SE504074C2 - Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering - Google Patents

Description

504 074 2 koncentrat av faktor VIII. Den trunkerade rekombinanta faktor VIII-molekylen benämnes r-VIII SQ och produceras av ovarieceller från kinesisk hamster i (CHO-celler) i ett cellodlingsförfarande i serumfritt medium.

Strukturen och biokemin av rekombinanta faktor VIII-produkter i all- mänhet har beskrivits av Kaufman Tibtech, Vol 9, 1991 och Hematology, 63, 155- 65, 1991. Strukturen och biokemin av r-VIII SQ har beskrivits i WO 91/09122.

Den primära enkedjiga translationsprodukten om 170 kDa klyvs i den produce- rande cellen till ett komplex av två kedjor. r-VIII SQ består sålunda av en kedja om 90 kDa och en kedja om 80 kDa som innehåller de funktionella faktor VIII- domänerna A1 och A2 respektive A3, C1 och C2. I genkonstruktionen fór r-VIII SQ har den centrala B-domänen deleterats, förutom en sekvens om fjorton amino- syror. Denna sekvens, den s.k. "SQ-kopplingen" utgör en brygga mellan A2- domänen i 90 kDa-kedjan med A3-domänen i 80 kDa-kedjan och motsvaras av de forsta aminosyrorna i den N-terminala delen av B-domänen följt av de sista aminosyrorna iden C-terminala delen av B-domänen. Vid fusering av N- och C- terminala aminosyror har en sekvens som finns närvarande i både N- och C- terminal, -Ser-Gln-Asm, utnyttjats och bibehållits. En överlagring av dessa amino- syror har gjorts i konstruktionen så att SQ-kopplingen bildats, vilken omfattar fjorton aminosyror med sekvensen Ser-Phe-Ser-Gln-Asn-Pro-Pro-Val-Leu-Lys- Arg-His-Gln-Arg.

Dosen liknar doserna av från plasma härledda koncentrat av faktor VIII.

Stora proteiner ges normalt intravenöst så att läkemedlet blir direkt till- gängligt i blodomloppet. Det skulle emellertid vara fördelaktigt om ett läkemedel kunde ges subkutant, intramuskulärt eller intradermalt då dessa administra- tionsformer är mycket lättare att hantera för patienten. Detta gäller speciellt om läkemedlet måste tas regelbundet under en hel livstid och behandlingen måste påbörjas tidigt, redan då patienten är ett barn. Ett läkemedel med en mycket stor och labil molekyl, såsom koagulationsfaktor VIII pâ 170-300 kDa, har emellertid normalt en mycket låg biotillgänglighet också vid subkutan, intramuskulär eller intradermal administration, eftersom upptagningen inte är tillräcklig och ned- brytningen är betydande. Såvitt vi vet är det enda koagulationsfaktorprotein 504 074 2A som administrerats genom subkutan injektion är faktor IX (90 kDa).

Alla faktor VIII-preparat som nu är tillgängliga på marknaden är till- I verkade som en beredning fór intravenös administration och är stabiliserade med albumin (humant serumalbumin).

Till vår stora förvåning har vi funnit att faktor VIII, som är ett mycket känsligt protein, kan ges subkutant och i motsats till all tidigare erfarenhet erhåller vi en godtagbar adsorption och en hög nivå av aktiv faktor VIII-protein i blodet. Lösningen är stabiliserad utan albumin.

Vi har således utvecklat en beredning som gör det möjligt att administrera faktor VIII subkutant, intramuskulärt eller intradermalt och som innebär en stor fórdel för alla patienter med behov av faktor VIII.

Rekombinant faktor VIII SQ fóreskrives för behandling av klassisk hemofili. Halva livslängden av r-VIII SQ är ungefär 12 504 074 3 timmar för människa efter intravenös injektion. För profylaktisk behandling ges 15-25 IU/kg kroppsvikt av faktor VIII tre gånger per vecka. En intravenös injektion är normalt 5-10 ml. En subku- tant administrerad injektion är mellan 0,05 och 1 ml och koncen- trationen av faktor VIII måste därför vara mycket hög i en sådan beredning. Detta är möjligt att uppnå med var högrenade rekom- binanta faktor VIII.

Uppfinningsidén är således en kombination av upptäckten att faktor VIII kan absorberas i blodomloppet efter administration som en subkutan, intramuskulär eller intradermal farmaceutisk beredning och att det är möjligt att framställa en beredning som omfattar den erforderligt höga koncentrationen av faktor VIII för detta ändamål.

