JPS62181786A - 融合蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） この発明は、エシェリヒア・コリ（Ｅ　、ｃｏｌｉ、大
腸菌）のＴｒｐＬＥ遺伝子を用いた融合蛋白質の新規生
産方法、得られた融合蛋白質およびその用途、並びに上
記蛋白質を得るのに用いられた修飾プラスミドに関する
ものである。

（関連文献） 組換えＤＮＡ方法を用いて実質的に大腸菌のような別の
有機体における供給源から有用な蛋白質およびポリペプ
チドを生産する際の技術的および経済的利益は現在充分
に確立している。一般に、この方法は、強力なプロモー
ター−オペレーターが所望の異種遺伝子の発現を制御す
る、宿主細胞内で多数のコピーをもたらし得る自己複製
ベクターの作成を含む。次に続いてベクターによる宿主
（例、大腸菌）の形質転換、宿主培養物の高密度に達す
るまでの生長およびプロモーターの誘導により異種ポリ
ペプチドが生産される。所望のポリベブチドを高収量で
得るためには当然均質の生成物を生産する精製を少なく
しなければならないが、一般に各特異的ポリペプチドご
とに物理化学特性が異なるため各ポリペプチドに対して
個別の精製計画が必要である。

宿主細胞が生長している間の最適な時点で異種ポリペプ
チドの過剰生産を制御し得る強誘導性プロモーター−オ
ペレーター系の特性が非常に重、視されてきた。特に深
く研究された例はＴｒｐプロモーター−オペレーターの
例である。クローフォードおよびストーファ、［アニュ
アル・レビュー・オブ・バイオケミストリーＪ（Ａ　ｎ
ｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。

）、４９巻、１６３〜１９５頁（ｔ９８０年）参照。

大腸菌におけるトリプトファンの生合成は、ＴｒｐＡ、
ＴｒｐＢｌＴｒｐＣ，ＴｒｐＤおよびＴ　ｒｐＥと称さ
れる一連の５個の酵素により触媒される。これらの酵素
をコードする遺伝子は隣接しており、Ｔｒｐプロモータ
ー−オペレーターにより制御され、Ｔｒｐリーダーのご
く近くにＴ　ｒｐＥ遺伝子を伴なう。

Ｔｒｐリーダーペプチドのアミノ末端をＴｒｐＥ蛋白質
のカルボキシ部分に融合することにより様々なリーダー
−ＴｒｐＥ（ｆＬＥＪ）蛋白質が生産される、一連の欠
失突然変異体が単離された。パートランド等、「ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ（Ｊ　、Ｍ
ｏ１．Ｂ　ｉｏｌ、）、１０３巻、３１９−３３７頁（
１９７６年）、ミオツアーりおよびヤノフスキー、［ジ
ャーナル・オブ・バタテリオロジーＪ（Ｊ　、Ｂａｃｔ
、）、１３３巻、１４５７−１４６６頁（１９７８年）
参照。これらのＬＥ蛋白質は野生型配置のＴｒｐＥ蛋白
質より８−１０倍高いレベルで生産され得るため、これ
らの改変されたＴｒｐ遺伝子を用いて多くの異種ポリペ
プチドが生産されてきた。フレイド等、イギリス国特許
第２０７３２０３号、ニコルスおよびヤノフスキー、「
メソッズ・イン・エンサイモロジーＪ（Ｍｅｔｈ、　Ｅ
　ｎｚｙ＋＋ｏ１．）、１０１巻、１５５−１６４頁（
１９８３年）参照。

発現に適した宿主遺伝子に融合した興味ある異種遺伝子
の発現による融合蛋白質の細胞内合成は、異種蛋白質の
高レベルの発現を達成する好都合な手段である。大腸菌
において小さなポリペプチドホルモンを生産するために
、このアプローチは非融合ホルモンと比べて融合蛋白質
の発現レベルおよび安定性の両方の増加をもたらした。

イタクラ等、［サイエンスＪ（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、１
９８巻、１０５６−１０６３頁、（１９７７年）、ゲー
デル等、「ネイチャーＪ（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、２８１巻
、５４４−５４８頁、（１９７９年）、シャイン等「ネ
イチ＋−Ｊ（Ｎａｔｕｒｅ）、２８５巻、４５６−４６
１頁、（１９８０年）参照。ロ蹄疫ウィルスキャップジ
ッド蛋白質ＶＰ３　　（フレイド等、［サイエンスＪ（
Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２目１．１１２５−１１２９頁（
１９８１年）〕またはインフルエンザウィルス赤血球凝
集素蛋白質ＨＡ（ディビス等、「ジーンＪ（Ｇｅｎｅ）
、〕のどちらかとのＴｒｐＬＥ蛋白質の融合ポリペプチ
ドが発現に適していることが報告された。またこれらの
融合蛋白質は極度の不溶性である。これらの２種のウィ
ルス蛋白質は普通容易にアグリゲート（集合）するため
、ＴｒｐＬＥ融合蛋白質のアグリゲーションは異種蛋白
質の物理化学特性によるものであると考えられた。

