HU215098B

HU215098B - Eljárás igen nagy tisztaságú, gyógyászatilag alkalmazható, standardizált humán von Willebrand-faktor koncentrátum előállítására nagyüzemi méretekben

Info

Publication number: HU215098B
Application number: HU9200767A
Authority: HU
Inventors: Thierry Burnouf; Miryana Burnouf-Radosevich
Original assignee: Centre Regional De Transfusion Sanguine De Lille
Priority date: 1991-03-08
Filing date: 1992-03-06
Publication date: 1998-09-28
Also published as: EG20300A; IT1256692B; PL293738A1; EP0503991B1; JPH0597696A; CA2062340A1; DE69227055D1; RU2088590C1; ITTO920189A1; ES2121830T3; AU1113192A; FI920992A0; IL101043A; DE122009000034I1; ZA921430B; US5408039A; FI920992A; NZ241701A; FI106721B; EP0503991A1

Description

A találmány tárgya eljárás nagy tisztaságú, nagy specifikus aktivitású, nagy móltömegű multimerekben gazdag, standard humán von Willebrand-faktor koncentrátum előállítására ipari méretekben. A találmány szerinti eljárással előállított koncentrátum gyógyászati célokra alkalmazható.

A von Willebrand-faktor (vWF) a legnagyobb ismert molekula, amely a plazmában kering. Ez a molekula diszulfid-kötéssel kapcsolódó, nagyméretű multimerek sorozataként fordul elő, amelyek alapegysége körülbelül 260 kilodalton (Kda) móltömegű. A vWF legkisebb formája a plazmában egy dimer, amelynek körülbelül 440-500 Kda a móltömege, míg a dimer multimeijeinek legnagyobb formái a 200 millió dalton móltömeget is elérik. Az összekapcsolódó alegységek sejtspecifikusak lehetnek, a vWF-et a megakarociták és belhámsejtek szintetizálják és polimerizálják.

Ez a faktor alapvető szerepet játszik hemosztázisban két, egymástól elkülönülő funkciója révén: szállítja és stabilizálja a véráramban a VIIL faktort, és mind adhezív protein elősegíti a vérlemezkék szétterülését, kapcsolódását és aggregációját az ér-szubendoteliumban, ezáltal részt vesz a sérült erek gyors gyógyulásában.

Az örökletes vWF-hiány vagy a fenti faktor szerkezeti anomáliája a von Willebrand-betegség kialakulásához vezet, amely kezdetben hemorrágiában (vérzés) nyilvánul meg, különösen a bőrön és a nyálkahártyamembránokon. A fenti betegség klinikai formái rendkívül heterogének és a sebészeti beavatkozás során a legtöbb problémát okozzák. A von Willebrand-betegség kezelése alapvető fontosságú annak érdekében, hogy az elsődleges vérzéscsillapítás (vérzési idő) és a koagulálás (aktivált kefalin idő és VIII. faktor aktivitás) anomáliáit korrigáljuk.

A betegséget vWF-ben dúsított humán plazmaszármazékok (például a plazma krioprecipitált frakciója vagy megfelelő mennyiségű vWF-t tartalmazó VIII. faktor koncentrátumok) helyettesítéses terápiájával kezelik. Azonban ezeket a termékeket nem standardizálták a von Willebrand-betegség kezelésére. Ezenkívül a humán plazma, különösen a krioprecipitátum rosszul tisztított frakciói magukban hordozzák a virális szennyeződés veszélyét, mivel ezeket gyakran nem vetik alá kielégítő vírus-inaktiválási lépésnek. Ezenkívül ezek alkalmazásával túl sok szennyező protein kerül a szervezetbe, ami a beteg számára nem előnyös, és amely több injekció után immunreakciókat okozhat.

A tisztított VIII. faktort ezzel szemben kielégítő vírus-inaktivációs kezelésnek lehet alávetni, de a tisztítási eljárást az A-típusú hemofiliában szenvedő betegek számára optimalizálták, és nem a vWF-deficiensbetegek kezelésére. Valójában a jelenleg kifejlesztett és egyre hatékonyabb eljárások, például az immunaffinitási kromatográfia vagy ioncserélős tisztítás, amelyet a VIII. faktor előállítására használnak, olyan koncentrátumokat eredményeznek, amelyek már nem tartalmaznak elegendő mennyiségű vWF-et ahhoz, hogy a von Willebrand-betegség kezelésére alkalmazhatók lennének.