Föreliggande uppfinning avser en slutlig farmaceutisk bered- ning som omfattar en koagulationsfaktor VIII och som kan absor- beras i blodet efter subkutan, intramuskulär eller intradermal administration och ge faktor VIII:C aktivitet. Kompositionen ges företrädesvis subkutant. Mängden faktor VIII är lämpligen större än 1500 IU/ml i beredningen och företrädesvis från 5 000 till 100 000 IU/ml. Den volym som ges är lämpligen 0,1 till 1 ml, företrä- desvis 0,5 till 1 ml.

Faktor VIII är full-längd ur plasma eller rekombinant och kan antingen föreligga i full-längdform eller lämpligen som ett deletionsderivat såsom SQ-derivat. Med deletionsderivat avses här koagulerande faktor VIII:C van' hela eller en del av B-domänen saknas.

Vår använda faktor VIII är höggradigt renad, dvs har en specifik aktivitet som överstiger 5 000 IU/mg protein, t.o.m. mer än 12 000 IU/mg och är lärnpligen stabiliserad utan tillsats av albumin.

Beredningen kan också omfatta natrium- eller kaliumklorid, lämpligen i en mängd större än 0,1 M.

Kalcium (eller divalenta metalljoner) krävs för att bibehålla associationen mellan tung och lätt kedja i faktor VIII. Här tillsättes kalciumklorid (CaCl2) men andra salter såsom kalciumglukonat, kalciumglubionat eller kalciumgluceptat kan också användas.

Kompositionen omfattar lämpligen kalciumklorid eller kalciumglu- 504 074 4 konat i en mängd som överstiger 0,5 mM.

En arninosyra användes för att buffra systemet och denna skyddar också proteinet i den amorfa fasen om beredningen frys- torkas. En lämplig buffert kan vara L-histidin, lysin och/eller arginin. L-histidin har primärt valts p.g.a den goda buffertkapa- citeten av L-histidin kring pH 7.

Beredningen kan omfatta i) minst 1 500 IU/ml rekombinant faktor VIII ii) minst 0,01 mg/ml av en polyoxietylen (20) fettsyraester iii) natriumklorid, lämpligen i en mängd som överstiger 0,1 M iv) kalciumsalt såsom kalciumklorid eller kalciumglukonat, företrädesvis i en mängd som överstiger 0,5 mM v) en aminosyra såsom L-histidin i en mängd som överstiger 1 mM.

Den nonjoniska ytaktiva substansen väljes lämpligen bland segmentsampolymerer såsom en poloxamer eller polyoxietylen (20) fettsyraester, såsom polysorbat 20 eller polysorbat 80. Tween 80® har använts som polysorbat 80. Den nonjoniska ytaktiva substansen bör finnas närvarande i en mängd som överstiger den kritiska micellkoncentrationen (CMC). Se Wan och Lee, Joumal of Pharm Sci, 63, 136, 1974. Polyoxietylen (20) fettsyraestern finns lämpligen i en mängd av minst 0,01 mg/ml.

Till denna beredning kan sättas mono- eller disackarider eller sockeralkoholer, lämpligen sackaros. Även antioxidanter såsom glutation, acetylcystein, tokoferol, metionin, askorbinsyra, EDTA, citronsyra, butylhydroxitoluen och/eller butylhydroxianisol kan tillsättas.

Beredningen omfattar lämpligen L-histidin och sackaros.

Förhållandet natriumklorid till L-histidin i kompositionen är lämp- ligen större än 1:1.

Beredningen kan föreligga i torkad form, lämpligen lyofíli- serad eller i vattenlösning före eller efter torkning. Den torkade produkten rekonstitueras med sterilt vatten för injektion eller en buffertlösning.

Den åberopade beredningen kan också vara en stabil vatten- lösning som är klar att använda. 504 Û74 Beredningen kan förvaras i en syrereducerad miljö såsom beskrives i den svenska patentansökningen 9301581-6. I Medel som ökar absorptionen eller proteasinhibitorer kan tillsättas.

Beredningen enligt uppfinningen kan framställas genom blandning av faktor VIII med en nonjonisk ytaktiv substans i vattenlösning, lämpligen tillsammans med en aminosyra såsom L- histidin, natriumsalt, sackaros och ett kalciumsalt eller genom elue- ring av faktor VIII från det sista reningssteget med en buffert som innehåller en nonjonisk ytaktiv substans i vattenlösning, lämpligen tillsammans med natriumsalt, sackaros, kalciumsalt och en aminosyra såsom L-histidin.

