JP3435668B2 - 高純度で治療用に適した標準化ヒト フオン・ビルブラント因子濃厚液の工業規模製造の方法 - Google Patents
高純度で治療用に適した標準化ヒト フオン・ビルブラント因子濃厚液の工業規模製造の方法Info
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- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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Description
【０００１】
【発明の分野】本発明は、純度が非常に高く、比活性
（本明細書では「特異的活性」ともいう）が非常に高
く、高分子量多量体の含有量が高い、特に治療用の、標
準化ヒトフォン・ビルブラント（ｖｏｎ ｗｉｌｌｅｂ
ｒａｎｄ）因子濃厚液の工業規模の製造法に関する。
（本明細書では「特異的活性」ともいう）が非常に高
く、高分子量多量体の含有量が高い、特に治療用の、標
準化ヒトフォン・ビルブラント（ｖｏｎ ｗｉｌｌｅｂ
ｒａｎｄ）因子濃厚液の工業規模の製造法に関する。
【０００２】
【関連技術の背景】フォン・ビルブラント因子（ｖＷ
Ｆ）は、知られている中で最も大きな血漿中を循環する
分子である。これは一連のジスルフィド結合多量体とし
て存在し、その基本的サブユニットの分子量は約２６０
キロダルトン（ＫＤａ）である。血漿中のｖＷＦの最小
の形態は、約４４０−５００ＫＤａの二量体であり、最
大の形態は最高２千万ダルトンの分子量を持つ二量体の
多量体である。結合しているサブユニット集合体は細胞
特異的であることができ、ｖＷＦは巨核球及び内皮細胞
で合成され、重合する。
Ｆ）は、知られている中で最も大きな血漿中を循環する
分子である。これは一連のジスルフィド結合多量体とし
て存在し、その基本的サブユニットの分子量は約２６０
キロダルトン（ＫＤａ）である。血漿中のｖＷＦの最小
の形態は、約４４０−５００ＫＤａの二量体であり、最
大の形態は最高２千万ダルトンの分子量を持つ二量体の
多量体である。結合しているサブユニット集合体は細胞
特異的であることができ、ｖＷＦは巨核球及び内皮細胞
で合成され、重合する。
【０００３】この因子は、２通りの異なるやり方で止血
に大きな役割を果たす：血流中の因子ＶＩＩＩを輸送
し、安定化し、粘着蛋白質として内皮下血管上で血小板
を広げ、接触させ、凝集させ、損傷血管の速やかな治癒
に寄与する。
に大きな役割を果たす：血流中の因子ＶＩＩＩを輸送
し、安定化し、粘着蛋白質として内皮下血管上で血小板
を広げ、接触させ、凝集させ、損傷血管の速やかな治癒
に寄与する。
【０００４】体質性ｖＷＦ不全症、又はこの因子の構造
異常は、フォン・ビルブラント病を引き起こし、これは
最初特に皮膚及び粘膜の出血として現れる。この病気の
臨床的形態は非常に様々で、外科手術の時に主な問題と
なる。一次止血（出血時間）及び凝集（活性化セファリ
ン時間及びＦ ＶＩＩＩ活性）不全を修正するためにフ
ォン・ビルブラント病の治療が重要である。
異常は、フォン・ビルブラント病を引き起こし、これは
最初特に皮膚及び粘膜の出血として現れる。この病気の
臨床的形態は非常に様々で、外科手術の時に主な問題と
なる。一次止血（出血時間）及び凝集（活性化セファリ
ン時間及びＦ ＶＩＩＩ活性）不全を修正するためにフ
ォン・ビルブラント病の治療が重要である。
【０００５】病気は、ｖＷＦ−濃縮ヒト血漿誘導体（例
えば血漿の寒冷沈降物画分［本明細書では「低温沈澱留
分」ともいう］又は十分量のｖＷＦを含む第ＶＩＩＩ因
子の濃厚液）を用いた置換治療により治療する。しかし
これらの生成物は、フォン・ビルブランド病の治療用に
標準化されていない。さらに精製度の低い血漿の留分、
特に低温沈澱は有効なウィルス不活性化段階を経ていな
いことが多いために、ウィルス汚染の危険がある。さら
に、患者が必要としておらず、多数回の注射の後に免疫
反応を起こし得る蛋白質の過剰の混入を生ずる。
えば血漿の寒冷沈降物画分［本明細書では「低温沈澱留
分」ともいう］又は十分量のｖＷＦを含む第ＶＩＩＩ因
子の濃厚液）を用いた置換治療により治療する。しかし
これらの生成物は、フォン・ビルブランド病の治療用に
標準化されていない。さらに精製度の低い血漿の留分、
特に低温沈澱は有効なウィルス不活性化段階を経ていな
いことが多いために、ウィルス汚染の危険がある。さら
に、患者が必要としておらず、多数回の注射の後に免疫
反応を起こし得る蛋白質の過剰の混入を生ずる。
【０００６】逆に精製第ＶＩＩＩ因子は、有効なウィル
ス不活性化処理を行うことができるが、その精製法はｖ
ＷＦ不全の患者ではなく、血友病Ａの患者用に最適化し
てある。実際最近開発され、有効性の増した方法、例え
ば第１ＶＩＩＩ因子の製造に使用される免疫アフィニテ
ィー又はイオン交換精製は、フォン・ビルブラント病の
治療に十分な量のｖＷＦを含まない濃厚液を製造する。
ス不活性化処理を行うことができるが、その精製法はｖ
ＷＦ不全の患者ではなく、血友病Ａの患者用に最適化し
てある。実際最近開発され、有効性の増した方法、例え
ば第１ＶＩＩＩ因子の製造に使用される免疫アフィニテ
ィー又はイオン交換精製は、フォン・ビルブラント病の
治療に十分な量のｖＷＦを含まない濃厚液を製造する。
【０００７】出願人が種々の血漿分子の単離物から、最
適な利点を保持したままｖＷＦを精製する新規工業的方
法を開発したことは、フォン・ビルブラント病の有効な
治療法というこの要求を満たすものである。特にこの方
法により１段階で第ＶＩＩＩ因子の濃厚液を製造し（Ｅ
Ｐ出願０ ３５９ ５９３に記載の方法に従い）、低温
沈澱の同一バッチから別のｖＷＦ留分を回収することが
でき、ヒト血漿の最適利用が可能になる。このようにし
て得られたｖＷＦ留分は、さらに２段階のクロマトグラ
フィーにより精製し、非常に高純度のｖＷＦ濃厚液を得
る。
適な利点を保持したままｖＷＦを精製する新規工業的方
法を開発したことは、フォン・ビルブラント病の有効な
治療法というこの要求を満たすものである。特にこの方
法により１段階で第ＶＩＩＩ因子の濃厚液を製造し（Ｅ
