AT407115B - Verfahren zur herstellung eines konzentrates von standardisiertem, menschlichem von willebrand-faktor - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines konzentrates von standardisiertem, menschlichem von willebrand-faktor Download PDFInfo
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Description
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung im industriellen Massstab von standardistertem, menschlichen von Willebrand-Faktor-Konzentrat von hoher Reinheit und sehr hoher spezifischer Aktivität, welcher einen hohen Anteil an Multimeren mit hohem Molekulargewicht aufweist und besonders zur therapeutischen Verwendung bestimmt ist
Der von Willebrand-Faktor (fvW) ist das grösste bekannte, im Plasma zirkulierende Molekül Es besteht aus einem durch S-S-Brücken verknüpften Multimeren-Komplex, dessen Grundbaustein ein Molekulargewicht von nahe 260 Kilodaltons (KDa) hat Die kleinste Form des fvW im Plasma ist ein Dimer mit 440-500 KDa und die grossten Formen sind Multimere dieses Dimeren, deren Molekulargewicht 20 Millionen Daltons erreichen kann.
Diese Ansammlung von Multimer- Untereinheiten kann für die Zellen, in welchen sie wirksam sind, spezifisch sein, wobei der fvW in den Megacaryocyten und in den Endothel-Zellen synthetisiert und polymerisiert wird
Dieser Faktor spielt bei der Blutstillung durch zwei bestimmte Funktionen eine wesentliche Rolle- als Adhasionsprotein erlaubt er die Dispersion, die Haftung und die Aggregation der Blutplättchen auf dem vaskulären Nebenepithel (und nimmt am Vorgang der schnellen Vernarbung der verletzten Gefässe teil) und zum anderen sorgt er für die Stabilisierung und den Transport des Faktors VIIIim Blutkreislauf
Ein kongenitaler Mangel an fvW oder eine strukturelle Anomalie dieses Faktors haben die Willebrand-Krankheit zur Folge,
die sich durch Blutungen vor allem der Haut und der Schleimhäute äussert Diese Krankheit ist in ihrem klinischen Ausdruck sehr heterogen und bereitet im Falle chirurgischer Eingriffe grosse Probleme. Die Behandlung der Willebrand-Krankheit erfordert es, die Anomalien der primären Blutstillung (Blutungszeit) und der Koagulation (Zeit für das aktivierte Cephalin und Gerinnungsaktivität des Faktor VIII) zu verbessern.
Die Krankheit wird durch Substitutionstherapie mit an fvW angereicherten (zum Beispiel der Kryopräzipitat-Fraktion des Plasmas oder ausreichend damit assoziierten fvW enthaltende Faktor VIII-Konzentrate) menschlichen Plasmadenvaten behandelt Diese Produkte sind jedoch im Hinblick auf die Behandlung der Willebrand-Krankheit nicht standardisiert. Zudem sind die wenig gereinigten Blutplasmafraktionen, insbesondere das Kryopräzipitat, nicht frei von viralen Kon- taminationsrisiken, da sie haufig keiner wirksamen Virusinaktivierung unterworfen werden. Femer schleppen sie eine Mehrbelastung an verunreinigenden Proteinen ein, welche der Patient nicht benötigt, und welche nach mehrfachen Injektionen immunologische Reaktionen zur Folge haben.
Der gereinigte Faktor VIII kann hingegen einer wirksamen Virusinaktivierung unterworfen werden, aber sein Reinigungsverfahren ist im Hinblick auf die Behandlung der Hämophihe A und nicht hinsichtlich der Behandlung des fvW-Mangels optimiert worden.
Auf diese Weise sind die bisher entwickelten Verfahren zur Herstellung des Faktor VIII, wie der Immunoaffinität und der Reinigung durch lonenaustausch, immer leistungsfähiger und produzieren Konzentrate, welche nicht genügend fvW enthalten, um bei der Behandlung der Willebrand- Krankheit wirksam zu sein
Um dieses Bedürfnis nach einer wirksamen Behandlung der Willebrand-Krankheit zu befriedigen, hat die Patentinhaberin ein neues Verfahren zur Reinigung von fvW in industriellem Nassstab entwickelt, welches die Extraktion verschiedener Plasmamoleküle sehr rentabel zu machen erlaubt.
