KR20120061898A - 출혈성 장애의 치료요법 및 예방 치료에 있어서의 비정맥내 투여를 위한 알부민 융합 응고 인자 - Google Patents

출혈성 장애의 치료요법 및 예방 치료에 있어서의 비정맥내 투여를 위한 알부민 융합 응고 인자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 출혈성 장애의 치료요법 및 예방 치료에 있어서의 비정맥내 투여를 위한, 알부민 융합 응고 인자를 포함하는 약제학적 제제 및 이를 알부민에 융합시켜 응고 인자의 비정맥 투여 후의 생체내 회복을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

출혈성 장애의 치료요법 및 예방 치료에 있어서의 비정맥내 투여를 위한 알부민 융합 응고 인자{Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders}
본 발명은 출혈성 장애의 치료요법 및 예방 치료에 있어서의 비정맥내 투여를 위한, 알부민 융합 응고 인자를 포함하는 약제학적 제제, 및 응고 인자를 알부민에 융합시켜 상기 응고 인자의 비정맥내 투여 후의 생체내 회복을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다.
수개의 재조합 치료 폴리펩타이드는 사람에서 치료용 및 예방용으로 시판중이다. 환자들은 일반적으로 재조합 활성 성분들의 작용의 특정 방식으로부터 혜택을 얻지만, 현재 시판중인 모든 응고 인자들은 정맥내 투여를 통해 투여되고, 이러한 정맥내 투여는 종종 주사 부위에서 감염을 유발하며, 특히 응고 과정에서 결함을 갖는 소아의 치료에서 일반적으로 환자들이 피하고 싶은 시술이다.
밸런스(Ballance) 등(국제공개공보 제WO 01/79271호)은, 사람 혈청 알부민에 융합되는 경우에 생체 내에서 기능성 반감기를 증가시키고 반감기를 연장시킬 것으로 예상되는 다수의 다양한 치료 폴리펩타이드의 융합 폴리펩타이드를 기술하고 있다. 각각의 알부민 융합 단백질이 실제로 생물학적 활성을 보유하고 특성을 개선시키는지에 대한 거의 모든 폴리펩타이드의 실험 데이터를 나타내지 않고 잠재적인 융합 파트너의 긴 목록을 기술하고 있다. 상기 치료 폴리펩타이드들의 목록 중에는 인자 IX 및 FVII/FVIIa가 예로서 언급된다. 알부민과 FIX 또는 FVII/FVIIa의 사이에 펩타이드 링커가 존재하는 FIX와 FVII/FVIIa의 융합체도 기재되어 있다. 그러나, 각각의 응고 인자가 비정맥내 투여되는 경우에 알부민 융합체가 치료를 개선시킬 수 있다는 것은 공개되어 있지 않다.
인자 VII 및 VIIa
FVII은 분자량이 50kDa인 단일쇄 당단백질이고, 이는 간 세포에 의해 혈류에 406개의 아미노산의 불활성 자이모겐(zymogen)으로 분비된다. FVII은, Arg152와 Ile153 사이에서 단일 펩타이드 결합을 단백질 가수분해시켜 1개의 이황화 가교에 의해 함께 유지되어 있는 2개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 N 말단 경쇄(24kDa) 및 C-말단 중쇄(28kDa)를 형성함으로써 이의 활성 형태인 인자 VIIa로 전환된다. 다른 비타민 K 의존성 응고 인자들과 대조적으로, 활성화 펩타이드는 활성화 동안 절단되지 않는다. 인자 VII의 활성화 절단은, 예를 들면, 인자 Xa, 인자 IXa, 인자 VIIa, 인자 XIIa, 인자 VII 활성화 프로테아제(Factor Seven Activating Protease; FSAP) 및 트롬빈에 의해 달성될 수 있다. 문헌[참조: Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505)]에 의하면, 일부 절단이 중쇄의 Arg290 및/또는 Arg315에서의 중쇄에 있어서도 발생하는 것으로 보고되었다.
인자 VII은 500ng/ml의 농도로 혈장에 존재한다. 약 1% 또는 5ng/ml의 인자 VII는 활성화 인자 VIIa로서 존재한다. 인자 VII의 말단 혈장 반감기는 약 4시간이고 인자 VIIa의 반감기는 약 2시간인 것으로 밝혀졌다.
생리학적 농도를 초과하는 농도의 인자 VIIa를 투여함으로써, 인자 VIIIa 및 인자 IXa를 필요로 하지 않는 지혈이 달성될 수 있다. 인자 VII에 대한 cDNA를 클로닝[참조: 미국 특허 제4,784,950호]함으로써, 활성화 인자 VII은 약제로서 개발될 수 있었다. 인자 VIIa는 1988년에 최초로 성공적으로 투여되었다. 그 이래로 인자 VIIa가 출혈을 정지시키는 범용 지혈제가 될 가능성을 보여주는 증거의 수가 꾸준하게 늘어났다[참조: Erhardtsen, 2002]. 그러나, 인자 VIIa의 말단 반감기가 약 2시간으로 짧고 생체내 회복이 감소하여 이의 적용을 제한하고 있다.
사람 FIX
비타민 K-의존성 폴리펩타이드 그룹 중의 일원인 사람 FIX는 분자량이 57kDa인 단일-쇄 당단백질로서, 간 세포에 의해 혈류에 415개의 아미노산의 불활성 자이모겐으로 분비된다. 이는 폴리펩타이드의 N-말단 Gla-도메인에 위치하는 12개의 γ-카복시-글루탐산 잔기를 함유한다. Gla 잔기는 이의 생합성을 위해 비타민 K를 필요로 한다. Gla 도메인 다음에, 2개의 표피 성장 인자 도메인, 즉 활성화 펩타이드 및 트립신-형 세린 프로테아제 도메인이 존재한다. 추가로, FIX의 해독 후 변형은 하이드록실화(Asp 64), N-(Asn157 및 Asn167), O-형 글리코실화(Ser53, Ser61 , Thr159, Thr169 및 Thr172), 황산화(Tyr155) 및 인산화(Ser158)를 포함한다.
FIX는, Arg145와 Ala146 사이 및 Arg180과 Val181 사이에서 활성화 펩타이드를 단백질 가수분해시켜 1개의 이황화 가교에 의해 함께 유지되어 있는 2개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 N-말단 경쇄(18kDa) 및 C-말단 중쇄(28kDa)를 형성함으로써 이의 활성 형태인 인자 IXa로 전환된다. 인자 IX의 활성화 절단은 시험관 내에서, 예를 들면, 인자 XIa 또는 인자 VIIa/TF에 의해 달성될 수 있다. 인자 IX는 5 내지 10μg/ml의 농도로 사람 혈장에 존재한다. 사람에서 인자 IX의 말단 혈장 반감기는 약 15 내지 18시간인 것으로 밝혀졌다[참조: White GC et al., 1997. Recombinant factor IX. Thromb Haemost. 78: 261-265; Ewenstein BM et al., 2002. Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant F IX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B. Transfusion 42:190-197].
B형 혈우병은 비기능성 인자 IX 또는 인자 IX의 결여로 인해 유발되며 혈장 유래의 인자 IX 농축물 또는 인자 IX의 재조합체 형태로 치료된다. B형 혈우병 환자는 종종 적어도 격주로 인자 IX를 예방 투여하여 자연 출혈을 방지하기 때문에, 적용된 인자 IX 생성물의 반감기를 증가시켜 투여 사이의 간격을 증가시키는 것이 바람직하며, 인자 IX의 정맥내 투여를 피하는 것이 바람직하다.
인자 VIII( FVIII )
FVIII은 분자량이 약 260kDa인 혈장 당단백질로서, 포유동물의 간에서 생성된다. 이는 혈액 응고를 일으키는 응고 반응 캐스케이드(cascade)의 중요한 성분이다. 이러한 캐스케이드에는, 인자 IXa(FIXa)가 FVIII과 함께 인자 X(FX)을 활성 형태인 FXa로 전환시키는 단계가 있다. FVIII은 이 단계에서 보조인자로 작용하고, FIXa의 활성을 위해 칼슘 이온과 인지질을 필요로 한다. 가장 일반적인 혈우병 장애는 A형 혈우병으로 불리는 기능성 FVIII의 결여로 인해 유발된다.
