RU2088590C1 - Способ получения стандартизированного концентрата человеческого фактора виллебранда и концентрат, полученный этим способом - Google Patents

Способ получения стандартизированного концентрата человеческого фактора виллебранда и концентрат, полученный этим способом Download PDF

Info

Publication number
RU2088590C1
RU2088590C1 SU925011041A SU5011041A RU2088590C1 RU 2088590 C1 RU2088590 C1 RU 2088590C1 SU 925011041 A SU925011041 A SU 925011041A SU 5011041 A SU5011041 A SU 5011041A RU 2088590 C1 RU2088590 C1 RU 2088590C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
column
von willebrand
factor
fraction
willebrand factor
Prior art date
Application number
SU925011041A
Other languages
English (en)
Inventor
Бюрнуф-Радозевич Мирьяна
Бюрнуф Тьерри
Original Assignee
Сантр Режиональ де Трансфюзьон Сангин де Лилль
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сантр Режиональ де Трансфюзьон Сангин де Лилль filed Critical Сантр Режиональ де Трансфюзьон Сангин де Лилль
Application granted granted Critical
Publication of RU2088590C1 publication Critical patent/RU2088590C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Использование: в медицине при получении стандартизированного концентрата человеческого фактора Виллебранда. Сущность изобретения: криоосажденную фракцию плазмы, предварительно очищенную на гидроксиде алюминия, дважды последовательно очищают ионообменной хромоматографией на смоле типа макропористого винилового полимера, имеющего группировки диэтиламиноэтила. Затем проводят дополнительную очистку с помощью аффинной хроматографии на колонке с желатин-сефарозой, приведенной в равновесие буферным раствором, используемым в качестве элюирующего на предыдущей стадии. Полученный концентрат фактора Виллебранда имеет высокую удельную активность и повышенное содержание мультимеров с высоким молекулярным весом. 2с. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил.

Description

Изобретение относится к способу получения в промышленном масштабе стандартизированного концентрата человеческого фактора Виллебранда очень высокой чистоты, имеющего очень высокую удельную активность и повышенное содержание мультимеров с высоким молекулярным весом, который предназначен особенно для терапевтического употребления.
Фактор Виллебранда /ФВ/ является самой большой известной молекулой, циркулирующей в плазме. Он состоит из системы мультимеров, связанных мостиками S-S, основной элемент которых имеет молекулярный вес, близкий к 260 килодальтонам /кДа/. Наименьшей формой ФВ в плазме является димер с молекулярным весом 440-500 кДа, а наибольшими формами являются мультимеры этого димера, молекулярный вес которых может достигать 20 миллионов Дальтонов. Такое соединение субэлементов в мультимеры может быть специфичным для клеток, в которых он вырабатывается, причем ФВ синтезируется и полимеризуется в мегакариоцитах и в клетках эндотелия.
Этот фактор играет основную роль в гемостазе за счет двух различных функций: в качестве адгезионного белка он осуществляет диспергирование, слипание и агрегирование кровяных пластинок /тромбоцитов/ на субэндотелии сосудов и участвует таким образом в процессе быстрого зарубцевания (заживления) поврежденных сосудов и, с другой стороны, он обеспечивает стабилизацию и перемешивание фактора YIII в процессе кровообращения.
Врожденная недостаточность ФВ или структурная аномалия этого фактора приводят к болезни Виллебранда, которая проявляется в кровотечениях, особенно кожных и в слизистых оболочках. Эта болезнь является очень неоднородной в своем клиническом выражении и ставит серьезные проблемы в случае хирургического вмешательства. Лечение болезни Виллебранда требует исправления аномалий первичного гемостаза /период свертывания крови/ и коагулирования /период активности головного мозга и коагулирующая активность фактора YIII/. Болезнь лечится в результате терапии методом замены производными человеческой плазмы, обогащенной ФВ /например, криосажденной фракцией плазмы или концентратами фактора YIII, содержащими достаточно ФВ, связанного с последним/. Однако эти продукты не являются стандартизированными для лечения болезни Виллебранда. Кроме того, малоочищенные фракции кровяной плазмы, в частности криоосажденная фракция, не лишены риска вирусного заражения, потому что они часто не подвергаются эффективной обработке для вирусной инактивации. Помимо этого они приводят к избытку загрязняющих белков, которые не нужны пациенту и которые могут вызвать иммунологические реакции после многократных введений.
Напротив, очищенный фактор YIII может подвергаться обработке для эффективной вирусной инактивации, однако способ его очистки был оптимизирован для лечения гемофилии А; а не для лечения недостаточности ФВ.
Таким образом, способы получения фактора YIII, разработанные недавно, такие как иммуноаффиность или очистка путем ионного обмена, становятся все более и более эффективными и проводят к получения концентратов, которые больше не содержат ФВ в количестве, достаточном, чтобы быть эффективными при лечении болезни Виллебранда.