Tekintettel arra, hogy a von Willebrand-betegség kezelésére hatékony módszert kell találnunk, célunk olyan új, ipari méretű eljárás kifejlesztése volt a vWF tisztítására, amely ugyanakkor optimális hozamot biztosít az egyéb különböző plazmamolekulákból is. Közelebbről, a találmány szerinti eljárás egy lépésben lehetővé teszi a VIII. faktor koncentrátum előállítását (a 0 359 593 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint), és egy elkülönített vWF frakció kinyerését ugyanezen adag krioprecipitátumból, ezáltal biztosítja a humán plazma optimális felhasználását. Az így kapott vWF frakciót további kromatográfiás lépésben tisztítjuk és ezáltal igen nagy tisztaságú vWF koncentrátumot kapunk.

A vWF molekulák komplex volta nagyon megnehezíti azok tisztítását. Analitikai vizsgálatokra kis léptékű módszerekkel például 5-2000 ml-es mennyiségeket már előállítottak [Thorell és munkatársai: Thromb. Rés. 35, 431^450 (1984)], azonban ezeket a módszereket nem lehetett a vWF ipari léptékű előállítására adaptálni. Ezenkívül nem tekintették célnak azt sem, hogy a VIII. faktor mellett állítsák elő a vWF-et a krioprecipitátum lehető legnagyobb mértékű hasznosításával. A vWF-et ismert módon szulfatált vegyületeken differenciális szolubiiizálással tisztítják, glicin [Bemtop és munkatársai: Vox Sang 56, 212 (1989)] és szulfatált vegyületek [Winkelman és munkatársai: Vox Sang. 57, 97 (1989)] jelenlétében, különféle kromatográfiás elválasztási módszerek alkalmazásával, például molekulaméreten alapuló kizárással [Perret és munkatársai: Haemostasis 14, 289 (1984)] és ioncserélő kromatográfiával [Austen és munkatársai: Thromb. Haemostas. 48, 295 (1982)]. Azonban ezekkel a módszerekkel vagy alacsony hozammal kapják a vWF-et, vagy a gél kapacitása alacsony, vagy nem teszik lehetővé a VIII. faktor és a vWF egymás melletti izolálását, ily módon ipari alkalmazás szempontjából nem kielégítőek.

Ezenkívül a Bemtorp és munkatársai módszere szerint előállított vWF [Vow Sang. 56, 212 (1989)] kis tisztaságú, csak 45 egység Ag/mg protein (213. oldal), ugyanakkor a találmány szerinti eljárással előállított vWF 205 egység Ag/mg protein tisztaságú. Hasonlóképpen a Winkelman és munkatársai módszere szerint előállított vWF [Vox Sang. 57, 97 (1989)] is csak 10 egység Ag/ml protein tisztaságú (101. oldal).

Perret és munkatársai [Haemostasis 14, 289 (1984)] a fibrin molekulák formájában lévő fibrinogén eltávolítására egy defibrinációs lépést hajtanak végre kalcium és kígyóméregből származó enzimek alkalmazásával. Emiatt ez a készítmény nyilvánvalóan alkalmatlan gyógyászati célokra. Ezenkívül a gélszűréses rendszerek - mint például az általuk alkalmazott rendszer nem felelnek meg az ipari méretű előállítás céljainak, mivel az átfolyási sebesség ezekben csak 10 cm/óra vagy kevesebb, és igen hajlamosak az eldugulásra, különösen fibrinogén és fibronektin jelenlétében. Ezenkívül a tisztítási faktor is köztudottan rendszerint alacsony, a proteinek rossz szétválasztása miatt ebben a kromatográfiás rendszerben.

Austen és munkatársai [Throm. Haemostas. 48, 46 (1982)] szintén kis tisztaságú koncentrátumot állítanak elő (8 egység Ag/mg protein) és viszonylag ala2

HU 215 098 Β csony hozammal, valószínűleg a drasztikus kromatográfiás körülmények (pH 5,5) következtében.

Harrisson és munkatársa [Thromb. Rés. 50, 295 (1988)] dextrán-szulfát-sepharoset alkalmaznak kromatográfiás mátrixként; ennek az anyagnak igen alacsony a retenciós kapacitása a vWF-re. Ennek eredményeként alacsony specifikus aktivitású vWF készítményt kapnak csak, az aktivitás 2-4 egység/mg protein (301. oldal).