A형 혈우병 치료에서의 중요한 진전은 사람 FVIII의 완전한 2,351개 아미노산 서열을 암호화하는 cDNA 클론을 분리한 것(미국 특허 제4,757,006호)과 사람 FVIII 유전자 DNA 서열 및 이의 생산을 위한 재조합 방법을 제공한 것이다.
클로닝된 cDNA로부터 결정된 사람 FVIII의 추론된 1차 아미노산 서열의 분석에 의하면, FVIII은 더 큰 전구체 폴리펩타이드로부터 가공처리된 이종이량체(heterodimer)인 것으로 나타난다. 이러한 이종이량체는 약 210kDa의 N-말단 중쇄 단편과 금속 이온 의존성 결합된 약 80kDa의 C-말단 경쇄로 이루어진다[참조: Kaufman, Transfusion Med. Revs. 6:235(1992)]. 이종이량체의 생리학적 활성화는 트롬빈에 의한 단백질 쇄의 단백질 가수분해 절단을 통해 일어난다. 트롬빈은 상기 중쇄를 90kDa의 단백질로, 이어서 54kDa과 44kDa의 단편으로 절단한다. 또한, 트롬빈은 80kDa의 경쇄를 72kDa의 단백질로 절단한다. 활성 FVIII을 구성하는 것은 후자의 단백질과, 칼슘 이온에 의해 함께 유지되어 있는 2개의 중쇄 단편(상기 54kDa 및 44kDa)이다. 불활성화는 상기 72kDa 및 54kDa의 단백질이 트롬빈, 활성화 단백질 C 또는 FXa에 의해 추가 절단될 때 일어난다. 혈장에서, 이러한 FVIII 복합체는 50배 과량의 VWF 단백질("VWF")과 결합하여 안정화되는데, 이러한 단백질은 전술한 바와 같은 FVIII의 단백질 가수분해에 의한 파괴를 억제하는 것으로 보인다.
FVIII의 아미노산 서열은 3개의 구조 도메인, 즉 330개 아미노산의 삼중 A 도메인, 980개 아미노산의 단일 B 도메인 및 150개 아미노산의 이중 C 도메인으로 조직되어 있다. 상기 B 도메인은 다른 단백질들과 상동성이 전혀 없으며, 이러한 단백질에서의 25개의 잠재적 아스파라긴(N)-결합된 글리코실화 부위 중 18개를 제공한다. 상기 B 도메인은 응고에 뚜렷한 기능을 하지 않아 결실될 수 있고, B-도메인 결실된 FVIII 분자는 여전히 응고촉진 활성을 갖는다.
폰 빌레브란트 인자( VWF ; Von Willebrand Factor )
VWF는 포유동물의 혈장에서 존재하는 다량체 부착성 당단백질로서, 복수의 생리학적 기능을 갖고 있다. 1차 지혈 동안, VWF는 혈소판 표면의 특이적인 수용체와 콜라겐과 같은 세포외 매트릭스 성분 사이에서 매개체로서 작용한다. 더욱이, VWF는 응고촉진성 FVIII에 대한 담체 및 안정화 단백질로서 작용한다. VWF는 내피 세포와 거대핵세포에서 2813개의 아미노산 전구체 분자로서 합성된다. 전구체 폴리펩타이드인 pre-pro-VWF는 22개 잔기의 신호 펩타이드, 741개 잔기의 프로펩타이드 및 성숙 혈장 VWF에서 발견되는 2050개 잔기의 폴리펩타이드로 이루어진다[참조: Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994]. 혈장에 분비되면, VWF는 분자 크기가 상이한 다양한 종의 형태로 순환한다. 이러한 VWF 분자들은 2050개의 아미노산 잔기로 이루어진 성숙 서브유닛의 올리고머 및 다량체로 이루어져 있다. VWF는 하나의 이량체 내지는 50 내지 100개의 이량체로 이루어진 다량체로서 혈장에서 일반적으로 발견될 수 있다[참조: Ruggeri et al., Thromb. Haemost. 82: 576-584, 1999]. 사람 혈행 중에서 사람 VWF의 생체내 반감기는 약 12 내지 20시간이다.
사람에서 가장 흔한 유전성 출혈성 장애는 폰 빌레브란트 질환(VWD)이며, 이러한 질환은 혈장 기원 또는 재조합체 기원의 VWF를 함유하는 농축물에 의한 대체 치료요법으로 치료될 수 있다.
VWF는, 예를 들면, 유럽 특허 제EP 05503991호에 기술된 바와 같이 사람 혈장으로부터 제조될 수 있다. 유럽 특허 제EP 0784632호에는 재조합 VWF를 분리하는 방법이 기재되어 있다.
VWF는 생체 내에서 FVIII를 안정화시키는 것으로 알려져 있고, 따라서 FVIII의 혈장 수준을 조절하는데 중요한 역할을 하며, 결과적으로 1차 및 2차 지혈을 조절하는 중심 인자이다. 또한, VWF를 함유하는 약제학적 제제를 VWD 환자에게 정맥내 투여한 후에는 내인성 FVIII:C가 24시간 내에 1ml당 1 내지 3유닛까지 증가하는 것을 관찰할 수 있고, 이는 FVIII에 대한 VWF의 생체내 안정화 효과를 증명한다.
오늘날까지, A형 혈우병과 VWD의 표준 치료는 FVIII 및 VWF 농축 제제의 빈번한 정맥내 주입을 수반한다. B형 혈우병의 치료는 인자 IX의 격주 투여를 필요로 하며, FVIIa에 의한 억제제 환자의 치료에서는 출혈을 방지하기 위해 FVIIa의 매주 복수회 투여가 사용된다.
이러한 대체 치료요법은 일반적으로 효과적이지만, 예를 들면, 예방 처치를 받고 있는 중증 A형 혈우병 환자의 경우에는 인자 VIII의 혈장 반감기가 약 12시간으로 짧기 때문에 인자 VIII을 매주 약 3회 정맥내(i.v.) 투여해야 한다. 예를 들면, FVIII 수준을 0.01U/ml씩 상승시켜 FVIII 활성의 수준이 비혈우병 환자의 FVIII 활성의 1% 이상이 되면, 중증 A형 혈우병은 온화한 A형 혈우병으로 전환된다. 예방적 치료요법에서, 용량 요법은 FVIII 활성의 최저 수준이 비혈우병 환자의 FVIII 활성의 2 내지 3% 농도 아래로 떨어지지 않도록 설계된다.
정맥내 투여를 통한 응고 인자의 투여는 특히 A형 혈우병 진단을 받은 소아의 부모 또는 환자 본인에 의해 대부분 가정 치료로 수행되기 때문에 번거롭고 통증과 관련되며 감염 위험을 수반한다. 또한, 빈번한 정맥내 주사는 불가피하게 주사 자국을 형성하여, 향후 주입을 방해한다. 중증 혈우병의 예방 처치는 생애 초기에, 즉 종종 2살 미만의 소아에게 시작되기 때문에, 이러한 작은 환자들의 정맥에 FVIII을 매주 3회 주사하기는 더욱더 어렵다. 제한된 기간 동안, 포트 시스템(port system)의 이식이 대안으로 제공될 수 있다. 감염이 반복적으로 일어날 수 있고 포트가 운동 중에 불편을 유발할 수 있다는 사실에도 불구하고, 상기 포트 시스템은 일반적으로 정맥내 주사에 비해 유리한 것으로 여겨진다.
따라서, 응고 인자를 정맥내로 주입할 필요성을 제거하는 의학적 요구가 크다.
본 발명은 출혈성 장애의 치료요법 및 예방 치료에 있어서의 비정맥내 투여를 위한, 알부민 융합 응고 인자를 포함하는 약제학적 제제, 및 응고 인자를 알부민에 융합시켜 상기 응고 인자의 비정맥내 투여 후의 생체내 회복을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다.
바람직한 응고 인자는 비타민 K-의존성 응고 인자, 및 이들의 단편 및 변이체이다. FVIIa, FIX, 및 이들의 단편 및 변이체가 더욱 더 바람직하다. 또한, 알부민-융합 FVIII 및 VWF, 피브리노겐, 인자 II, 인자 X, 인자 XIII, 트롬빈, 프로트롬빈 및 단백질 C도 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
알부민 융합 응고 인자를 포함하는 제형은 바람직하게는 피하 투여된다. 그러나, 다른 방식의 모든 비정맥내 투여, 예를 들면, 근육내 투여 또는 피내 투여가 포함된다.