〔発明の記載〕

この発明者は、高レベルの発現に加えて、ＴｒｐＬＥ蛋
白質は融合蛋白質に対して異種ポリペプチドの精製に有
用な特性を付与し得ることを発見した。特に、ＬＥカル
ボキシ末端領域の可変部分を異種ポリペプチドと置き換
えると、これが小さな可溶性ポリペプチドであっても自
己集合性融合蛋白質をもたらす。アグリゲート（集合体
）は細胞リゼイト（溶解物）の分画的遠心分離により得
られた沈澱物において容易にふ富化および濃縮されるた
め融合蛋白質の精製は非常に簡単なものとなった。

したがって、この有用な精製工程は様々な異種遺伝子に
ついて用いることができる。融合蛋白質部位は、望まし
い自己集合特性を失うことなくＴｒｐＬＥ遺伝子内で変
えられ得るため、ＴｒｐＬＥ遺伝子内の好都合な制限部
位を用いて所望のプラスミドベクターの作成を簡易化す
ることができる。融合部位の選択には融通性があるため
、ＴｒｐＬＥ蛋白質に他の改変を行なう（この明細書に
記載）ことにより異種ポリペプチドの精製を向上させる
ことができる。

さらに、ＴｒｐＬＥ遺伝子に結合した「３−フレームリ
ンカ−」を用いることにより、そのトリブレットリーデ
ィングフレーム（および２＠のアウト・オブ・フレーム
「ナンセンス」ポリペプチド）にかかわらず所望の異種
ポリペプチドを得ることができる。３−フレームリンカ
−が無ければ、正しいリーディングフレーム方向をもた
らす融合部位を選択するかまたは複雑なりローニング戦
略を用いなければならないため、可能な融合部位の数が
制限されることになる。３−フレームリンカ−を用いる
と、正しい（「センス」）リーディングフレームが未知
の場合でさえ容易に所望のポリペプチドを得ることがで
きる。

この発明の蛋白質とは異なるある種の融合蛋白質が、明
らかに異なる方法によりＴｒｐＬＥ遺伝子を用いて製造
された。ヨーロッパ特許出願３６７７６および１１４５
０６号参照。

後天性免疫不全症候群（Ａ４ＤＳ）の根本原理解明にお
ける重大な進歩は、ＡｊＤＳまたはＡＩＤＳ関連徴候（
ＡＲＣ）の患者から新しい種類のレトロウィルスを単離
したことである。この群のウィルスは、リンパ節症ウィ
ルス（ＬＡＶ）（ワインーホブソン等、「セルＪ（Ｃｅ
ｌｌ）、４０巻、９−１７頁（１９８５年）〕、ヒトＴ
リンパ球白血病ウィルス［［（ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ）［ラ
トナー等、「ネイチャー」（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、３１３
巻、２７７−８４頁（１９８５年）〕およびＡＩＤＳ関
連レトロウィルス（ＡＲＶ）〔サンチェスーペスカドー
ル等、［サイエンスＪ（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２７巻、
４８４−９２頁（１９８５年）〕と様々に呼ばれている
。形態学および生物学的見地から見ると、この群のウィ
ルスはレンチウィルス科と非常に密接な関係にある。こ
れまで１００を越える単離体が異なる研究グループによ
り得られた。プロウィルスＤＮＡの制限酵素分析による
と様々な単離体の間におけるかなりの程度の配列多形性
が示唆されている。限られた数のクローン単離体の間で
ヌクレオチド配列を比較すると、配列可変性がエンベロ
ープ遺伝子内で特に明白であると思われる。

