SE468050C - Rekombinant derivat av human faktor VIII - Google Patents

Description

468 050 2 dyra på grund av den begränsade tillgången av ramaterialet humanplasma.

En faktor-VIII-produkt härledd från rekombinant mate- rial löser sannolikt en väsentlig del av de problem som är förenade med användningen av plasmahärledda faktor-VIII- -koncentrat för behandling av hemofili A, och ett antal grupper arbetar för närvarande på utvecklingen av en sådan produkt. Utvecklingen av en rekombinant faktor VIII har emellertid stött på vissa svårigheter, exempelvis proble- met att uppnå produktionsniváer i tillräckligt höga utby- ten, speciellt beträffande fullangdsmolekylen.

I färsk plasma beredd i närvaro av proteasinhibitorer har faktor VIII befunnits ha en molekylvikt av 280 kDa och vara sammansatta av tva polypeptidkedjor om 200 kDs re- spektive 80 kDa (Andersson, L-0., et al. (1986) Proc.

Natl. Acad. Soi. USA 83, 2979-2983). Dessa kedjor samman- hålles genom metalljanbryggor. Mer eller mindre proteoly- tiskt nedbrutna former av faktor-VIII-molekylen kan åter- finnas som aktiva fragment i faktor-VIII-material renat frán kommersiella koncentrat (Andersson, L-O., et al. i§i§.; Andersson, L-0., et al. (1985) EP 0197901). Den fragmenterade formen av faktor VIII med molekylvikter av från 260 kDa nad till 170 kDa består av en tung kedja med en molekylvikt varierande från 180 kDa ned till 90 kDa, vari alla varianter har identiska aminotermini, i kombina- tion med en latt kedja om BO kDa. Aminoterminalregionen av den tunga kedjan är identisk med den för den enkelkedjiga faktor-VIII-polypeptid som kan deduoeras fràn nukleotid- sekvensdata av faktor-VIII-oDNA (wood, w.I., et al. (1984) Nature 312, 330-336; Vehar, G.A., et al. (1984) Nature 312, 337-342).

Den minsta aktiva formen av faktor VIII med en mole- kylvikt av 170 kDa bestående av en 90 kDa- och en 80 kDa- -kedja kan aktiveras med trombin i samma utsträckning som formen av en högre molekylvikt och representerar sålunda en oaktiverad form. Den har har även visats ha full biolo- gisk aktivitet ig give vid test i hemofilihundar (Brink- nl? .Fa O\ OO C) U 1 C) 3 hous, K.M., et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Soi. USA 82, 8752-8756). Den hemostatiska effektiviteten av 170-kDa- -formen är sålunda densamma som för de högmolekylara for- merna av faktor VIII.

Det faktum att den mellanliggande mycket glykosyle- rade regionen av faktor-VIII-polypeptidkedjan som återfin- nes mellan aminosyrorna Arg-740 och Glu-1649 ej synes vara nödvändig för full biologisk aktivitet har medfört att flora forskare försökt producera derivat av rekombinnnt faktor VIII i avsaknad av denna region. Det har uppnåtts genom daletering av en del av den CDNA som kodar för den mellanliggande tungt glykosylerade regionen av faktor VIII endera helt och hållet eller partiellt.

Exempelvis J.J. Toole, et al. har rapporterat kon- struktion och expression av faktor VIII saknande aminosy- rorna 982 till 1562 respektive 760 till 1639 (Proc. Natl.

Acad. Soi. USA (1986) 83, 5939-5942). D.L. Eaton, at al. har rapporterat konstruktion och expression av faktor VIII saknande aminosyrorna 797 till 1562 (Bioohemistry (1986) , 8343-8347). R.J. Kaufman har beskrivit axpression av faktor VIII saknande aminosyrorna 741 till 1646 (PCT-an- sökan nr WO 87/04187). N. Server, et al. har rapporterat konstruktion och expression av faktor VIII saknande amino- syrorna 747 till 1560 (DNA (1987) 6, 553-564). M. Pasek har rapporterat konstruktionen och expresaionen av faktor VIII saknande aminosyrorna 745 till 1562 respektive amino- syrorna 741 till 1648 (PCT-ansökan nr 88/00831). K-D Lagner har rapporterat konstruktion och expression av fak- tor VIII saknande aminosyrorna 816 till 1598 respektive aminosyrorna 741 till 1689 (Behring Inst. Mitt., (1988) nr 82, 16-25, EP 295597). P. Meulien, et al., har rapporterat konstruktion och expression av faktor VIII saknande amino- syrorna 868 till 1562 respektive aminosyrorna 771 till 1666 (Protein Engineering (1988) 2(4), 301-306, EP 0 303 540 Al). Expression av dessa delaterade former av faktor-VIII-oDNA i mammalieoeller är produktionsnivàn ty- piskt 10 gànger högre jämfört med fullängds-faktor VIII. 468 ÜBO 4 Vidare har försök gjorts att uttrycka 90 kDa- och 80 kDa-kedjorna separat från tva olika cDNA-derivat i samma cell (Burke, R.L., et al. (1986), J. Biol. Chem. 261, 12574-12578, Pavirani, A., et al. (1987) Biochem. Biophys.

Res. Comm., 145, 234-240). I detta system synes emellertid rekonstitutionen in give vara av begränsad effektivitet med avseende på tillvaratagen faktor VIII:C-aktivitet.

Föreliggande uppfinning beskriver deleterade faktor- -VIII-cDNA-molekyler som kodar for rekombinanta faktor- -VIII-derivat motsvarande beträffande molekylvikt och andra biokemiska karakteristika en tidigare harledd plasma faktor-VIII-form närvarande i väsentliga mängder i kom- mersiella koncentrat (Andersson, L-O. et al. (1986), Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979-2983). Dessa nya deleterade faktor-VIII-cDNA-derivat kan ge tillräckligt höga utbyten av rekombinant faktor-VIII-protein for användning i en industriell process för farmaceutisk framställning av re- kombinant faktor VIII.

