved fremgangsmåden ifølge et vilkår- I I ligt af kravene 1 ti I9,kendetegnet ved, at det har en specifik aktivitet I I på mindst 100 iE/mg protein, og at det er af en kvalitet sammenlignelig med I I kvaliteten af et enkelt-gruppe koncentrat. I I 20 I