CZ283633B6

CZ283633B6 - Způsob průmyslové přípravy standardizovaného koncentrátu lidského von Willebrandova faktoru o velmi vysoké čistotě, vhodného pro terapeutické použití

Info

Publication number: CZ283633B6
Application number: CS92568A
Authority: CZ
Inventors: Thierry Burnouf; Miryana Burnouf-Radosevich
Original assignee: Centre Regional De Transfusion Sanguine De Lille
Priority date: 1991-03-08
Filing date: 1992-02-26
Publication date: 1998-05-13
Also published as: ES2121830T3; SK279533B6; ATA43692A; UA27732C2; DE69227055T2; DE122009000034I2; CA2062340C; US5408039A; LT3175B; ITTO920189A1; DE122009000034I1; JP3435668B2; IT1256692B; AT407115B; EP0503991B1; BR9200770A; PL293738A1; AU645172B2; HU9200767D0; PL168353B1

Abstract

Způsob čištění lidského von Willebrandova faktoru z kryoprecipitované frakce plasmy zahrnuje kombinaci tří chromatografických separací. Získaný koncentrát má velmi vysokou specifickou aktivitu a vysoký podíl vysokomolekulárních multimerů. Koncentrát má zejména terapeutické použití.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy standardizovaného vysoce čistého koncentrátu lidského von Willebrandova faktoru s vysokým podílem vysokomolekulárních multimerů a takto získaného koncentrátu, který se hodí zejména pro terapeutické účely.

Dosavadní stav techniky

Von Willebrandův faktor (vWF) je největší známá molekula, která je v oběhu v plazmě. Existuje jako řada velkých multimerů, spojených disulfidickými můstky, jejichž základní jednotka má molekulovou hmotnost asi 260 kDa (kilodalton). Nejmenší formou vWF v plazmě je dimer o asi 440 až 500 kDa a největší formy představují multimery tohoto dimeru s molekulovými hmotnostmi, dosahujícími až 20 milionů daltonů. Seskupení navzájem spojených jednotek může být specifické pro buňky, v nichž je obsaženo, přičemž vWF je syntetizován a polymerován v megakaryocytech a endotheliálních buňkách.

Tento faktor hraje podstatnou roli při hemostáze prostřednictvím dvou různých funkcí: transportuje a stabilizuje faktor VIII v krevním řečišti a jako adhezní protein umožňuje rozptýlení, ulpívání a shlukování krevních destiček na vaskulámím subendotheliu, a tak přispívá k rychlému hojení poškozených cév.

Vrozený nedostatek vWF nebo strukturní anomálie tohoto faktoru vyvolává von Willebrandovu chorobu, která má zpočátku formu hemorrhagie, zejména kůže a sliznic. Klinické formy této nemoci jsou velmi různorodé a působí těžké problémy v případech chirurgického zákroku. Léčba Willebrandovy nemoci je nezbytná pro nápravu anomálií primární hemostázy (doba krvácení) a srážlivosti (aktivní cefalinová doba a srážecí aktivita faktoru VIII).

Nemoc se léčí substituční terapií deriváty lidské plazmy, obohacené vWF (například kryoprecipitovanou frakcí plazmy nebo koncentráty faktoru VIII, obsahujícími dostatečné množství vWF). Tyto produkty však nejsou standardizovány pro léčbu von Willebrandovy nemoci. Kromě toho málo čištěné frakce krevní plazmy, zejména kryoprecipitát, nejsou bez rizika virové kontaminace, poněvadž často nejsou podrobovány účinné virální inaktivaci. Navíc vyvolávají přebytek kontaminujících proteinů, které pacient nepotřebuje a které mohou po opakovaných injekcích způsobovat imunologické reakce.