ANVÄNDA DEFINITIONER I följande avsnitt definieras uttrycket "faktor-VIII- -deleteringsderivat" som en eller flera polypeptidkedjor med faktor-VIII:C-aktivitet härledd fràn fullängdsfaktor- -VIII-polypeptiden med 2332 aminosyror genom delatering av ett segment innefattande aminosyrorna 741 till 1648 och ersättning av nämnda segment med ett linkersegment bestå- ende av minst tre basiska aminosyror, dvs. utvalda bland lysin och arginin. Uttrycket "faktor-VIII:RE" definieras som en polypeptidkedja härledd från fullängdsfaktor VIII saknande aminosyrorna 741 till 1648. Uttrycket "faktor- -VIII-QD" definieras som en polypeptidkedja härledd fràn fullängdsfaktor VIII saknande aminosyrorna 745 till 1562.

Uttrycket “faktor-VIII:R3" definieras som en polypeptid saknande aminosyrorna 741 till 1648 med nämnda segment er- satt med tvà argininrester. Uttrycket "faktor VIII:R4" de- finieras av en polypeptid saknande aminosyrorna 741 till 1648 med nämnda segment ersatt med tre argininrester. Ut- trycket "faktor-VIII-R5" definieras som en polypeptid sak- nande aminosyrorna 741 till 1648 med nämnda segment ersatt med fyra argininrester.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Föreliggande uppfinning avser teknik för framställ- ning av proteiner med faktor-VIII:C-aktivitet. Närmare be- stämt astadkommes genom föreliggande uppfinning modifie- rade faktor-VIII-GDNA-sekvenser harledda från fullëngds- faktor-VIII-QDNA som vid expression i animalceller ger upphov till produktion i hög nivå av proteiner med faktor- -VIII:C-aktivitet bestående i huvudsak av två polypeptid- kedjor med en molekylvikt om 90 kDa respektive 80 kDa.¶ Genom föreliggande uppfinning åstadkommas följaktli- gen en DNA-sekvens kodande för ett biologiskt aktivt re- kombinant humant faktor-VIII-derivat innefattande ett första DNA-segment kodande för 90 kDa-kedjan av human fak- tor VIII och ett andra DNA-segment kodande för 80 kDa- -kedjan av human faktor VIII, varvid nämnda segment är in- bördes anslutna medelst ett linker-DNA-segment kodande för en linkerpeptid om minst 2 aminosyrarester utvalda bland' lysin och arginin.

Ehuru längden av den linkerpeptid som kodas för av nämnda linker-DNA-segment ej är kritisk är det föredraget att den ej innehåller mer än cirka 10 aminosyrarester.

Det är speciellt föredraget att linkerpeptiden ut- göres av 2, 3 eller 4 aminosyrerester, speciellt 3 eller 4 aminosyrarester. Det är speciellt föredraget att amino- syraresten som föregår Glu-1649 utgöres av arginin.

I enlighet med föreliggande uppfinning är det före- draget att samtliga aminosyrarester som bildar linkerpep- tiden är argininrester.

Det bör observeras, ett linkerpeptiden är uppbyggd fran basiska aminosyror, nämligen lysin- och/eller argi- ninrester. Bland dessa tva är argininrester föredragna. 468 050 6 Uppfinningen avser även en rekombinant expressions- vektor innehållande en transkriptionsenhet innefattande den DNA-sekvens som angivits ovan och ytterligare en pro- noter- och en polyadenyleringssignalsakvens.

Upptinningen täcker även värdceller av animaliskt ur- sprung transformerade med den rekombinanta expressionsfak- _torn som definierats ovan.

Genom uppfinningen åstadkommas vidare ett förfarande för framställning av ett biologiskt aktivt rekombinant nu- mant faktor-VIII-derivat såsom beskrivits ovan, vilket förfarande innefattar odling av en djuroellinje transfor- merad med en rekombinant expressionsvektor sàsom definie- rats ovan i ett näringsmedium som tillåter expression och sekretion av ett humant faktor-VIII-derivat sammansatt av 90 kDa-domänen och bunden därtill via en metalljonbindning 80 kDa-domänen, varvid nämnda uttryckta derivat sedan tillvaratas från odlingsmediet.

Slutligen astadkommes genom uppfinningen ett humant faktor-VIII-derivat innefattande 90 kba-kedjan och bunden därtill eventuellt via linkerpeptiden eller del darav ge- nom en metallbindning 80 kDa-kedjan av human faktor VIII.

För att erhålla ett protein med faktor-VIII:C-akti- vitet bestående av ovan angivna polypeptidkedjor maste den under translation in viyg skapade enkla polypeptidkedjan spjälkas endera genom post-translationell processning under den biosyntetiska processen i den producerande oel- len eller genom proteolytisk prooessning in vitrg eller badadera. Eftersom ett protein med faktor-vIII:C-aktivitet bestående av tvà polypeptidkedjor om 200 kDa och 80 kDa molekylvikt kan isoleras fràn human plasma antas det att här föreligger ett lämpligt spjälkningsställe for process- ningsenzymer pà den primära translationsprodukten av den enkelkedjiga fullangdsfaktorn VIII. Ett väsentligt pro- oessningsstalle in give är troligen beläget vid karboxi- terminalsidan av Arg-1648. Under proteolytisk mognad ger spjalkning vid Arg-1648 upphov till ett faktor-VIII-pro- tein bestående av ovanstående kedjor om 200 kDa och 80 kDa 7 molekylvikt. Eftersom Arg-1648 synes vara belägen vid en övergång mellan strukturella domäner i faktor-VIII-mole- kylen kan den utgöra ett steriskt tillgängligt mal för prooessningsenzymet eller -enzymerna. Ett annat process- ningsställe kan föreligga vid Arg-740, som ger upphov till omvandling av 200 kDa-kedjan till en 90 kDa-kedja in yiprg, sålunda resulterande 1 90 kDa- och 80 kDa-formen av faktor VIII närvarande i kommersiella faktor-VIII-konoen- trat hfirledda fràn human plasma. I enlighet med förelig- gande uppfinning har det befunnits, att för att producera deleteringsderivat av faktor VIII som kan processes endera in 2229 eller in vitrg till proteiner bestående av två polypeptidkedjor om 90 kDa och 80 kDa molekylvikt den polypeptidkedja om 908 aminosyror som sammanbinder Arg- -740 och Glu-1649 i fullangdsfaktor-VIII-proteinet kan er- sättas med minst tre basiska aminosyrarester, dvs. lysin- eller argininrester eller bàdedera. Företredesvis är aminosyran vid aminoterminalsidan av Glu-1649 en arginin- rest.

