SK279533B6

SK279533B6 - Spôsob prípravy štandardizovaného vysoko čistého k

Info

Publication number: SK279533B6
Application number: SK568-92A
Authority: SK
Inventors: Miryana Burnouf-Radosevich; Thierry Burnouf
Original assignee: Centre Regional De Transfusion Sanguine De Lille
Priority date: 1991-03-08
Filing date: 1992-02-26
Publication date: 1998-12-02
Also published as: AU645172B2; EE03057B1; CA2062340C; HU215098B; AT407115B; CS56892A3; ATA43692A; JP3435668B2; DE122009000034I2; HU9200767D0; BR9200770A; EP0503991A1; NO920867L; EG20300A; NZ241701A; HUT63176A; ES2121830T3; FR2673632A1; US5408039A; DE122009000034I1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu prípravy štandardizovaného vysoko čistého koncentrátu ľudského von Willebrandovho faktora s vysokým podielom vysokomolekulárnych multimérov a takto získaného koncentrátu, ktorý je vhodný najmä na terapeutické účely.

Doterajší stav techniky

Von Willebrandov faktor (vWF) je najväčšia známa molekula, ktorá je v obehu v plazme. Existuje ako rad veľkých multimérov, spojených disulfidickými mostíkmi, ktorých základná jednotka má molekulovú hmotnosť asi 260 kDa (kilodalton). Najmenšou formou vWF v plazme je dimér s asi 440 až 500 kDa a najväčšiu formu predstavujú multiméry tohto diméru s molekulovými hmotnosťami, dosahujúcimi až 20 miliónov daltonov. Zoskupenie navzájom spojených jednotiek môže byť špecifické pre bunky, v ktorých je obsiahnuté, pričom vWF je syntetizovaný a polymcrizovaný v megakaryocytoch a endoteliálnych bunkách.

Tento faktor hrá podstatnú úlohu pri hemostáze prostredníctvom dvoch rôznych funkcií: transportuje a stabilizuje faktor VIII v krvnom riečisku a ako adhézny proteín umožňuje rozptýlenie, prilipnutie a zhlukovanie krvných doštičiek na vaskulárnom subendotéliu, a tak prispieva k rýchlemu hojeniu poškodených ciev.

Vrodený nedostatok vWF alebo štruktúrne anomálie tohto faktora vyvoláva von Willebrandovu chorobu, ktorá má spočiatku formu hemoragie, najmä kože a slizníc. Klinické formy tejto choroby sú veľmi rôznorodé a pôsobia ťažké problémy v prípadoch chirurgického zákroku. Liečba von Willebrandovej choroby je nevyhnutná na nápravu anomálií primárnej hemostázy (čas krvácania) a zrážavosti (aktívny cefalínový čas a zrážacia aktivita faktora VIII).

Choroba sa lieči substitučnou terapiou ľudskej plazmy obohatenej vWF (napríklad kryoprecipitovanou frakciou plazmy alebo koncentrátmi faktora VIII, obsahujúcimi dostatočné množstvo vWF). Tieto produkty však nie sú štandardizované na liečbu von Willebrandovej choroby. Okrem toho málo čistené frakcie krvnej plazmy, najmä kryoprecipitát, nie sú bez rizika vírusovej kontaminácie, pretože často nie sú podrobované účinnej vírusovej inaktivácii. Navyše vyvolávajú prebytok kontaminujúcich proteínov, ktoré pacient nepotrebuje a ktoré môžu po opakovaných injekciách spôsobovať imunologické reakcie.

Čistený faktor VIII je možné naproti tomu podrobiť účinnej vírusovej inaktivácii, ale proces jeho čistenia bol optimalizovaný na liečbu hemofílie A a nie na nedostatok vWF. Nedávno vyvinuté a stále účinnejšie procesy, ako je imunoafinitné alebo ionexové čistenie, používané na prípravu faktora VIII, v skutočnosti produkujú koncentráty, ktoré už neobsahujú vWF v množstve, dostatočnom na účinnú liečbu von Willebrandovej choroby. Na uspokojenie tejto potreby účinnej liečby von Willebrandovej choroby vyvinul prihlasovateľ nový priemyselný postup čistenia vWF, umožňujúci optimalizovať izoláciu rôznych plazmatických molekúl. Umožňuje najmä jednostupňovú prípravu koncentrátu faktora VIII (postupom podľa EP-A-D 359 593) a získavanie frakcie vWF z rovnakej šarže kryoprecipitátu, teda optimálne využitie ľudskej plazmy. Takto získaná frakcia vWF sa čistí ďal šími dvoma chromatografickými stupňami, poskytujúcimi koncentrát vWF s veľmi vysokou čistotou.