Insbesondere erlaubt es in einem ersten Schritt die Herstellung eines Faktor VIII-Konzentrats (gemäss einem in der EP 0 359 593 A1 beschriebenen Verfahren) und später, ausgehend von derselben Menge Kryopräzipitat, die Gewinnung einer an Willebrand-Faktor angereicherten Fraktion, was die Verwendung menschlichen Plasmas rentabler macht Die auf diese Weise erhaltene fvW-Fraktion wird hemach in zwei zusätzlichen Chromatographieschritten gereinigt, was zu einer Konzentrierung des fvW zu sehr grosser Reinheit führt
Die Komplexität des Moleküls des von Willebrand-Faktor-Moleküls macht seine Herstellung sehr schwierig Reinigungsverfahren im kleinen Massstab, das heisst von 5 bis 2000 ml, mit dem Ziel der analytischen Untersuchung sind schon beschneben worden, aber man hat diese Verfahren nicht an einen industriellen Massstab anpassen können (Thorell et al Thromb Res 35, 1984,
431-450). Weiterhin war das Prinzip der maximalen Rentabilisierung des Kryopräzipitats, um auf einmal FVIII und fvW herzustellen, noch nicht beabsichtigt
Der von Willebrand-Faktor ist durch differentielle Löslichkeit der Sulfatkomplexe in Anwesenheit von Glycin (Bemtorp et al. Vox Sang. 56, 1989, 212-217, Winkelman et al. Vox Sang- 57,1989, 97-103) und durch verschiedene chromatographische Trennverfahren, durch molekulare
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Siebung (Perret et al Haemostasis 14, 1984,289-295) oder durch lonenaustausch (Austen et al., Thromb Haemostas. 48,1982, 46-48, Harrison et al.
Thromb Res 50, 1988, 295-304) gereinigt worden, aber diese Techniken zeigen geringe Ausbeuten an von Willebrand-Faktor und eine geringe Kapazität des Gels oder erlauben die gleichzeitige Gewinnung von FVIII und von fvW nicht, was sie fur eine industrielle Anwendung weniger interessant macht
Austen et al (1982, bereits zitiert) erhielten ein Konzentrat geringer Reinheit (8 U Ag/mg Protein) in ziemlich geringer Ausbeute, wahrscheinlich aufgrund ihrer sehr drastischen Chromatographiebedingungen (pH 5,5)
Harrison et al.
(1988, bereits zitiert) verwendeten Dextran-Sulfat-Sepharose als Matrix; dieses Material besitzt nur eine geringe Retentionskapazität für fvW und der so hergestellte fvW besitzt nur eine spezifische Aktivität von 2-4 Ulmg Protein
Der grösste Teil dieser Produkte enthält neben aktiven multimeren Formen einen wesentlichen Anteil an denaturierten oder inaktiven Formen, wie das Verhältnis aktiver Ristocetin- Cofaktor (RCo)/Antigen zeigt, welcher in der Grossenordnung von 0,08 bis 0,8 (Lawrie et al Br. J Haematol. 1989, 73, 100) ist, was sie für eine therapeutische Verwendung bei, der Willebrand- Krankheit weniger wirkungsvoll macht.