Čištěný faktor VIII je možno naproti tomu podrobit účinné virální inaktivaci, ale proces jeho čištění byl optimalizován pro léčbu hemofilie A a nikoli nedostatku vWF. Nedávno vyvinuté a stále účinnější procesy, jako je imunoafinitní nebo ionexové čištění, používané pro přípravu faktoru VIII, ve skutečnosti produkují koncentráty, které již neobsahují vWF v množství, dostatečném pro účinnou léčbu von Willebrandovy nemoci.

K uspokojení této potřeby účinné léčby von Willebrandovy nemoci vyvinul přihlašovatel nový průmyslový postup čištění vWF, umožňující optimalizovat izolaci různých plazmatických molekul. Umožňuje zejména jednostupňovou přípravu koncentrátu faktoru VIII (postupem podle EP-A-0 359 593) a získávání frakce vWF ze stejné šarže kryoprecipitátu, tedy optimální využití lidské plazmy. Takto získaná frakce vWF se čistí dalšími dvěma chromatografickými stupni, poskytujícími koncentrát vWF o velmi vysoké čistotě.

-1 CZ 283633 B6

Čištění vWF je v důsledku složitosti jeho molekuly obtížné. Byly již popsány metody v malém měřítku, tj. 5 až 2000 ml pro účely analytických studií (Thorell et al., Thromb. Res. 1984, 35: 431-450), ale nebylo možno tyto metody přípravy vWF adaptovat na průmyslové měřítko. Kromě toho nebylo předpokládáno co nej lepší využití kryoprecipitátu výrobou vWF vedle WVIII.

Von Willibrandův faktor byl čištěn diferenční rozpustností na sulfatovaných sloučeninách v přítomnosti glycinu (Bemtorp et al., Vox Sang. 1989, 56: 212), sulfatovaných sloučeninách (Winkelman et al., Vox Sang. 1989, 57: 97) a s použitím různých metod chromatografického dělení, jako je použití molekulárních sít (Perret et al., Haemostas. 1982, 48: 295). Tyto metody však buď poskytují nízký výtěžek vWF, nebo mají nízkou kapacitu gelu, nebo neumožňují současnou izolaci FVIII a vWF, a jsou tedy méně zajímavé pro průmyslovou aplikaci.

Bemtorp et al. (Vox Sang. 1989, 56: 212) kromě toho získávají vWF o nízké čistotě 45 U Ag/mg (str. 213), zatímco přihlašovatel dosahuje 205 U Ag/mg proteinu. Podobně Winkelman et al. (Vox Sang. 1989, 57: 97) získává 10 U Ag/mg proteinu (str. 101).

Perret et al. (Haemostatis 1984, 14: 289) provádí stupeň defibrinace (k odstranění fibrinogenu ve formě molekul fibrinu) s použitím vápníku a rovněž enzymů z hadího jedu; tato příprava je tedy zjevně nevhodná pro terapeutické účely. Kromě toho zařízení pro gelovou filtraci, jaké použil, je sotva použitelné pro průmyslové měřítko, poněvadž umožňuje pouze průtok 10 cm/h nebo méně a je velmi náchylné k ucpávání, zvláště v přítomnosti fibrinogenu a fibronektinu. Faktor čištění v tomto chromatografickém systému je rovněž obvykle nízký vlivem nízkého rozlišení proteinů.

Austen et al. (Throm. Haemostas. 1982, 48: 46) také získává koncentrát o nízké čistotě (9 U Ag/mg proteinu) a s relativně nízkým výtěžkem, pravděpodobně v důsledku použitých drastických podmínek chromatografie (pH 5,5).

Harrison et al. (Thromb. Res. 1988, 50: 295) používá jako chromatografickou matrici dextransulfát-sepharosu; tento materiál má nízkou retenční kapacitu nebo vWF. V důsledku toho získává preparát vWF s nízkou specifickou aktivitou: 2 až 4 U/mg proteinu (str. 301).