Produktionen av faktor-VIII-proteiner bestående av två polypeptidkedjor enligt ovan vid höga nivåer i lämpli- ga värdceller kräver sammansättning av faktorns VIII dela- teringsderivat cDNAn i effektiva trenskriptionella enheter tillsammans med regulatoriska elementen i en kloningsvek- tor som kan propageras i E. coli enligt förfaranden som är kända för fackmän på området. Effektiva transkriptionella regulatoriska element kan härledas från virus med animals celler som naturliga värdar eller frán kromosomal DNA av animalceller. Företrädesvis kan promoter-enhancerkombina- tioner harledda från Simian Virus 40, adenovirus, BK poly- omavirus, humant oytomegalovirus eller långa terminala repeaten av Rous sarkomavirus eller promoter-enhancer- kombinationer innefattande starkt konstitutivt trenskri- berade gener i animalceller såsom beta-aktin eller GRP78 användas. För att uppnå höga stabila nivåer av mRNA trans- kriberade fràn faktor-VIII-cDNAn bör den transkriptionelle enheten i sin 3'-proximala del innehålla en DNA-region 468 050 8 kodande for en transkriptionsll terminations-polyadeny1a- tionssekvens. Denna sekvens är företrädesvis hërledd från den tidiga transkriptionella regionen av Simian virus 40, kanin beta-globingenen eller den humana vävnadsplasmino- genaktivatorgenen.

De till effektiva transkriptionella enheter sålunda sammansatta faktor-VIII-cDNAn introduceras sedan 1 en lämplig värdorganism för expression av de olika faktor- -VIII-proteinerna. Denna organism bör företrädesvis vara en aminalcellinje av vertebratursprung för att åstadkomma korrekt veckning, disulfidbindningsbildning, asparagin- knuten glykosylering och andra posttranslationella modi- fikationer även som sekretion i odlingsmediet. Exempel pá andra posttranslationella modifikationer är tyrosin-O- -sulfatering och proteolytisk processning av den nascenta polypeptidkedjan essentiell för bildning av de tvàkedjiga 90 kDa- och 80 kDa faktor-VIII-molekylerna. Exempel pa cellinjer som kan användas är ap-COS-celler, mus~L-celler, mus-C127-celler, hamster-BHK-21-celler, humana embryona njur-293-celler och preferentiellt CHO-celler.

Transkriptionsenheterna kodande för faktor-VIII- -cDNAn kan introduceras i en animal oellinje pà flera olika sätt. Exempelvis kan rekombinanter skapas fràn ovan- stående transkriptionsenheter och vektorer baserade pà de olika animals virus. Exempel på sådana är vektorer base- rade på bakulovirus, vaooiniavirus, adenovirus och före- trädesvis bovint papillomavirus.

Transkriptionsenheterna kodande for faktor-VIII-cDNAn kan även introduceras i animals celler tillsammans med en annan rekombinant gen som kan fungera som en dominant se- lekterbar markör i dessa celler för att underlätta isole- ringen av specifika cellkloner som i sitt genom integrerat rekombinant DNA. Exempel pà denna typ av dominanta selek- tarbara markörgener är Tn5 aminoglykosidfosfotransferas som ger resistens mot Geneticin (G4l8), hygromyoinfosfo- transíeras som ger resistens mot hygromycin och puromycin- aoetyltransferas som ger resistens mot puromyoin. Den ...L C oo c: (fl co 9 transkriptionella enheten kodande för en sådan selekterbar markör kan föreligga endera pà samma vektor som den som kodar för faktor-VIII-CDNA eller den kan kodas pà en sepa- rat vektor som samtidigt införes ooh integreras i vard- oellens genom vilket ofta resulterar 1 en tät fysikalisk bindning mellan de olika transkriptionsenheterne.

Andra typer av selekterbara markörgener som kan an- vändas tillsammans med faktor-VIII-cDNAn baserade pà olika transkriptionsenheter kodande för dihydrofolatreduktas (dhfr). Efter introduktion av denna typ av gen i celler som saknar endogen dhfr-aktivitet, främst CHO-celler (DUKX-Bll, DG-44) kan dessa tillväxa i media som saknar nukleosider. Ett exempel pà ett sådant medium är Ham's F12 utan hypoxantin, tymidin och glycin. Dessa dhfr-gener kan introduceras tillsammans med de transkriptionella faktor- -VIII~cDNA-enheterna i CHO-celler av ovanstående typ, en- dera bundna till samma vektor eller på olika vektorer, så att sålunda dhfr-positiva oellinjer skapas vilka produce- rar rekombinat faktor-VIII-protein.

Om ovanstående cellinje får tillväxa i närvaro av cytotoxiskt dhfr-inhibitormetotrexat kommer nya cellinjer resistenta mot metotrexat att uppträda. Dessa cellinjer kan producera rekombinant faktor-VIII-protein i för hög grad beroende pá ökat antal transkriptionella enheter av bunden dhfr och faktor VIII. vid propagering av dessa oellinjer 1 ökande konoentrationer av metotrexat (1-10000 nM) kan nya oellinjer erhållas vilka producerar faktor- -VIII-protein vid mycket hög nivå.