Végül a feníi módon kapoll termékek többsége meglehetősen nagy arányban tartalmaz denaturált és inaktív formában lévő vWF-et, amelyet a risztocetinkokfaktor aktivitás bizonyít (RCo/antigén arány 0,08 és 0,8 között változik) [Lawrie és munkatársai: Br. J. Haematol. 73, 100 (1989)]. Ennek következtében ezek a termékek nem alkalmazhatók elég hatékonyan a von Willebrand-betegség kezelésére. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárással a vWF tisztaságára jellemző RCo/antigén arány nagyobb, mint 1 egység, ami összemérhető a normál plazmából kapott natív vWF értékével.

A találmány szerinti eljárás tehát gyógyászati célokra alkalmas vWF koncentrátum ipari méretű előállítására vonatkozik, a nagytisztaságú VIII. faktor előállítására szolgáló eljárás melléktermékeként, amely lehetővé teszi igen nagy plazma-térfogatokból (4000 liter vagy több) nagy móltömegű multimerekben gazdag, standard termék előállítását, és ezáltal lehetővé teszi a krioprecipitátum optimális hasznosítását.

Közelebbről, a találmány szerinti eljárás a vWF koncentrátum előállítására három, egymást követő kromatográfiás lépésből áll, amely lehetővé teszi a vWF biológiai aktivitásával összefüggő, nagy móltömegű multimerekben való feldűsulást. Az eljárás kiindulási anyaga a humán plazma krioprecipitált frakciója, amelyet szokásos előtisztítási lépésként alumínium-hidroxidon való adszorpciónak vetettek alá. Ezt az anyagot ezután vírus-inaktiválásnak vetjük alá, például oldószer-detergens kezeléssel, mielőtt tisztítanánk.

A találmány szerinti eljárás a VIII. faktor előállítási eljárása során melléktermékként kapott frakció három, egymást követő kromatográfiás tisztításából áll. Az első két kromatográfiás tisztítás ioncserélő kromatográfiás lépés, és a harmadik affinitási kromatográfia.

A két ioncserélő kromatográfiás lépést azonos vinilpolimer-gyantán hatjuk végre, amelyen dietil-aminoetil-csoportok (DEAE) vannak kötve, közelebbről DEAE-Fractogel^R TSK 650 (Merck) oszlopon, amelyet 0,01 mol/1 trinátrium-citrátot, 0,11 mol/1 nátrium-kloridot, 0,001 mol/1 kálcium-kloridot, 0,12 mol/1 glicint és 0,016 mol/1 lizint tartalmazó pufferrel (pH 7) ekvilibráltunk.

A DEAE-Fractogel^R TSK 650 szintetikus, hidrofil gélközeg. Hordozója oligo-etilénglikol, glicidin-metakrilát és pentaeritrit-dimetakrilát kopolimer, amelyhez dietil-amino-etil-csoportok, például -O-CH2-CH2N⁺(C2H₅)₂HC1 csoportok vannak kapcsolva, ezáltal enyhén lúgos anioncserélő jellegű. A DEAE-Fractogel^RTSK 650 két részecskeméret-tartományban kerül forgalomba (vízzel nedvesítve): S típus (0,025-0,050 mm) és

M típus (0,045-0,090 mm). Mind a két típus alkalmazható a találmány szerinti eljárásban.

Az előzetesen tisztított és virális inaktivációs kezelésen keresztülment krioprecipitátum plazmafrakciót felvisszük az első kromatográfiás oszlopra, amely a vWF fő tömegét visszatartja. A vWF-t ezután eluáljuk oly módon, hogy a puffer-oldatban a nátrium-klorid koncentrációját 0,14-0,15 mol/l-re növeljük.