Das erfindungsgemässe Verfahren dagegen erlaubt es, ein fvW-Konzentrat zu erhalten, dessen Verhältnis RCo/Ag grösser als eins ist, was mit dem von natürlichem fvW im Plasmapool vergleichbar ist
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrates von von Willebrand-Faktor zur therapeutischen Verwendung, wobei es dieses Verfahren erlaubt, standardisierte Mengen von jeweils sehr grossen Plasmavolumina (4000 Liter oder mehr) herzu- stellen, von denen man bereits FVIII-Konzentrat gewonnen hat, was die Verwendung von Kryopräzipitat sehr rentabel macht
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrates von von Willebrand-Faktor, welches die Kombination dreier aufeinanderfolgender chromatographischer Schritte umfasst,
welche eine Anreicherung an mit der biologischen Wirksamkeit des fvW verbundenen Multimeren mit hohem Molekulargewicht erlauben. Das Ausgangsmaterial ist die Kryopräzipitats-Fraktion des menschlichen Plasmas, welche einem klassischen Vorreinigungsschritt durch Adsorption an Aluminiumhydroxid unterworfen wird Dieses Material wird darauf einer Virusinaktivierung unterworfen, zum Beispiel vor seiner Reinigung durch eine Behandlung mit einem Solvent-Detergens
Das Reinigungsverfahren gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst eine Kombination dreier aufeinanderfolgender Schritte der Chromatographie eines Nebenproduktes der Herstellung von
EMI2.1
chromatographie ist.
Die zwei lonenaustauschchromatographien werden auf demselben mit DEAE- (Diethylamino- ethyl) Gruppen versehenen Vinylpolymer-Harz, insbesondere an mit 0,01 M Trinatriumcitrat, 0,11 M Natriumchlorid, 0,001 M Calciumchlorid, 0,12 M Glycin und 0,016 M Lysin enthaltendem
EMI2.2
Copolymer aus Oligoethylenglykol, Glycidinmethacrylat und Pentaerythrit-dimethacrylat, an welches Diethylaminoethyl-Gruppen wie -OCH2-CH2N+(C2H5)2HCI gebunden sind, was einen
EMI2.3
Teilchengrössen verfugbar (nach Rehydratisierung). dem Typ S (0,0025-0,050 mm) und dem Typ M (0,045 - 0,090 mm). Die beiden Typen können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die vorgereinigte und einer Virusinaktivierung unterworfene Kryopräzipitatsfraktion des Plasmas wird auf die erste Chromatographiesäule aufgebracht, welche einen Grossteil des von Willebrand-Faktors zurückhält. Dieser wird darauf durch eine Erhöhung der Natriumchlorid- konzentration des Puffers auf 0,14-0,15 M eluiert
Die auf diese Weise an von Willebrand-Faktor angereicherte eluierte Fraktion wird unter denselben Bedingungen wie auf die erste auf die zweite Chromatographiesäule aufgebracht Bei der auf diese zweite Saule aufgegebenen Fraktion, weiche bereits von vielen Proteinen, die in Konkurrenz um die Adsorptionsplätze stehen, befreit ist (vor allem FVIII und Fibronectin), ist die Absorptionskapazität für fvW auf der zweiten Säule viel grösser Nach Entfernen des Filtrats und
EMI2.4
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Natriumchloridkonzentration des Puffers auf 0,
15-0,17 M eluiert
Dank der hohen Adsorptionskapazität und der Leistungsfähigkeit des DEAE-Fractogels gegenüber fvW wird dieser mit einer hohen spezifischen Aktivität ( > 150 U RColml) gewonnen, was es erlaubt, einen zusätzlichen Konzentrierungsschritt durch Ultrafiltration zu vermeiden.
Die auf diese Weise eluierte Fraktion wird einer Affinitätschromatographie an einer Gelatine- Sepharose-Chromatographiesäule im selben Aquilibrierungspuffer unterworfen, was es erlaubt, einen zusätzlichen Dialyse- oder Ultrafiltrationsschritt zur Änderung der Salzkonzentration zu vermeiden Diese Saule hält die verbliebenen Fibronectin-Moleküle, welche den fvW noch verunreinigen, zurück. Die Wahl des an die Gelatine gebundenen Gels ist nicht kritisch : kann
EMI3.1
Man verwendet vorteilhaft Gelatine-Sepharose welche bis zu 5-10 mg Fibronectin/ml unter den im erfindungsgemässen Verfahren angewandten Bedingungen festhält
Der gereinigte von Willebrand-Faktor bindet sich unter diesen Bedingungen nicht an das Gel und geht in das Filtrat. Da der Chromatographieschritt in Anwesenheit von Gelatine die wichtige Verdünnung des fvW nicht beeinflusst, ist es nicht notwendig, ihn zu konzentrieren (zum Beispiel durch Ultrafiltration), und er kann direkt aufgearbeitet und lyophylisiert werden. Die Abwesenheit proteolytischer Enzyme im Endprodukt stellt die Stabilität im Verlauf der Sterilfiltration und der Lyophilisation sicher, was den Zusatz von Stabilisatoren vermeidet.