我々は８５名のＡＩＤＳ患者におけるこれらの構造上の
相異の意義をウィルス感染に対する個々の免疫応答を比
較することにより評価を試みた。

健康な者並びにＡＲＣおよびＡＩＤＳ患者から血清試料
を採取し、ウェスタンプロット分析を用いてクローンさ
れたＡＩＤＳウィルス蛋白質との免疫反応性についてス
クリーンした。以前の研究者らはアッセイにおいて感染
したＡＩＤＳウィルス粒子由来の蛋白質を使用してきた
。例えば、サーンガドハラーン等、サイエンス（Ｓ　ｃ
ｉｅｎｃｅ）、２２４＠、５０６−０８頁（１９８０年
）、シュプバッハ等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２２４巻、５０３−０５頁（１９８４年）参照。我々の
アプローチはまず前記ＴｒｐＬＥベクターを用いて大腸
菌においてＡＩＤＳウィルスのサブゲノムセグメントを
クローンおよび発現することにより、後の血清試験の抗
原として用いる特異的組換え蛋白質または蛋白質フラグ
メントをもたらすことであった。こうして生産された試
薬は、ウィルス感染診断の際に有用であることに加えて
ワクチン成分としても貴重なものであり得る。他の研究
者らはＡＩＤＳウィルスゲノムのクローン部分に対して
（我々の方法より）利益の劣るクローニングベクターお
よび方法を用いてきた。例えば、ガロ等、「サイエンス
」（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２８巻、９３−９６頁（１９
８５年）、ガロ等、［ネイチ’ｒ−Ｊ（Ｎａｔｕｒｅ）
、３１５巻、１５１−１５４頁（１９８５年）、ウォン
グースクール等、［セルＪ（Ｃｅ１１）、４１巻、９７
９−９８６頁（１９８５年）参照。

この明細書に我々は、大部分のＡＩＤＳウィルスゲノム
に及ぶ７種の組み換えクローンの作成について記載する
。誘導後、ＡＩＤＳ患者から得られた血清と免疫反応す
る新規融合蛋白質が生産された。我々はまた、組換え蛋
白質を用いて１５２個の血清をスクリーンすることによ
り７種のクローンの中からＡＩＤＳウィルスに対する抗
体を検出するのに最ら有用なものを確立する実験を開示
する。

本発明者はまたは、臭化シアン消化により得られたある
種のＡＩＤＳ−ＴｒｐＬＥ融合蛋白質のフラグメントが
インタクト（ｉｎｔａｃｔ）な蛋白質の免疫活硅を保持
していることを発見した。抗原蛋白質の小さいが免疫活
性のあるフラグメントを用いれば、精製の問題は非常に
簡単なものとなる。表面に出ない反応が減ることにより
感度が増加する。

［定義コ 特許請求の範囲を含むこの明細書中に登場する語は次の
ように定義される。

ｒＧＲＦＪの語は、成長ホルモン放出因子を表わす。Ｈ
ｕＧＲＦ　がヒト成長ホルモン放出因子を意味するのに
対し、ＰＧＲＦおよびＢＧＲＦはそれぞれブタおよびウ
シ種の場合を意味する。

この明細書で用いられているｒＡＩＤｓウィルス」）語
は、ＨＴＬＶ−ＩＩ［、ＡＲＶ、ＬＡＶおよび類縁ウィ
ルスを指すが、これらはＡＩＤＳ、ＡＲＣＳＬＡＤおよ
び類縁疾患の原因または原因である疑のあることが知ら
れている。

ｒＨＢＶＪの語は、Ｂ型肝炎ウィルスを指す。

「天然アミノ酸」の語は、普通天然に見出される、すな
わち天然産蛋白質の一般成分である供給源白米のアミノ
酸を指す。天然アミノ酸の例としてはグリシン、アラニ
ン、トリプトファン、ヒスチジン、ンステイン、メチオ
ニン、フェニルアラニン等がある。アミノ酸は、生物供
給源から抽出されようと、または化学的技術を用いて製
造されようと「天然」である。

「合成アミノ酸」の語は、当技術分野で公知ではあるが
普通生物供給源由来の蛋白質の成分ではないアミノ酸を
指す。「合成アミノ酸類」の語は、例えばノルロイシン
・ホモアルギニン、ホモセリン、γ−アミノ酪酸等を包
含するが、これらに限定されない。

ＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に用いられている「
配列」の語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーが
特定の順序で配置されたＤＮＡ分子またはポリペプチド
分子を指す。

ｒＴ　ｒｐＬ　Ｅ・（制限酵素）」形の語は、５′末端
から対応する制限酵素認識部位までのＴｒｐＬＥ欠失変
異ＤＮＡ配列を指す。すなわち「ＴｒｐＬＥ−８ｓＬＩ
ＩＪの語は、最初の５ｓｔｌＩ制限部位までの’ｒｒｐ
プロモーターおよびＬＥ蛋白質をコードするエシェリヒ
ア・コリ（Ｅ　−ｃｏｌｉ、大腸菌）ＤＮＡ配列を指す
。同様に、ｒＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩｌｌの語は、最初
のＢｓ５ＨＩＩ制限部位までのＴｒｐＬＥ蛋白質をコー
ドするエシェリヒア・コリ（Ｅ−ｃｏｌｉ）ＤＮＡ配列
を指す。