Čistenie vWF je v dôsledku zložitosti jeho molekuly ťažké. Boli už opísané metódy v malom meradle, tzn. 5 až 2000 ml na účely analytických štúdií (Thorell et al., Thromb. Res., 1984, 35: 431 -450), ale nebolo možné tieto metódy prípravy vWF adoptovať na priemyselné meradlo. Okrem toho sa nepredpokladalo čo najlepšie využitie kiyoprecipitátu výrobou vWF popri FVIII.

Von Willebrandov faktor bol čistený diferentnou rozpustnosťou na sulfátovaných zlúčeninách v prítomnosti glycínu (Bemtorp et al., Vox Sang. 1989, 56: 212) sulfátovaných zlúčeninách (Winkelman et al., Vox Sang. 1989, 57: 97) a pri použití rôznych metód chromatografického delenia, ako je použitie molekulárnych sít (Perret et al., Haemostasis 1984, 14: 289) a výmena iónov (Austen et al., Thromb. Haemostas. 1982, 48: 295). Tieto metódy však buď poskytujú nízky výťažok vWF, alebo majú nízku kapacitu gélu, alebo neumožňujú súčasnú izoláciu FVIII a vWF, a sú teda menej zaujímavé na priemyselnú aplikáciu.

Bemtorp et al. (Vox Sang. 1989, 56: 212) okrem toho získavajú vWF s nízkou čistotou 45 U Ag/mg (str. 213), zatiaľ čo prihlasovateľ dosahuje 205 U Ag/mg proteínu. Podobne Winkelman et al. (Vox Sang. 1989, 57: 97) získava 10 U Ag/mg proteínu (str. 101).

Perret et al. (Haemostasis 1984, 14: 289) uskutočnili stupeň deflbrinácie (na odstránenie fibrinogénu vo forme molekúl fibrínu) s použitím vápnika a rovnako enzýmov z hadieho jedu; táto príprava je teda zjavne nevhodná na terapeutické účely. Okrem toho zariadenie na gélovú filtráciu, ktoré použili, je ťažko použiteľné v priemyselnom meradle, pretože umožňuje iba prietok 10 cm/h alebo menej a je veľmi náchylné na upchávanie, najmä v prítomnosti fibrinogénu a fibronektínu. Faktor čistenia v tomto chromatografickom systému je rovnako obyčajne nízky vplyvom nízkeho rozlíšenia proteínov.

Austen et al. (Thromb. Haemostas. 1982, 48: 46) tiež získavajú koncentrát s nízkou čistotou (8 U Ag/mg proteínu) a relatívne nízkym výťažkom pravdepodobne v dôsledku použitých drastických podmienok chromatografle (pH 5,5).

Harrison et al. (Thromb. Res. 1988, 50: 295) používajú ako chromatografickú matricu dextránsulfát-sepharosu; tento materiál má nízku retenčnú kapacitu pre vWF. V dôsledku toho získavajú preparát vWF s nízkou špecifickou aktivitou: 2 až 4 U Ag/mg proteínu (str. 301).

Väčšina týchto produktov konečne obsahuje pomerne veľký podiel denaturovaných alebo inaktívnych foriem vWF, čo dokazuje kofaktorová aktivita ristocetínu (RCo)/antigén rádovo 0,08 až 0,8 (Lawrie et al. Br. J. Haematol. 1989, 73: 100). Z tohto dôvodu sú menej účinné pri terapeutickom použití pri von Willebrandovej chorobe. Naproti tomu postup prihlasovateľa umožňuje získavať vWF s pomerom RCo/antigén vyšším ako jeden, porovnateľným s natívnym vWF z normálnej plazmy.