Ｐ出願０ ３５９ ５９３に記載の方法に従い）、低温
沈澱の同一バッチから別のｖＷＦ留分を回収することが
でき、ヒト血漿の最適利用が可能になる。このようにし
て得られたｖＷＦ留分は、さらに２段階のクロマトグラ
フィーにより精製し、非常に高純度のｖＷＦ濃厚液を得
る。
【０００８】ｖＷＦ分子は複雑なために精製が非常に困
難である。小規模法、すなわち分析研究用の５−２００
０ｍｌの規模の方法はすでに記載されている（Ｔｈｏｒ
ｅｌｌ等、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９８４，３５：４
３１−４５０）が、この方法を工業規模のｖＷＦ生産に
適応させるのは不可能である。さらにＦＶＩＩＩの他に
ｖＷＦを製造することにより、低温沈澱を可能な限り最
高に利用するという概念は考慮されていない。
難である。小規模法、すなわち分析研究用の５−２００
０ｍｌの規模の方法はすでに記載されている（Ｔｈｏｒ
ｅｌｌ等、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９８４，３５：４
３１−４５０）が、この方法を工業規模のｖＷＦ生産に
適応させるのは不可能である。さらにＦＶＩＩＩの他に
ｖＷＦを製造することにより、低温沈澱を可能な限り最
高に利用するという概念は考慮されていない。
【０００９】ｖＷＦは、グリシンの存在下における硫酸
化化合物への溶解度差により（Ｂｅｒｎｔｏｒｐ等，Ｖ
ｏｘ Ｓａｎｇ．１９８９，５６：２１２）、硫酸化化
合物への溶解度差により（Ｗｉｎｋｅｌｍａｎ等，Ｖｏ
ｘ Ｓａｎｇ．１９８９，５７：９７）、ならびに分子
の大きさによる排除（Ｐｅｒｒｅｔ等，Ｈａｅｍａｓｔ
ａｓｉｓ １９８４，１４：２８９）及びイオン交換
（Ａｕｓｔｅｎ等，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔａ
ｓ．１９８２，４８：２９５）などの種々のクロマトグ
リフィー分離法により精製されてきた。しかしこれらの
方法は、低収率のｖＷＦしか与えず、又はゲル容量が低
く、あるいはＦＶＩＩＩ及びｖＷＦを同時に単離するこ
とができず、工業的用途にはあまり便利でない。
化化合物への溶解度差により（Ｂｅｒｎｔｏｒｐ等，Ｖ
ｏｘ Ｓａｎｇ．１９８９，５６：２１２）、硫酸化化
合物への溶解度差により（Ｗｉｎｋｅｌｍａｎ等，Ｖｏ
ｘ Ｓａｎｇ．１９８９，５７：９７）、ならびに分子
の大きさによる排除（Ｐｅｒｒｅｔ等，Ｈａｅｍａｓｔ
ａｓｉｓ １９８４，１４：２８９）及びイオン交換
（Ａｕｓｔｅｎ等，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔａ
ｓ．１９８２，４８：２９５）などの種々のクロマトグ
リフィー分離法により精製されてきた。しかしこれらの
方法は、低収率のｖＷＦしか与えず、又はゲル容量が低
く、あるいはＦＶＩＩＩ及びｖＷＦを同時に単離するこ
とができず、工業的用途にはあまり便利でない。
【００１０】さらにＢｅｒｎｔｏｒｐ等（Ｖｏｘ Ｓａ
ｎｇ．１９８９，５６：２１２）の得たｖＷＦは純度が
低く、４５Ｕ Ａｇ／ｍｇ蛋白質（ｐ．２１３）である
が、出願人は２０５Ｕ Ａｇ／ｍｇ蛋白質を得た。同様
に、Ｗｉｎｋｅｌｍａｎ等（Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．１９８
９，５７：９７）の得た純度は１０Ｕ Ａｇ／ｍｌ蛋白
質（ｐ．１０１）である。
ｎｇ．１９８９，５６：２１２）の得たｖＷＦは純度が
低く、４５Ｕ Ａｇ／ｍｇ蛋白質（ｐ．２１３）である
が、出願人は２０５Ｕ Ａｇ／ｍｇ蛋白質を得た。同様
に、Ｗｉｎｋｅｌｍａｎ等（Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．１９８
９，５７：９７）の得た純度は１０Ｕ Ａｇ／ｍｌ蛋白
質（ｐ．１０１）である。
【００１１】Ｐｅｒｒｅｔ等（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ
１９８４，１４：２８９）は、カルシウムならびにヘ
ビ毒からの酵素を用いて脱繊維素段階（フィブリン分子
としてフィブリノーゲンを除去する）を行っている。こ
れは、明らかに製造法を治療目的に適さないものとして
いる。さらに彼らが用いたゲル濾過系は、流量がわずか
１０ｃｍ／時間かそれ以下であり、特にフィブリノーゲ
ン及びフィブロネクチンが存在する場合閉塞の危険が高
いので工業的大規模化にはほとんど適さない。このクロ
マトグラフィー系における蛋白質の分解能が低いため精
製因子も通常低いことが知られている。
１９８４，１４：２８９）は、カルシウムならびにヘ
ビ毒からの酵素を用いて脱繊維素段階（フィブリン分子
としてフィブリノーゲンを除去する）を行っている。こ
れは、明らかに製造法を治療目的に適さないものとして
いる。さらに彼らが用いたゲル濾過系は、流量がわずか
１０ｃｍ／時間かそれ以下であり、特にフィブリノーゲ
ン及びフィブロネクチンが存在する場合閉塞の危険が高
いので工業的大規模化にはほとんど適さない。このクロ
マトグラフィー系における蛋白質の分解能が低いため精
製因子も通常低いことが知られている。
【００１２】Ａｕｓｔｅｎ等（Ｔｈｒｏｍ．Ｈａｅｍｏ
ｓｔａｓ．１９８２，４８：４６）も、おそらく粗悪な
クロマトグラフィー条件（ｐＨ５．５）のために、低純
度の濃厚液（８Ｕ Ａｇ／ｍｇ蛋白質）を比較的低収率
で得ている。
ｓｔａｓ．１９８２，４８：４６）も、おそらく粗悪な
クロマトグラフィー条件（ｐＨ５．５）のために、低純
度の濃厚液（８Ｕ Ａｇ／ｍｇ蛋白質）を比較的低収率
で得ている。
【００１３】Ｈａｒｒｉｓｓｏｎ等（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒ
ｅｓ．１９８８，５０：２９５）は、クロマトグラフマ
トリックスとして硫酸化デキストラン−セファロースを
使用している：この材料はｖＷＦに関する保持容量が低
い。その結果特異的活性の低いｖＷＦ調剤を与える：２
−４Ｕ／ｍｇ蛋白質（ｐ．３０１）。
ｅｓ．１９８８，５０：２９５）は、クロマトグラフマ
トリックスとして硫酸化デキストラン−セファロースを