Ovanstående cellinje som producerar faktor-vIII-pro- tein kan odlas i stor skala, endera i suspensionskultur eller på olika fasta underlag. Exempel pà sådana underlag ar mikrobärare baserade pà dextran- eller kollagenmatriser eller fasta underlag i form av ihåliga fibrer eller olika keramiska material. Vid odling i suspensionskultur eller på mikrobërare kan odlingen av ovanstående cellinjer ut- föras endera som batch-odling eller som perfusionsodling med kontinuerlig produktion av konditionerat medium över 468 G50 utsträckta tidsperioder. Enligt föreliggande uppfinning är sålunda ovanstående cellinjer väl lämpade för utveckling av en industriell process för produktion av rekombinant faktor VIII som motsvarar den autentiska tvápolypeptid- kedjiga faktor VIII (90 kDa och 80 kDa) som kan isoleras från humant plasma.

Det rekombinanta faktor-VIII-proteinet som ansamlas i mediet av CHO-celler av ovanstående typ kan koncentreras och renas genom mangfaldiga och kemiska metoder innefat- tande metoder som utnyttjar skillnader i storlek, ladd- ning, hydrofobicitet, löslighet, specifik affinitet etc. mellan det rekombinanta faktor-VIII-proteinet och andra substanser i cellodlingsmediet.

Ett exempel pà en sådan rening är adsorptionen av det rekombinanta faktor-VIII-proteinet till en monoklonal entikropp som är immobiliserad på en fast bärare. Efter desorption kan faktor-VIII-proteinet ytterligare renas genom olika kromatografisk teknik baserat pà ovanstående egenskaper.

De rekombinanta proteinerna med faktor-VIII-aktivitet som beskrives i föreliggande uppfinning kan formuleras i. farmaceutiska beredningar för terapeutisk användning. De renade faktor-VIII-proteinerna kan upplöses i konventio- nella fysiologiskt kompatibla vattenbaserade buffertlös- ningar, till vilka man eventuellt kan tillsätta farmaceu- tiska edjuvantia för att åstadkomma farmaceutiska bered- ningar.

Föreliggande uppfinning kommer att beskrivas mera i detalj i det följande genom icke inskränkande exempel där- av. Denna beskrivning av konkreta utföringsformer enligt uppfinningen utföres i anslutning till bilagda ritningar, vari: Fig. 1 är en schematisk återgivning av förhållandet mallen fullangdsfaktor VIII och faktorn vIII:R3, faktorn VIII:R4 respektive faktorn VIII:R5. Den primära strukturen av regionen mellan C-terminus av 90 kna-kedjan (Arg-740) och N-terminus av 80 kna-kedjan (Glu-1649) visas.

.Is cm co f: LTI ca 11 Fig. 2 är en illustration av plasmiden pKGE49l inne- hållande faktor VIII:R3-oDNA under transkriptionell kon- troll av den humana cytomegaloviruspromotern; Fig. 3 är en illustration av plasmiden pKGE674 inne- hållande faktor-VIII:R4-cDNA under transkriptionell kon- troll av den humana GRP78-promotarn och en ytterligare transkriptionell enhet kodande för musdihydrofolatreduk- tas-cDNA under transkriptionell kontroll av den långa terminala repeaten av musmammartumörvirus; Fig. 4 är en illustration av plasmiden pKGE672 inne- hållande faktor VIII:R5-CDNA under transkriptionell kon- troll av den humana GRP78-promotern, och musdihydrofolat- reduktas liknande den i Fig. 3 àtergivna vektorn: Fig. 5 är en illustration av plasmiden pKGE327 inne- hållande endast den transkriptionella enheten av musdihyd- rofolatreduktas~cDNA (jfr Pig. 3); Pig. 6 är en illustration av immuno-blotting av fak- torn VIII:R3, faktorn vIII:R5 och plasmaderiverad faktor VIII efter polyakrylamidgelelektrofores i närvaro av nat- riumdodecylsulfat. Spelt A: plasma faktor VIII. Spalt B: faktor VIII:R3. Spalt C: faktor VIII:R5.

Pig. 7 visar ett diagram pà förändringar i faktor VIII-aktivitet av rekombinant faktor vIII:R5 efter inkuba- tion med humant a-trombin: Fig. 8 illustrerar förändringar i mönster av SDS-PAGE och immuno-blotting av rekombinant faktor VIII:R5 efter inkubering med humant a-trombin (0,01 NIH-enheter trombin per 1 IU faktor VIII:C).

EXEMPEL 1 En serie av deleteringsderivat av faktor VIII-:DNA har konstruerats, vilka kodar för polypeptidkedjor ej in- nehållande hela B-domänen men innehållande olika antal ba- siaka aminoayror som sammanbinder karboxiterminus av den tunga kedjan till aminoterminus av den lätta kedjan. Dessa faktor-VIII-deleteringsderivat underkastas proteolytisk processning in gigg av den primära translationsprodukten i 468 050 12 två polypeptidkedjor. I nedan angivna exempel avser amino- syranomenklaturen de positioner som återges i fullängds- faktor-VIII-molekylen utan signalsekvensen.