Именно для того, чтобы удовлетворять необходимость в эффективном лечении болезни Виллебранда, заявитель разработал новый способ очистки ФВ в промышленном масштабе, который позволяет наилучшим образом сделать рентабельной экстракцию различных молекул плазмы. В частности, он позволяет на первой стадии получить концентрат фактора YIII /в соответствии со способом, описанным в заявке на европейский патент 0359593/, а в дальнейшем провести извлечение фракции, обогащенной фактором Виллебранда, исходя из той же самой партии криоосажденной фракции, что позволяет наилучшим образом сделать рентабельным использование человеческой плазмы. Полученная таким образом фракция ФВ затем очищается в результате двух дополнительный стадий методом хроматографии, что приводит к получению концентрата ФВ очень высокой чистоты.
Сложность молекулы фактора Виллебранда делает ее получение очень трудным. Способы очистки в небольшом масштабе, т.е. от 5 до 2000 мл, в целях аналитического излучения уже были описаны, однако эти способы не могли быть приспособлены для промышленного масштаба /Thorell et al, Jhromb, Res, 35, 1984, 431-450/. Кроме того, принцип максимальной рентабельности криоосажденной фракции с целью получения одновременно фактора YIII и ФВ еще не рассматривался.
Фактор Виллебранда очищался в результате дифференцированной растворимости по отношению к сульфатированным соединениям в присутствии глицерина /Berntorp et al, Vox Sang, 56, 1989. 212-217; Winkelman et al, Vox Sang, 57, 1989, 97-103/ и в результате различных методов хроматографического разделения, например, путем использования молекулярных сит /Perret et al Haemosfasis, 14, 1984, 289-295 /или путем ионного обмена /Austen et al Jhromb, Haemostasis, 48, 1982, 46-48; Harrison et al, Jhromb. Res. 50, 1988, 295-304/, однако эти способы дают довольно небольшие выходы по фактору Виллебранда или небольшую емкость геля или же не позволяют проводить одновременно извлечение фактора YIII и ФВ, что делает их менее выгодными для промышленного применения.
Austen et al /1982, указано выше/ получают концентрат небольшой чистоты /8 Ед Аг/мг белка/ и с довольно небольшим выходом, обусловленным, вероятно, очень неблагоприятными условиями их хроматографирования /pH=5,5/.
Harrison et al /1988, указано выше/ используют в качестве матрицы декстран-сульфат-сефарозу; этот материал обладает лишь небольшой удерживающей способностью по отношению к ФВ, а полученный таким образом ФВ проявляет удельную активность лишь 2-4 Ед/мг белка.
Более того, большинство этих продуктов содержат значительную долю денатурированных или инактивированных форм наряду с мультимерными активными формами, как это показывает отношение: активность кофактора ристоцетина (RCO) /антиген, которое составляет порядка от 0,08 до 0,8 /Zawrie etal, Br, J. Naemotal, 1989, 73, 100/, что делает их менее эффективными для терапевтического употребления при лечении болезни Виллебранда. Напротив, способ фирмы-заявителя позволяет получить концентрат ФВ; у которого отношение RCO/Аг превышает единицу, что сравнимо с тем же отношением для естественного ФВ в плазме.
Настоящее изобретение относится к способу получения концентрата фактора Виллебранда для терапевтического употребления, причем указанный способ позволяет получать стандартизированные партии, каждая из которых происходит из очень больших объемов плазмы /4000 литров или более/, из которых уже был извлечен концентрат фактора YIII, что наилучшим образом делает рентабельным использование криоосажденной фракции.
В частности, настоящее изобретение относится к способу получения концентрата фактора Виллебранда, который включает комбинацию трех последовательных хроматографических стадий, позволяющих проводить обогащения по мультимерам с высоким молекулярным весом, обусловливающим биологическую активность ФБ. Исходным материалом является криоосажденная фракция человеческой плазмы, подвергнутая классической очистке в результате адсорбции на гидроксиде алюминия. Этот материал затем подвергается вирусной инактивации, например, путем обработки растворителем-детергентом перед его очисткой.
Способ очистки в соответствии с настоящим изобретением включает комбинацию трех последовательных хроматографических стадий получения VIII из полупродукта, причем две первых стадии представляют собой ионообменную хроматографию, а третья является аффинной хроматографией.
Две стадии ионообменной хроматографии осуществляются на одной и той же смоле из винилового полимера с привитыми группировками ДЭАЭ /диэтиламиноэтила/, в частности, на колонках со смолой ДЭАЭ-фрактогель (M) TSK 650 /Мерк/, приведенной в равновесие с буферным раствором, содержащим 0,01 М трехнатриевого цитрата, 0,11 М хлорида натрия, 0,001 М хлорида кальция, 0,12 М глицина и 0,016 М лизина, с pH 7.