A vWF-ben feldúsult, fenti módon eluált frakciót ezután a második kromatográfiás oszlopra visszük, az elsővel azonos körülmények között. Mivel ebből a frakcióból az első kromatográfiás lépésben már eltávolítottuk a proteinek nagy részét (különösen a VIII. faktort és a fibronektint), amelyek az adszorpciós helyekért versenyeznek, a vWF adszorpciós kapacitása a második oszlopon előnyösen sokkal nagyobb. A szűrlet eltávolítása és az oszlop ekvilibráló pufferoldattal való átöblítése után az adszorbeált vWF-et a pufferoldat nátrium-klorid koncentrációjának 0,15-0,17 mol/li-re növelésével eluáljuk. A DEAE-Fractogel^R gyanta vWF-el szembeni kiváló kapacitásának és hatékonyságának köszönhetően az oszlopról igen magas aktivitású vWF eluálódik (>50 egység RCo/ml). Ezáltal az ultraszűréssel járó mechanikus stresszt, amely a termék koncentrálására szükséges lenne, elkerülhetjük.

A fenti módon eluált frakciót affinitási kromatográfiának vetjük alá zselatinból származó gélen, azonos ekvilibrációs pufferoldatban, ezáltal elkerüljük a dialízist, vagy ultraszűréses lépést a sóösszetétel változtatására; ez az oszlop alapvetően arra a célra szolgál, hogy a vWF-et szennyező maradék fibronektin molekulákat visszatartsa. A zselatin-alapú gél megválasztása nem kritikus, azonban a fenti célra általában megfelel a GelatinSepharose, a Gelatin-Ultrogel^R, a Gelatin-Spherodex^R és a Gelatin-Fractogel^R. A Gelatin-Sepharose a legelőnyösebb, mivel a találmány szerinti eljárásban alkalmazott körülmények között mintegy 5-10 mg fibronektin megkötésére alkalmas 1 ml gélre vonatkoztatva.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott körülmények között a nagytisztaságú vWF nem kötődik a gélen, és így a szűrletben eluálódik; mivel a zselatin-affinitási kromatográfiás lépés nem jár a vWF frakció nagymértékű tágulásával, a terméket közvetlenül kiszerelhetjük koncentrálási lépés, például ultraszűrés szükségessége nélkül. Mivel a végtermékben nincsenek proteolitikus enzimek, igen stabil a sterilre szűrés és a fagyasztva szárítás során, így nem szükséges stabilizálószert alkalmazni.

A találmány szerinti eljárással előállított von Willebrand-faktor koncentrátum tisztítási faktora kiemelkedően magas, 10000-szeresnél nagyobb a kiindulási plazmához viszonyítva, és specifikus aktivitása 345 egység CBA/mg protein (kollagénkötő aktivitás egységben meghatározva), illetve 100 egység RCo/mg proteinnél nagyobb (risztocetin-kofaktor aktivitás egységben). Az egyes kromatográfiás lépések szerepét a vWF tisztításában az 1. ábrán mutatjuk be.

Igen jelentős, hogy a termék minőségének javulását az egymást követő tisztítási lépésekben a magas móltömegű multimerek (a vWF nagy biológiai aktivitású

HU 215 098 Β molekuláris formái) függvényében ábrázoltuk, amelyet elektroforetikus analízissel detektáltunk.

Meglepő módon a fenti analízis szerint a > 4 multimerekben progresszív dúsulás figyelhető meg (2. ábra), ami a vWF polimerek 79%-át jelenti, noha a krioprecipitálás során ezek fele elveszik. Meglepő módon a DEAE-Fractogel^R TSK 650-en végzett kromatográfia az a lépés, amely elősegíti az igen nagy multimerek szelektív retencióját és a szűrletben eltávolítja a kisméretű, abnormális szerkezetű (részleges proteolízisen átesett) és kis aktivitású formákat.

A találmány szerinti eljárással előállított standardizált vWF koncentrátum nagy tisztaságú, nagy specifikus aktivitású és nagy molekulatömegű multimerekben gazdag, ezáltal különösen alkalmas gyógyászati célokra, a von Willebrand-betegség különféle formái kezelésére, előzetes klinikai vizsgálataink szerint.

Az előzetes klinikai vizsgálatok azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított koncentrátum megfelelő mértékben csökkenti a vérzési időt különféle vérzések esetében.

In vitro vizsgálatok szerint biokémiai és fiziológiai tulajdonságai azonosak a natív molekuláéval, különösen azon képességét tekintve, hogy képes a vérlemezkék fixálására a perfúziós eszközben és in vivő képes endogén VIII. faktor megkötésére.

Nagy tisztaságának következtében a találmány szerinti eljárással előállított vWF alkalmas különféle laboratóriumi alkalmazásokra is (például finomszerkezeti elemzésekre, funkcionális vizsgálatokra, diagnózisokra), valamint specifikus antitestek termelésére.