Většina těchto produktů konečně obsahuje poměrně velký podíl denaturovaných nebo inaktivních forem vWF, což dokazuje kofaktorová aktivita ristocetinu (Rco) antigen řádově 0,08 až 0,9 (Lawrie et al., Br. J. Haematol. 1989, 73: 100). Z toho důvodu jsou méně účinné při terapeutickém použití při von Willebrandově nemoci. Naproti tomu postup přihlašovatele umožňuje získávat vWF s poměrem Rco/antigen vyšším než jedna, srovnatelným s nativním vWF z normální plazmy.

Podstata vynálezu

Konkrétně je předmětem vynálezu způsob přípravy standardizovaného vysoce čistého koncentrátu lidského von Willebrandova faktoru s vysokým podílem vysokomolekulámích multimerů z kryoprecipitované frakce plazmy, předčištěné na hydroxidu hlinitém, jehož podstata spočívá vtom, že zahrnuje tři po sobě následující chromatografické stupně, z nichž první dva představují iontově výměnnou chromatografii na vinylické polymemí pryskyřici s velkými póry, tedy póry s vylučovací mezí molekulové hmotnosti nad 10⁶ dalton, s navázanými diethylaminoethylskupinami, a třetí spočívá v afinitní chromatografii na gelu želatina-sepharosa.

Dalším předmětem vynálezu je koncentrát von Willebrandova faktoru, připravený výše popsaným způsobem, jehož podstata spočívá v tom, že vykazuje vysokou specifickou aktivitu nad 300 U CBA/mg proteinu nebo 180 U RCO/mg proteinu, jeho poměr aktivity k antigenů je alespoň 1,5 a jeho obsah vysokomolekulámích multimerů je alespoň 65 %.

-2 CZ 283633 B6

Způsob podle vynálezu umožňuje získávat vWF jako vedlejší produkt při výrobě vysoce čistého FVIII z velkých objemů plazmy a tak optimalizovat využití kryoprecipitátu. Vysokomolekulámí multimery, kterými se koncentrát podle vynálezu obohacuje, souvisejí s biologickou aktivitou vWF. Výchozím materiálem je kryoprecipitovaná frakce lidské plazmy, podrobená klasickému předběžnému čištění adsorpcí na hydroxid hlinitý. Tento materiál se pak podrobí virální inaktivaci, například působením rozpouštědla-detergentu, a pak se čistí.

Postup čištění podle vynálezu zahrnuje kombinaci tří po sobě následujících stupňů chromatografíe vedlejšího produktu z výroby FVIII, z nichž první dva spočívají v ionexové a třetí v afinitní chromatografii.

Obě ionexové chromatografíe se provádějí na stejné pryskyřici z vinylického polymeru, na němž jsou navázány diethylaminoethylové (DEAE) skupiny, konkrétně na kolonách DEAE-Fractogelu TSK 650 (Měrek), ekvilibrovaných tlumivým roztokem, obsahujícím 0,01M citrát sodný, 0,11M chlorid sodný, 0,001M chlorid vápenatý, 0,12Mglycin a 0,016M lysin, o pH 7.

DEAE-Fractogel TSK 650 je syntetický hydrofilní gel. Nosičem je kopolymer oligoethylenglykolu, glycidinmethakrylátu a pentaerythritol-dimethakrylátu, na nějž jsou navázány diethylaminoethylové skupiny, tj. -O-CH₂-CH₂N⁺ (C₂H₅)₂HC1, díky nimž tvoří slabě alkalický měnič aniontů. DEAE-Fractogel TSK 650 je dostupný ve dvou velikostech částic (po zvlhčení vodou): typ S (0,025 až 0,050 mm) a typ M (0,045 až 0,090 mm). K provedení vynálezu jsou vhodné oba typy.

Kryoprecipitovaná frakce plazmy, která byla podrobena prepurifikaci a virální inaktivaci obvyklým způsobem, se nanáší na první chromatografickou kolonu, která zadržuje velký podíl vWF. vWF se pak eluuje zvyšováním koncentrace chloridu sodného v tlumivém roztoku na 0.14 až 0,15 M.