ДЭАЭ-Фрактогель(M) TSK 650 представляет собой гидрофильный синтетический гель. Носителем является сополимер олигоэтиленгликоля, глицидинметакрилата и пентаэритритол-диметакрилата, к которому прививаются группировки диэтиламиноэтила, такие как -O-CH2-CH2N+ /C2H5/2HCl, что образует слабощелочной анионообменник. В распоряжении имеется ДЭАЭ-Фрактогель TSK 650 с частицами двух размеров /после регидратации/: типа S /0,025 0,050 мм/ и типа M /0,045 0,090 мм/; оба этих типа могут использоваться для настоящего изобретения.
Криоосажденная фракция плазмы, очищенная и подвергнутая обработке для вирусной инактивации, пропускается через первую хроматографическую колонку, колонка удерживает значительную часть фактора Виллебранда. Последний затем элюируется путем увеличения концентрации хлорида натрия в буферном растворе до 0,14 0,15 М.
Элюированная таким образом фракция, обогащенная фактором Виллебранда, пропускается через вторую хроматографическую колонку при тех же самых условиях, что и для первой колонки. Поскольку фракция, введенная в эту вторую колонку, уже освобождена от большинства белков /особенно от фактора VIII и фибронектина/, которые конкурировали за адсорбционные центры, то адсорбционная способность ФВ на второй колонке является значительно более высокой. После удаления фильтрата и промывания колонки буферным раствором для установления равновесия адсорбированный ФВ элюируется в результате увеличения концентрации хлорида натрия в буферном растворе до значений 0,15 0,17 М.
Благодаря высокой адсорбционной способности и эффективности смолы ДЭАЭ-Фрактогель по отношению к ФВ, последний извлекается с высокой удельной активностью (>150 Ед RCo/мл), что позволяет обходиться без дополнительной стадии концентрирования путем ультрафильтрации.
Элюированная таким образом фракция подвергается аффинной хроматографии на колонке с желатин-сефарозой в том же самом буферном растворе для установления равновесия, что позволяет избежать стадии диализа или ультрафильтрации с целью изменения солевой концентрации; эта колонка удерживает молекулы остаточного фибронектина, который еще загрязняет ФВ. Выбор геля, ассоциированного с желатиной, не является критическим: можно также использовать системы желатин-Ультрогель(M), желатин-Сферодекс(M) или желатин-Фрактогель(M). Используют предпочтительно желатин-сефарозу(M), которая связывает до 5 10 мг фибронектина/мл в условиях, применяемых по способу в соответствии с изобретением.
Фактор Виллебранда, очищаемый в этих условиях, не связывается с гелем и переходит в фильтрат; поскольку хроматографическая стадия в присутствии желатины не приводит к значительному разбавлению ФВ, то не является необходимым концентрировать его /например, путем ультрафильтрации/ и он может непосредственно доводиться до кондиции и лиофилизироваться. Отсутствие протеолитического энзима в конечном продукте обеспечивает его стабильность в ходе стерилизующей фильтрации и лиофилизации, что позволяет избегать прибавления стабилизирующих агентов.
Концентрат фактора Виллебранда, полученный по способу в соответствии с настоящим изобретением, имеет степень очистки, исключительно превышающую более чем в 10000 раз уровень относительно исходной плазмы, а его удельная активность составляет 345 Ед СВА/мг белков/ единиц измерения активности связывания коллагена/ и более 10 Ед RCO /мг белков/ единиц активности кофактора ристоцетина/. Роль каждой хроматографической стадии в очистке ФВ иллюстрируется фиг.1.
Улучшение качества продукта в ходе последовательных стадий очистки наблюдалось, в частности, в зависимости от доли молекул в состоянии мультимеров с высоким молекулярным весом /т.е. молекулярных форм с высокой биологической активностью/ методом электрофоретического анализа.
Этот анализ показывает прогрессивное обогащение по мультимерам >4 /Фиг. 2/, которые составляют 79% ФВ в конечном препарате по сравнению с 70% в естественной плазме, тогда как в результате криоосаждения половина их теряется. Неожиданно оказалось, что именно хроматография на ДЭАЭ-фрактогеле(M) благоприятствует этому селективному удерживанию мультимеров очень большого размера и удаляет в фильтрат формы небольшого размера с аномальной структурой /подвергнувшиеся частичному протеолизу/ и с небольшой активностью.
Стандартизированный концентрат ФВ большой чистоты с высокой удельной активностью и с высоким содержанием мультимеров с большим молекулярным весом, полученный по способу в соответствии с настоящим изобретением, особенно хорошо, следовательно, приспособлен для терапевтического употребления при лечении различных форм болезни Виллебранда, что подтверждается предварительными клиническими испытаниями. Последние показывают, в частности, что концентрат ФВ эффективно сокращает период свертывания крови в ходе кровотечений.