Podstata vynálezu

Konkrétne je predmetom vynálezu spôsob prípravy štandardizovaného vysoko čistého koncentrátu ľudského von Willebrandovho faktora s vysokým podielom vysokomolekulárnych multimérov z kryoprecipitovanej frakcie plazmy predčistenej na hydroxide hlinitom, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa tri po sebe nasledujúce

SK 279533 Β6 chromatografické stupne, z ktorých prvé dva predstavujú iónovo výmennú chromatografiu na vinylickej polymérnej živici s veľkými pórmi, teda pórmi s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 10⁶ daltonov s nadväznými dietylaminoetylskupinami a tretí spočíva v afinitnej chromatografii na géli želatína-sepharosa.

Ďalším predmetom vynálezu je koncentrát von Willebrandovho faktora pripravený opísaným spôsobom, ktorého podstata spočíva v tom, že má vysokú špecifickú aktivitu nad 300 U CBA/mg proteínu alebo 180 U RCo/mg proteínu, jeho pomer aktivity k antigénu je aspoň 1,5 a jeho obsah vysokomolekulárnych multimérov je aspoň 65 %.

Spôsob podľa vynálezu umožňuje získať vWF ako vedľajší produkt pri výrobe vysoko čistého FVIII z veľkých objemov plazmy, a tak optimalizovať využitie kryoprecipitátu. Vysokomolekulárne multiméry, ktorými sa koncentrát podľa vynálezu obohacuje, súvisia s biologickou aktivitou vWF. Východiskovým materiálom je kryoprecipitovaná frakcia ľudskej plazmy, podrobená klasickému predbežnému čisteniu adsorpciou na hydroxid hlinitý. Tento materiál sa potom podrobí vírusovej inaktivácii, napríklad pôsobením rozpúšťadla-detergentu, a potom sa čistí.

Postup čistenia podľa vynálezu zahŕňa kombináciu troch po sebe nasledujúcich stupňov chromatografie vedľajšieho produktu z výroby FVIII, z ktorých prvé dva spočívajú v ionexovej a tretí v afinitnej chromatografii.

Obidve ionexové chromatografie sa uskutočňujú na rovnakej živici z vynilického polyméru, na ktorom sú naviazané dietylaminoetylové (DEAE) skupiny, konkrétne na kolónach DEAE-Fractogelu TSK 650 (Merck), ekvilibrovaných tlmivým roztokom, obsahujúcim 0,0IM citrát sodný, 0,1 IM chlorid sodný, 0,001M chlorid vápenatý, 0,12M glycín a 0,016M lyzín s pH 7.

DEAE-Fractogel TSK 650 je syntetický hydrofilný gél. Nosičom je kopolymér oligoetylénglykolu, glycidínmetakrylátu a pentaerytritol-dimetakrylátu, na ktorý sú naviazané dietylaminoetylové skupiny, tzn. -O-CH₂-CH₂N⁺(C₂H₅)2HC1, vďaka ktorým tvorí slabo alkalický menič aniónov. DEAE-Fractogel TSK 650 je dostupný v dvoch veľkostiach častíc (po zvlhčení vodou): typ S (0,025 až 0,050 mm) a typ M (0,045 až 0,090 mm). Na uskutočňovanie vynálezu sú vhodné obidva typy.

Kryoprecipitovaná frakcia plazmy, ktorá bola podrobená predpurifikácii a vírusovej inaktivácii obvyklým spôsobom, sa nanáša na prvú chromatografickú kolónu, ktorá zadŕža veľký podiel vWF. vWF sa potom eluuje zvyšovaním koncentrácie chloridu sodného v tlmivom roztoku na 0,14 až 0,15 M.