使用している：この材料はｖＷＦに関する保持容量が低
い。その結果特異的活性の低いｖＷＦ調剤を与える：２
−４Ｕ／ｍｇ蛋白質（ｐ．３０１）。
【００１４】最後にこれらの製品のほとんどが、リスト
セチンコファクター（ＲＣｏ）／抗原比が０．０８−
０．８（Ｌａｗｒｉｅ等，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏ
ｌ．１９８９，７３：１００）であることに示される通
り、変性又は不活性化ｖＷＦを大きな割合で含む。この
ため、これらはフォン・ビルブラント病の治療にはあま
り有効でない。逆に出願人の方法は、ＲＣｏ／抗原比が
１以上のｖＷＦの回収を可能にし、これは正常なプール
血漿からの本来のｖＷＦの比率と同等である。
セチンコファクター（ＲＣｏ）／抗原比が０．０８−
０．８（Ｌａｗｒｉｅ等，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏ
ｌ．１９８９，７３：１００）であることに示される通
り、変性又は不活性化ｖＷＦを大きな割合で含む。この
ため、これらはフォン・ビルブラント病の治療にはあま
り有効でない。逆に出願人の方法は、ＲＣｏ／抗原比が
１以上のｖＷＦの回収を可能にし、これは正常なプール
血漿からの本来のｖＷＦの比率と同等である。
【００１５】
【発明の概略】本発明は、高純度ＦＶＩＩＩ製造法の副
生成物として治療用のｖＷＦ濃厚液を製造し、標準化バ
ッチを可能にする工業的方法において、高分子量多量体
の含有量が多く、大量の血漿（４０００リットルかそれ
以上）から製造し、低温沈澱の最適利用を可能にするこ
とを特徴とする方法に関する。
生成物として治療用のｖＷＦ濃厚液を製造し、標準化バ
ッチを可能にする工業的方法において、高分子量多量体
の含有量が多く、大量の血漿（４０００リットルかそれ
以上）から製造し、低温沈澱の最適利用を可能にするこ
とを特徴とする方法に関する。
【００１６】特に本発明は、ｖＷＦ生物活性と関連する
高分子量多量体の濃縮を可能にする３連続クロマトグラ
フィー段階の組み合わせを含むｖＷＦ濃厚液の製造法に
関する。出発材料は水酸化アルミニウムへの吸着を含む
従来の精製を行ったヒト血漿の低温沈澱留分である。そ
の後この材料は精製前に、例えば溶剤−洗剤処理などを
用いたウィルス不活性化を行う。
高分子量多量体の濃縮を可能にする３連続クロマトグラ
フィー段階の組み合わせを含むｖＷＦ濃厚液の製造法に
関する。出発材料は水酸化アルミニウムへの吸着を含む
従来の精製を行ったヒト血漿の低温沈澱留分である。そ
の後この材料は精製前に、例えば溶剤−洗剤処理などを
用いたウィルス不活性化を行う。
【００１７】
【好ましい具体化の詳細な説明】本発明の精製法は、Ｆ
ＶＩＩＩ製造法の副生成物留分からの３連続クロマトグ
ラフィー段階の組み合わせを含み、最初の２段階はイオ
ン交換クロマトグラフィー、第３段階はアフィニティー
クロマトグラフィーである。
ＶＩＩＩ製造法の副生成物留分からの３連続クロマトグ
ラフィー段階の組み合わせを含み、最初の２段階はイオ
ン交換クロマトグラフィー、第３段階はアフィニティー
クロマトグラフィーである。
【００１８】イオン交換クロマトグラフィーの２段階
は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を固定した同
一のビニルポリマー樹脂、特にＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏ
ｇｅｌRＴＳＫ６５０（Ｍｅｒｃｋ）のカラム上で行
い、０．０１Ｍのクエン酸三ナトリウム、０．１１Ｍの
塩化ナトリウム、０．００１Ｍの塩化カルシウム、０．
１２Ｍのグリシン及び０．０１６Ｍのリシンを含む溶液
でｐＨ７に緩衝してある。ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅ
ｌ ＴＳＫR６５０は、合成親水性ゲル媒体である。保
持体は、オリゴエチレングリコール、グリシジンメタク
リレート及びペンタエリスリトール−ジメタクリレート
のコポリマーであり、それにジエチルアミノエチル基、
すなわち−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2Ｎ+（Ｃ2Ｈ5）2ＨＣｌが結
合し、弱アルカリ性イオン交換剤となっている。ＤＥＡ
Ｅ−ＦｒａｃｔｏｇｅｌRＴＳＫ６５０は、２種類の粒
径範囲で入手できる（水で湿らせた場合）：Ｓ型（０．
０２５−０．０５０ｍｍ）及びＭ型（０．０４５−０．
０９０ｍｍ）。両種類共、本発明を行うのに有用であ
る。
は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を固定した同
一のビニルポリマー樹脂、特にＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏ
ｇｅｌRＴＳＫ６５０（Ｍｅｒｃｋ）のカラム上で行
い、０．０１Ｍのクエン酸三ナトリウム、０．１１Ｍの
塩化ナトリウム、０．００１Ｍの塩化カルシウム、０．
１２Ｍのグリシン及び０．０１６Ｍのリシンを含む溶液
でｐＨ７に緩衝してある。ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅ
ｌ ＴＳＫR６５０は、合成親水性ゲル媒体である。保
持体は、オリゴエチレングリコール、グリシジンメタク
リレート及びペンタエリスリトール−ジメタクリレート
のコポリマーであり、それにジエチルアミノエチル基、
すなわち−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2Ｎ+（Ｃ2Ｈ5）2ＨＣｌが結
合し、弱アルカリ性イオン交換剤となっている。ＤＥＡ
Ｅ−ＦｒａｃｔｏｇｅｌRＴＳＫ６５０は、２種類の粒
径範囲で入手できる（水で湿らせた場合）：Ｓ型（０．
０２５−０．０５０ｍｍ）及びＭ型（０．０４５−０．
０９０ｍｍ）。両種類共、本発明を行うのに有用であ
る。
【００１９】従来の方法で予備精製し、ウィルス不活性
化処理を行った低温沈澱血漿留分を、１回目のクロマト
グラフィーカラムにかけると、大部分のｖＷＦが保持さ
れる。その後緩衝液の塩化ナトリウム濃度を０．１４−