상기 응고 인자는 본 발명의 특정 양태에서 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 링커를 통해 알부민에 융합될 수 있다.
본 발명의 요지는 특히 비타민 K-의존성 폴리펩타이드 인자 VII 및 알부민에 의해 입증된다. 본 발명은 또한 기타 응고 인자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알부민-융합 응고 인자를 암호화하는 cDNA에 관한 것이다. 각각의 응고 인자를 암호화하는 cDNA는 유전자상으로 사람 혈청 알부민을 암호화하는 cDNA 서열에 융합되며, 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 개재 펩타이드 링커를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결될 수 있다. 본 발명은 또한 비정맥내 투여를 위한 이러한 융합 cDNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터의 용도에 관한 것이다. 이는, 예를 들면, 알부민-융합 응고 인자를 암호화하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터의 근육내 주사를 통한 유전자 치료요법일 수 있다.
도 1: 300μg/kg의 rVIIa-FP 및 NovoSeven®에 따른 경시 FVII:Ag 혈장 농도(풀; n=3/시점; 리니어 스케일)
도 2: 300μg/kg의 rVIIa-FP 및 NovoSeven®에 따른 경시 FVII:Ag 혈장 농도(풀; n=3/시점; 로그-리니어 스케일)
도 3: 610μg/kg의 rIX-FP 및 Berinin®에 따른 경시 FIX:Ag 혈장 농도(풀; n=5/시점; 리니어 스케일)
도 4: 610μg/kg의 rIX-FP 및 Berinin®에 따른 경시 FIX:Ag 혈장 농도(풀; n=5/시점; 로그-리니어 스케일)
본 발명의 맥락에서의 "알부민-융합 응고 인자"란, 생성된 융합 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 동일한 비융합 응고 인자와 비교하여 증가되고 비정맥내 투여 후의 생체내 회복이 동일한 비융합 응고 인자의 비정맥내 투여 후의 생체내 회복과 비교하여 증가되는, 사람 알부민과 응고 인자의 유전자 융합체를 의미한다.
본 발명의 바람직한 양태는 비정맥내 투여 후의 생체내 회복이 동일한 비-융합 응고 인자의 비정맥내 투여 후의 생체내 회복과 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 100% 이상, 더욱 더 바람직하게는 200% 이상 증가되는 알부민-융합 응고 인자이다.
"비-정맥내 투여 후의 생체내 회복"이란, 비정맥내 투여 후 혈장에서 발견될 수 있는 생물학적 활성 응고 인자의 양을 의미한다.
비정맥내 투여 후의 생체내 회복은 당해 기술분야에 공지되어 있는 각각의 응고 인자의 생물학적 활성을 측정하기 위한 분석적 응고 관련 검정법을 사용하여, 예를 들면, "곡선 아래의 면적" 또는 "피크 혈장 농도"로서 측정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서의 "생체내 회복"이란, 생성물의 투여 직후 혈액 또는 혈장에서 발견되는 생성물의 양을 의미한다. 그러므로, 일반적으로 생체내 회복의 검출의 경우, 혈장 함량은 생성물의 투여 후, 예를 들면, 15분, 60분, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 또는 20시간에 측정된다.
본 발명의 맥락에서의 "응고-관련 검정"이란 응고 과정에서 관련되는 효소 활성 또는 보조인자 활성을 측정하거나, 내인성 또는 외인성 응고 캐스테이드가 활성화되었는지를 측정할 수 있는 임의의 검정이다. 따라서, "응고 관련" 검정이란 aPTT, PT 또는 트롬빈 생성 검정과 같은 직접적인 응고 검정일 수 있다. 그러나, 특정 응고 인자에 적용되는 발색 검정과 같은 기타 검정도 또한 포함된다. 이러한 검정 또는 상응하는 시약에 대한 예로는 상응하는 응고 인자 결여 혈장(Dade Behring)을 함유하는 Pathromtin® SL(aPTT 검정, Dade Behring) 또는 Thromborel® S(프로트롬빈 시간 검정, Dade Behring); 예를 들면, 응고 인자 결여 혈장을 사용하는 트롬빈 생성 검정 키트(Technoclone, Thrombinoscope); Biophen Factor IX(Hyphen BioMed), Staclot® FVIIa-rTF(Roche Diagnostics GmbH), Coatest® Factor VIII:C/4(Chromogenix) 또는 기타와 같은 발색 검정이 있다.
생물학적 활성 응고 인자를 측정하기 위한 대용으로서, 각각의 응고 인자의 항원의 양도 또한 측정될 수 있다. 항원 수준은 바람직하게는 ELISA 시험과 같은 기술에 의해 측정된다.
본 발명의 맥락에서의 "응고 인자"란, 1차 또는 2차 지혈에 기여할 수 있는 임의의 폴리펩타이드이다. "응고 인자"에는 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 폰 빌레브란트 인자, 인자 V, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 인자 I, 인자 II(프로트롬빈), 단백질 C, 단백질 S, GAS6, 또는 단백질 Z 및 이들의 활성 형태들로 이루어진 폴리펩타이드가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 유용한 응고 인자는 야생형 폴리펩타이드일 수 있거나 돌연변이를 함유할 수 있다. 글리코실화 또는 기타 해독 후 변형의 정도 및 위치는 선택되는 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 성질에 따라 달라질 수 있다. 특정 아미노산 서열에 관한 경우, 이러한 서열의 해독 후 변형은 본원에 포함된다.
알부민
본원에서 사용되는 "알부민"이란, 총체적으로 알부민 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 알부민의 하나 이상의 기능성 활성(예를 들어, 생물학적 활성)을 갖는 변이체를 의미한다. 특히, "알부민"이란, 사람 알부민 또는 이의 단편, 특히 본원에서 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 성숙 형태의 사람 알부민, 기타 척추동물 기원의 알부민 또는 이들의 단편, 또는 이러한 분자 또는 이들의 단편의 유사체 또는 변이체를 의미한다.
알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 상기된 바와 같은 전장의 HA 서열을 포함할 수 있거나, 치료 활성을 안정화시키거나 연장시킬 수 있는 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 길이가 10개 이상인 아미노산일 수 있거나, HA 서열 기원의 약 15, 20, 25, 30, 50개 또는 그 이상의 연속 아미노산을 포함할수 있거나, HA의 특정 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 정상적인 HA의 천연 또는 인공 변이체일 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 폴리펩타이드 부분은 또한 본원에 기재된 바와 같은 상응하는 치료 폴리펩타이드의 변이체일 수도 있다. 용어 "변이체"는 보존 또는 비보존적이고 천연 또는 인공적인 삽입, 결실 및 치환을 포함하며, 이때 이러한 변화들은 치료 폴리펩타이드의 치료 활성을 부여하는 활성 부위 또는 활성 도메인을 실질적으로 변화시키지 않는다.
특히, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 사람 알부민 및 사람 알부민 단편의 천연적으로 존재하는 다형성 변이체를 포함할 수 있다. 상기 알부민은 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를 들어, 사람, 소, 양 또는 돼지로부터 유래할 수 있다. 비포유동물 알부민에는 암탉 및 연어가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 알부민 결합 폴리펩타이드에서 치료 폴리펩타이드 부분 이외의 알부민 부분은 상이한 동물로부터 유래할 수 있다.
일반적으로 말해서, 알부민 단편 또는 변이체는 10개 이상, 바람직하게는 40개 이상, 가장 바람직하게는 70개 이상의 아미노산 길이이다. 알부민 변이체는 우선적으로 알부민의 하나 이상의 온전한 도메인 또는 상기 도메인의 단편, 예를 들면, 도메인 1(서열번호 1의 아미노산 1번 내지 194번), 도메인 2(서열번호 1의 아미노산 195번 내지 387번), 도메인 3(서열번호 1의 아미노산 388번 내지 585번), 도메인 1+2(서열번호 1의 1번 내지 387번), 도메인 2+3(서열번호 1의 195번 내지 585번) 또는 도메인 1+3(서열번호 1의 아미노산 1번 내지 194번 + 서열번호 1의 아미노산 388번 내지 585번)으로 이루어지거나, 이들을 포함할 수 있다. 각각의 도메인 자체는 2개의 상동성 서브도메인, 즉 1번 내지 105번, 120번 내지 194번, 195번 내지 291번, 316번 내지 387번, 388번 내지 491번 및 512번 내지 585번으로 구성되고, 잔기 Lys106 내지 Glu119, Glu292 내지 Val315 및 Glu492 내지 Ala511을 포함하는 가요성 상호-서브도메인 링커 영역을 갖는다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 HA 또는 이의 보존적 변형체의 서브도메인 또는 도메인을 하나 이상 포함할 수 있다.