Takto vymytá frakcia, obohatená vWF, sa aplikuje na druhú chromatografickú kolónu za rovnakých podmienok ako pri prvej kolóne. Pretože veľké množstvo proteínov (najmä FVIII a fibronektínu), ktoré súťažilo o adsorpčné miesta, bolo už z tejto frakcie odstránené v priebehu prvého chromatografického stupňa, je kapacita druhej kolóny na adsorpciu vWF výhodne oveľa väčšia. Po odstránení filtrátu a premytí kolóny ekvilibračným tlmivým roztokom sa adsorbovaný vWF vymýva zvyšovaním koncentrácie chloridu sodného v tlmivom roztoku na 0,15 až 0,17 M. Vďaka vysokej kapacite a účinnosti živice DEAE-Fractogel pre vWF je možné vWF z kolóny eluovať s veľmi vysokou špecifickou aktivitou (vyššou ako 150 U RCo/ml). Nie je teda nutné aplikovať mechanické sily ultrafiltrácie, ktoré by vyžadovali koncentrovanie produktu.

Takto eluovaná frakcia sa podrobuje afinitnej chromatografii na géli, odvodenom od želatíny, v rovnakom ekvilibračnom tlmivom roztoku, takže nie je nutné modifikovať zloženie solí napríklad dialýzou alebo ultrafiltráciou; táto kolóna je nutná na zadržanie molekúl zvyškového fibronektínu, ktoré ešte kontaminujú vWF. Výber želatínového gélu nie je rozhodujúci; rovnocenne je možné použiť želatínovú Scpharosu, želatínový Ultrogel, želatínový Spherodex a želatínový Fractogel. Najvýhodnejšia sa javí želatínová Sepharosa, pretože za podmienok tohto procesu fixuje 5 až 10 mg fibronektínu/ml gélu.

Pri použitých podmienkach sa vysoko čistený vWF naviaže na gél a je vymývaný vo filtráte; pretože pri použitej afinitnej chromatografii nedochádza k významnému riedeniu frakcie vWF, je produkt priamo k dispozícii bez potreby zahusťovania napríklad ultrafiltráciou. Vplyvom neprítomnosti proteolytických enzýmov je finálny produkt veľmi stabilný a počas sterilnej filtrácie a lyofilizácie nevyžaduje prítomnosť stabilizátorov.

Koncentrát von Willebrandovho faktora, získaný spôsobom podľa vynálezu, má výnimočne vysoký· faktor čistenia, dosahujúci viac ako 10000-násobok vo vzťahu k pôvodnej plazme a jeho špecifická aktivita je 345 U CBA/mg proteínu (merná jednotka pre väzbovú aktivitu kolagénu) a viac ako 100 U RCo/mg proteínu (jednotka aktivity ristocetínového kofaktora). Príspevok každého chromatografického stupňa k čisteniu vWF je ilustrovaný na obr. 1.

Zlepšovanie kvality produktu v priebehu jednotlivých stupňov čistenia bolo konkrétne sledované ako funkcia podielu vysokomolekulárnych multimérov (molekulárna forma vWF s vysokou biologickou kvalitou) elektorforetickou analýzou.

Táto analýza ukazuje progresívne obohacovanie o multiméry > 4 (obr. 2), ktoré predstavujú 79 % polymérov vWF, napriek tomu, že pri kryoprecipitácii sa ich polovina stratí. Nepredpokladalo sa, že chromatografia na DEAE-Fractogéli TSK 650 bude takto podporovať selektívnu retenciu veľmi vysokých multimérov a odstraňovať z filtrátu formy s malou veľkosťou, abnormálnou štruktúrou (pri ktorých došlo k čiastočnej proteolýze) a nízkou aktivitou.

Štandardizovaný koncentrát vWF s vysokou čistotou, vysokou špecifickou aktivitou a vysokým obsahom vysokomolekulárnych multimérov, získaný spôsobom podľa vynálezu, je preto veľmi vhodný na terapeutické použitie pri rôznych formách von Willebrandovej choroby, ako bolo potvrdené predbežnými klinickými skúškami.

Predbežné klinické skúšky ukázali, že tento koncentrát spôsobuje účinné skrátenie času krvácania pri hemoragiách.

Skúšky in vitro potvrdili identitu jeho biochemických a fyziologických vlastností s natívnou molekulou, najmä v prípade schopnosti fixácie krvných doštičiek v perfuznom prístroji a schopnosti viazať in vivo endogénny faktor VIII.