A találmány szerinti eljárással előállított koncentrátumot stabilizálószerként is alkalmazhatjuk a VIII. faktor géntechnológiailag transzformált sejtek általi előállítása, valamint az így előállított VIII. faktor tisztítása során.

A mellékelt ábrák jelentése az alábbi:

1. ábra:

Tisztított vWF frakciók SDS-poli(akril-amid)-gél elektroforézise

1. sáv: krioprecipitátum;

2. sáv: SD-kezelt krioprecipitátum;

3. sáv: DEAE-fraktogélen nem kötődő frakció;

4. sáv: első vWF eluátum;

5. sáv: második vWF eluátum;

6. sáv: zselatinon nem kötődő frakció;

7. sáv: standardok, Fbn = fibronektin; IgG = immunoglobulin; Alb = albumin.

2. ábra:

Multimerek megoszlása a vWF tisztítási frakciókban

1. sáv: normál plazma;

2. sáv: krioprecipitátum;

3. sáv: SD-kezelt krioprecipitátum;

4. sáv: DEAE-fraktogélen nem kötődő frakció;

5. sáv: első vWF eluátum;

6. sáv: második vWF eluátum;

7. sáv: zselatinon nem kötődő frakció.

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példával kívánjuk szemléltetni.

Példa

Kiindulási anyag

A krioprecipitátumot friss plazmából állítjuk elő, amelyet 4%-os nátrium-citrát-oldat vagy CPD (citrát, foszfát, dextróz) antikoaguláns oldat jelenlétében gyűjtünk, és legfeljebb 6 órán keresztül fagyasztunk, miután megkaptuk. A plazmát -60 °C-on mélyhűtjük, majd -35 °C-on tartósítjuk. Az egyes plazmaadagok 1800-2000 litert tartalmaznak, ezeket 4000 literes adagokká egyesítjük minden egyes találmány szerinti alkalmazás esetén. A felolvasztást úgy végezzük, hogy a plazmát szabályozott hőmérsékletű kamrába helyezzük 12 órára, amely lassú, szabályos felmelegedést biztosít -7 °C-ra, majd termosztáttal szabályozott fürdőn 0-2 °C-on állandó keverés közben felolvasztjuk. A krioprecipitátumot (amely mintegy 9 g/ml plazmát jelent) hidegen való centrifugálással nyerjük ki.

Centrifugálás után a krioprecipitátumot újra szolibilizáljuk, és alumínium-hidroxidon adszorbeáljuk bizonyos szennyeződések, vagyis a protrombin-komplex komponensei (főleg a VII. faktor) és a ΧΠ. faktor eltávolítása céljából. A felülúszót ezután 15 °C-ra hűtjük (ezzel részben eltávolítjuk a fibrinogent és a fibronektint).

A fenti kezeléssel 80-86% hozammal kapjuk a VIII. faktor - vWF elegyet a krioprecipitátumból; a VIII. faktor specifikus aktivitása 0,7 nemzetközi egység/mg, a vWF-é 0,6 egység RCo/mg (risztocetin kofaktor aktivitás), illetve 1,2 egység CBA/mg (kollagénkötő aktivitás).

Vírus-inaktiválás

A VIII. faktor és a vWF elegyét tartalmazó oldatot oldószer-detergens kezelésnek vetjük alá, amely ismert módon hatékonyan alkalmazható a lipidburokkal rendelkező vírusok megsemmisítésére [Horowitz és munkatársai: Transfusion, 25, 516 (1985)], amely kezelés abból áll, hogy az oldatot 0,3% tri(n-butil)-foszfát (TnBP) és 1% Tween 80 jelenlétében 8 órán keresztül, 25 °C-on inkubáljuk.

A fenti kezelés után az előző lépésben mért VIII. faktor és vWF aktivitás 95%-át visszanyerjük. Elektroforézist alkalmazhatunk annak megerősítésére, hogy a vWF még mindig multimer formában van jelen.

Kromatográfiás elválasztási eljárás

A vWF tisztítását a 0 359 593 számú európai szabadalmi bejelentésünk szerinti eljárásból fejlesztettük ki, amely a VIII. faktor tisztítására vonatkozik.