Mutagenes av faktor-VIII-oDNA för att åstadkomma faktor- -VIII:R3-deletering Ett 627 baspar Kpnl-PstI-restriktionsfragment erhål- let från GDNA av ett faktor-VIII-deleteringsderivat (fak- tor vIII:RE, M. Pasek, PCT-ansökan nr WO 88/00831, ATCC 53517) kodande för aminosyrorna Leu 587 till Ala 1702 sam- manbundna via en direkt fusion mellan Arg 740 och Glu 1649 av fullängdsfaktor VIII introducerades i bakteriofagvek- torn Ml3mp19 (Yanisch-Perron, C. et al. (1985) Gene 33, 103-119) enligt standardmetoder. Oligonukleotidriktad mutagenes (Nakamaye, K. och Eokstein, F. (1986) Nucleic Acids. Res. 14, 9679-9698) utfördes på enkelsträngat DNA- -templat framställt av ovanstående rekombinanta bakterie- fag. 10 pg renad cirkulär enkelsträngad feg-DNA annealera- des till 8 pmoler av en 5'-fosforylerad oligonukleotid med sekvenaen: '-AACAATGCCATTGAACCAÅGAAGAAGAGAAATAACTCGTACTACTCTTCAG-3' Den andra strängen av cirkulär DNA syntetiserades pà det bildade templatet genom addition av alla fyra deoxi- nukleotiderna, dCTPdS, 12 enheter av Klenow-fragmentet av DNA-polymeras I och 12 enheter T4 DNA-ligas. Efter inkuba- tion över natten vid 16°C anrikades reaktionsblandningen med avseende pà dubbelsträngad DNA genom filtrering av nitrooellulosa i närvaro av 500 mM NaCl. En femtedel av renad dubbelsträngad DNA nickades genom inkubation med 5 enheter av restriktionsenzymet Neil, behandlat med 50 en- heter Exonuclease III i sådan utsträckning, att templat- strängen av fag-DNA partiellt avlagsnades. Bildat parti- ellt duplex gjordes dubbelsträngat genom behandling med 3 enheter DNA-polymeras I och 2 enheter T4 DNA-ligas i när- varo av samtliga fyra deoxinukleotidtrifosfaterna vid 16°C J> CN CD CD (fl CD 13 i 3 timmar. En fjärdedel av den erhållna blandningen an- vändes för att transformera 300 pl kompetenta E. coli TG1.

Av de resulterande mutageniserade fagklonerna underkasta- des tio dideoxi-DNA-sekvenering (Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Soi. USA 74, 5463-5467). En av de sekve- nerade fagklonerna innehöll en insats med den förväntade nukleotidsekvensen dikterat av ovanstående mutagena pri- mer. Faginsatsen bestàr sålunda av ett 630 baspars Kpnï- -Pstl-fragment av faktor-VIII-cDNA kodande för en fusion mellan Arg 740 och Glu 1649 via tvâ extra Årg-rester (faktor VIII:R3).

Konstruktion av en mammalieexpressionsvektor kodande for faktor VIII:R3 Det 630 baspar Kpnl-Pstl-fragmentet kodande för fak- tor-VIII:R3-fusionen enligt ovan uttogs från den dubbel- strängade replikativa formen av Ml3mpl9-fag-DNAn och in- troducerades i vektorn pKGE43l. Denna vektor består av ett 2046 baspar Kpnl-Sphl-fragment fran faktor-VIII:RE-cDNAn (M. Pasek, PCT-ansökan nr WO 88/00831, ATCC 53517) kodande för aminosyrorna Leu 587 till Met 2176 av faktor-VIII:RE- -proteinet i pUCl9. Det 630 parbas fragmentet kodande for faktor-VIII:R3-fusionen enligt ovan introducerades i pKGE43l som fullständigt spjälkats med Kpnl och partiellt spjälkats med Pstl. Den resulterande vektorn, pKGE490, in- nehåller en 2052 baspar Kpnl-Sphl-insats kodande för aminosyrorna Leu 587 till Met 2176 av faktor VIII:R3. pKGE490 uppslöts med Kpnl och Apal, och motsvarande 1665 baspar fragment kodande för Leu 587 till Ala 2047 av faktor-VIII:R3-proteinet ligerades till det stora fragmen- tet av vektorn pKGE347 som uppslutits med Kpnl och Apal.

Vektorn pKGE347, som är baserad på E. coli-kloningsvektorn pBR327, består av en human cytomegalovirueenhancer/promo- ter kodad pá ett 741 haspar DNA-segment (nukleotidpositio- nerna -671 till +71, Boshart, M. et al. (1985) Cell 41, 521-530) uppströms om faktor~VIII:QD-cDNA med SV40 t-anti- genintron- och polyadenyleringssekvensen vid den 3'-prox1- 468 050 14 mala delen. Den resulterande vektorn (pKGE491) som återges 1 Fig. 2 innehåller fullständiga faktor-vI11:R3-oDNA och är identiskt med pKGE347 bortsett ifran det olikartade deleteringsderivatet av faktor VIII som kodats för.