알부민의 모든 단편 또는 변이체가 비융합 응고 인자와 비교하여 혈장에서의 치료 융합 단백질의 반감기를 25% 이상 연장시키는 한, 본 발명은 응고 인자의 융합 파트너로서 상기 알부민의 모든 단편 및 변이체를 포함한다.
본원에 사용되는 "알부민 융합 응고 인자"란, 각각의 응고 인자의 활성 형태 및 비활성 형태를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명에 사용되는 "알부민 융합 응고 인자"에는 자연 응고 인자 및 알부민의 아미노산 서열을 각각 갖는 단백질이 포함된다. 또한, 이는 약간 변형된 아미노산 서열, 예를 들면, N-말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N 말단을 갖는 단백질을 포함하는데, 이러한 단백질은 각각의 응고 인자의 생물학적 활성을 실질적으로 보유해야 한다. 상기 정의에서의 "알부민 융합 응고 인자"는 또한 개체마다 존재하고 발생할 수 있는 천연 대립 변이체도 포함한다. 상기 정의에서의 "알부민 융합 응고 인자"는 추가로 각각의 응고 인자 및 알부민의 변이체도 포함한다. 이러한 변이체는 야생형 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이하다. 이러한 차이의 예로는 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들면, 1 내지 10개의 아미노산 잔기)의 N- 및/또는 C-말단의 절단, 또는 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 잔기의 부가, 예를 들면, N- 말단에서 메티오닌 잔기의 부가, 및 보존적 아미노산 치환, 즉 유사한 특징을 갖는 아미노산 그룹, 예를 들어, (1) 소형 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산 및 (6) 방향족 아미노산 내에서 수행되는 치환이 포함된다. 이러한 보존적 치환의 예는 하기의 표에 나타낸다.
(1) 알라닌 글리신
(2) 아스파르트산 글루탐산
(3a) 아스파라긴 글루타민
(3b) 세린 트레오닌
(4) 아르기닌 히스티딘 라이신
(5) 이소류신 류신 메티오닌 발린
(6) 페닐알라닌 타이로신 트립토판
일반적으로 말단 반감기 또는 β-반감기로서 측정되는 본 발명의 융합 단백질의 생체내 반감기는 비융합 폴리펩타이드의 생체내 반감기보다 통상적으로 약 25% 이상, 바람직하게는 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 100% 이상 더 길다.
바람직한 양태에서의 링커 영역은 투여될 응고 인자의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는데, 이들은 발현된 융합 단백질의 신생항원 특성(사람 단백질에 존재하지 않는 치료 항원 내에서의 펩타이드의 발생으로 인한 신규의 강력한 면역원성 에피토프의 형성)의 위험을 감소시켜야 한다. 또한, 응고 인자가 (예를 들면, 단백질 가수분해에 의해 활성화될 필요가 있는) 자이모겐인 경우, 펩타이드 링커 절단의 동력학은 자이모겐의 응고 관련 활성화 동력학을 보다 면밀히 반영할 것이다. 따라서, 이러한 바람직한 양태에서, 자이모겐 및 상응하는 링커는 유사한 동력학으로 활성화되고 각각 절단된다. 이러한 이유로, 본 발명은 또한 특히 자이모겐과 알부민의 융합 단백질에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 링커 펩타이드는 1개 이상의 프로테아제를 위한 절단 부위를 포함한다. 이는 다양한 프로테아제에 의해 동일 위치에서 절단될 수 있는 링커 펩타이드 또는 2개 이상의 다양한 절단 부위를 제공하는 링커 펩타이드에 의해 달성될 수 있다. 이는 치료 융합 단백질이 단백질 가수분해에 의한 절단에 의해 활성화되어 효소 활성을 달성해야 하고 다양한 프로테아제가 이러한 활성화 단계에 기여할 수 있는 유리한 환경일 수 있다. 이는 FXIa 또는 FVIIa/조직 인자(Tissue Factor; TF)에 의해 달성될 수 있는 경우(예를 들면, FIX의 활성화시)이다.
본 발명의 바람직한 양태는 펩타이드 링커가 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 치료 융합 단백질인데, 이러한 프로테아제는 응고 인자를 활성화시키고, 이로 인해 상기 링커의 절단이 응고 발생 부위에서 응고 인자의 활성화와 연관되어 있음을 보장한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 치료 융합 단백질은 펩타이드 링커가 치료 융합 단백질의 일부인 응고 인자에 의해 절단될 수 있는 것들인데, 이러한 응고 인자는 일단 활성화되고, 이로 인해 상기 융합 단백질의 절단이 응고 현상과 관련되어 있음을 보장한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 치료 융합 단백질은 펩타이드 링커가 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 것들인데, 이러한 치료 융합 단백질 자체는 치료 융합 단백질의 일부인 응고 인자의 활성에 의해 직접 또는 간접적으로 활성화되고, 이로 인해 상기 융합 단백질의 절단이 응고 현상과 관련되어 있음을 보장한다.
가장 바람직한 치료 융합 단백질의 한 부류는 펩타이드 링커가 FXIa 및/또는 FVIIa/TF에 의해 절단될 수 있는 것들이며, 응고 인자는 FIX이다.
본 발명의 또 다른 양태는 비정맥 투여를 위한 알부민 융합 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물의 용도이다. 투여 방식은 우선적으로 피하 투여이지만, 모든 혈관외 투여 경로를 포함한다. 상피 표면(예를 들면, 피부)을 통한 투여도 또한 포함된다. 패치를 통한 적용은 특히 임상적으로 유용하다. 이러한 국소 투여는 피부를 통한 흡수를 요하지만, 표면 마찰 및 타고난 피부에 의해 상당히 현저해질 수 있고, 이는 점안제 및 비강 적용제를 포함할 수 있다. 상피 표면을 통한 투여는 흡입을 포함하는데, 이러한 흡입은 단백질로 덮인 대단히 큰 표면으로 인해 적합하며, 이로 인해 간의 신속한 흡수 및 우회를 야기한다. 상피 표면에 대한 투여는 구강 내에서 또는 설하에서 유지되는 용량 형태, 즉 협측 또는 설하 용량 형태, 심지어 가능하다면 츄잉검 형태를 포함한다. 구강의 pH는 비교적 중성(산성의 위 환경과 대조적임)이기 때문에, 이는 FVIII과 같은 불안정한 단백질에 유리하다. 또한, 직장에서 배출되는 정맥의 일부가 대순환으로 직접 이어지기 때문에, 질 투여 및 심지어 직장 투여도 고려될 수 있다. 일반적으로, 이는 어린 소아와 같이 경구 경로를 통해 물질을 섭취할 수 없는 환자에게 가장 도움이 된다.
피내 주사(피부에서)는 더욱 침습적인 투여 방식이지만, 훈련된 사람에 의한 도움이나 심지어 실행 없이 치료하기에는 여전히 적합하다. 피내 투여 후에는 피하 주사(피부 바로 아래)가 이어질 수 있다. 일반적으로, 흡수는 상당히 실질적이며, 주사 부위를 가온하거나 마사지함으로써 증가될 수 있다. 또는, 혈관을 수축시켜 반대 거동을 야기할 수 있다, 즉 흡수를 감소시키지만 효과를 연장시킬 수 있다.
더욱더 침습적인 혈관외 투여는 근육내 전달(근육 바디 내로)을 포함한다. 이는 지방조직을 피해감으로써 이익을 제공하지만, 일반적으로 피하 주사보다 더 고통스럽고, 특히 주사로 개선될 결핍성 응고계를 특징으로 하는 환자의 경우에는 출혈을 유발하는 조직 병변의 위험이 있다.