０．１５Ｍに増すことによりｖＷＦを溶離する。
化処理を行った低温沈澱血漿留分を、１回目のクロマト
グラフィーカラムにかけると、大部分のｖＷＦが保持さ
れる。その後緩衝液の塩化ナトリウム濃度を０．１４−
０．１５Ｍに増すことによりｖＷＦを溶離する。
【００２０】そのようにして溶離したｖＷＦの豊富な留
分を、１回目と同一条件下で２回目のクロマトグラフィ
ーカラムにかける。吸着部位に関して競争する多くの蛋
白質（特にＦＶＩＩＩ及びフィブロネクチン）がすでに
第１クロマトグラフィー段階でこの留分から除去されて
いるので、第２のカラム上へのｖＷＦ吸着の容量ははる
かに多く、有利である。濾液を除去した後、カラムを平
衡緩衝液で濯ぎ、緩衝液の塩化ナトリウム濃度を０．１
５−０．１７Ｍに上げることにより吸着ｖＷＦを溶離す
る。ｖＷＦに関するＤＥＡＥ ＦｒａｃｔｏｇｅｌR樹
脂の容量及び効率が高いために、非常に高い力価（＞１
５０Ｕ ＲＣｏ／ｍｌ）でｖＷＦをカラムから溶離する
ことができる。従って生成物の濃縮に必要な限外濾過の
機械的応力を避けることができる。
分を、１回目と同一条件下で２回目のクロマトグラフィ
ーカラムにかける。吸着部位に関して競争する多くの蛋
白質（特にＦＶＩＩＩ及びフィブロネクチン）がすでに
第１クロマトグラフィー段階でこの留分から除去されて
いるので、第２のカラム上へのｖＷＦ吸着の容量ははる
かに多く、有利である。濾液を除去した後、カラムを平
衡緩衝液で濯ぎ、緩衝液の塩化ナトリウム濃度を０．１
５−０．１７Ｍに上げることにより吸着ｖＷＦを溶離す
る。ｖＷＦに関するＤＥＡＥ ＦｒａｃｔｏｇｅｌR樹
脂の容量及び効率が高いために、非常に高い力価（＞１
５０Ｕ ＲＣｏ／ｍｌ）でｖＷＦをカラムから溶離する
ことができる。従って生成物の濃縮に必要な限外濾過の
機械的応力を避けることができる。
【００２１】このようにして溶離した留分を、同一の平
衡緩衝液中でゼラチン−誘導ゲル上のアフィニティーク
ロマトグラフィーにかけ、塩組成を修正するための透析
又は限外濾過を避ける：このカラムはｖＷＦをまだ汚染
している残留フィブロネクチンの分子を保持するのが重
要である。ゼラチン−誘導ゲルの選定は重要でない。し
かし：Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｇｅｌａ
ｔｉｎ−ＵｌｔｒｏｇｅｌR，Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｓｐｈ
ｅｒｏｄｅｘR及びＧｅｌａｔｉｎ−Ｆｒａｃｔｏｇｅ
ｌRはすべて本目的に適している。Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｓ
ｏｐｈａｒｏｓｅは、本方法で使用する条件下で５−１
０ｍｇフィブロネクチン／ｍｌゲルを固定するので、最
も良い選択である。
衡緩衝液中でゼラチン−誘導ゲル上のアフィニティーク
ロマトグラフィーにかけ、塩組成を修正するための透析
又は限外濾過を避ける：このカラムはｖＷＦをまだ汚染
している残留フィブロネクチンの分子を保持するのが重
要である。ゼラチン−誘導ゲルの選定は重要でない。し
かし：Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｇｅｌａ
ｔｉｎ−ＵｌｔｒｏｇｅｌR，Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｓｐｈ
ｅｒｏｄｅｘR及びＧｅｌａｔｉｎ−Ｆｒａｃｔｏｇｅ
ｌRはすべて本目的に適している。Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｓ
ｏｐｈａｒｏｓｅは、本方法で使用する条件下で５−１
０ｍｇフィブロネクチン／ｍｌゲルを固定するので、最
も良い選択である。
【００２２】使用する条件で、高純度ｖＷＦはゲル上に
結合せず濾液中に溶離する；ゼラチンアフィニティー段
階によりｖＷＦ留分の大きな希釈は起こらないので、生
成物は例えば限外濾過などによる濃縮段階を必要とせず
に直接調剤することができる。最終生成物に蛋白質分解
酵素がないので、無菌濾過及び凍結乾燥段階の間非常に
安定で、安定剤を必要としない。
結合せず濾液中に溶離する；ゼラチンアフィニティー段
階によりｖＷＦ留分の大きな希釈は起こらないので、生
成物は例えば限外濾過などによる濃縮段階を必要とせず
に直接調剤することができる。最終生成物に蛋白質分解
酵素がないので、無菌濾過及び凍結乾燥段階の間非常に
安定で、安定剤を必要としない。
【００２３】本発明の方法により得たフォン・ビルブラ
ント因子濃厚液は、最初の血漿の＞１０，０００倍とい
う特に高い精製因子を有し、その特異的活性は３４５Ｕ
ＣＢＡ／ｍｇ蛋白質（コラーゲン結合活性測定の単
位）、及び＞１００Ｕ ＲＣｏ／ｍｇ蛋白質（リストセ
チンコファクター活性の単位）である。ｖＷＦの精製へ
の各クロマトグラフィー段階の寄与を図１に示す。
ント因子濃厚液は、最初の血漿の＞１０，０００倍とい
う特に高い精製因子を有し、その特異的活性は３４５Ｕ
ＣＢＡ／ｍｇ蛋白質（コラーゲン結合活性測定の単
位）、及び＞１００Ｕ ＲＣｏ／ｍｇ蛋白質（リストセ
チンコファクター活性の単位）である。ｖＷＦの精製へ
の各クロマトグラフィー段階の寄与を図１に示す。
【００２４】連続的精製段階の間の生成物の質の向上
を、電気泳動分析により検出した高分子量多量体（高生
物活性を有するｖＷＦの分子形態）の割合を関数として
監視したのは非常に重要である。
を、電気泳動分析により検出した高分子量多量体（高生
物活性を有するｖＷＦの分子形態）の割合を関数として
監視したのは非常に重要である。
【００２５】興味深いことに、この分析により多量体が
≧４で漸増的に濃縮されることが明らかになり（図
２）、それは低温沈澱によりその半分が除去されたとし
てもｖＷＦの７９％に相当する。予想に反して非常に大
きな多量体を選択的に保持し、小さい、異常構造（部分
的蛋白質分解を受けた）の低活性の形態を濾液と共に除
去する傾向があるのはＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ
ＴＳＫ６５０上のクロマトグラフィーである。