Vysoká čistota koncentrátu von Willebrandovho faktora, získaného spôsobom podľa vynálezu, rovnako umožňuje predpokladať jeho rôzne laboratórne aplikácie (na jemnú štruktúrnu analýzu, štúdium funkcionality, diagnostiku a pod.) a použitie na výrobu špecifických protilátok.

Koncentrát podľa vynálezu môže rovnako byť používaný ako stabilizátor pri produkcii faktora VIII bunkami, transformovanými genetickým inžinierstvom, aj pri čistení takto vyrobeného faktora VIII.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje SDS-PAGE frakciu vWF počas čistenia. Pruh 1: kryoprecipitát, pruh 2: kryoprecipitát ošetrený rozpúšťadlom-detergentom, pruh 3: frakcia naviazaná na DEAE-Fractogel, pruh 4: prvý eluát vWF, pruh 5: druhý eluát vWF, pruh 6: frakcia nenaviazaná na želatínový gél, pruh 7: štandardy.

Tbn = fibronektín

IgG = imunoglobulíny

Alb = albumín

Obr. 2 predstavuje distribúciu multimérov vWF vo frakciách počas čistenia. Pruh 1: normálna plazma, pruh 2: kryoprecipitát, pruh 3: kryoprecipitát ošetrený rozpúšťadlom-detergentom, pruh 4: frakcia naviazaná na DEAE-Fractogel, pruh 5: prvý eluát vWF, pruh 6: druhý eluát vWF, pruh 7: frakcia nenaviazaná na želatínový gél.

Príklad uskutočnenia vynálezu

Východiskový materiál

Kryoprecipitát sa pripraví z čerstvej plazmy, odoberanej v prítomnosti citrátu sodného (4 %) alebo antikoagulačného roztoku CPO (citrát, fosfát, dextróza) a zmrazenej najviac 6 h po získaní. Plazma sa hlboko zmrazí na -60 °C a potom sa uchováva pri -35 °C. Sarže plazmy obsahujú 1800 až 2000 1 a na každé vykonanie procesu sa preskupí do šarží po 4000 1. S cieľom roztopiť sa plazma umiestni na 12 h do teplotné regulovanej komory, kde sa pomaly pravidelne ohreje na -7 °C a potom sa roztopí za stáleho miešania v termostaticky kontrolovanej uzatvorenej nádobe pri 0 až 2 °C. Kryoprecipitát (ktorý predstavuje asi 9 g/1 plazmy) sa získa odstreďovaním za studená.

Kryoprecipitát, získaný po odstredení, sa opäť rozpustí a podrobí adsorpcii na hydroxide hlinitom na odstránenie niektorých nečistôt, konkrétne zložiek protrombínového komplexu (najmä faktora VII) a faktora XII. Supernatant sa potom ochladí na 15 °C (čím sa čiastočne odstráni fibrinogén a fibronektín).

Táto operácia umožňuje získať z kryoprecipitátu 80 až 86 % zmesi faktora VIII a von Willebrandovho faktora; špecifická aktivita faktora VIII je 0,7 IU/mg a špecifická aktivita vWF predstavuje 0,6 U RCo/mg (aktivita kofaktora ristocetínu) a 1,2 U CBA/mg (väzbová aktivita kolagénu).

Vírusová inaktivácia

Roztok, obsahujúci zmes faktora VIII a von Willebrandovho faktora sa podrobí pôsobeniu rozpúšťadla-detergentu, ktoré ako je známe, účinne likviduje vírusy s lipidickým obalom (Horowitz et al., Transfusion, 1985, 25: 516) a ktoré zahŕňa inkubáciu počas 8 hodín pri 25 °C v prítomnosti 0,3 % tri-n-butylsulfátu (TnBP) a 1 % Tweenu 80.

Po tejto operácii sa získa 95 % aktivity faktora VIII a von Willebrandovho faktora, merané v predchádzajúcom stupni. Elektroforézou je možné potvrdiť, že vWFje stále v multimémej forme.

Proces chromatografického delenia

Čistenie vWF je odvodené z postupu čistenia faktora VIII, opísaného rovnakým prihlasovateľom v EP-A-0 359 593.