Испытания in vitro подтвердили идентичность его биохимических и физиологических свойств с теми же свойствами природной молекулы, в частности, его способность связывать кровяные пластинки /тромбоциты/ в устройстве для переливания /перфузии/ и его способность соединения с эндогенным фактором VIII.
Высокая чистота концентратора фактора Виллебранда, полученного по способу в соответствии с настоящим изобретением, позволяет также рассматривать его применение для различных лабораторных потребностей /для тонкого анализа структуры, для излучения функциональности, для диагностики и т.д./ и для получения специальных антител.
Концентрат по настоящему изобретению может также использоваться в качестве стабилизатора в ходе получения фактора VIII при помощи клеток, трансформированных методом генной инженерии и в ходе стадий очистки Фактора VIII, полученного таким образом.
Следующий пример иллюстрирует осуществления настоящего изобретения, не ограничивая вместе с тем его сферу действия.
Пример. Исходный материал.
Криосажденную фракцию получают, исходя из свежесобранной плазмы в присутствии цитрата натрия /4%/ или антикоагулирующего раствора ЦФД /цитрат, фосфат, декстроза/, которую замораживают не позднее, чем через 6 часов после ее отбора. Плазма замораживается при температуре -60oC, затем хранится при температуре -35oC. Партии плазмы содержат от 1800 до 2000 литров и объединяются в партии по 4000 литров для каждого осуществления способа. С целью размораживания плазму помещают в камеру при температуре -7oC а течение, по меньшей мере, 12 часов для того, чтобы обеспечить медленное и регулярное подогревание, затем ее оттаивают в камере, термостатируемой при температуре 0-2oC с постоянным перемешиванием. Криоосажденную фракцию (которая составляет примерно 9 г/л плазмы) извлекают путем центрифугирования на холоде.
После центрифугирования извлеченную криоосажденную фракцию снова переводят в раствор и адсорбируют на гидроксиде алюминия с целью удаления основных загрязнений, т.е. компонентов протромбинового комплекса /в частности, фактора VII/, Фактора XII. Всплывшую фазу затем охлаждают до температуры 15oC /что частично удаляет фиброноген и фибронектин/.
Эта обработка позволяет извлекать от 80 до 86% смеси Фактор VIII Фактор Виллебранда из криоосажденной фракции. Удельная активность Фактора VIII составляет 0,7 Ед 1/мг, а удельная активность ФВ составляет 0,6 Ед RCo/мг /активность кофактора ристоцетина/ и 1,2 Ед CBA/мг /активность связывания коллагена/.
Обработка для вирусной инактивации.
Раствор, содержащий смесь Фактор VIII Фактор Виллебранда, подвергают обработке под действием растворителя-детергента, известного своей эффективностью против вирусов с липидной оболочкой /Horowitz et al. Transfusion 1985. 25, 516 522/, которая включает также инкубацию в течение 8 часов при температуре 25oC в присутствии 0,3% три-н-бутилфосфата /ТнБФ/ и 1% Твина 80.
После этой обработки обнаруживают 95% активности факторов VIII и Виллебранда, измеренной на предыдущей стадии. Электрофорез позволяет контролировать то, что ФВ все время находится в мультимерной форме.
Способ хроматографического разделения.
Очистка фактора Виллебранда является способом, производным от способа очистки Фракции VIII, описанного заявителем в заявке на европейский патент 0359593.
Первая хроматографическая стадия осуществляется на колонке с ДЭАЭ-Фрактогелем(M) TSK650 /Мерк/. Буферный раствор для установления равновесия содержит трехнатриевый цитрат /0,01 М/, хлорид кальция/0,001 М/, хлорид кальция /0,11 М/, глицин /0,12 М/ и L-лизин /0,016 М/. Фактор Виллебранда, Фактор VIII и фибронектин удерживаются колонкой; загрязняющие белки /в основном фибриноген и IgG/ связываются слабо или не связываются колонкой, а остатки от обработки для вирусной инактивации удаляются в результате многократных последовательных промываний тем же самым буферным раствором.
Линейная скорость потока в колонке составляет величину 100 см/час.
В этих условиях осуществления используемая колонка имеет удерживающую способность по отношению к ФВ приблизительно 75% /определяемому в форме антигена, Аг/, а остаток уходит с фильтратом. Эта удерживающая способность соответствует 45 Ед Аг-ФВ/ мл геля.
Фактор Виллебранда десорбируют из колонки в результате увеличения концентрации NaCl в буферном растворе до значения 0,15 М. Собранная фракция ФВ содержит от 30 до 35 первоначального ФВ, однако 40% последнего остаются соадсорбированными с Фактором VIII и будет соэлюироваться вместе с последним в результате второго увеличения концентрации буферного раствора до значения 0,25 М и будет соочищаться вместе с последним.