≧４で漸増的に濃縮されることが明らかになり（図
２）、それは低温沈澱によりその半分が除去されたとし
てもｖＷＦの７９％に相当する。予想に反して非常に大
きな多量体を選択的に保持し、小さい、異常構造（部分
的蛋白質分解を受けた）の低活性の形態を濾液と共に除
去する傾向があるのはＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ
ＴＳＫ６５０上のクロマトグラフィーである。
【００２６】従って本発明の方法で得た純度が高く、特
異的活性が高く、高分子量多量体の含有量の多い標準化
ｖＷＦ濃厚液は、予備的臨床研究によって確認された通
り、種々の形態のフォン・ビルブラント病の治療に用い
るのに特に適している。
異的活性が高く、高分子量多量体の含有量の多い標準化
ｖＷＦ濃厚液は、予備的臨床研究によって確認された通
り、種々の形態のフォン・ビルブラント病の治療に用い
るのに特に適している。
【００２７】予備的臨床試験により、この濃厚液が出血
の時の出血時間を有効に短縮することが示された。
の時の出血時間を有効に短縮することが示された。
【００２８】インビトロ試験により、その生化学的及び
生理学的性質、特に懽水装置内で血小板を固定する能力
及びインビボ内在因子ＶＩＩＩを結合する能力が本来の
分子と同一であることが確認された。
生理学的性質、特に懽水装置内で血小板を固定する能力
及びインビボ内在因子ＶＩＩＩを結合する能力が本来の
分子と同一であることが確認された。
【００２９】本発明の方法により得られるｖＷＦは純度
が高いため、種々の実験室における用途（微量構造分
析、官能性研究、診断など）、ならびに特異的抗体の製
造にも適していると思われる。
が高いため、種々の実験室における用途（微量構造分
析、官能性研究、診断など）、ならびに特異的抗体の製
造にも適していると思われる。
【００３０】本発明の濃厚液は、遺伝子工学により形質
転換された細胞による第ＶＩＩＩ因子の製造の間、及び
そのようにして製造された第ＶＩＩＩの精製の間の安定
剤として使用することもできる。
転換された細胞による第ＶＩＩＩ因子の製造の間、及び
そのようにして製造された第ＶＩＩＩの精製の間の安定
剤として使用することもできる。
【００３１】以下の実施例は本発明の具体化のひとつの
形態を説明するもので、その範囲を制限するものではな
い。
形態を説明するもので、その範囲を制限するものではな
い。
【００３２】
【実施例】出発材料
クエン酸ナトリウム（４％）又はＣＰＤ（クエン酸塩、
リン酸塩、デキストロース）抗凝集溶液の存在下で集め
た新しい血漿から低温沈澱を得、入手後最高６時間で凍
結する。血漿は−６０℃に深冷凍結し、その後−３５℃
で保存する。血漿バッチには１８００−２０００リット
ルを含み、それをそれぞれ方法に適用するために４００
０リットルのバッチにプールする。解凍する場合は、血
漿を温度制御室に１２時間置き、確実にゆっくり一定の
加温をして−７℃とし、その後一定の撹拌をしながら温
度調節器で制御した０−２℃の容器で解凍する。低温沈
澱（約９ｇ／ｌ血漿に相当する）を冷遠心により回収す
る。
リン酸塩、デキストロース）抗凝集溶液の存在下で集め
た新しい血漿から低温沈澱を得、入手後最高６時間で凍
結する。血漿は−６０℃に深冷凍結し、その後−３５℃
で保存する。血漿バッチには１８００−２０００リット
ルを含み、それをそれぞれ方法に適用するために４００
０リットルのバッチにプールする。解凍する場合は、血
漿を温度制御室に１２時間置き、確実にゆっくり一定の
加温をして−７℃とし、その後一定の撹拌をしながら温
度調節器で制御した０−２℃の容器で解凍する。低温沈
澱（約９ｇ／ｌ血漿に相当する）を冷遠心により回収す
る。
【００３３】遠心の後、回収した低温沈澱を再溶解し、
水酸化アルミニウムに吸着していくらかの汚染物、すな
わちプロトロンビン複合体（おそらく第ＶＩＩ因子）及
び第ＸＩＩ因子を除去する。その後上澄み液を１５℃に
冷却する（おそらくフィブリノーゲン及びフィブロネク
チンの一部が除去される）。
水酸化アルミニウムに吸着していくらかの汚染物、すな
わちプロトロンビン複合体（おそらく第ＶＩＩ因子）及
び第ＸＩＩ因子を除去する。その後上澄み液を１５℃に
冷却する（おそらくフィブリノーゲン及びフィブロネク
チンの一部が除去される）。
【００３４】この処理により低温沈澱から第ＶＩＩＩ因
子／ｖＷＦ混合物の８０−８６％が回収できる；第ＶＩ
ＩＩ因子の特異的活性は０．７ＩＵ／ｍｇ、及びｖＷＦ
の特異的活性は０．６Ｕ ＲＣｏ／ｍｇ（リストセチン
コファクター活性）ならびに１．２Ｕ ＣＢＡ／ｍｇ
（コラーゲン結合活性）を示す。
子／ｖＷＦ混合物の８０−８６％が回収できる；第ＶＩ
ＩＩ因子の特異的活性は０．７ＩＵ／ｍｇ、及びｖＷＦ
の特異的活性は０．６Ｕ ＲＣｏ／ｍｇ（リストセチン
コファクター活性）ならびに１．２Ｕ ＣＢＡ／ｍｇ
（コラーゲン結合活性）を示す。
【００３５】ウィルス不活性化処理
第ＶＩＩＩ因子／ｖＷＦ混合物を含む溶液に、溶剤−洗
剤処理を行う。この処理は、脂質エンベロープウィルス
（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ等，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，１９
８５，２５：５１６）の破壊に有効なことが知られてお
り、０．３％のトリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢ
Ｐ）及び１％のＴｗｅｅｎ８０の存在下、２５℃にて８
時間の培養を含む。
剤処理を行う。この処理は、脂質エンベロープウィルス
（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ等，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，１９
８５，２５：５１６）の破壊に有効なことが知られてお
り、０．３％のトリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢ
Ｐ）及び１％のＴｗｅｅｎ８０の存在下、２５℃にて８