Takto vymytá frakce, obohacená vWF, se aplikuje na druhou chromatografickou kolonu za stejných podmínek jako u první kolony. Protože velké množství proteinů (zejména FVIII a fibronektinu), které soutěžily o adsorpční místa, bylo již z této frakce odstraněno v průběhu prvního chromatografického stupně, je kapacita druhé kolony pro adsorpci vWF výhodně mnohem větší. Po odstranění filtrátu a promytí kolony ekvilibračním pufrem se adsorbovaný vWF vymývá zvyšováním koncentrace chloridu sodného v pufru na 0,15 až 0,17 M. Díky vysoké kapacitě a účinnosti pryskyřice DEAE-Fractogel pro vWF je možno vWF z kolony eluovat s velmi vysokou specifickou aktivitou (vyšší než 150 U Rco/ml). Není tedy nutno aplikovat mechanické síly ultrafiltrace, které by vyžadovalo koncentrování produktu.

Takto eluovaná frakce se podrobuje afinitní chromatografii na gelu, odvozeném od želatiny, ve stejném ekvilibračním pufru, takže není nutno modifikovat složeni solí například dialýzou nebo ultrafiltrací; tato kolona je nutná k zadržení molekul zbytkového fibronektinu, které ještě kontaminují vWF. Výběr želatinového gelu není rozhodující; rovnocenně je možno použít želatinovou Sepharosu, želatinový Ultrogel, želatinový Spherodex a želatinový Fractogel. Nejvýhodnější se jeví želatinová Sepharosa, poněvadž za podmínek tohoto procesu fixuje 5 až 10 mg fibronektinu/ml gelu.

Za použitých podmínek se vysoce čištěný vWF neváže na gel a je vymýván ve filtrátu; poněvadž při použité afinitní chromatografii nedochází k významnému ředění frakce vWF, je produkt přímo k dispozici bez potřeby zahušťování například ultrafiltrací. Vlivem nepřítomnosti proteolytických enzy mů je finální produkt velmi stabilní a během sterilní filtrace a lyofilizace nevyžaduje přítomnost stabilizátorů.

-3 CZ 283633 B6

Koncentrát von Willebrandova faktoru, získaný způsobem podle vynálezu, má výjimečně vysoký faktor čištění, dosahující více než lOOOOnásobku ve vztahu k původní plazmě, a jeho specifická aktivita je 345 U CBA/mg proteinu (měrová jednotka pro vazebnou aktivitu kolagenu) a více než 100 U Rco/mg proteinu (jednotka aktivity ristocetinového kofaktoru). Příspěvek každého chromatografického stupně k čištění vWF je ilustrován na obr. 1.

Zlepšování kvality produktu v průběhu jednotlivých stupňů čištění bylo konkrétně sledováno jako funkce podílu vy sokomolekulámích multimerů (molekulární forma vWF s vysokou biologickou aktivitou) elektroforetickou analýzou.

Tato analýza ukazuje progresivní obohacování o multimery > 4 (obr. 1), které představují 79 % polymerů vWF, přestože při kryoprecipitaci se jich polovina ztratí. Nepředpokládalo se, že chromatografie na DEAE-Fractogelu TSK 650 bude takto podporovat selektivní retenci velmi velkých multimerů a odstraňovat z filtrátu formy o malé velikosti, abnormální struktuře (u nichž došlo k částečné proteolýze) a nízké aktivitě.

Standardizovaný koncentrát vWF o vysoké čistotě, vysoké specifické aktivitě a vysokém obsahu vysokomolekulámích multimerů, získaný způsobem podle vynálezu, je proto velmi vhodný pro terapeutické použití při různých formách von Willebrandovy nemoci, jak bylo potvrzeno předběžnými klinickými zkouškami.

Předběžné klinické zkoušky ukázaly, že tento koncentrát způsobuje účinné zkrácení doby krvácení při hemorrhagiích.

Zkoušky in vitro potvrdily identitu jeho biochemických a fyziologických vlastností s nativní molekulou, zejména v případě schopnosti fixace krevních destiček v perfuzním přístroji a schopnosti vázat in vivo endogenní faktor VIII.