Фракцию, содержащую элюированный из первой колонки ФВ, вводят во вторую колонку, идентичную первой, при тех же самых условиях после небольшого разбавления буферным раствором для установления равновесия с целью довести ионную силу фракции ФВ до значения, эквивалентного 0,11 М для хлорида натрия.
Поскольку введенная фракция уже освобождена от загрязнений и от Фактора VIII, которые конкурировали за возможность связывания на адсорбционных центрах первой колонки, то для второй колонки наблюдают значительно более высокую удерживающую способность величиной 320 Ед Аг-ФВ/мл геля.
ФВ десорбируют в результате увеличения концентрации NaCl в буферном растворе до 0,17 М.
Эта вторая хроматографическая стадия позволяет получить коэффициент концентрирования, в 8-10 раз превышающий уровень предыдущей стадии, что дает возможность обходиться без дополнительных стадий концентрирования путем ультрафильтрации, например. В обычных разнообразных измерительных системах элюат содержит следующие концентрации или активности ФВ:
антиген /Аг/ 88±9 Ед/мл;
кофактор ристоцетина 97±19 Ед/мл;
способность связывания с коллагеном /СВА/ 149±13 Ед/мл;
мультимеры /Z4/ с высоким молекулярным весом 79%
Отношение СВА/Аг величиной 1,69 показывает, что активность ФВ хорошо сохраняется. Это находится в соответствии с высоким процентным содержанием /79%/ мультимеров с высоким молекулярным весом.
Электрофоретический анализ этого элюата с ФВ показывает присутствие небольшого загрязнения фибронектином и интер-альфа-трипсиновым ингибитором /ИТИ/.
Этот второй элюат с ФВ подвергают третьей стадии очистки на колонке с желатин-Сефарозой CL4B /Фармация/, приведенной в равновесие с элюирующим буферным раствором, применяемым для второй колонки, с целью удаления фибронектина.
Этот гель для аффинной хроматографии имеет удерживающую способность по отношению к фибронектину, превышающую 5 мг/мл, что позволяет уменьшить уровень этого загрязнения до недетектируемых количеств (<4мг/л) для фракции ФВ.
Очищенный ФВ находится в фильтрате этой последней стадии и может непосредственно доводиться до кондиции и лиофилизироваться:
Электрофоретический анализ больше не детектирует никакого загрязнения;
Содержание ФВ составляет 250 Ед Аг/мг белка.
Его удельная активность составляет 345 Ед СВА/мг белка и 186 220 Ед РСо/мг белка.
Общая степень очистки более чем в 10 000 раз превышает уровень относительно первоначальной плазмы.
Полученный по окончании очистки ФВ состоит из 65-80% мультимеров с высоким молекулярным весом, т. е. имеет состав, сравнимый с составом исходной плазмы, который равен 70% как это показывает электрофоретический анализ на агарозе-SDS.
Стабильность концентрата была изучена в жидком состоянии при обычной температуре в течение 24 часов: не обнаружено никаких следов протеолиза и никакого изменения удельной активности.
Полное отсутствие тромбогенной активности концентрата контролировалось при помощи классических тестов NAPTT/"non activated partial tromboplastin time"/. Полное отсутствие тромбина, РКА и каллекреина было установлено.
Полученный конечный концентрат не требует никакого прибавления стабилизатора.
Фиг. 1: SDS-PAGE фракции ФВ в ходе очистки: полоса 1 криоосажденная фракция; полоса 2 криоосажденная фракция, обработанная растворителем-детергентом; полоса 3 фракция, не связываемая с ДЭАЭ-фрактогелем; полоса 4 1-й элюат ФВ; полоса 5-2-й элюат ФВ; полоса 6 - фракция, не связанная с гелем на желатине; полоса 7 стандарты.
Fвп фибронектин
IgG иммуноглобулины
Alb альбумин
Фиг.2: Распределение мультимеров ФВ во фракциях в ходе очистки после электрофореза на агарозе SDS: полоса 1 естественная плазма; полоса 2 - криоосажденная фракция; полоса 3 криоосажденная фракция, обработанная растворителем-детергентом; полоса 4 фракция, не связываемая с ДЭАЭ-Фрактогелем; полоса 5 1-й элюат ФВ; полоса 6 2-й элюат ФВ; полоса 7 - фракция, не связываемая с гелем на желатине.

Claims (3)

1. Способ получения стандартизированного концентрата человеческого фактора Виллебранда из криоосажденной фракции плазмы, предварительно очищенной на гидроксиде алюминия, включающий две последовательные стадии ионообменной хроматографии на смоле типа макропористого винилового полимера, имеющего группировки диэтиламиноэтила, отличающийся тем, что дополнительно проводят стадию очистки с помощью аффинной хроматографии на колонке с желатин-сефарозой, причем колонка приведена в равновесие буферным раствором, используемым в качестве элюирующего на предыдущей стадии.