Az első kromatográfiás lépést DEAE-Fractogel^RTSK 650 (S vagy M típus) (Merck) oszlopon végezzük. Az ekvilibráló pufferoldat 0,02 mol/1 trinátriumcitrátot, 0,001 mol/1 kalcium-kloridot, 0,12 mol/1 glicint, 0,016 mol/1 L-lizint és 0,11 mol/1 nátrium-kloridot tartalmaz. Az oszlopon megkötődik a vWF, a VIII. faktor és a fibronektin; a szennyező proteinek (főleg fibrinogén és valamennyi IgG) lazán kötődik vagy nem kötődik az oszlopon és a vírus-sterilizáló szerek ugyanezzel a pufferoldattal való néhány egymást követő mosással eltávolíthatók.

Az oszlopot 100 cm/óra lineáris átfolyási sebességgel üzemeltetjük. Ilyen körülmények között az alkalmazott oszlop vWF retenciós kapacitása közelítőleg 75%-a

HU 215 098 Β a beinjektált mennyiségnek (amelyet antigén Ag-ként mérünk), a maradék a szűrlettel elveszik. Ez a kötőkapacitás 45 egység vWF Ag/ml gélnek felel meg.

A vWF-t az oszlopról úgy deszorbeáljuk, hogy a pufferoldatban a nátrium-klorid koncentrációját 0,15 mol/l-re növeljük. A vWF-t tartalmazó frakció 30-35%-át tartalmazza a kiindulási vWF-nek, míg 40%-a a Vili. faktorral együtt adszorbeálva marad, és amelyet azzal együtt eluálunk oly módon, hogy a pufferoldatban a nátrium-klorid koncentrációját 0,25 mol/li-re növeljük, majd együttes tisztítást végzünk.

Az első oszlopról eluált vWF-t tartalmazó frakciót az ekvilibráló pufferrel kismértékben hígítjuk, majd egy második, azonos töltetű oszlopra visszük fel újra, abból a célból, hogy a vWF frakció ionerősségét újra 0,11 mol/1 nátrium-kloridnak megfelelő értékre csökkentsük.

Mivel a szennyeződéseket és a VIII. faktort, - amelyek az első oszlopon a vWF-el versenyeznek az adszorpciós helyekért - szinte teljesen eltávolítottuk az első kromatográfiás lépésben, a második oszlop kötőkapacitása sokkal nagyobb: 320 egység vWF Ag/ml gél.

A vWF-t az oszlopról a pufferoldat nátrium-klorid koncentrációjának 0,17 mol/l-re emelésével deszorbeáljuk.

Ebben a második kromatográfiás lépésben a koncentráció 8-10-szer nagyobb lehet, mint az előzőben, ezáltal a további koncentrálási lépések - például ultraszűrés - elhagyható. Standard módszerek szerint meghatározva az eluátum a következő vWF mennyiségeket (vagy aktivitásokat) tartalmazza:

- Antigén (Ag) 88 ± 9 NE/ml

- Risztocetin kofaktor (RCo) 97 ± 19 NE/ml

- Kollagénkötő aktivitás (CBA) 149 ± 13 NE/ml

- Nagy móltömegű multimerek (>4 multimer) 79%

A CBA egységeket (kollagénkötő aktivitást) ELISA módszerrel határozzuk meg Brown és Bosak módszere szerint [Thromb. Rés. 43, 303 (1986)]. Az értékek nemzetközi egységben való kifejezésére összehasonlító anyagként a második British Standard (86/717) szerint kalibrált standard plazmát alkalmazunk.

A CBA/Ag arány - amely 1,69 - azt mutatja, hogy a vWF aktivitása jól megőrződik. Ez összhangban van a nagy móltömegű multimerek magas százalékos értékével (79%) és előnyösen összehasonlítható a plazmából származó natív vWF 70%-os értékével.

A vWF eluátum elektroforetikus analízisével kimutatható, hogy szennyeződésként kevés fibronektint és inter-alfa-tripszin inhibitort (egy szerin-proteáz inhibitor) tartalmaz.

A második vWF eluátumot ezután egy harmadik tisztítási lépésben a fibronektin eltávolítása céljából Gelatin-Sepharose CL4B (Pfarmacia) oszlopon tisztítjuk, amelyet az előző oszlopon eluáló pufferként használt oldattal ekvilibráltunk.