時間の培養を含む。
【００３６】この処理の後、前段階で測定した第ＶＩＩ
Ｉ因子及びｖＷＦの活性の９５％が回収される。電気泳
動を用いて、ｖＷＦがまだ多量体の形態であることを確
認することができる。
Ｉ因子及びｖＷＦの活性の９５％が回収される。電気泳
動を用いて、ｖＷＦがまだ多量体の形態であることを確
認することができる。
【００３７】クロマトグラフィー分離法
ｖＷＦの精製は、欧州特許出願ＥＰ０，３５９，５９３
において出願人により開示された第ＶＩＩＩ因子精製法
から誘導する。
において出願人により開示された第ＶＩＩＩ因子精製法
から誘導する。
【００３８】第１のクロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ−
ＦｒａｃｔｏｇｅｌRＴＳＫ６５０（Ｓ型又はＭ型）
（Ｍｅｒｃｋ）のカラム上で行う。平衡緩衝液は、クエ
ン酸三ナトリウム（０．０１Ｍ）、塩化カルシウム
（０．００１Ｍ）、グリシン（０．１２Ｍ）、Ｌ−リシ
ン（０．０１６Ｍ）及び塩化ナトリウム（０．１１Ｍ）
を含む。ｖＷＦ、第ＶＩＩＩ因子及びフィブロネクチン
がカラムに保持される；汚染蛋白質（主にフィブリノー
ゲン及びいくらかのＩｇＧ）は、カラムにゆるく固定さ
れるか又は固定されず、ウィルス滅菌剤は同緩衝液で連
続的に数回洗浄することにより除去される。
ＦｒａｃｔｏｇｅｌRＴＳＫ６５０（Ｓ型又はＭ型）
（Ｍｅｒｃｋ）のカラム上で行う。平衡緩衝液は、クエ
ン酸三ナトリウム（０．０１Ｍ）、塩化カルシウム
（０．００１Ｍ）、グリシン（０．１２Ｍ）、Ｌ−リシ
ン（０．０１６Ｍ）及び塩化ナトリウム（０．１１Ｍ）
を含む。ｖＷＦ、第ＶＩＩＩ因子及びフィブロネクチン
がカラムに保持される；汚染蛋白質（主にフィブリノー
ゲン及びいくらかのＩｇＧ）は、カラムにゆるく固定さ
れるか又は固定されず、ウィルス滅菌剤は同緩衝液で連
続的に数回洗浄することにより除去される。
【００３９】カラムは、１００ｃｍ／時間の線流量で使
用する。このような作業条件下で、使用カラムのｖＷＦ
保持容量は、注入量の約７５％（抗原、Ａｇとして測
定）であり、残りは濾液中に失われる。この結合容量
は、４５ＵのｖＷＦ Ａｇ／ｍｌゲルに相当する。
用する。このような作業条件下で、使用カラムのｖＷＦ
保持容量は、注入量の約７５％（抗原、Ａｇとして測
定）であり、残りは濾液中に失われる。この結合容量
は、４５ＵのｖＷＦ Ａｇ／ｍｌゲルに相当する。
【００４０】緩衝液のＮａＣｌ濃度を０．１５Ｍに上げ
ることにより、カラムからｖＷＦを脱着する。回収した
ｖＷＦの留分は、最初のｖＷＦの３０−３５％を含み、
その４０％は第ＶＩＩＩ因子と共吸着して残り、緩衝液
のＮａＣｌ濃度を２回目に０．２５Ｍに上げることによ
り共溶離し、共精製する。
ることにより、カラムからｖＷＦを脱着する。回収した
ｖＷＦの留分は、最初のｖＷＦの３０−３５％を含み、
その４０％は第ＶＩＩＩ因子と共吸着して残り、緩衝液
のＮａＣｌ濃度を２回目に０．２５Ｍに上げることによ
り共溶離し、共精製する。
【００４１】この第１のカラムから溶離したｖＷＦを含
む留分を、ｖＷＦ留分のイオン強度を０．１１Ｍの塩化
ナトリウムと等量に合わせるために少量の平衡緩衝液で
希釈した後、同一の第２カラム上に再注入する。
む留分を、ｖＷＦ留分のイオン強度を０．１１Ｍの塩化
ナトリウムと等量に合わせるために少量の平衡緩衝液で
希釈した後、同一の第２カラム上に再注入する。
【００４２】第１カラムの吸着部位をｖＷＦと競争した
汚染物及び第ＶＩＩＩ因子が第１クロマトグラフィー段
階でほとんど除去されたので、第２カラムの結合容量は
ずっと大きく：３２０ＵのｖＷＦ Ａｇ／ｍｇゲルであ
る。
汚染物及び第ＶＩＩＩ因子が第１クロマトグラフィー段
階でほとんど除去されたので、第２カラムの結合容量は
ずっと大きく：３２０ＵのｖＷＦ Ａｇ／ｍｇゲルであ
る。
【００４３】緩衝液のＮａＣｌ濃度を０．１７Ｍに上げ
ることによりｖＷＦを脱着する。
ることによりｖＷＦを脱着する。
【００４４】この第２クロマトグラフィーにより、前回
の８−１０倍の濃縮比が得られ、限外濾過による追加の
濃縮段階を必要としない。例えば標準法を用いて、溶離
物が以下のｖＷＦ量又は活性を含むことがわかる： −抗原（Ａｇ） ８８±９ＩＵ
／ｍｌ −リストセチンコファクター（ＲＣｏ） ９７±１９Ｉ
Ｕ／ｍｌ −コラーゲン結合活性（ＣＢＡ） １４９±１３Ｉ
Ｕ／ｍｌ −高分子量多量体（≧４多量体） ７９％ ＣＢＡ単位（コラーゲン活性）は、Ｂｒｏｗｎ及びＢｏ
ｓａｋにより記載されているＥＬＩＳＡにより定量する
（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９８６，４３：３０３）。
国際単位を用いて値を表すために参照として、第２英国
標準規格に対して検量線を作成した標準血漿を用いた。
の８−１０倍の濃縮比が得られ、限外濾過による追加の
濃縮段階を必要としない。例えば標準法を用いて、溶離
物が以下のｖＷＦ量又は活性を含むことがわかる： −抗原（Ａｇ） ８８±９ＩＵ
／ｍｌ −リストセチンコファクター（ＲＣｏ） ９７±１９Ｉ
Ｕ／ｍｌ −コラーゲン結合活性（ＣＢＡ） １４９±１３Ｉ
Ｕ／ｍｌ −高分子量多量体（≧４多量体） ７９％ ＣＢＡ単位（コラーゲン活性）は、Ｂｒｏｗｎ及びＢｏ
ｓａｋにより記載されているＥＬＩＳＡにより定量する
（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９８６，４３：３０３）。
国際単位を用いて値を表すために参照として、第２英国
標準規格に対して検量線を作成した標準血漿を用いた。
【００４５】１．６９というＣＢＡ／Ａｇ比は、ｖＷＦ
の活性が十分に保存されていることを示す。これは、高
分子量多量体の含有パーセントが高い（７９％）ことと
一致し、血漿からの本来の含有率（７０％）に匹敵す
る。
の活性が十分に保存されていることを示す。これは、高
分子量多量体の含有パーセントが高い（７９％）ことと
一致し、血漿からの本来の含有率（７０％）に匹敵す
る。
【００４６】このｖＷＦ溶離物の電気泳動分析により、
フィブロネクチン及びインター−α−トリプシンインヒ