2. Способ по п.2, отличающийся тем, что фильтрат после колонки с желатин-сефарозой, содержащей фактор Виллебранда, собирают, разливают по флаконам индивидуальных дозировок и затем лиофилизируют.
3. Концентрат фактора Виллебранда, полученный способом по пп.1 и 2, со специфической активностью, соответствующей 345 Eg СВА/мг белка и 186 220 EgR Со/мг белка, характеризующийся отношением активности, измеренной в единицах СВА, к количеству антигена, равным по меньшей мере 1,5 и состоящий более чем на 65 80% из мультимерных форм с высокой молекулярной массой.
SU925011041A 1991-03-08 1992-03-06 Способ получения стандартизированного концентрата человеческого фактора виллебранда и концентрат, полученный этим способом RU2088590C1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9102804 1991-03-08
FR9102804A FR2673632A1 (fr) 1991-03-08 1991-03-08 Procede de preparation de concentre de facteur von willebrand humain de tres haute purete, approprie a un usage therapeutique.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2088590C1 true RU2088590C1 (ru) 1997-08-27

Family

ID=9410505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU925011041A RU2088590C1 (ru) 1991-03-08 1992-03-06 Способ получения стандартизированного концентрата человеческого фактора виллебранда и концентрат, полученный этим способом

Country Status (29)

Country Link
US (1) US5408039A (ru)
EP (1) EP0503991B1 (ru)
JP (1) JP3435668B2 (ru)
AT (1) AT407115B (ru)
AU (1) AU645172B2 (ru)
BE (1) BE1004178A3 (ru)
BR (1) BR9200770A (ru)
CA (1) CA2062340C (ru)
CZ (1) CZ283633B6 (ru)
DE (2) DE69227055T2 (ru)
DK (1) DK0503991T3 (ru)
EE (1) EE03057B1 (ru)
EG (1) EG20300A (ru)
ES (1) ES2121830T3 (ru)
FI (1) FI106721B (ru)
FR (1) FR2673632A1 (ru)
HU (1) HU215098B (ru)
IL (1) IL101043A (ru)
IT (1) IT1256692B (ru)
LT (1) LT3175B (ru)
NL (1) NL300394I1 (ru)
NO (1) NO301278B1 (ru)
NZ (1) NZ241701A (ru)
PL (1) PL168353B1 (ru)
RU (1) RU2088590C1 (ru)
SA (1) SA92120446B1 (ru)
SK (1) SK279533B6 (ru)
UA (1) UA27732C2 (ru)
ZA (1) ZA921430B (ru)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4435392B4 (de) * 1994-10-04 2008-02-07 Immuno Ag Verfahren zur Trennung von vWF in hochmolekularen vWF und niedermolekularen vWF
DE4435485C1 (de) * 1994-10-04 1996-03-21 Immuno Ag Verfahren zur Gewinnung von hochreinem von Willebrand-Faktor
DE4437544A1 (de) * 1994-10-20 1996-04-25 Behringwerke Ag Einsatz von vWF-enthaltenden Konzentraten als Kombinationstherapie bei Therapie mit Antithrombotika und Fibrinolytika
US5659017A (en) * 1995-11-07 1997-08-19 Alpha Therapeutic Corporation Anion exchange process for the purification of Factor VIII
DE19616540A1 (de) * 1995-11-10 1997-05-15 Immuno Ag Verwendung von von Willebrand-Faktor und pharmazeutische Zubereitung
US6005077A (en) * 1995-11-10 1999-12-21 Immuno Aktiengesellschaft Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation
AT403764B (de) 1996-03-15 1998-05-25 Immuno Ag Stabiler faktor viii/vwf-komplex
US6068838A (en) * 1996-04-29 2000-05-30 Baxter Aktiengesellschaft Purified multimerase
AT404358B (de) * 1997-02-04 1998-11-25 Immuno Ag Verfahren zur chromatographischen reinigung bzw. fraktionierung von von willebrand-faktor aus einem vwf-hältigen ausgangsmaterial
AT405403B (de) 1997-02-27 1999-08-25 Immuno Ag Reinigung von von willebrand-faktor durch kationenaustauscherchromatographie
AT405485B (de) * 1997-05-28 1999-08-25 Immuno Ag Eine das vwf-propeptid enthaltende pharmazeutische präparation
JP5149470B2 (ja) 1999-02-22 2013-02-20 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 新規のアルブミンを含有していない第ｖｉｉｉ因子処方物
EP1148063A1 (de) * 2000-04-18 2001-10-24 Octapharma AG Haemostatisch aktives vWF enthaltendes Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung
EP1593388A1 (en) * 2004-05-05 2005-11-09 ZLB Behring GmbH Therapeutic plasma protein-concentrates containing von willebrand factor as high molecular weight multimers
FR2874216B1 (fr) 2004-08-16 2006-11-03 Lab Francais Du Fractionnement Procede de preparation d'un concentre de facteur von willebrand (fvw) par voie chromatographique et concentre de fvw susceptible d'etre ainsi obtenu
DE102004044419B4 (de) 2004-09-14 2010-04-15 Biotest Ag Verfahren zur Aufreinigung eines von Willebrand Faktors mittels Hydroxylapatit-Durchlaufchromatographie
DE102004044429B4 (de) * 2004-09-14 2009-04-30 Biotest Ag Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung enthaltend von Willebrand Faktor
ITLU20070007A1 (it) * 2007-05-07 2008-11-08 Kedrion Spa Processo cromatografico per l'ottenimento di un complesso fviii/vwf con differenti rapporti tra le due proteine da utilizzare nella terapia della emofilia a e nella malattia di von willebrand.