Uppfinningen avser även användning av beredningen enligt uppfinningen för framställning av ett läkemedel för subkutan, intramuskulär eller intadermal administration för behandling av hemofili, lämpligen för användning av ett deletionsderivat rekom- binant faktor VIII för framställning av ett läkemedel för subkutan administration. Den avser även en metod för behandling av hemo- fili genom subkutan, intramuskulär eller intradermal administra- tion av beredningen enligt uppfinningen.

De data som anges i exemplet visar att r-VIH SQ kan injice- ras subkutant och återvinnas intravenöst in vivo vilket utgör en mycket överraskande upptäckt, eftersom någon sådan beredning tidigare ej varit känd.

Skyddet är ej begränsat till en komposition enligt detta exempel. i. I.

Framställning av rekombinant faktor VIII SQ (r-VIII SQ) skedde väsentligen såsom beskrivits i patentskriften WO 91/- 09122, exempel 1-3. En DHFR deficient CHO-cellinje (DG44N.Y.) elektroporerades med en expressionsvektor som innehöll r-VIII SQ-genen och en expressionsvektor som innehöll dihydroflolate- reduktasgenen. Efter selektion på selektiva media amplifierades överlevande kolonier genom odling i stegvis ökande mängder av metotrexat. Supernatant från de erhållna koloniema screenades 504 074 6 individuellt med avseende på VIII:C-aktivitet. En produktionsklon utvaldes och denna anpassades därefter till serumfri suspensions- tillväxt i ett definierat medium och slutligen utvecklades ett stor- skaligt fermentationsförfarande. Supernatant uppsamlas efter vissa tidsperioder och renades vidare såsom beskrives nedan.

Det klarade konditionerade mediet pH-inställdes och anbrin- gades på en S-Sepharose FF-kolonn. Efter tvättning eluerades faktor VIII med en saltbuffert som innehöll 5 mM CaClg.

Immunoadsorption utfördes på ett immunoaffinitetsharts där liganden var en monoklonal antikropp (8A4) riktad mot den tunga kedjan i faktor VIII. Före påfömingen på kolonnen behandlades S- eluatet med 0,3 % TNBP och 1 % Octoxynol 9. Kolonnen ekvilibrerades, tvättades och faktor VIII eluerades med en buffert som innehöll 0,05 M CaCl2 och 50 % etylenglykol. mAb-eluatet placerades på en Q-Sepharose FF-kolonn, ekvili- brerad med elueringsbufferten i immunoaffinitetssteget. Efter tvätt- ning eluerades faktor VIII med 0,05 M L-histidin, 0,6 M natrium- klorid, 4 mM kalciumklorid och pH 6,8.

Q-eluatet anbringades på en gelfiltreringskolonn (Superdex 200 p.g.). Ekvilibrering och eluering utfördes med den buffert som inne- höll L-histidin, natriumklorid och kalciumklorid. Proteintoppen upp- samlades och lösningen formulerades före frystorkning.

Detta r-VIII SQ-material erhölls från det sista reningssteget.

VlllzC-aktiviteten och koncentrationen av de inaktiva komponen- terna justerades genom spädning med en lämplig buffert som inne- höll PEG. Lösningen sterilñltrerades (0,22 pm) därefter, dispensera- des och frystorkades.

Rekombinant faktor VIII framställdes enligt den metod som beskrivits under Försök.

Den lyofiliserade kompositionen i glasflaskan, som innehöll r- VIII SQ, var följande och rekonstituerades i 4 ml sterilt vatten för injektion: 504 074 7 Sammansättning per glasflaska: L-histidin, mg 31,0 Natriumklorid, mg 70,1 Kalciumklorid, mg 2,35 PEG 4 ooo, mg 4,0 VIII:C tillsatt IU/flaska 4240 Tween 80, mg 1 Albinohanmöss med en vikt av ca 30 g av stammen NMRI, SPF, injicerade subkutant i halsen med den rekonstituerade r-VIII SQ- lösningen. Den injicerade volymen vid dosnivàn 10 000 IU/kg var 9,4 ml/kg och vid den högre dosniván, S0 000 IU/kg, 5 gånger större, 47 ml/kg. Vid placebobehandlingen användes salin, 9,4 ml/kg. 3-5 minuter innan blodprov togs anestetiserades mössen i.p. med Membumal® (pentobarbital) vet. 60 mg/ml. Den injicerade volymen var 100 ml/kg dvs ca 0,3 mUmus. Under anestesi uppsamlades 0,45 ml blod från vena cava i plastsprutor som innehöll 0,05 ml 0,13 M natriumcitrat. Plasma framställdes sedan från det uppsamlade blodet genom centrifugering (8 800 g i 7 minuter) och förvarades frusen i Cryoflex plaströr vid -70°C tills det var dags att bestämma VHI:C.