Das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene von Willebrand-Faktor- Konzentrat zeigt einen aussergewöhnlich erhöhten Reinigungsgehalt von > 10 OOOfach im Verhältnis zum Ausgangsplasma, und seine spezifische Aktivität beträgt 345 U CBA/mg Proteine (Masseinheiten der Aktivität der Kollagenbindung) und von > 100 U RCo/mg Proteine (Masseinheiten des Ristocetm-Cofaktors) Die Rolle jedes Chromatograhieschrittes bei der Reinigung des fvW wird durch Figur 1 veranschaulicht
Die Verbesserung der Produktqualität im Verlauf der aufeinanderfolgenden Reinigungsschritte ist insbesondere als Funktion des Verhältnisses der Moleküle im Zustand der Multimeren mit hohem Molekulargewicht (das heisst molekulare Formen mit hoher biologischer Wirksamkeit) durch elektrophoretische Analyse überwacht worden.
Diese Analyse offenbart eine zunehmende Anreicherung an Multimeren > 4 (Figur 2), welche 79% fvW in der Endpräparation entspricht, im Verhältnis zu 70% im natürlichen Plasma, während durch die Kryopräzipitation die Hälfte verloren wird Die Chromatographie an DEAE-Fractogel(M) begünstigt in unerwarteter Weise diese selektive Retention von sehr grossen Multimeren und schliesst im Filtrat die kleinen Formen, diejenigen mit abnormaler Struktur (welche eine teilweise Proteolyse erfahren haben) und mit geringer Aktivität aus
Das standardisierte von Willebrand-Faktor-Konzentrat von grosser Reinheit und hoher spezifischer Aktivität und einem hohen Gehalt an Multimeren mit hohem Molekulargewicht aufweist, welches nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten wurde,
ist daher besonders gut an die therapeutische Verwendung bei verschiedenen Formen der Willebrand-Krankheit angepasst, was durch vorläufige klinische Studien belegt wird. Diese zeigen insbesondere, dass das fvW-Konzentrat tatsächlich die Heilungszeit im Verlauf von Blutungen verkürzt.
In vitro-Tests haben die Identität seiner biochemischen und physiologischen Eigenschaften, insbesondere seiner Fähigkeit, die Blutplättchen in einer Infusionsvorrichtung zu fixieren und seine Fähigkeit, sich an den endogenen Faktor VIII zu binden, mit denen des natürlichen Moleküls bestä- tigt.
Die hohe Reinheit des nach dem erfindungsgemassen Verfahren erhaltenen von Willebrand- Faktor-Konzentrats gestattet gleichermassen, seine Anwendung bei verschiedenen Laborato- numsverfahren (Strukturfeinanalye, Untersuchungen zur Funktionalität, Diagnostik ...) und der Herstellung spezifischer Antikörper in Betracht zu ziehen
Das Konzentrat gemäss der vorliegenden Erfindung kann gleichermassen als Stabilisator im Verlauf der Herstellung von Faktor VIII durch gentechnologisch veränderte Zellen und im Laufe von Reinigungsschntten des derart hergestellten Faktors VIII verwendet werden.
Das folgende Beispiel veranschaulicht eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ohne deren Umfang zu beschränken.