Mutagenee av faktor-VIII-cDNA för att skapa faktor- -VIII:R4-deletering Den del av faktor VIII:R3-cDNAn enligt ovan kodande för det 630 baspar Kpnl-Pst-fragmentet introducerades i vektorn pUCl9 som öppnats med samma enzymer. Den erhållna vektorn, kallad pKGE657, underkastades sedan site-riktad mutagenes genom överlappförlängning under användning av polymeraskedjereaktionen (Ho, S.N., et al. (1989) Gene 77, 51-59; Saiki, R.K. et al. (1988) Science 239, 487-491). I den första delen av mutagenesreaktionen uppställdes två parallella experiment. I experiment nr ett blandades 100 ng av plasmiden pKGE657 med 1 pM vardera av följande tva primera: '~ATTGAACCAAGAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACT-3' '-GATAACAATTTCÅCACÅ-3'" Till detta sattes i en slutlig reaktionsvolym om 100 pl 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,01% gelatin, 200 uM vardera av de fyra deoxinukleoti- derna och 2,5 enheter Taq-polymeras. Proven underkastades denatureringscykler vid 94°C i l min., annealing vid 50°C 1 2 min. och förlängning vid 72°C i 3 min. under an- vändning av en DNA Thermal Cycler enligt fabrikantens spe- cifikationer (Perkin Elmer Cetus). Analys av reaktionspro- dukterna med agarosgelelektrofores och färgning med eti- diumbromid enligt standardprocedurer angav bildningen av en enkel förstärkt DNA-produkt med längden 240 baspar. I experiment nr tvâ utfördes polymeraskedjereaktidnen pà identiskt sätt under användning av följande två primers: '-ÅGTACGAGTTATTTCTCTTCTTCTTCTTGGTTCAAT-3' '-GTAACGCCÅGGGTTTTCC-3' Analys av reaktionsprodukterna med agarosgelelektro- fores angav bildningen av en enkel förstärkt DNA-produkt med en längd av 550 baspar. I den andra delen av mutagene- sen kombinerades 10 pl vardera av produktblandningarna från de tva ovanstående parallella experimenten i en tredje polymeraskedjereaktion i en total volym om 100 pl med betingelser som var identiska med de ovanstående bort- sett ifrån att endast följande två primers användes: '-GTAACGCCAGGGTTTTCC-3' '-GATAACAATTTCACACÅ-3' Analys av reaktionsblandningen med agarosgelelektro- fores angav bildningen av en enkel förstärkt DNA-produkt med en längd av 750 baspar. Detta DNA-fragment uppslöts med Kpnï och Pstl och introducerades i vektorn pUCl9 öpp- nad med samma enzymer. Flera av de bildade plasmiderna DNA-sekvenerades med metoden med dideoxikedjeterminering (Senger. F., et al., viga 53235) och en plasmid med det förväntade 633 baspar Kpnl-Pst-fragmentet med korrekt sek- vens betecknedes pKGE658. Denna plasmidinsats består sa- lunda av ett fragment av faktor~VIII:R4-CDNA kodande för en fusion mellan Arg 740 och Glu 1649 via tre extra Arg- -rester.

Konstruktion av en mammalieexpressionsvektor kodande för faktor VIII:R4 Den för 633 baspar KonI-Pstï-fragmentet kodande deler av faktor VIII:R4-cDNA uttogs fràn vektorn pKGE658 och in- troducerades i vektorn pKGE49O som fullständigt spjalkats med Kpnl och partiellt spälkats med PstI. Den erhållna vektorn pKGE673 innehåller en 2055 baspar Kpnl-Sphï-insats 468 050 16 kodande för aminosyrorna Lou 587 till Met 2176 av faktor vIII:R4. Ett 1668 baspar Kpnl-ApaI~fragment kodande för Leu 587 till Ala 2047 av faktorn VIII:R4 uttogs fràn pKGE673 och överfördes till det stora fragmentet av vek- torn pKGE60l som öppnats med samma enzymer. Vektorn pKGE60l, som baseras pa E. coli kloningsvektorn pML2, be- _ står av den humana GRP78 enhanoer/promotern kodad på ett 443 baspar DNA-segment (nukleotidpositionerna 2.till 445, Ting. J. & Lee, A.S. (1988) DNA 7(4), 275-286) uppströms om faktor-VIII:R5-QDNA med SV40 t-antigenintron- och poly- adenyleringssekvensen vid den 3'-proximala regionen. Pla- cerad nedströms om denna region är en transkriptionsenhet kodande för musdihydrofolatreduktas~cDNA under kontroll av den långa terminala repeaten av musmammartumörvirus ooh utnyttjande samma SV40 3'-kontrollelement som ovan. Den resulterande vektorn, pKGE674, återges i Fig. 3 Mutagenes av faktor-VIII-cDNA för att skapa faktor- -VIII:R5-deletering Vektorn pKGE657 underkastades site-riktad mutagenes genom överlappförlängning under användning av polymeras- kedjereaktionen på ett sätt som är analogt med ovanstående exempel beträffande faktor VIII:R4. Som primers i den första av de två parallella reaktionerna användes föl- jande: '-ATTGAACCAAGAAGAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACT-3' '-GATAACÅATTTCACACA-3' Analys av reaktionsprodukter med agarosgelelektro- fores, såsom i ovanstående exempel, angav bildningen av en reaktionsprodukt om 240 basparl I den andra av de två parallella reaktionerna användes följande primers: '-AGTACGAGTTATTTCTCTTCTTCTTCTTCTTGGTTCAAT-3' 468 050 17 '-GTAACGCCAGGGTTTTCC~3' Analys av reaktionsprodukterna med agarosgelelektro- fores angav en reaktionsprodukt om 550 baspar. Den andra delen av mutagenesexperimentet, analog med ovanstående exempel, gav en förstärkt DNA-produkt om 760 baspar. Efter uppslutning av denna DNA med Kpnl och Pstl introducerades den i pKGE49O som fullständigt spjälkats med Kpnl och par- tiellt spjälkats med Pstl.

En pasmid med det förväntade 636 baspar KpnI-Pst- -fragmentet med korrekt sekvens bestämdes genom metoden med dideoxikedjeterminering (Sanger, F., et al. vide ggggg) och betecknadee pKGE659, och består totalt av en 2058 baspar Kpnï-Sphl-insats bestående av ett fragment av faktor~VIII:R5-cDNA som kodar för en fusion mellan Arg-740 och Glu-1649 via fyra extra Arg-rester.

Konstruktion av en mammalieexpressionsvektor kodande för faktor VIII:R5 Ett 1668 baspar Kpnl-Apal-fragment kodande för Leu 587 till Ala 2047 av faktor VIII:R5 uttogs från pKGE659 och överfördes till det stora fragmentet av vektorn pKGE601 som öppnats med samma enzymer pà samma sätt som beskrivits ovan för faktor VIII:R4-expressionevektorn pKGE674. Den resulterande vektorn kodande för faktor vIII:R5 (pKGE672) àterges 1 Fig. 4.