AU2008261261B2 (en) 2007-06-13 2013-06-27 Csl Behring Gmbh Use of VWF stabilized FVIII preparations and of VWF preparations without FVIII for extravascular administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders
FR2920429B1 (fr) * 2007-08-30 2012-10-05 Lfb Biotechnologies Procede de purification du facteur viii et du facteur von willebrand
EP2073015A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 CSL Behring GmbH Diagnostic in vitro method for assessing Von Willebrand Disease and bleeding risk associated with Von Willebrand Disease and acquired or congenital disorders of platelet function
US20100273206A1 (en) * 2007-12-21 2010-10-28 Manfred Rauh Diagnostic in vitro method for assessing von willebrand disease and increased bleeding risk associated with von willebrand disease and acquired or congenital disorders of platelet function
KR101507718B1 (ko) 2008-06-24 2015-04-10 체에스엘 베링 게엠베하 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ｖｉｉｉ, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체
NZ593190A (en) 2008-11-07 2013-01-25 Baxter Int Factor viii formulations
IT1396528B1 (it) 2009-01-19 2012-12-14 Kedrion Spa Nuovo processo di purificazione altamente selettivo di due proteine plasmatiche: von willebrand factor (vwf) e fibronectina (fn).
AU2010284977A1 (en) 2009-08-20 2012-03-29 Csl Behring Gmbh Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders
AU2011343813B2 (en) 2010-12-15 2015-05-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited Eluate collection using conductivity gradient
EP2768521B1 (en) 2011-10-18 2016-07-13 CSL Behring GmbH Combined use of a sulfated glycosaminoglycan and a hyaluronidase for improving the bioavailability of factor viii
KR20140083036A (ko) 2011-10-18 2014-07-03 체에스엘 베링 게엠베하 인자 ｖｉｉｉ의 생체이용률을 향상시키기 위한 황산화 글리코사미노글리칸의 용도
PL2814502T3 (pl) 2012-02-15 2018-02-28 Csl Behring Gmbh Warianty czynnika von Willebranda mające ulepszone powinowactwo do wiązania czynnika VIII
EP2796145B1 (en) 2013-04-22 2017-11-01 CSL Ltd. A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge
WO2015066769A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Csl Ltd. New method to concentrate von willebrand factor or complexes thereof
BR112016030950A2 (pt) 2014-07-02 2018-03-27 Csl Ltd polipeptídeo modificado que se liga ao fator viii, complexo, composição farmacêutica, métodos para tratar uma coagulopatia, para produzir um polipeptídeo que compreende um vwf modificado e para aumentar a afinidade de ligação ao fator viii do vwf e a meia-vida do fator viii, uso de um polipeptídeo modificado ou de um complexo, polinucleotídeo, plasmídeo ou vetor, e, célula hospedeira.