BEISPIEL
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Ausgangsmaterial
Das Kryopräzipitat wird aus in Anwesenheit von Natriumcitrat (4 Vol %) oder Antikoagulans- Losung CPD (Citrat, Phosphat, Dextrose) frisch gewonnenem Plasma hergestellt und spätestens 6 Stunden nach seiner Entnahme tiefgekühlt. Das Plasma wird auf -60"C gekühlt und dann bei -35 C gelagert. Die Ansätze mit Plasma enthalten 1800 bis 2000 Liter und werden in Einheiten von 4000 Litern bei jeder Durchführung des Verfahrens zusammengefasst. Zum Auftauen wird das Plasma wenigstens 12 Stunden in eine Kammer von -7 C verbracht, um eine langsame Erwärmung sicherzustellen und zu regeln, darauf wird es in einem thermostatisierten Behältnis bei 0 - 2 C unter gleichmässigem Rühren aufgetaut. Das Kryopräzipitat (welches etwa 9 g/Liter Plasma ausmacht) wird durch Kaltzentrifugieren gewonnen.
Nach dem Zentrifugieren wird das gewonnene Kryopräzipitat erneut in Lösung gebracht und an Aluminiumhydroxid adsorbiert, um die Hauptverunreinigungen, das heisst die Bestandteile des Protothrombin-Komplexes (insbesondere den Faktor VII) und den Faktor XII, zu entfernen Der Überstand wird anschliessend auf 15 C abgekuhlt (was teilweise das Fibrinogen und das Fibronectin entfernt).
Diese Behandlung gestattet eine Gewinnung von 80 bis 86% des Gemisches Faktor VIII - von Willebrand-Faktor aus dem Kryopräzipitat. Die spezifische Aktivität des Faktors VIII beträgt 0,7 Ul/mg und jene des fvW 0,6 U RCo/mg (Ristocetin-Cofaktor-Aktivität) und 1,2 U CBA/mg (Kollagenbindungs-Aktivität)
Behandlung zur Virusinaktivierung
Die den Faktor VIII - von Willebrand-Faktor enthaltende Lösung wird einer Behandlung mit einem für seine Wirksamkeit gegen Lipidhüllen-Virus bekannten Solvent-Detergens (Horowitz et al , 1985, Transfusion, 25,516-522) unterzogen, welche eine Inkubation für 8 Stunden bei 25 C in Anwesenheit von 0,3% Tri-n-butylphosphat (TnBP) und von 1% Tween 80 umfasst
Nach dieser Behandlung findet man 95% der im vorangehenden Schritt gemessenen Aktivität des Faktors VIII und des von Willebrand-Faktors wieder.
Die Elektrophorese erlaubt zu kontrollieren, dass der fvW immer in multimerer Form vorliegt Chromatographisches Trennverfahren
Die Reinigung des von Willebrand-Faktors stellt sich als eine Ableitung des in der EP 0 359 593 A1 beschriebenen Verfahrens zur Reinigung von Faktor VIII dar.
Die erste Chromatographie wird an DEAE-Fractogel(M) TSK 650-Säule (Merck) durchgeführt Der Aquilibrierungspuffer enthält Trinatriumcitrat (0,01 M), Calciumchlorid (0,001 M), Natriumchlorid (0,11 M), Glycin (0,12 M) und L-Lysin (0,016 M) Der von Willebrand-Faktor, der Faktor VIII und das Fibronectin werden durch die Saule zurückgehalten; die durch die Säule schwach oder nicht fixierten verunreinigenden Proteine (hauptsächlich das Fibrinogen und die IgG) und die Rückstände der Behandlung zur Virusinaktivierung werden durch mehrere aufeinanderfolgende Waschvorgänge mit demselben Puffer entfernt.
Die Säule wird mit einer linearen Fliessgeschwindigkeit von 100 cm/Stunde betrieben
Unter diesen Betnebsbedingungen besitzt die Säule eine Retentionskapazität des fvW von etwa 75% (gemessen in der Antigenform, Ag), wobei der Rest im Filtrat verloren worden ist. Dieses Fixiervermögen entspricht 45 U Ag fvW/ml Gel.