본 발명의 응고 인자는 치료적 유효 용량으로 환자에게 투여되는데, 이러한 용량은 견딜 수 없는 부작용을 나타내는 용량에 도달하지 않고 치료되는 병태 또는 증상의 중증도 또는 확산을 방지하거나 경감시키거나 원하는 효과를 나타내기에 충분한 용량을 의미한다. 정확한 용량은 다수의 인자들, 예를 들면, 증상, 제형, 투여 방식에 따라 달라지며, 각각의 증상마다 임상전 시험 및 임상 시험으로 결정되어야 한다.
본 발명의 응고 인자는 가족성 또는 후천성 A형 및 B형 혈우병, 가족성 또는 후천성 폰 빌레브란트 질환, 모든 유형의 외상(단일 장기, 골 분획 또는 다발성 외상으로부터의 중증 출혈을 유발하는 둔기 외상 또는 관통 외상), 수술중 또는 수술후 출혈을 포함한 외과적 처치 동안의 출혈, 소아 심장 수술에서 체외 순환 및 혈액 희석을 받는 환자를 포함한 심장 수술에 의한 출혈, 뇌내 출혈, 지주막하 출혈, 경막하 또는 경막외 출혈, 감염 환자에서 응고 인자의 수준을 감소시키는 비원형질 용적 치환에 의한 혈액 손실 및 혈액 희석으로 인한 출혈, 파종성 혈관내 응고(Disseminated Intravascular Coagulation; DIC) 및 소모성 응고병, 혈소판 기능장애, 고갈 및 응고병으로 인한 출혈, 간 경화, 간 기능장애, 전격성 간 부전 및 간 질환 환자에서의 간 생검으로 인한 출혈, 간 및 기타 장기 이식 후의 출혈, 위 정맥류로 인한 출혈 및 소화성 궤양 출혈, 기능장애 자궁 출혈(Dysfunctional Uterine Bleeding; DUB), 태반의 조기 박리, 저체중 출생아의 뇌실주위 출혈, 분만 후 출혈, 신생아의 치명적 고통과 같은 부인과 출혈, 화상과 관련된 출혈, 아밀로이드증과 관련된 출혈, 혈소판 장애와 관련된 조혈모세포 이식, 악성 종양과 관련된 출혈, 출혈성 바이러스에 의한 감염, 췌장염과 관련된 출혈을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 알부민 융합 응고 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"이란, 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA이거나 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA이거나 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"는 또한 이노신과 같은 하나 이상 변형된 염기 및/또는 특이한 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA도 포함한다. 각종 변형은 당업자에게 공지되어 있는 다수의 유용한 목적을 제공하는 DNA 및 RNA에 대하여 이루어질 수 있는 것으로 인식된다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 이러한 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 화학적 형태의 DNA 및 RNA 특징의 바이러스 및 세포(예를 들면, 단순 및 복합 세포 포함)를 포함한다.
당업자는 유전자 암호의 축퇴로 인해, 소정의 폴리펩타이드가 다양한 폴리뉴클레오타이드들에 의해 암호화될 수 있음을 이해한다. 이러한 "변이체"는 본 발명에 포함된다.
바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 정제된 폴리뉴클레오타이드이다. 용어 "정제된" 폴리뉴클레오타이드란, 이에 한정되는 것은 아니지만 기타 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA와 같은 기타 핵산 서열이 실질적으로 없는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 정제된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 통상적인 핵산 정제 방법은 정제된 폴리뉴클레오타이드를 수득하는데 사용될 수 있다. 상기 용어는 또한 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학 합성 폴리뉴클레오타이드도 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 용도이다. 바람직하게, 상기 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터이다. 특정 양태에서, 상기 벡터는 사람 유전자 치료요법에서 사용하기 위한 전이 벡터이다.
글리코실화 또는 기타 해독 후 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 성질에 따라 달라질 수 있다. 특정 아미노산 서열을 언급할 때, 이러한 서열의 해독 후 변형도 본원에 포함된다.
용어 "재조합체"란, 예를 들면, 변이체가 유전자 조작 기술에 의해 숙주 유기체에서 생산되는 것을 의미한다. 본 발명의 FVIII 또는 VWF 변이체는 일반적으로 재조합 변이체이다.
제안된 변이체의 발현:
적합한 숙주 세포에서 재조합 단백질의 고수준의 생산은, 전술한 변형 cDNA가 당업자에게 공지된 방법에 따라 다양한 발현계에서 번식될 수 있는 재조합 발현 벡터에서 적당한 조절 요소와 함께 효율적인 전사 단위로 조립되는 것을 필요로 한다. 효율적인 전사 조절 요소는 천연 숙주로서 동물 세포를 갖는 바이러스로부터 또는 동물 세포의 염색체 DNA로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 시미안 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스 또는 라우스 육종 바이러스의 장 말단 반복 유래의 프로모터-인핸서 조합체, 또는 베타 액틴 또는 GRP78과 같은 동물 세포에서 강하게 구성적으로 전사된 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합체가 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사된 mRNA의 안정한 고수준을 달성하기 위해, 전사 단위는 이의 3'-근접 부분에 전사 말단화 폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 포함해야 한다. 이러한 서열은 시미안 바이러스 40의 조기 전사 영역, 토끼 베타 글로빈 유전자 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성인자 유전자로부터 유래되는 것이 바람직하다.
그 다음, cDNA는 본 발명의 알부민 융합 응고 인자의 발현에 적합한 숙주 세포주의 게놈 내에 통합된다. 상기 세포주는 바람직하게는 정확한 접힘, Gla 도메인 합성, 이황화 결합 형성, 아스파라긴 연결된 글리코실화, O 연결된 글리코실화 및 기타 해독 후 변형뿐만 아니라 배양 배지로의 분비를 보장하기 위해 척추동물 기원의 동물 세포주이어야 한다. 기타 해독 후 변형의 예로는 초기 폴리펩타이드 쇄의 하이드록실화 및 단백질 가수분해적 가공이 있다. 사용될 수 있는 세포주의 예로는 원숭이 COS 세포, 마우스 L 세포, 마우스 C127 세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아 신장 293 세포 및 햄스터 CHO 세포가 있다.
상응하는 cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 수개의 상이한 방식으로 동물 세포주에 도입될 수 있다. 예를 들면, 재조합 발현 벡터는 다양한 동물 바이러스에 기초한 벡터로부터 생성될 수 있다. 이의 예로는 바큘로바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스에 기초한 벡터가 있고, 소 유두종 바이러스가 바람직하다.
상응하는 DNA를 암호화하는 전사 단위는 또한 상기 세포에서 우성의 선택성 마커로 작용할 수 있는 또 다른 재조합 유전자와 함께 동물 세포에도 도입될 수 있고, 이것은 이의 게놈 내에 재조합 DNA를 통합한 특정 세포 클론의 분리를 용이하게 하기 위해 이들 세포에서 우성의 선택성 마커로서 작용할 수 있다. 이러한 유형의 우성의 선택성 마커 유전자의 예로는 제네티신(G418)에 대한 내성을 부여하는 Tn5 아미노 글리코사이드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 퓨로마이신에 대한 내성을 부여하는 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제가 있다. 이러한 선택성 마커를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 목적하는 단백질의 cDNA를 암호화하는 벡터와 동일 벡터 상에 존재하거나, 숙주 세포의 게놈 내에 동시에 도입되고 통합되는 별도의 벡터 상에서 암호화되어 종종 다양한 전사 단위 사이에서 단단한 물리적 결합을 유발할 수 있다.
목적하는 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 기타 유형의 선택성 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase; dhfr)를 암호화하는 다양한 전사 단위를 기본으로 한다. 이러한 유형의 유전자가 내인성 dhfr 활성 결핍 세포, 우선적으로는 CHO 세포(DUKX-B11, DG-44) 내에 도입된 후, 상기 세포는 뉴클레오사이드 결여 배지에서 성장할 수 있게 된다. 이러한 배지의 예는 하이포크산틴, 티미딘 및 글리신이 없는 햄 F12(Ham's F12)이다. 이러한 dhfr 유전자는 동일한 벡터 상에 연결되거나 상이한 벡터 상에 연결된 상기 유형의 CHO 세포 내에 응고 인자 cDNA 전사 단위와 함께 도입되어, 재조합 단백질을 생산하는 dhfr 양성 세포주를 생성할 수 있다.