Beslutat TABELL1 VHI:C i plasma från möss som erhållit r-VHI SQ 10 000 IU/kg subkutant.

Tid efter VIII:C n administration IU / ml antal obs. (h) X :t Sd 0 0,82 :t 0,43 12 0,33 1,23 :t 0,41 3 1,0 1,38 :t 0,56 4 1,5 1,83 i 0,60 12 2,0 1,43 i 0,91 8 4,0 1,34 i 0,72 6 Tid efter administration (h) 6,0 8,0 16,0 ,0 24,0 TABELL 1 (forts.) VIII:C IU / ml X i Sd 1,27 i 0,42 1,55 i 0,80 0,62 i 0,28 0,58 :t 0,12 0,76 i 0,53 TABELL 2 Dos - svar hos möss som erhållit r-VIII SQ subkutant.

Dos: Dos r-VIII SQ som administrerats (IU/KS).

Svar: VIH:C i plasma (IU/ml) 1,5 h efter administration.

Dos (IU/kg) Blank (baslinjen) Salin 000 50 000 Kmmnm Svar IU/ml 0,82 i 0,43 0,21 i 0,34 1,83 i 0,60 2,47 i 0,60 Svar: IU/ml (efterjusterin g till baslinjen) 0,39 1,01 1,65 504 074 Il antal obs. -ßbJ-à-Ä-ß antal obs 12 12 1. Resultaten av ändringen av koncentration av VIII:C i plasma med tiden efter en subkutan dos av r-VIII SQ 10 000 IU/kg, visar det typiska mönstret för ett läkemedel som absorberas från en subkutan depå. Den maximala koncentrationen uppnås efter ca 1,5 timmar. 504 074 9 2. Absorptionen av r-VIII SQ från en subkutan depå veriñeras ytterligare genom ökningen av maximal koncentration som uppstår då dosen ökas S-faldigt. Även om ändringen i injektíonsvolym kan ha en viss effekt motsäger detta ej absorption av subkutant administre- rat r-VIII SQ.

Claims (12)

10 15 20 25 30 35 504 074 10

1. En farmaceutisk beredning omfattande koagulationsfaktor VIII i en koncentration högre än 1500 IU/ml och som ger faktor VIII- aktivitet i blodet efter subkutan, intramuskulär eller intradermal administration.

2. En beredning enligt krav 1, för subkutan administration.

3. En beredning enligt något av kraven l och 2, vari faktor VIII är höggradigt renad i en koncentration högre än 5 000 IU/ml.

4. En beredning enligt något av kraven l-3, som har en volym av 0,1 till 1 ml, lämpligen 0,5 till 1 ml.

5. En beredning enligt något av kraven 1-4, vari faktor VIII är full- längd ur plasma eller rekombinant härledd eller ett deletionsderivat av rekombinant faktor VIII.

6. En beredning enligt krav, 5, vari faktor VIII är deletionsderivatet rekombinant faktor VIII SQ.

7. En beredning enligt något av kraven 1-6, vari faktor VIII är hög- gradigt renad och vilken komposition är stabiliserad utan tillsats av albumin.

8. En beredning enligt krav 1, omfattande i) minst 1 500 IU/ml av deletionsderívatet rekombinant faktor VIII SQ ii) minst 0,01 mg/ml av en polyoxietylen (20) fettsyraester iii) natriumklorid, lämpligen i en mängd större än 0,1 M iv) kalciumsalt såsom kalciumklorid eller kalciumglukonat, företrädesvis i en mängd större än 0,5 mM v) en aminosyra såsom L-histidin i en mängd större än 1 mM. 10 504 074 11

9. En beredning enligt något av kraven 1-8, som är frystorkad elle en stabil vattenlösning klar att använda. i

10. En beredning enligt något av kraven 1-9, vartill satts absorptions- ökande medel eller proteasinhibitorer.

11. ll. Användning av en beredning enligt något av kraven 1-10 för tillverkning av ett läkemedel för subkutan, intramuskulär eller intra- dermal administration för behandling av hemofili.

12. Användning av ett deletionsderivat rekombinant faktor VIII för tillverkning av ett läkemedel för subkutan administration.