EXEMPEL 2 Derivering_av Kinahamsterovarieceller produoerande faktor VIII:R3 I en oellodlingsskàl med 10 centimeters diameter ymf pades 0,5 millioner dihydrofolatreduktassaknande Kinahams- terovarieceller (CHO-DG44, erhållna från Dr L A Chasin, Columbia University, New York) i Dulbecco's modifierade Eagles Medium/Ham's F12 (lzl) supplementerat med 10% foetalt kalvserum och inkuberades över natten vid 37°C i 468 050 18 en 5% koldioxidinkubator. Nästa dag tvättades cellerna med färskt medium och transfekterades sedan genom kalciumfos- fatmetoden med 10 ug av en 1:1-blandning av faktor VIII:R3-expressionsvektorn PKGE491 och dihydrofolatreduk- tasvektorn pKGE327 enligt metoder kända inom tekniken.

Vektorn pKGE327 innehåller en transkriptionsenhet bestå- ende av den långa terminala repeaten av musmammartumör- virus uppströms om musdihydrofolatreduktas-cDNA med SV40 t-antigen- och polyadenyleringssekvensen vid den 3'-proxi- mala delen klonad i vektorn pML2 pà medurs sätt (Fig. 5).

Dag tre avlägsnades mediet, cellerna tvättades och uppde- lades i nya odlingsskàlar. Dag fyra initierades selektio- nen för dihydrofolatreduktas positiva celler genom ersätt- ning av mediet med ovanstående cellodlingsmedium saknande hypoxantin, glycin och tymidin och supplementerades med % noggrant dialyserat foetalt kalvserum. Detta medium byttes två gånger per vecka, och efter cirka tvâ veckor kunde kclonier av dihydrofolatreduktas positiva celler skördas. Dessa kolonier poolades och odlades vidare i 25 cmz cellodlingsflaskor, och efter att ha uppnått subkon- .fluens ersattes mediet med färskt medium innehållande 3% foetalt kalvserum. Efter en tidsperiod av 24 timmar tes- tades aktiviteten av faktor VIII:C i cdlingsmediet under användning av metoden med syntetiskt substrat (Coatest Factor VIII:C, KABI-Pharmacia) och en expressionsnivà av 80 mU/ml erhölls. Poolen av dihydrofolatreduktaspositiva celler underkastades genförstärkning genom flera veckors odling i medium innehållande dihydrofolatreduktasinhibi- torn metotrexat. Efter selektion genom stegvis förhöjning av koncentrationen av metotrexat upp till 500 nM erhölls en pool av resistenta celler som producerade faktor vIII:C vid en nivå av 1,0 U/ml i rullflaskor.

.Iä CN CO CD (fl CD 19 Derivering av Kinahamsterovarieoeller producerande_faktor VIII:R5 På samma sätt som ovanstående transfektion av den faktor VIII:R3-kodande expressionsvektorn transfekterades Kinahamsterovarieceller med den faktor VIII:R5~kodende expressionsvektorn pKGE672. I detta fall uteslöts kotrans- fektion med pKGE327 eftersom en transkriptionsenhet koden- de för selektions- och amplifikationsmarkördihydrofolat- reduktas är närvarande i denna vektor. Efter selektion i medium saknade hypoxantin, glycin och tymidin och supple- menterat med 10% noggrant dialyserat foetalt kalvserum på samma sätt som ovan erhölls en pool av oellkloner som pro- ducerade 110 mU/ml faktor VIII:C-aktivitet uppmätt enligt Coatest-metoden. Selektion för genamplifiering genom odling flera veckor i 20 mM metotrexat gav en pool av resistenta cellkloner som producerade 1,5 U/ml faktor VIII:C i rullflaskor.

EXEMPEL 3 Biokemisk karakterisering av faktor VIII:R3 och faktor VIII:R5 Faktor VIII:R3 och faktor VIII:R5 producerade genom deras respektive förstärkta CHO-DG44 cellinjepooler såsom beskrivits i Exempel 2 undersöktes med avseende pa bio- kemiska egenskaper. Rening av materialet från odlings- mediet utfördes genom immunoaffinitetskromatografi med an- vändning av monoklonala antikroppar riktade mot faktor VIII åtföljt av ett jonbytarkromatografisteg. Den specifi- ka aktiviteten av det erhållna renade materialet låg inom intervallet 3000 till 4000 IU/A280 och förhållandet faktor VIII-aktivitet/faktor VIII-antigen var nära 1 (aktiviteten uppmätt med Coatest (KABI-Pharmacia) och antigen bestämdes genom Elisa-essay med användning av monoklonala antikrop- par riktade mot 80 kDa-kedjan. 468 050 Renad faktor VIII:R3 och faktor vIII:R5 underkastades SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och western- blot-analys. SDS-PAGE utfördes enligt Laemmli (1970): Nature 227, 680-685). Polyklonala anti-humana faktor VIII- antikroppar fran kanin tidigare beskrivna (Andersson, L-0., at al. (1986), Proc. Natl. Aoad. Soi. USA, 83, 2979- -2983) användes för westernblot-analysen i huvudsak sàsom beskrivas av Towbin, H., et al. (1979, Prcc. Natl. Acad.

Soi. USA, 76, 4350-4354). Resultaten visas i Fig. 6.

Spalt A: plasmafaktor VIII innehållande en 80 kDa lätt kedja och tunga kedjor varierande fràn 200 kDa till 90 kDa. Spalt B: faktor VIII:R3. Spalt C: faktor VIII:R5.