상기 세포주가 세포독성 dhfr 저해제인 메토트렉세이트의 존재 하에서 성장하면, 메토트렉세이트에 내성인 새로운 세포주가 나타날 것이다. 이러한 세포주는 연결된 dhfr과 목적하는 단백질의 전사 단위의 증폭된 수로 인해 재조합 단백질을 증가된 속도로 생산할 수 있다. 이러한 세포주를 메토트렉세이트의 증가 농도(1 내지 10000nM)에서 번식시킬 때, 목적하는 단백질을 매우 높은 속도로 생산하는 새로운 세포주가 수득될 수 있다.
목적하는 단백질을 생산하는 상기 세포주는 현탁 배양으로 또는 다양한 고체 지지체 상에서 대규모로 증식될 수 있다. 이러한 지지체의 예로는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스를 기본으로 하는 마이크로 담체, 또는 다양한 세라믹 재료 또는 중공 섬유 형태의 고체 지지체가 있다. 세포 현탁 배양으로 또는 마이크로 담체에서 성장될 때, 상기 세포주의 배양은 욕조 배양으로 수행하거나, 연장된 기간에 걸쳐 조건 배지의 연속 생산에 의한 관류 배양으로 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 상기 세포주는 목적하는 재조합 단백질을 생산하기 위한 산업 공정의 개발에 충분히 적합하다.
상기 유형의 분비성 세포의 배지에 축적되는 재조합 단백질은 세포 배양 배지 중에서 목적하는 단백질과 기타 물질 사이에서 크기, 하전, 소수성, 용해도, 특이적인 친화력 등의 차이를 이용하는 방법을 포함한 다양한 생화학 및 크로마토그래피 방법으로 농축 및 정제될 수 있다.
이러한 정제의 예는 고체 지지체 상에 고정된 단일클론 항체에 대한 재조합 단백질의 흡착이다. 탈착 후, 단백질은 상기 특성에 기초한 다양한 크로마토그래피 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다.
본 발명의 변형된 생물학적 활성의 알부민 융합 응고 인자를 80% 이상의 순도, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 순도로 정제하는 것이 바람직하고, 오염성 거대분자, 특히 기타 단백질 및 핵산에 관하여 순도가 99.9% 이상이고 감염성 및 발열성 물질이 없는 약제학적으로 순수한 상태인 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 분리 또는 정제된 변형된 생물학적 활성의 알부민 융합 응고 인자는, 기타 치료 단백질과의 배합물로 투여되어야만 하는 경우 외에는, 기타 폴리펩타이드가 실질적으로 없는 것이 바람직하다.
본 발명에 기재된 알부민 융합 응고 인자는 치료용의 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 정제된 단백질은 약제학적 제제를 제공하기 위해 임의로 약제학적 부형제가 첨가될 수 있는 통상적으로 생리학적으로 혼화성인 수성 완충 용액에 용해될 수 있다.
이러한 약제학적 담체 및 부형제 뿐만 아니라 적합한 약제학적 제제는 당업계에 공지되어 있다[참조: "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis(2000) 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press(2000)]. 구체적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조 형태 또는 안정한 가용성 형태로 제형화될 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제형은 사용 전에 주사용 멸균수 또는 멸균 생리학적 식염수 용액과 같은 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제를 첨가하여 재구성시킨다.
이러한 조성물 제형은 임의의 약제학적으로 적합한 비정맥내 투여 수단에 의해 개체에 전달된다. 다양한 전달 시스템은 공지되어 있으며, 임의의 편리한 경로를 통해 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비내 또는 경피 투여용으로 제형화되는 것이 바람직하고, 통상적인 방법에 따라 피하, 근육내 또는 경피 투여용으로 제형화되는 것이 가장 바람직하다. 이러한 제형은 주입 또는 일시 주사에 의해 연속 투여될 수 있다. 이러한 제형은 서방출 시스템을 포함한다.
본 발명의 알부민 융합 응고 인자는 치료적 유효 용량으로 환자에게 투여되는데, 이러한 용량은 견딜 수 없는 부작용을 나타내는 용량에 도달하지 않고 치료되는 병태 또는 증상의 중증도 또는 확산을 방지하거나 경감시키는 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 용량을 의미한다. 정확한 용량은 다수의 인자들, 예를 들면, 증상, 제형, 투여 방식에 따라 달라지며, 각각의 증상마다 임상전 시험 및 임상 시험으로 결정되어야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 동일한 약제의 일부로서 혼입될 수 있다.
실시예
실시예 1: 랫트에서 피하 투여된 rVIIa - FP 의 생체이용성 평가
첫 번째 실시예에 요약된 실험의 목표는 rVIIa-FP(사람)에 의한 혈관외 주사가 개선된 치료요법에 대한 선택일 수 있는지를 평가하는 것이었다. 전형적으로 대표적인 혈관외 치료요법으로서, 피하 주사를 선택하였다. 기준 제품 NovoSeven®에 대한 rVIIa-FP의 적합성을 비교하기 위해, 표 2에 상세하게 나타낸 비임상적 약동학 연구를 수행하였다. 등몰 용량의 rVIIa-FP(국제공개공보 제WO 2007/090584호의 30 및 31페이지에 기재된 바와 같이 생성된 pFVII-937) 및 NovoSeven®을 랫트에 1회 정맥내/피하 주사한 후 경시 혈장 농도를 측정하였다. NovoSeven®의 경우, 용량은 300μg/kg이었다. rVIIa-FP의 용량은 OD 측정(280 내지 320nm)에 의해 측정되는 단백질 농도를 기준으로 하였다. 상기 FP의 알부민 부분에 대해 보정하면, 300μg(FVIIa)/kg의 용량이 또한 투여되었다. 이로써, 제품 둘 다는 치료학적으로 유효한 성분인 FVIIa와 관련하여 동일한 용량으로 투여되었다. 랫트는 이러한 유형의 연구에 잘 특성화되고 종종 사용되는 종이기 때문에, 랫트를 본 연구를 위한 동물 종으로 선택하였다. 실험 동안 체중 약 200g의 랫트(CD주)는 Charles River(독일 슐츠펠트 소재)에 의해 제공되었다. 랫트를 표준 주거 조건에서 유지하였다. 단기 마취하에, 혈액 샘플을 안와 후방에서 채취하고, 시트르산칼슘으로 10 내지 20% 시트르산염 혈액까지 항응고시키고, 혈장으로 처리하고, FVII 혈장 수준 측정을 위해 -20℃에서 보관하였다. 샘플 채취 시점을 표 2에 상세하게 나타낸다. 포획 항체로서 양의 항 FVII IgG(Cedarlane/ Biozol) 및 검출 항체로서 POD 결합된 양의 항 FVII IgG(Cedarlane/ Biozol)를 사용하는 샌드위치 ELISA를 사용하여, 사람 FVII의 혈장 농도를 측정하였다. 표준 사람 혈장을 기준으로서 사용하였다. rVIIa-FP의 발효, 정제 및 활성화는 다른 곳에 기재하였다.
rVIIa-FP의 정맥내 주사는 동일 용량의 NovoSeven®에 의한 처리와 비교하여 약 60% 높은 초기 혈장 수준을 나타냈다(표 3 및 도 1 참조). rVIIa-FP로 피하 처리된 그룹의 경우만, FVII이 혈장에서 검출되었다. 최대 농도는 주사한 지 약 8시간 후에 관찰되었으며, 기준선은 처리한 지 1 내지 2일 후에 다시 도달되었다. 동일 용량의 NovoSeven®으로 피하 처리된 그룹의 경우, 비록 NovoSeven®이 rVIIa-FP와 동일한 FVIIa 용량으로 주사되었음에도 불구하고 혈장 수준은 전체 관찰 기간 동안 검출 한계치 이하로 유지되었다(도 2 참조).