ビター、セリンプロテアーゼインヒビターによる少量の
汚染が明らかになる。
フィブロネクチン及びインター−α−トリプシンインヒ
ビター、セリンプロテアーゼインヒビターによる少量の
汚染が明らかになる。
【００４７】その後第２ｖＷＦ溶離物につき、前カラム
の溶離緩衝液を用いて平衡化したゼラチン−セファロー
ス ＣＬ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラム上の第３
精製段階を行い、フィブロネクチンを除去する。
の溶離緩衝液を用いて平衡化したゼラチン−セファロー
ス ＣＬ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラム上の第３
精製段階を行い、フィブロネクチンを除去する。
【００４８】このアフィニティークロマトグラフィーゲ
ルのフィブロネクチン保持容量は＞５ｍｇ／ｍｌであ
り、この汚染物をｖＷＦ留分中に検出できない量（＜４
ｍｇ／ｌ）に減少させることができる。
ルのフィブロネクチン保持容量は＞５ｍｇ／ｍｌであ
り、この汚染物をｖＷＦ留分中に検出できない量（＜４
ｍｇ／ｌ）に減少させることができる。
【００４９】本発明の精製ｖＷＦはこの最終段階の濾液
中に存在し、直接調剤して凍結乾燥することができる。
中に存在し、直接調剤して凍結乾燥することができる。
【００５０】最終生成物の電気泳動分析で、もはや汚染
物は検出されない。ｖＷＦ含有量は２０５Ｕ Ａｇ／ｍ
ｌ蛋白質であり、その特異的活性は３４５Ｕ ＣＢＡ／
ｍｇ蛋白質、及び１８６−２２０Ｕ ＲＣＯ／ｍｇ蛋白
質である。
物は検出されない。ｖＷＦ含有量は２０５Ｕ Ａｇ／ｍ
ｌ蛋白質であり、その特異的活性は３４５Ｕ ＣＢＡ／
ｍｇ蛋白質、及び１８６−２２０Ｕ ＲＣＯ／ｍｇ蛋白
質である。
【００５１】最初の血漿に対する全精製度は、＞１０，
０００倍である。
０００倍である。
【００５２】電気泳動分析（ＳＤＳ−アガロース及びバ
ンドの走査）は、この精製法により得られたｖＷＦが６
５−８０％の高分子量多量体を含む、すなわち最初の血
漿中の７０％という含有量に匹敵することを示す。
ンドの走査）は、この精製法により得られたｖＷＦが６
５−８０％の高分子量多量体を含む、すなわち最初の血
漿中の７０％という含有量に匹敵することを示す。
【００５３】液体の状態の濃厚液の安定性を、室温にて
２４時間調べた：蛋白質分解の兆候又は特異的活性の変
化は検出できなかった。
２４時間調べた：蛋白質分解の兆候又は特異的活性の変
化は検出できなかった。
【００５４】非−活性化部分トロンボプラスチン時間
（ＮＡＰＴＴ）などの従来の試験を用いて、トロンボゲ
ン活性のないことを確認した。トロンビン、ＰＫＡ及び
カリクレインは検出されなかった。
（ＮＡＰＴＴ）などの従来の試験を用いて、トロンボゲ
ン活性のないことを確認した。トロンビン、ＰＫＡ及び
カリクレインは検出されなかった。
【００５５】従って、最終ｖＷＦ濃厚液に安定剤を加え
る必要はない。
る必要はない。
【００５６】ＦＶＩＩＩ製造法の副生成物としてｖＷＦ
を回収するために特別に意図された精製法の設計の可能
性は、フォン・ビルブラント病の治療のために標準化し
た純度の高い、非常に有効な治療用濃厚液の製造を初め
て可能にする。
を回収するために特別に意図された精製法の設計の可能
性は、フォン・ビルブラント病の治療のために標準化し
た純度の高い、非常に有効な治療用濃厚液の製造を初め
て可能にする。
【００５７】本発明の主たる特徴及び態様は、以下の通
りである。
りである。
【００５８】１．連続３クロマトグラフィー段階によ
る、血漿の低温沈澱留分からの、高分子量多量体の豊富
なヒト フォン・ビルブラント因子の標準化高純度濃厚
液の製造法において、最初の２段階がＤＥＡＥ基の結合
した大孔ビニルポリマー樹脂上のイオン交換クロマトグ
ラフィーであり、第３段階がゼラチン−セファロース上
のアフィニティークロマトグラフィーであることを特徴
とする方法。
る、血漿の低温沈澱留分からの、高分子量多量体の豊富
なヒト フォン・ビルブラント因子の標準化高純度濃厚
液の製造法において、最初の２段階がＤＥＡＥ基の結合
した大孔ビニルポリマー樹脂上のイオン交換クロマトグ
ラフィーであり、第３段階がゼラチン−セファロース上
のアフィニティークロマトグラフィーであることを特徴
とする方法。
【００５９】２．第１項に記載の方法において、出発材
料が水酸化アルミニウム上で精製した血漿の低温沈澱留
分であることを特徴とする方法。
料が水酸化アルミニウム上で精製した血漿の低温沈澱留
分であることを特徴とする方法。
【００６０】３．第１項に記載の方法において、第１及
び第２イオン交換樹脂が、０．０１Ｍのクエン酸三ナト
リウム、０．１１Ｍの塩化ナトリウム、０．００１Ｍの
クエン酸カルシウム、０．１２Ｍのグリシン及び０．０
１６ＭのＬ−リシンを含む緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
−ＦｒａｃｔｏｇｅｌRＴＳＫ６５０であることを特徴
とする方法。
び第２イオン交換樹脂が、０．０１Ｍのクエン酸三ナト
リウム、０．１１Ｍの塩化ナトリウム、０．００１Ｍの
クエン酸カルシウム、０．１２Ｍのグリシン及び０．０
１６ＭのＬ−リシンを含む緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
−ＦｒａｃｔｏｇｅｌRＴＳＫ６５０であることを特徴
とする方法。
【００６１】４．第１項に記載の方法において、血漿の
精製低温沈澱留分を第１イオン交換クロマトグラフィー
カラムにかけ、緩衝液の塩化ナトリウム濃度を０．１４
−０．１５Ｍに上げることにより第１のフォン・ビルブ
ランド因子含有留分を溶離することを特徴とする方法。
精製低温沈澱留分を第１イオン交換クロマトグラフィー
カラムにかけ、緩衝液の塩化ナトリウム濃度を０．１４
−０．１５Ｍに上げることにより第１のフォン・ビルブ
ランド因子含有留分を溶離することを特徴とする方法。
【００６２】５．第１項に記載の方法において、第１ク
ロマトグラフィーからのフォン・ビルブラント因子含有
溶離液を第２イオン交換クロマトグラフィーカラムにか
け、緩衝液の塩化ナトリウム濃度を０．１５−０．１７