Vysoká čistota koncentrátu von Willebrandova faktoru, získaného způsobem podle vynálezu, rovněž umožňuje předpokládat jeho různé laboratorní aplikace (pro jemnou strukturní analýzu, studium funkcionality, diagnostiku apod.) a použití pro výrobu specifických protilátek.

Koncentrát podle vynálezu může být rovněž používán jako stabilizátor při produkci faktoru VIII buňkami, transformovanými genetickým inženýrstvím, i při čištění takto vyrobeného faktoru VIII.

Přehled obrázků na vý kresech

Obr. 1 znázorňuje SDS-PAGE frakcí vWF během čištění. Pruh 1: kryoprecipitát, pruh 2: kryoprecipitát, ošetřený rozpouštědlem-detergentem, pruh 3: frakce nenavázaná na DEAEFractogel, pruh 4: první eluát vWF, pruh 5: druhý eluát vWF, pruh 6: frakce, nenavázaná na želatinový gel, pruh 7: standardy.

Tbn = fibronektin

IgG = imunoglobuliny

Alb = albumin

Obr. 2 představuje distribuci multimerů vWF ve frakcích během čištění. Pruh 1: normální plazma, pruh 2: kryoprecipitát, pruh 3: kryoprecipitát, ošetřený rozpouštědlem-detergentem. pruh 4: frakce, nenavázaná na DEAE-Fractogel, pruh 5: první eluát vWF. pruh 6: druhý eluát vWF, pruh 7: frakce, nenavázaná na želatinový gel.

-4 CZ 283633 B6

Příklad provedení wnálezu

Výchozí materiál

Kryoprecipitát se připraví z čerstvé plazmy, odebrané v přítomnosti citrátu sodného (4 %) nebo antikoagulačního roztoku CPD (citrát, fosfát, dextróza) a zmrazené nanejvýš 6 h po získání. Plazma se hluboce zmrazí na -60 °C a pak se uchovává při -35 °C. Šarže plazmy obsahují 1800 až 2000 1 a pro každé provedení procesu se přeskupí do šarží po 4000 1. Za účelem roztavení se plazma umístí na 12 h do teplotně regulované komory, kde se pomalu pravidelně ohřeje na -7 °C, a pak se roztaví za stálého míchání v termostaticky kontrolované uzavřené nádobě při 0 až 2 °C. Kryoprecipitát (který představuje asi 9 g/l plazmy) se získá odstředěním za studená.

Kryoprecipitát, získaný po odstředění, se znovu rozpustí a podrobí adsorpci na hydroxidu hlinitém k odstranění některých nečistit, konkrétně složek prothrombinového komplexu (zejména faktoru VII) a faktoru ΧΠ. Supematant se pak ochladí na 15 °C (čímž se částečně odstraní fibrinogen a fibronektin).

Tato operace umožňuje získat z kryoprecipitátu 80 až 86 % směsi faktoru VIII a von Willebrandova faktoru; specifická aktivita faktoru VIII je 0,7 IU/mg a specifická aktivita vWF představuje 0,6 U Rco/mg (aktivita kofaktoru ristocetinu) a 1,2 U CBA/mg (vazebná aktivita kolagenu).

Virální inaktivace

Roztok, obsahující směs faktoru VIII a von Willebrandova faktoru, se podrobí působení rozpouštědla-detergentu, které, jak známo, účinně likviduje viry s lipidickým obalem (Horowitz et al., Transfusion, 1985, 25: 516) a které zahrnuje inkubaci po dobu 8 h při 25 °C a v přítomnosti 0.3 % tri-n-butylfosfátu (TnBP) a 1 % Tweenu 80.

Po této operaci se získá 95 % aktivity faktoru VIII a von Willebrandova faktoru, měřené v předchozím stupni. E-lektroforézou je možno potvrdit, že vWF je stále v multimemí formě.