Ennek az affinitási kromatográfiás gélnek a fibronektin - visszatartó kapacitása >5 mg/ml, ezáltal lehetővé válik, hogy a vWF frakcióban ezt a szennyeződést a kimutathatóság határa alá (<4 mg/ml) csökkentsük.

A találmány szerinti eljárással tisztított vWF ezen utolsó tisztítási lépéssel kapott szűrletben található és közvetlenül szétmérhető és fagyasztva szárítható.

A végtermék elektroforetikus analízise szerint nem 5 mutatható ki semmiféle szennyeződés. A vWF tartalom 205 egység Ag/ml protein és specifikus aktivitása 345 egység CBA/mg protein, illetve 186-220 egység

RCO/mg protein.

A végső tisztítási fok a kiindulási plazmához viszo10 nyitva > 10 000-szeres.

A fenti tisztítási eljárással kapott vWF-t SDSagarózon elektroforetikus analízisnek alávetve és a sávokat megvizsgálva azt találjuk, hogy az 65-80%-ban tartalmaz nagy móltömegű multimereket, vagyis ez az arány összehasonlítható a kiindulási plazma fenti értékével (70%).

A koncentrátum stabilitását cseppfolyós halmazállapotban, szobahőmérsékleten 24 órán keresztül vizsgáljuk: nem tapasztalunk proteolitikus aktivitást és nem mu20 tatható ki semmiféle változás a specifikus aktivitásban.

A koncentrátum trombogén aktivitásának hiányát szokásos vizsgálati módszerekkel mutattuk ki, például meghatároztuk a nem aktivált részleges tromboplasztin időt (NAPTT). PKA és kallikrein nem volt detektálható.

Fentiek miatt nem szükséges stabilizálószert adni a találmány szerinti vWF koncentrátumhoz.

Mivel sikerült olyan tisztítási eljárást találnunk, amely specifikusan alkalmas a VIII. faktor előállítási eljárása során melléktermékként keletkezett vWF ki30 nyerésére, először sikerült olyan nagy tisztaságú, nagy hatású, gyógyászatilag alkalmazható koncentrátumot előállítani, amely a von Willebrand-féle betegség kezelésére alkalmas.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás standardizált, nagy tisztaságú, magas móltömegű multimerekben gazdag humán von

40 Willebrand-faktor koncentrátum előállítására, azzal jellemezve, hogy a plazma krioprecipitált frakcióját három egymást követő kromatográfiás lépéssel tisztítjuk, az első két lépésben ioncserélő kromatográfíát alkalmazunk DEAE csoportokat tartalmazó, nagy pórusú

45 vinil polimer-gyantán, míg a harmadik lépésben affinitási kromatográfíát végzünk zselatin-Sepharose oszlopon.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként alumínium-hidroxidon elő50 zetesen tisztított, krioprecipitált plazma-frakciót alkalmazunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első és második oszlop tölteteként DEAEFractogel^R TSK 650 ioncserélő gyantát alkalmazunk,

55 amelyet 0,01 mol/1 trinátrium-citrátot, 0,11 mol/1 nátrium-kloridot, 0,001 mol/1 kálcium-kloridot, 0,12 mol/1 glicint és 0,016 mol/1 L-lizint tartalmazó puffer-oldattal ekvilibráltunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,

60 hogy az előzetesen tisztított krioprecipitált plazma-frak5

HU 215 098 Β ciót az első ioncserélő kromatográfiás oszlopra visszük, és a von Willebrand-faktort tartalmazó frakciót a puffer nátrium-klorid koncentrációjának 0,14-0,15 mol/l-re növelésével eluáljuk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első kromatográfiás oszlopról kapott, von Willebrand-faktort tartalmazó eluátumot egy második ioncserélő kromatográfiás oszlopra visszük fel, és a von Willebrand-faktort a puffer nátrium-klorid koncentrációjának 0,15-0,17 mol/l-re növelésével eluáljuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második kromatográfiás oszlopról kapott eluátumot egy zselatin-Sepharose kromatográfiás oszlopra visszük, amelyet az előző kromatográfiás lépésben al5 kalmazott eluáló pufferrel ekvilibráltunk, így a maradék fibronektin az oszlopon szelektíven adszorbeálódik.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a zselatin-Sepharose oszlopon átfolyt, von Willebrand-faktort tartalmazó szűrletet összegyűjtjük,
10 szétmérjük, és fagyasztva szárítjuk.