Der von Willebrand-Faktor wird von der Säule durch eine Erhöhung der NaCI-Konzentration des Puffers auf 0,15 M desorbiert Die gesammelte fvW-Fraktion enthält 30 bis 35% des anfänglichen fvW, jedoch bleiben 40% von diesem mit dem Faktor VIII zusammen adsorbiert und werden mit diesem zusammen durch eine zweite Konzentrationserhöhung des Puffers auf 0,25 M zusammen eluiert und mit diesem zusammen gereinigt
Die von dieser Säule eluierte, den fvW enthaltende Fraktion wird nach einer geringen Verdünnung mit dem Äquilibrierungspuffer, um die lonenstärke der fvW-Fraktion auf ein Äquivalent von 0,11 M Natriumchlorid einzustellen, erneut auf eine mit der ersten identische zweite Säule unter denselben Bedingungen aufgegeben
Da die aufgegebene Fraktion, welche bereits von Verunreinigungen und vom Faktor VIII,
welche in Konkurrenz um das Bindungsvermögen der Adsorptionsplätze der ersten Saule standen, befreit ist, beobachtet man für die zweite ein viel grösseres Bindungsvermögen von
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320 U Ag fvW/ml Gel
Der fvW wird durch eine Erhöhung der Konzentration des Puffers an Natriumchlorid auf 0,17 M desorbiert
Diese zweite Chromatographie erlaubt einen Konzentnerungsfaktor von 8 bis 10fach im Vergleich zur vorangehenden, was zusätzliche Konzentrierungsschritte, zum Beispiel durch Ultra- filtration, vermeidet In den verschiedenen, üblichen Masssystemen enthält das Eluat die folgenden Gehalte oder Aktivitäten an fvW.
EMI5.1
<tb>
Antigen <SEP> (Ag) <SEP> 88 <SEP> ¯ <SEP> 9 <SEP> U/ml
<tb> Ristocetin-Cofaktor <SEP> 97 <SEP> ¯19 <SEP> U/ml
<tb>
<tb> Kollagenbindungsfaktor <SEP> (CBA) <SEP> 149¯ <SEP> 13 <SEP> U/ml
<tb>
<tb>
<tb> Multimere <SEP> ( > <SEP> 4) <SEP> hohen <SEP> 79%
<tb>
<tb> Molekulargewichts
<tb>
Das Verhältnis CBAlAg von 1,69 zeigt, dass die Aktivität des fvW gut bewahrt wird Dies ist im Einklang mit dem hohen Prozentsatz (79%) an Multimeren hohen Molekulargewichts.
Die elektrophoretische Analyse dieses fvW-Etuats offenbart die Anwesenheit einer schwachen
EMI5.2
Dieses zweite fvW-Eluat wird einem dritten Reinigungsschritt an einer mit dem Elutionspuffer der vorangegangenen Säule äquilibrierten Säule aus Gelatine-Sepharose CL4B (Sephadex) unterworfen, um das Fibronectin zu entfemen
Dieses Gel zur Affinitätschromatographie besitzt eine Retentionskapazität für Fibronectin von > 5 mg/ml, was es erlaubt, diese Verunreinigung auf in der fvW-Fraktion nicht nachweisbare Mengen ( < 4 mgll) zu verringern.
Der gereinigte fvW befindet sich im Filtrat dieses letzten Schrittes und kann unmittelbar aufgearbeitet und lyophilisiert werden - Die elektrophoretische Analyse weist keine Verunreinigung mehr nach, - der Gehalt an fvW betragt 205 U Ag/mg Protein, seine spezifische Aktivität beträgt 345 U CBA/mg Protein und 186-220 U RCo/mg Protein.
Der Gesamtbetrag der Aufreinigung bezogen auf das Ausgangsplasma ist > 10 OOOfach.