Faktor VIII:R3 visar band vid 80 kDa, 90 kDa, 130 kDa och 170 kna. 80 kDa- och 90 kDa-banden återfanns i samma posi- tion pá gelen som 80 kDa 90 kDa-peptider representerande det minsta biologiskt aktiva komplexet av plasmafaktor VIII. 170 kDa-bandet representerar förmodligen den icke processade primära translationsprodukten, och bandet vid 130 kDa en i okorrekt prooessad form av faktor VIII:R3. De 'icke autentiska polypeptidkedjorna har sålunda aven erhal- iits förutom ao kps- och 90 kna-kedjorna. Faktor vI:1=Rs uppvisar band vid 80 kDa och 9 kDa. Ingen signifikant mängd icke prooessad primärtranslationsprodukt (170 kna- -kedjan) var närvarande i detta material. Detta betyder att den proteolytiska prooessningen in gigg av den primära translationsprodukten i tva polypeptidkedjor var effektiv i detta fall. En tvakedjig molekyl med peptidkedjor av molekylvikter motsvarande de som är närvarande i den minsta aktiva formen av plasma faktor VIII erhölls sålunda i bada fallen. Dessutom visade N-terminal sekvensbestam- ning med automatiserad Edman-nedbrytning av faktor vIII:R5 att aminotermini av 90 kDa- och 80 kDa-kedjorna ar iden- tiska med den för plasma hërledda fràn 90 kDa plus 80 kDa faktor VIII.

I Fig. 7 och 8 visas aktiveringskurvan och SDS- -PAGE/westernblot-mönstret som erhålls efter inkubation av faktor VIII:R5 med trombin (0,01 U trombin per 1 U faktor 21 VIII tillsattes). En enstegs klottingmetod (Mikaelsson, M. et al., (1983) Blood 62, 1006-1015) användes för omedelbar analys av prover från reaktionsblandningen. En 17-faldig aktivering erhölls inom tva minuter vilken senare åtfölj- des av inaktivering. Natriumdodecylsulfat vid 0,02 g/ml tillsattes för att avbryta reaktionen i prover för analys genom SDS-PAGE/westernblot. Elektrofores och Westernblot- -analys utfördes på proverna uttagna vid tidsintervaller under reaktionen, såsom beskrivas i anslutning till Fig. 6. De erhållna resultaten uppvisade en molekylförëndring av faktor VIII-peptider identisk med den för plasma faktor VIII under inkubering med trombin. 90 kDa-peptiden spjäl- kades således med trombin och en 50 kDa plus en 40 kDa- -peptid bildades. 80 kDa-peptiden spjälkades och en 70 kDa-peptid bildades, Studierna med trombin visade att fak- tor VIII:R5 beter sig som plasma faktor VIII i inter- aktionen med detta enzym. Detta särdrag betecknas vara väsentligt för biologisk aktivitet in gigg.

Interaktionen av faktor VIII:R5 med human von Wille- brandfaktor studerades med användning av storleksexklu- sionekromatografi pá Sepharose CL-68. Tio (10) IU av faktor VIII:R5 inkuberades med 30 U renad human von Wille- brandfaktor vid 37°C i 20 minuter. Inkuberingsblandningen applicerades sedan pà en kolonn packad med Sepharose CL- 6B. Allt material med faktor VIII-aktivitet eluerade i voidvolymen med von Willebrandfaktor. När faktor VIII:R5 utan tillsatt von willebrandfaktor applicerades pà kolon- nen eluerades material med faktor VIII-aktivitet endast i de inre fraktionerna vid en position där även 90 kDa- 80 kDa-formen av plasma faktor VIII eluerades. Detta re- sultat visar att faktor VIII:R5 har kapaciteten att binda von willebrandfaktorn, vilken är en egenskap nödvändig för goa överlevnad gg 5%; (erinxnauae, kmr., et al. (1985) Proo. Natl. Aoad. Soi. USA 82, 8752-8756).

Faktor~VIII-derivaten enligt föreliggande uppfinning har deponerats vid Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen den 13 mars 1991. Faktor VIII:R3 har så- 468 050 22 lunda givits depositionsnumret DSM 6415, faktor VIII:R4 har givits depositionsnummer DSM 6417 och faktor vIII:R5 har givits depositionsnummer DSM 6416.

Claims (8)

10 15 20 25 30 35 468 050 23 PATENTKRAV

1. DNA-sekvens kodande för ett biologiskt aktivt rekombinant humant faktor VIII-derivat innefattande ett första DNA-segment kodande för aminosyrorna 1 till 740 av human faktor VIII och ett andra DNA-segment kodande för aminosyrorna 1649 till 2332 av human faktor VIII, varvid nämnda segment är inbördes anslutna med ett linker-DNA- segment kodande för en linkerpeptid om 2 till cirka 10 aminosyrarester, vilka är utvalda bland lysin och arginin.

2. DNA-sekvens enligt patentkravet 1, vari nämnda linker-DNA-segment kodar för 2, 3 eller 4 aminosyrarester.

3. DNA-sekvens enligt patentkravet 1 eller 2, vari nämnda linker-DNA-segment kodar för 3 eller 4 aminosyra- rester, varvid den aminosyrarest som föregår Glu-1649 är arginin.

4. DNA-sekvens enligt något av de föregående patent- kraven, vari alla aminosyrarester av nämnda linker är arginin.

5. DNA-sekvens enligt något av de föregående patent- linker-DNA-segment kodar för 3 eller 4 utgöres av arginin. kraven, vari nämnda aminosyrarester som

6. Rekombinant transkriptionsenhet expressionsvektor innefattande en innehållande DNA-sekvensen enligt nå- got av de föregående patentkraven, en transkriptionell promoter och en polyadenyleringssekvens.

7. Värdcell av animaliskt ursprung transformerad med den rekombinanta expressionsvektorn enligt patentkravet 6.

8. Förfarande för framställning av ett biologiskt ak- tivt rekombinant humant faktor-VIII-derivat uttryckt med en DNA-sekvens enligt något av patentkraven 1 till 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att man odlar en animal- cellinje transformerad med en rekombinantexpressionsvektor enligt patentkravet 6 i ett näringsmedium som tillåter expression och sekretion av ett humant faktor VIII-derivat sammansatt av två polypeptider med molekylvikter om 90 kDa respektive 80 kDa, brygga, och tillvaratagande av nämnda derivat från od- inbördes sammanbundna med en metalljon- lingsmediet.