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NovoSeven®을 rFVIIa-FP와 동일한 용량으로 주사하였고, 혈장 수준은 발견되지 않았다. 따라서, rVIIa-FP에 의한 피하 처리가 주사에 이은 다소 짧은 유도기(약 8시간에서) 후 관찰된 피크 농도 및 오랫동안의 지속적인 감소, 즉 적어도 1 내지 2일 동안의 지속적인 감소를 갖는 잘 검출될 수 있는 FVIIa 혈장 수준을 유발하는 것으로 나타난 것은 놀라웠다. 이는 심지어 정맥내 주사에 따른 rVIIa-FP의 시간 경과를 지속하였다. rVIIa-FP의 약 50%인 저분자량의 NovoSeven®은 피하 구획으로부터 흡수를 촉진하는 것으로 예상되었다. 연구 결과는 반대 결과가 발생하는 것으로 나타났다. 피하 투여된 rVIIa-FP의 상대적 생체이용성은 약 10%에 도달하였으며, NovoSeven®의 피하 주사 후에 검출되는 혈장 농도는 없었다.
대순환으로의 흡수 또는 수송과 관련하여 rVIIa-FP의 특정 이점이 있는지를 판단하기 위해, rVIIa-FP와 NovoSeven®의 상대적 생체이용성을 비교하는 것은 적합하지 않을 수 있고, 이는 피하 투여된 rVIIa-FP의 AUC가 긴 말단 반감기에 의해 지배되어 피하 구획으로부터 대순환으로 rVIIa-FP를 지속적으로 방출시킬 수 있기 때문이다. NovoSeven®과 대조적으로, 정맥내 주입 후의 말단 반감기는 이미 6배 이상 증가하였다. 또한, rVIIa-FP와 NovoSeven®의 제거 특징은 피하 공간으로부터 대순환으로의 수송 및 확산에 의해 우선적으로 영향받을 수 있다. 따라서, 이러한 주제에 대한 특이적인 결론은 피크 농도의 평가에 더욱 확실히 기초할 수 있다. NovoSeven®의 경우, 혈장 농도는 25ng/ml의 검출 한계치에 도달하지 않았으며, 주사 직후 융합 단백질에 대하여 약 140ng/ml이었다.
제1 단계로서, 대순환으로의 흡수 또는 수송이 rVIIa-FP와 동일하다는 가정하에, 혈장 농도가 NovoSeven®으로 처리한 후에 어떻게 예상되는지를 평가하는 것이 가능하다. 정맥내 주사시 rVIIa-FP의 60% 이상의 회복에 대해 보정하면, 약 90ng/ml의 피크 혈장 농도를 예상할 수 있다. 이는 명백히 검출 한계치 이상이고, 따라서 NovoSeven®으로 피하 처리한 후 혈장에서 FVII의 관찰을 잠재적으로 방지할 수 있었던 근본적인 방법론적 문제를 배제한다. 알부민에 대한 융합에 의해 달성되는 최소 이점을 평가하는 제2 단계에서, NovoSeven®에 실질적으로 유리한 가장 좋은 경우의 시나리오를 가정할 수 있다. 이는, 피크 농도가 모든 시점에서 25ng/ml의 검출 농도 이하로 바로 최소로 유지되기 때문에, NovoSeven®이 실제로 혈장으로 수송되지만 관찰될 수 없다는 가정에 기초한다. NovoSeven®은 혈장에 존재할 수 있는 기간과 관련하여, NovoSeven®에 대한 가장 좋은 경우는 비록 말단 반감기가 약 6배 짧음에도 불구하고 rVIIa-FP와 동일한 시간 경과를 가정하는 것이다. NovoSeven®에 대한 생성된 AUDC는 550h*ng/ml이고, rVIIa-FP에 대해서는 약 2200h*ng/ml이다. 따라서, NovoSeven®에 매우 유리한 시나리오에서, 혈관외 주사 후 rVIIa-FP의 생체내 회복은 NovoSeven®에 대한 것보다 약 4배 이상 높은 것으로 결론난다.
실시예 2: B형 혈우병 모델[ FIX 녹아웃( knockout ; ko ) 마우스]에서 피하 투여된 rIX - FP 의 생체이용성 평가
rIX-FP(사람)에 의한 혈관외 주사가 개선된 치료요법에 대한 선택일 수 있는지를 평가하기 위해, 전형적으로 대표적인 혈관외 치료요법으로서 피하 주사를 선택하였다. 이러한 실시예를 검사하는 비임상적 약동학 연구의 설계는 표 4에 상세하게 나타낸다. 610IU/kg Berinin® 또는 rIX-FP를 B형 혈우병 모델에 1회 정맥내/피하 주사한 후 경시 혈장 농도를 측정하였다. 국제공개공보 제WO 2007/144173호의 실시예 1 내지 3(pFIX-1088)에 기재된 바와 같이 rIX-FP를 생산하였다. 상응하는 그룹들을 동일 용량의 FIX:응고 활성으로 처리하였다. 체중 약 25g의 FIX 녹아웃(ko) 마우스를 B형 혈우병 모델로서 사용하였다. 이러한 마우스는 FIX 유전자의 프로모터 영역이 결여되어 있고, 따라서 FIX를 발현하지 못한다[참조: Lin et. al., 1997, Blood, 90, 3962-3966]. 이는, ko 마우스의 혈장, 즉 기능적으로 활성인 단백질에서 FIX 활성의 정량화에 의해, 처리 후 FIX 농도의 분석을 가능하게 하였다. 단기 마취하에, 혈액 샘플을 안와 후방에서 채취하고, 시트르산칼슘으로 10 내지 20% 시트르산염 혈액까지 항응고시키고, 혈장으로 처리하고, FIX 활성 측정을 위해 -20℃에서 보관하였다. 샘플 채취 시점을 표 5에 상세하게 나타낸다. 혈장 중의 FIX 활성의 정량화는 표준 aPTT 기반 접근법(Behring Coagulation Timer)에 의해 수행하였다. 동물을 표준 주거 조건에서 유지하였다.
FIX ko 마우스에 대한 610U/kg의 Berinin®의 피하 주사는 정맥내 주사에 의해 달성되는 혈장 농도와 비교하여 혈장 농도에서 FIX 활성을 적게 증가시킨다(도 3 참조). 피하 투여 후의 생체이용성은 약 25%이었다. 피하 주사 후의 FIX는 약 1 내지 2일 동안 검출될 수 있었다. rFIX-FP에 대한 결과는 몇 가지 양상에서 명백히 상이하였다:
1) rFIX-FP의 피하 주입 후의 피크 농도는 비융합 야생형 FIX인 Berinin에 대하여 나타난 것의 약 2배이었다.
2) rFIX-FP에 의한 피하 처리 후의 생체이용성은 Berinin에 대하여 관찰된 것보다 거의 2배 이상 높았다(25% 대 45%).
3) Berinin과 대조적으로, 피하 rFIX-FP에 의해 달성된 혈장 농도는 심지어 말기 시기에서 정맥내 rFIX-FP에 의해 달성된 혈장 농도를 초과하였다.
종합해보면, 이러한 결과는 rIX-FP에 의한 혈관외 주사가 개선된 치료법에 대한 가치있는 선택이라는 것을 입증한다. 피크 농도가 보다 높을수록, 출혈성 현상의 경우에서 예방뿐만 아니라 가능하게는 심지어 시급한 대체 치료에 대한 가능성은 열린다. 생체이용성이 보다 높을수록, 저용량 및 주사 용량의 적용은 가능하게 되어, 비용 효율성을 증가시키고 환자에 대한 인내성 및 안정성을 증가시킨다. 마지막으로, 예방적 환경에서, 피하 적용은 심지어 치료 간격을 증가시킬 수 있는데, 이는 최저 수준이 정맥내 주사 후 보다 늦은 시점에서 도달되기 때문이다.
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실시예 3: A형 혈우병 모델( FVIII ko 마우스)에서 피하 투여된 rVIII - FP 의 생체이용성 평가
rVIII-FP(사람)에 의한 혈관외 주사가 개선된 치료요법에 대한 선택일 수 있는지를 평가하기 위해, 전형적으로 대표적인 혈관외 치료요법으로서 피하 주사를 선택한다. 수행되는 가능한 비임상적 약동학 연구의 설계는 표 7에 상세하게 나타낸다. ReFacto 또는 rFVIII-FP를 A형 혈우병 모델에 1회 정맥내/피하 주사한 후 경시 혈장 농도를 측정한다. 상응하는 그룹들을 동일 용량의 FVIII:응고 활성으로 처리한다. 체중 약 25g의 FVIII ko 마우스를 A형 혈우병 모델로서 사용한다. 이러한 마우스는 엑손 16 및 17이 결여되어 있고, 따라서 FVIII을 발현하지 못한다[참조: Bi L. et al., Nature genetics, 1995, Vol 10(1), 119-121; Bi L. et al., Blood, 1996, Vol 88(9), 3446-3450]. 이는, ko 마우스의 혈장에서 FVIII 활성의 정량화에 의해, 처리 후 FVIII 농도의 분석을 가능하게 한다. 처리의 상세한 사항의 가능한 개요를 표 8에 제시한다. 단기 마취하에, 혈액 샘플을 안와 후방에서 채취하고, 시트르산칼슘으로 10 내지 20% 시트르산염 혈액까지 항응고시키고, 혈장으로 처리하고, FVII 활성 측정을 위해 -20℃에서 보관한다. 샘플 채취 시점에 대한 가능한 개요를 표 7에 상세하게 나타낸다. 혈장 중의 FVIII 활성의 정량화는 표준 aPTT 기반 접근법(Behring Coagulation Timer)에 의해 수행한다. 동물을 표준 주거 조건에서 유지한다.