Der am Ende der Aufreinigung erhaltene fvW besteht zu 65 bis 80% aus Multimeren hohen Molekulargewichts, das heisst ein Gehalt vergleichbar jenem des Ausgangsplasmas, welcher 70% beträgt, wie die elektrophoretische Analyse auf Agarose-SDS zeigt
Die Stabilität des Konzentrats ist im flüssigen Zustand bei gewöhnlicher Temperatur während 24 Stunden untersucht worden man weist weder eine Spur von Proteolyse noch eine Veränderung der spezifischen Aktivität nach
Die vollige Abwesenheit von Thrombogenaktivität bei dem Konzentrat ist durch klassische NAPTT-Tests ("non activated partial thromboplastin time") kontrolliert worden. Die völlige Abwesenheit von Thrombin, von PKA und von Kallikrein ist gezeigt worden.
Das erhaltene Endkonzentrat benötigt keinerlei Stabilisatorzusatz
Figur 1 SDS-PAGE der fvW-Fraktionen im Verlauf der Aufreinigung. Bande 1 Kryopräzipitat, Bande 2 mit Solvent-Detergens behandeltes Kryopräzipitat, Bande 3. an DEAE-Fractogel nicht gebundene Fraktion, Bande 4- 1. fvW-Eluat, Bande 5 2 fvW-Eluat; Bande 6: an das Gelatine-Gel nicht gebundene Fraktion; Bande 7: Standards.
Fbn = Fibronectin
IgG =lmmunoglobuline
Alb = Albumin
Figur 2 Multimerenverteilung des fvW in den Fraktionen im Verlauf der Aufreinigung, nach Elektrophorese auf Agarose-SDS
Bande 1 natürliches Plasma; Bande 2. Kryopräzipitat, Bande 3- mit Solvent-Detergens behandeltes Kryopräzipitat; Bande 4 an DEAE-Fractogel nicht gebundene Fraktion, Bande 5 1. fvW-Eluat, Bande 6. 2 fvW-Eluat, Bande 7. an das Gelatine-Gel nicht gebundene Fraktion
Claims (6)
- PATENTANSPRÜCHE: 1 Verfahren zur Herstellung eines Konzentrates von standardisiertem, menschlichem von Willebrand-Faktor aus einer kryopräzipitierten, an Aluminiumhydroxid vorgereinigten Plasmafraktion, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kombination von drei aufeinanderfolgenden chromatographischen Reinigungsschritten umfasst, wobei die zwei ersten Schritte lonenaustauschchromatographien an einem Harz vom grosspongen, DEAE- Gruppen enthaltenden Vinylpolymer-Typ sind und der dritte eine Affinitätschromatographie an Gelatine-Sepharose ist.
- 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden lonenaustausch- EMI6.1 fuhrt werden, welche mit einem 0,01 M Trinatriumcitrat, 0,11 M Natriumchlorid, 0,001 M Calciumchlorid, 0,12 M Glycin und 0,016 M Lysin umfassenden Puffer aquilibriert worden sind
- 3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die kryopräzipitierte und vorgereinigte Plasmafraktion auf die erste Chromatographiesäule aufgebracht wird und dass der von Willebrand-Faktor, welcher auf dieser adsorbiert wird, durch eine Erhöhung der Natriumchloridkonzentration des Puffers auf 0,14-0,15 M eluiert wird
- 4 Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das an von Willebrand-Faktor angereicherte Eluat aus der ersten Chromatographie auf die zweite Chromatographiesäule aufgebracht wird und dass der von Willebrand-Faktor,welcher auf dieser adsorbiert wird, durch eine Erhöhung der Natriumchloridkonzentration des Puffers auf 0,15-0,17 M eluiert wird
- 5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das an von Willebrand-Faktor angereicherte Eluat aus der zweiten Chromatographie auf eine Gelatine-Sepharose-Chromatographiesaule, welche mit demselben Puffer wie dem Puffer der vorangehenden Elution äquilibriert worden ist und welche das verbliebene Fibronectin durch selektive Affinität adsorbiert, aufgebracht wird
- 6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der im Filtrat der Gelatine-Sepharose-Säule vorhandene von Willebrand-Faktor gewonnen, aufgearbeitet und lyophilisiert wird.
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