Ｍに上げることによりフォン・ビルブラント因子を溶離
することを特徴とする方法。
ロマトグラフィーからのフォン・ビルブラント因子含有
溶離液を第２イオン交換クロマトグラフィーカラムにか
け、緩衝液の塩化ナトリウム濃度を０．１５−０．１７
Ｍに上げることによりフォン・ビルブラント因子を溶離
することを特徴とする方法。
【００６３】６．第１項に記載の方法において、第２ク
ロマトグラフィーからの溶離物を、前クロマトグラフィ
ー段階からの溶離緩衝液で平衡化したゼラチン−セファ
ロースクロマトグラフィーにかけ、残留フィブロネクチ
ンをカラム上に選択的に吸着させることを特徴とする方
法。
ロマトグラフィーからの溶離物を、前クロマトグラフィ
ー段階からの溶離緩衝液で平衡化したゼラチン−セファ
ロースクロマトグラフィーにかけ、残留フィブロネクチ
ンをカラム上に選択的に吸着させることを特徴とする方
法。
【００６４】７．第１項に記載の方法において、ゼラチ
ン−セファロースカラムの濾液中に存在するフォン・ビ
ルブラント因子を集め、調剤し、凍結乾燥することを特
徴とする方法。
ン−セファロースカラムの濾液中に存在するフォン・ビ
ルブラント因子を集め、調剤し、凍結乾燥することを特
徴とする方法。
【００６５】８．フォン・ビルブラント因子濃厚液にお
いて、第１項に従って得られた、純度が非常に高く、特
異的活性が非常に高く（ＲＣｏ及びＣＢＡ単位で測
定）、高分子量多量体の含有量が高いことを特徴とする
濃厚液。
いて、第１項に従って得られた、純度が非常に高く、特
異的活性が非常に高く（ＲＣｏ及びＣＢＡ単位で測
定）、高分子量多量体の含有量が高いことを特徴とする
濃厚液。
【００６６】９．第８項に記載のフォン・ビルブラント
因子濃厚液において、存在する抗原の量に対する活性比
（ＣＢＡ単位で測定）が少なくとも１．５であることを
特徴とする濃厚液。
因子濃厚液において、存在する抗原の量に対する活性比
（ＣＢＡ単位で測定）が少なくとも１．５であることを
特徴とする濃厚液。
【００６７】１０．第８又は９項に記載のフォン・ビル
ブラント因子濃厚液において、高分子量多量体の含有パ
ーセントが少なくとも６５−８０％であることを特徴と
する濃厚液。
ブラント因子濃厚液において、高分子量多量体の含有パ
ーセントが少なくとも６５−８０％であることを特徴と
する濃厚液。
【図１】図１は、ｖＷＦ精製留分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
１列：低温沈澱；２列：ＳＤ−処理低温沈澱；３列：非
結合ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ留分；４列：第１ｖ
ＷＦ溶離物；５列：第２ｖＷＦ溶離物；６列：非結合ゼ
ラチン留分；７列：標準。Ｆｂｎ＝フィブロネクチン；
ＩｇＧ＝免疫クロブリン；Ａｌｂ＝アルブミン。
１列：低温沈澱；２列：ＳＤ−処理低温沈澱；３列：非
結合ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ留分；４列：第１ｖ
ＷＦ溶離物；５列：第２ｖＷＦ溶離物；６列：非結合ゼ
ラチン留分；７列：標準。Ｆｂｎ＝フィブロネクチン；
ＩｇＧ＝免疫クロブリン；Ａｌｂ＝アルブミン。
【図２】図２は、ｖＷＦ精製留分の多量体分布。１列：
正常な血漿；２列：低温沈澱；３列：ＳＤ−処理低温沈
澱；４列：非結合ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ留分；
５列：第１ｖＷＦ溶離物；６列：第２ｖＷＦ溶離物；７
列：非結合ゼラチン留分。
正常な血漿；２列：低温沈澱；３列：ＳＤ−処理低温沈
澱；４列：非結合ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ留分；
５列：第１ｖＷＦ溶離物；６列：第２ｖＷＦ溶離物；７
列：非結合ゼラチン留分。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 欧州特許出願公開359593（ＥＰ，Ａ
１)
Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．48
（６），ｐ．641−652（1987)
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ.
25（11），ｐ．3146−3155（1986)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 14/745
C07K 1/18
C07K 1/22
ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｗ
ＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 水酸化アルミニウムで予備精製した寒冷
沈降血漿画分を出発原料とするフォン・ビルブラント因
子の標準化濃厚液の製造方法であって、 （ｉ） 組み合わさった３つの連続するクロマトグラフ
ィー段階を含み、最初の２つの段階が大多孔質で、か
つ、ＤＥＡＥ基がグラフトしたビニルポリマー型樹脂に
よるイオン交換クロマトグラフィーであり、そして第三
段階がゼラチンがグラフトしたゲルによるアフィニティ
ークロマトグラフィーであること、ならびに （ii） 前記３つのクロマトグラフィーを、クエン酸三
ナトリウム、塩化ナトリウム、グリシン及びリシンを含
有する一定の緩衝液で行うこと、 を特徴とする方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法により得られ、その
まま直接人体に注入可能であり、かつ、存在する抗原の
量に対する活性の比（ＣＢＡ単位で測定）が少なくとも
１．５であり、そして高分子量多量体の含有パーセント
が少なくとも６５％であることを特徴とする出血時の出
血時間を短縮するためのフォン・ビルブラント因子濃厚
液。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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