FVIII ko 마우스에 대한 200U/kg의 ReFacto의 피하 주사는 정맥내 주사 후 예상되는 혈장 농도와 비교하여 혈장 농도에서 FVIII 활성을 적게 증가시킨다. rVIII-FP(사람)에 의한 상응하는 처리(그룹 2 및 4)와 비교하면, rVIII-FP에 의한 혈관외 주사가 개선된 치료법에 대한 선택일 수 있는지에 대한 평과 결과가 나타난다.
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실시예 4: VWD 또는 A형 혈우병 모델( VWF 또는 FVIII ko 마우스)에서 피하 투여된 rVWF - FP 의 생체이용성 평가
rVWF-FP(사람)에 의한 혈관외 주사가 개선된 치료요법에 대한 선택일 수 있는지를 평가하기 위해, 전형적으로 대표적인 혈관외 치료요법으로서 피하 주사를 선택한다. 수행되는 가능한 비임상적 약동학 연구의 설계는 표 10에 상세하게 나타낸다. 그룹 1, 2 및 4 내지 6을 상기 표에서 상세하게 나타낸 바와 같이 처리하고, 적절한 경우에는 다른 용량의 VWF:Ag를 주사한다. Haemate® P, rVWF-FP 또는 VWF의 글리코실화 돌연변이를 A형 혈우병 또는 폰 빌레브란트 질환(VWD) 모델 동물에 1회 정맥내/피하 주사한 후 경시 혈장 농도를 측정한다. 상응하는 그룹들을 동일 용량의 VWF:Ag로 처리한다. 체중 약 25g의 FVIII ko 마우스를 A형 혈우병 모델로서 사용하였다. 이러한 마우스는 엑손 16 및 17이 결여되어 있고, 따라서 FVIII을 발현하지 못한다[참조: Bi L. et al., Nature genetics, 1995, Vol 10(1), 119-121; Bi L. et al., Blood, 1996, Vol 88(9), 3446-3450]. 체중 약 25g의 VWF ko 마우스를 VWD 모델로서 사용한다. 이러한 마우스는 VWF 유전자의 엑손 4 및 5가 결여되어 있고, 따라서 VWF를 발현하지 못한다[참조: Denis C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, Vol 95, 9524-9529].
처리의 상세한 사항을 표 6에 제시한다. 단기 마취하에, 혈액 샘플을 안와 후방에서 채취하고, 시트르산칼슘으로 10 내지 20% 시트르산염 혈액까지 항응고시키고, 혈장으로 처리하고, FVII 활성 측정을 위해 -20℃에서 보관한다. 샘플 채취 시점을 표 7에 상세하게 나타낸다. 혈장 중의 사람 VWF:Ag의 정량화는 시판중인 ELISA 테스트킷트(Asserachrom®, Diagnostica Stago)에 의해 수행한다. 동물을 표준 주거 조건에서 유지한다.
마우스에 대한 약 1400U/kg의 VWF:Ag U/kg Haemate® P의 피하 주사는 정맥내 주사 후 예상되는 혈장 농도와 비교하여 혈장에서 사람 VWF:Ag를 증가시킨다. rVWF-FP(사람)에 의한 상응하는 처리(그룹 2 및 5) 또는 VWF 글리코실화 돌연변이에 의한 상응하는 처리(그룹 3 및 6)와 비교하면, rVWF-FP 또는 VWF 글리코실화 돌연변이에 의한 혈관외 주사가 개선된 치료법에 대한 선택일 수 있는지에 대한 평가 결과가 나타난다.
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SEQUENCE LISTING <110> CSL Behring GmbH <120> Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders <130> 2009_M006_A150 <150> EP 09010699.8 <151> 2009-08-20 <150> US 61/237,006 <151> 2009-08-26 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585

Claims (17)

  1. 출혈성 장애의 치료요법 및 예방 치료에 있어서의 비정맥내 투여를 위한, 알부민 융합 응고 인자를 포함하는 약제학적 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 응고 인자가 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 폰 빌레브란트 인자, 인자 V, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 인자 I, 인자 II(프로트롬빈), 단백질 C, 단백질 S, GAS6, 또는 단백질 Z 및 이들의 활성 형태들로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 약제학적 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 응고 인자가 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 폰 빌레브란트 인자 및 이들의 활성 형태들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 응고 인자가 인자 VII 또는 인자 FVIIa인, 약제학적 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 출혈성 장애가 가족성 또는 후천성 A형 및 B형 혈우병, 모든 유형의 외상(단일 장기, 골 분획 또는 다발성 외상으로부터의 중증 출혈을 유발하는 둔기 외상 또는 관통 외상), 수술중 또는 수술후 출혈을 포함한 외과적 처치 동안의 출혈, 소아 심장 수술에서 체외 순환 및 혈액 희석을 받는 환자를 포함한 심장 수술에 의한 출혈, 뇌내 출혈, 지주막하 출혈, 경막하 또는 경막외 출혈, 감염 환자에서 응고 인자의 수준을 감소시키는 비원형질 용적 치환에 의한 혈액 손실 및 혈액 희석으로 인한 출혈, 파종성 혈관내 응고(Disseminated Intravascular Coagulation; DIC) 및 소모성 응고병, 혈소판 기능장애, 고갈 및 응고병으로 인한 출혈, 간 경화, 간 기능장애, 전격성 간 부전 및 간 질환 환자에서의 간 생검으로 인한 출혈, 간 및 기타 장기 이식 후의 출혈, 위 정맥류로 인한 출혈 및 소화성 궤양 출혈, 기능장애 자궁 출혈(Dysfunctional Uterine Bleeding; DUB), 태반의 조기 박리, 저체중 출생아의 뇌실주위 출혈, 분만 후 출혈, 신생아의 치명적 고통과 같은 부인과 출혈, 화상과 관련된 출혈, 아밀로이드증과 관련된 출혈, 혈소판 장애와 관련된 조혈모세포 이식, 악성 종양과 관련된 출혈, 출혈성 바이러스에 의한 감염, 및 췌장염과 관련된 출혈로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 약제학적 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 비정맥내 투여가 피하 투여, 경피 투여 또는 근육내 투여인, 약제학적 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 비정맥내 투여가 피하 투여인, 약제학적 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 응고 인자가 펩타이드 링커를 통해 알부민에 연결되어 있는, 약제학적 제제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 펩타이드 링커가 단백질 가수분해에 의해 절단될 수 있는, 약제학적 제제.
  10. 응고 인자를 알부민에 융합시켜 상기 응고 인자의 비정맥내 투여 후의 생체내 회복을 향상시키기 위한 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 응고 인자가 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 폰 빌레브란트 인자, 인자 V, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 인자 I, 인자 II(프로트롬빈), 단백질 C, 단백질 S, GAS6, 또는 단백질 Z 및 이들의 활성 형태들로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 응고 인자가 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 폰 빌레브란트 인자 및 이들의 활성 형태들로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 응고 인자가 인자 VII 또는 인자 VIIa인, 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 응고 인자가 펩타이드 링커를 통해 알부민에 연결되어 있는, 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 링커가 단백질 가수분해에 의해 절단될 수 있는, 방법.
  16. 제10항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 비정맥내 투여가 피하 투여, 경피 투여 또는 근육내 투여인, 방법.
  17. 제10항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 비정맥내 투여가 피하 투여인, 방법.


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