Prvá chromatografia sa vykonáva na kolóne DEAE-Fracctogeli TSK 650 (typ S alebo M, Merck). Ekvilib račný tlmivý roztok obsahuje citrát sodný (0,01 M), chlorid vápenatý (0,001 M), glycín (0,12 M), L-lyzín (0,016 M) a chlorid sodný (0,11 M). V kolóne sa zachytí vWF, faktor VIII a fibronektín; kontaminujúce proteíny (hlavne fibrinogén a niektoré IgG), zachytené voľne alebo nezachytené kolónou, a zvyšky z vírusovej inaktivácie sa odstránia niekoľkonásobným premytím rovnakým tlmivým roztokom.

Kolóna sa používa s lineárnym prietokom 100 cm/h.

Za týchto podmienok má použitá kolóna retenčnú kapacitu pre vWF približne 75 % nastrieknutého množstva (merané ako antigén Ag); zvyšok sa stráca vo filtráte. Táto väzbová kapacita zodpovedá 45 U vWF Ag/ml gélu.

Von Willebrandov faktor sa z kolóny desorbuje zvýšením koncentrácie NaCl v tlmivom roztoku na 0,15 M. Získaná frakcia vWF obsahuje 30 až 35 % pôvodného vWF, zatiaľ čo 40 % zostáva koadsorbovaných s faktorom VIII a bude s ním koagulované ďalším zvýšením koncentrácie NaCl v tlmivom roztoku na 0,25 M a podrobené spoločnému čisteniu.

Frakcia, obsahujúca vWF, eluovaná z tejto prvej kolóny, sa nastriekne po miernom zriedení ekvilibračným tlmivým roztokom na zníženie iónovej sily frakcie vWF na ekvivalent 0,11 M chloridu sodného do druhej identickej kolóny.

Pretože nečistoty a faktor VIII, ktoré v prvej kolóne súťažili s vWF o adsorpčné miesta, boli počas prvého chromatografického stupňa takmer odstránené, je väzbová kapacita druhej kolóny oveľa väčšia, 320 U vWF Ag/ml gélu. vWF sa desorbuje zvýšením koncentrácie NaCl v tlmivom roztoku na 0,17 M.

Táto druhá chromatografia umožňuje koncentračný faktor 8 až 10 vyšší ako v prvom stupni, a tak nevyžaduje ďalšie zahusťovacie operácie, napríklad ultrafiltráciu. Pri použití štandardných metód sa zisťujú tieto množstvá, resp. aktivity vWF: antigén (Ag) 88 ± 9 IU/ml kofaktor ristocetínu (RCo) 97 ± 19 IU/ml väzbová aktivita kolagénu (CBA) 149 ± 13 IU/ml vysokomolekulárne multiméry (> 4) 79 %

Jednotky CBA (väzbová aktivita kolagénu) sú kvantifikované pomocou ELISA podľa Browna a Bosaka (Thromb. Res., 43: 303). Na vyjadrenie hodnôt v medzinárodných jednotkách bola ako kontrola použitá štandardná plazma, kalibrovaná proti 2. britskému štandardu (86/717).

Pomer CBA/Ag rovnajúci sa 1,69 ukazuje, že aktivita vWF je dobre zachovaná. To je v súlade s vysokým percentom vysokomolekulárnych multimérov (79 %) a vychádza priaznivo v porovnaní s natívnym vWF (70 %) z plazmy.

Elektroforetickou analýzou tohto eluátu vWF sa zisťuje mierna kontaminácia fibronektínom a inter-alťa trypsínovým inhibítorom, serín-proteázovým inhibítorom.

Druhý eluát vWF sa potom podrobuje tretiemu stupňu čistenia na kolóne želatínovej Sepharosy CL4B (Pharmacia), ekvilibrovanej elučným tlmivým roztokom z predchádzajúcej kolóny, s cieľom odstrániť fibronektín.

Tento afmitný chromatografický gél má retenčnú kapacitu pre fibronektín väčšiu ako 5 mg/ml, čo umožňuje znížiť množstvo tejto nečistoty vo frakcii vWF na nedekovateľné množstvo (pod 4 mg/1).