Proces chromatograflckého dělení

Čištění vWF je odvozeno z postupu čištění faktoru VIII, popsaného stejným přihlašovatelem vEP-A-0 359 593.

První chromatografie se provádí v koloně DEAE-Fractogelu TSK 650 (typ S nebo M, Měrek). Ekvilibrační pufr obsahuje citrát sodný (0,01 M), chlorid vápenatý (0,001 M), glycin (0,12 M), L-lysin (0,016 M) a chlorid sodný (0,11 Μ). V koloně se zachytí vWF, faktor VIII a fibronektin; kontaminující proteiny (hlavně fibrinogen a některé IgG), zachycené volně nebo nezachycené kolonou, a zbytky z virální inaktivace se odstraní několikanásobným promytím stejným pufrem.

Kolona se používá s lineárním průtokem 100 cm/h. Za těchto podmínek má použitá kolona retenční kapacitu pro vWF přibližně 75 % nastříknutého množství (měřeno jako antigen Ag); zbytek se ztrácí ve filtrátu. Tato vazebná kapacita odpovídá 45 U vWF Ag/ml gelu.

Von Willebrandův faktor se z kolony desorbuje zvýšením koncentrace NaCl v pufru na 0,15 M. Získaná frakce vWF obsahuje 30 až 35 % původního vWF, zatímco 40 % ho zůstává koadsorbováno s faktorem VIII a bude s ním koeluováno dalším zvýšením koncentrace NaCl v pufru na 0,25 M a podrobeno společnému čištění.

-5CZ 283633 B6

Frakce, obsahující vWF, eluovaná z této první kolony, se nastříkne po mírném zředění ekvilibračním pufrem ke snížení iontové síly frakce vWF na ekvivalent 0,11 M chloridu sodného do druhé identické kolony.

Jelikož nečistoty a faktor VIII, které v první koloně soutěžily s vWF o adsorpční místa, byly během prvního chromatografiekého stupně téměř odstraněny, je vazebná kapacita druhé kolony mnohem větší, 320 U vWF Ag/ml gelu.

vWF se desorbuje zvýšením koncentrace NaCl v pufru na 0,17 M.

Tato druhá chromatografie umožňuje koncentrační faktor 8 až 10 vyšší než v prvním stupni, a tak nevyžaduje další zahušťovací operace, například ultrafiltraci. S použitím standardních metod se zjišťují tato množství, resp. aktivity vWF:

antigen (Ag) kofaktor ristocetinu (RCo) vazebná aktivita kolagenu (CBA) vysokomolekulámí multimery (> 4) ± 9 IU/ml ± 19 IU/ml

149 ± 13 IU/ml

79%

Jednotky CBA (vazebná aktivita kolagenu) jsou kvantifikovány pomocí ELISA podle Browna a Bosaka (Thromb. Res., 1986, 43: 303). Pro vyjádření hodnot v mezinárodních jednotkách byla jako kontrola použita standardní plazma, kalibrovaná proti 2. britskému standardu (86/717).

Poměr CBA/Ag rovný 1,69 ukazuje, že aktivita vWF je dobře zachována. To je v souladu s vysokým procentem vysokomolekulámích multimerů (79 %) a vychází příznivě ze srovnání s nativním vWF (70 %) z plazmy.

Elektroforetickou analýzou tohoto eluátu vWF se zjišťuje mírná kontaminace fibronektinem a inter-alfa trypsinovým inhibitorem, serin-proteázovým inhibitorem.

Druhý eluát vWE se pak podrobuje třetímu stupni čištění na koloně želatinové Sepharose CL4B (Pharmacia), ekvilibrované elučním pufrem z předchozí kolony, za účelem odstranění fibronektinu.

Tento afinitní chromatografický gel má retenční kapacitu pro fibronektin větší než 5 mg/ml, což umožňuje snížit množství této nečistoty ve frakci vWF na nedetekovatelné množství (pod 4 mg/1).