US10626164B2 (en) 2014-07-25 2020-04-21 Csl Limited Purification of VWF
FR3034669B1 (fr) 2015-04-07 2020-02-14 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Nouvelle utilisation du facteur von willebrand
CN108473530B (zh) * 2015-10-15 2022-12-23 普莱泽玛科技有限公司 从血浆中提取蛋白质的方法
RU2018128582A (ru) 2016-01-07 2020-02-11 Цсл Беринг Ленгнау Аг Мутированный укороченный фактор фон виллебранда
CN108779165B (zh) 2016-01-07 2022-12-02 康诺贝林伦瑙有限公司 突变的冯·维勒布兰德因子
CN105622746A (zh) * 2016-02-04 2016-06-01 江西博雅生物制药股份有限公司 一种从冷沉淀提取凝血因子ⅷ的废料中提取人血管性血友病因子的制备工艺
CN105541997A (zh) * 2016-02-04 2016-05-04 江西博雅生物制药股份有限公司 一种高纯度和高活性血管性血友病因子的制备工艺
CN105622747A (zh) * 2016-02-04 2016-06-01 江西博雅生物制药股份有限公司 一种vWF活性保护液
EP3488858A1 (en) 2017-11-27 2019-05-29 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies A von willebrand factor composition for use in treating a pathology mediated by angiogenesis
CN114249812B (zh) * 2020-09-22 2023-09-15 四川远大蜀阳药业有限责任公司 一种降低vWF制品中IgM含量的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61166542A (ja) * 1985-01-18 1986-07-28 Hitachi Chem Co Ltd 感光性組成物
US4970300A (en) * 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
US5006642A (en) * 1987-06-29 1991-04-09 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Purification of von Willebrand Factor by affinity chromatography
FR2632309B1 (fr) * 1988-06-07 1990-08-24 Lille Transfusion Sanguine Procede de purification par voie chromatographique de proteines, notamment de facteur viii, et les produits obtenus

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Austen et al., Thromb. Haemostas, v.48, 1982, p. 46-48. *

Also Published As

Publication number Publication date
BR9200770A (pt) 1992-11-17
UA27732C2 (ru) 2000-10-16
JPH0597696A (ja) 1993-04-20
EG20300A (fr) 1998-10-31
IT1256692B (it) 1995-12-12
CA2062340C (fr) 2000-05-09
JP3435668B2 (ja) 2003-08-11
SK279533B6 (sk) 1998-12-02
NO301278B1 (no) 1997-10-06
FI920992A (fi) 1992-09-09
FI106721B (fi) 2001-03-30
BE1004178A3 (fr) 1992-10-06
EP0503991A1 (fr) 1992-09-16
PL168353B1 (pl) 1996-02-29
CA2062340A1 (fr) 1992-09-09
HU215098B (hu) 1998-09-28
AT407115B (de) 2000-12-27
EE03057B1 (et) 1997-12-15
PL293738A1 (en) 1992-09-21
DE122009000034I1 (de) 2010-04-08
IL101043A (en) 1997-02-18
FR2673632A1 (fr) 1992-09-11
NO920867D0 (no) 1992-03-05
DK0503991T3 (da) 1999-06-14
LTIP266A (en) 1994-07-15
NZ241701A (en) 1994-10-26
DE122009000034I2 (de) 2011-06-16
ES2121830T3 (es) 1998-12-16
CS56892A3 (en) 1992-09-16
AU645172B2 (en) 1994-01-06
SA92120446B1 (ar) 2004-05-04
DE69227055D1 (de) 1998-10-29
NL300394I1 (nl) 2009-09-01
US5408039A (en) 1995-04-18
ITTO920189A0 (it) 1992-03-06
IL101043A0 (en) 1992-11-15
NO920867L (no) 1992-09-09
LT3175B (en) 1995-02-27
ATA43692A (de) 2000-05-15
HUT63176A (en) 1993-07-28
EP0503991B1 (fr) 1998-09-23
CZ283633B6 (cs) 1998-05-13
FI920992A0 (fi) 1992-03-06
AU1113192A (en) 1992-09-10
ITTO920189A1 (it) 1993-09-06
DE69227055T2 (de) 1999-04-22
HU9200767D0 (en) 1992-05-28
FR2673632B1 (ru) 1995-05-05
ZA921430B (en) 1992-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2088590C1 (ru) Способ получения стандартизированного концентрата человеческого фактора виллебранда и концентрат, полученный этим способом
DK175322B1 (da) Fremgangsmåde til separation af Faktor VIII, fibrinogen, fibronectin og von Willebrands faktor af humane eller animalske plasma og Faktor VIII opnået ved fremgangsmåden
JP5662988B2 (ja) 可溶化血漿フラクションから蛋白質フィブリノーゲン、第ｘｉｉｉ因子および生物学的グルーを分離し、そして該蛋白質の凍結乾燥濃縮物を調製するための方法
US5872099A (en) High molecular and low molecular fractions of von Willebrand Factor
AU2003244850B2 (en) Processes for the preparation of fibrinogen
JP2015042687A (ja) 第ｖｉｉｉ因子およびフォンビルブラント因子の精製方法
JP4250771B2 (ja) カチオン交換クロマトグラフィーによる因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の精製方法
DK162233B (da) Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii
NO324659B1 (no) Utvinning av von Willebrand-faktor ved kationebytterkromatografi samt preparat inneholdende slik faktor og anvendelse derav.
US7888476B2 (en) Process for the preparation of a von Willebrand (FvW) factor concentrate by chromatography and a FvW concentrate thus obtainable
RU2097047C1 (ru) Препарат человеческого фактора xi свертывания крови и способ его получения
CN103328000A (zh) 用于从含有凝血因子的溶液中减少和/或除去FXI和FXIa的方法
MXPA02010017A (es) Preparacion activa hemostaticamente, que contiene el factor de von willebrand y metodo para la produccion de la misma.
US20220056107A1 (en) Method for Filtering Fibrinogen
de Lille Burnouf-Radosevich et a1.
LV10193B (en) Highly clean and therapeutically usable standardized method for producing Willebrand factor concentrate for industrial production
JPH1053534A (ja) α２プラスミンインヒビターの製造方法