Čistený vWF podľa vynálezu sa nachádza vo filtráte z tohto posledného stupňa a je vhodný na priame použitie a lyofilizáciu.

Elektroforetickou analýzou finálneho produktu už nie je možné detekovať žiadne nečistoty. Obsah vWF je 205 U Ag/ml proteinu a jeho špecifická aktivita je 345 U CBA/mg proteinu a 186 až 220 U RCo/mg proteinu.

Celkový stupeň čistenia vo vzťahu k pôvodnej plazme je 10 000-násobný.

Elektroforetická analýza (SDS-agaróza a skanovanie pásov) ukazuje, že vWF, získaný týmto postupom čistenia, je 65 až 80 % tvorený vysokomolekulárnymi multimérmi: tento podiel je porovnateľný s pôvodnou plazmou, kde robí 70 %.

Stabilita koncentrátu bola študovaná počas 24 hodín v kvapalnom stave pri teplote miestnosti; neboli nájdené známky proteolytickej aktivity ani zmeny špecifickej aktivity.

Absencia trombogénnej aktivity v koncentráte bola potvrdená konvenčnými testami, ako je NAPTT (non-activated partial thromboplastn time). Nebolo možné detekovať trombin, PKA ani kallikreín.

Získaný finálny koncentrát vWF teda nevyžaduje prídavok stabilizátora.

Priemyselná využiteľnosť

Čistenie vWF špecifickým postupom, pri ktorom sa vWF získava ako vedľajší produkt výroby faktora VIII, po prvýkrát umožňuje výrobu vysoko čistého, vysoko účinného terapeutického koncentrátu, štandardizovaného na liečbu von Willebrandovej choroby.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob prípravy štandardizovaného vysoko čistého koncentrátu ľudského von Willebrandovho faktora s vysokým podielom vysokomolekulových multimérov z kryoprecipitovanej frakcie plazmy predčistenej na hydroxide hlinitom, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa tri za sebou nasledujúce chromatografické stupne, z ktorých prvé dva predstavujú ionexovú chromatografiu na vinylovej polymémej živici s veľkými pórmi, teda s pórmi s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti nad 10⁶ daltonov, s naviazanými dietylaminoetylovými skupinami, a tretí spočíva v afinitnej chromatografii na géli želatína-sepharosa.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že prvou a druhou ionexovou živicou je vinylový polymér so zakotvenými dietylaminoetylovými skupinami, ekvilibrovaný tlmivým roztokom obsahujúcim 0,01 M citrátu sodného, 0,11 M chloridu sodného, 0,001 M chloridu vápenatého, 0,12 M glycínu a 0,016 M L-lyzínu.
3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že predčistená kryoprecipitovaná frakcia plazmy sa aplikuje na prvú ionexovú chromatografickú kolónu a prvá frakcia, obsahujúca von Willebrandov faktor, sa eluuje zvýšením koncentrácie chloridu sodného v tlmivom roztoku na 0,14 až 0,15 M.
4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že eluát z prvej chromatografie obsahujúci von Willebrandov faktor sa aplikuje na druhú ionexovú chromatografickú kolónu a von Willebrandov faktor sa eluuje zvýšením koncentrácie chloridu sodného v tlmivom roztoku na 0,15 až 0,17 M.
5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že eluát z druhej chromatografie sa spracuje chromatografiou na géli želatína-sepharosa ekvilibrovanom elučným tlmivým roztokom z predchádzajúceho chromatografického stupňa k selektívnej adsorpcii zvyškového fibronektínu.
6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že filtrát z kolóny gélu želatína-sepharosa obsahujúci von Willebrandov faktor sa zachytí, jeho koncentrácia sa nastaví na konečnú hodnotu aspoň 30 IU/ml, rozdelí sa do 20-mililitrových fľaštičiek a lyofilizuje sa.
7. Koncentrát von Willebrandovho faktora pripravený spôsobom podľa niektorého z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že preukazuje vysokú špecifickú aktivitu nad 300 U CBA/mg proteinu alebo 180 U RCO/mg proteinu, jeho pomer aktivity k antigénu je aspoň 1,5 a jeho obsah vysokomolekulových multimérov je aspoň 65 %.