Čištěný vWF podle vynálezu se nachází ve filtrátu z tohoto posledního stupně a je vhodný k přímému použití a lyofilizaci.

Elektroforetickou analýzou finálního produktu již nelze detekovat žádné nečistoty. Obsah vWF je 205 U Ag/mg proteinu a jeho specifická aktivita je 345 U CBA/mg proteinu a 186 až 220 U RCo/mg proteinu.

Celkový stupeň čištění ve vztahu k původní plazmě je lOOOOnásobný.

Elektroforetická analýza (SDS-agaróza a skanování pásů) ukazuje, že vWF, získaný tímto postupem čištění, je z 65 až 80 % tvořen vysokomolekulámími multimery; tento podíl je srovnatelný s původní plazmou, kde činí 70 %.

Stabilita koncentrátu byla studována po dobu 24 h v kapalném stavu při teplotě místnosti; nebyly nalezeny známky proteolytické aktivity, ani změny specifické aktivity.

-6CZ 283633 B6

Absence thrombogenní aktivity v koncentrátu byla potvrzena konvenčními testy, jako je NAPTT (non-activated partial thromboplast time). Nebylo možno detekovat thrombin, PAK ani kallikrein.

Získaný finální koncentrát vWF tedy nevyžaduje přídavek stabilizátoru.

Průmyslová využitelnost

Čištění vWF specifickým postupem, při němž se vWF získává jako vedlejší produkt výroby faktoru VIII, poprvé umožňuje výrobu vysoce čistého, vysoce účinného terapeutického koncentrátu, standardizovaného pro léčbu von Willebrandovy nemoci.

Claims

1. Způsob přípravy standardizovaného vysoce čistého koncentrátu lidského von Willebrandova faktoru s vysokým podílem vysokomolekulámích multimerů z kryoprecipitované frakce plazmy, předčištěné na hydroxidu hlinitém, vyznačující se tím, že zahrnuje tři po sobě následující chromatografické stupně, z nichž první dva představují iontově výměnnou chromatografíí na vinylické polymemí pryskyřici s velkými póry, tedy póry s vylučovací mezí molekulové hmotnosti nad 10⁶ dalton, s navázanými diethylaminoethylskupinami, a třetí spočívá v afinitní chromatografíí na gelu želatina-sepharosa.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že první a druhou iontově výměnnou pryskyřicí je vinylový polymer se zakotvenými diethylaminoethylskupinami DEAEFractogel TSK 650, ekvilibrovaný pufrem, obsahujícím 0,01 M citrátu sodného, 0,11 M chloridu sodného, 0,001 M chloridu vápenatého, 0,12 M glycinu a 0,016 M L-lysinu.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že předčištěná kryoprecipitovaná frakce plazmy se aplikuje na první iontově výměnnou chromatografickou kolonu a první frakce, obsahující von Willebrandův faktor, se eluuje zvýšením koncentrace chloridu sodného v pufru na 0,14 až 0,15 M.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že eluát z první chromatografie, obsahující von Willebrandův faktor, se aplikuje na druhou iontově výměnnou chromatografickou kolonu a von Willebrandův faktor se eluuje zvýšením koncentrace chloridu sodného v pufru na 0,15 až 0,17 M.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že eluát z druhé chromatografie se zpracuje chromatografíí na gelu želatina-sepharosa, ekvilibrovaném elučním pufrem z předchozího chromatografického stupně k selektivní adsorpci zbytkového fibronektinu.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že von Willebrandův faktor, přítomný ve filtrátu z kolony gelu želatina-sepharosa, se shromáždí, rozdělí a lyofilizuje.

7. Koncentrát von Willebrandova faktoru, připravený způsobem podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že vykazuje vysokou specifickou aktivitu nad 300 U CBA/mg proteinu nebo 180 U RCO/mg proteinu, jeho poměr aktivity k antigenu je alespoň 1,5 a jeho obsah vysokomolekulámích multimerů je alespoň 65 %.