ｒＴｒｐＬＥ・（制限酵素）−（異種配列）」形の語は
、５′から３′へ向かって、指定された最初の対応する
制限酵素認識部位までのＴｒｐプロモーターおよびＴｒ
ｐＬＥ蛋白質をコードするＴｒｐＬＥ欠失変異ＤＮＡ配
列であって、所望により続いて３−フレームリンカーセ
グメント、開裂可能なリンカ−配列または両方を伴い、
３−フレームリンカ−（存在する場合のみ）の制限部位
、開裂可能なリンカ−配列（存在する場合のみ）の３′
末端またはＴｒｐＬＥ配列の３′末端に挿入された所望
の異種蛋白質をコードする異種ＤＮＡを有する場合を指
す。

例えば、ｒＴｒｐＬＥ−Ｓｓｔｆｆ−ＨｕＧＲＰＪの語
は、切頭されたＬＥ蛋白質、所望により３−フレームリ
ンカーセグメントおよび／または開裂可能なリンカ−配
列およびヒト成長ホルモン放出因子をコードするＤＮＡ
配列を指す。

ｒＬＥ−（異種ポリペプチド）」の形の語は、ＤＮＡ配
列ＴｒｐＬＥ・（制限酵素）−（異種配列）を発現させ
ることにより産生された融合蛋白質を指す。

例えば、ＬＥ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７は、ＴｒｐＬ
Ｅ−Ｓｓｔｌｌ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７（５ｓｔｌ
［部位までのＬＥポリペプチドを含む）またはＴｒｐＬ
Ｅ・Ｂｓ５ＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７（Ｂｓｓ
ＨＩ［部位までのＬＥポリペプチドを含む）、所望によ
り開裂可能なリンカ−または３−フレームリンカ−によ
りコードされたオリゴペプチドおよび２７位のアミノ酸
をロイシンと置き換えることにより修飾されたヒト成長
ホルモン放出因子を発現させることにより得られた融合
蛋白質を指す。

「開裂可能なリンカ−配列」の語は、当業界で公知の方
法により容易に開裂し得るペプチド配列をコードするヌ
クレオチド配列を指す。例えば、メチオニン含有ポリペ
プチドは、臭化シアン（ＣＮＢｒ）を用いて容易に開裂
され、Ａｓｐ−Ｐｒｏペブチド配列は酸加水分解により
開裂され、そしてＡｓｐ−’Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｐ　−
Ａ　ｓｐ　−Ｌ　ｙｓ配列はエンドペプチダーゼエンテ
ロキナーゼにより開裂される。例えば、ライト等、「ア
ナリティカル・バイオケミストリＪ（Ａｎａｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　）１０６巻１９９−２０６頁（１９８０
年）参照。異種ポリペプチドの変性を避けるためには、
異種ポリペプチドにも存在する開裂可能なペプチド配列
をコードする開裂可能なリンカ−配列を用いるべきでは
ない。例えば、異種蛋白質がＡｓｐ−Ｐｒｏ結合を内部
に含む場合、Ａｓｐ　−Ｐ　ｒｏをコードしない開裂可
能なリンカ−配列を用いるのが好ましい。しかしながら
、ＬＥ−ＫＡＬ−１０融合蛋白質はＫＡＬ−１０ポリペ
プチド内にメチオニン残基が存在しているにもかかわら
ずＣＮＢｒにより開裂されて、インタクトなＫＡＬ−１
０ポリペプチドと同じ免疫反応性を示すある種のポリペ
プチドフラグメントを産生じ得る。

「３−フレームリンカ−」または「３−フレームリンカ
−配列」の語は、プラスミドベクターのＴｒｐＬＥコー
ドセグメントに挿入された後、３つのリーディングフレ
ームのいずれか１つにおいて異種配列の挿入お夫び発現
を可能にかる１個またはそれ以上のＤＮＡ配列のセット
を指す。「３−フレームリンカーセグメント」の語は、
異種配列が挿入された後ＴｒｐＬＥ遺伝子および異種配
列間に残存する３−フレームリンカ−の部分を指す。後
記実施例では、各々が特定の制限酵素の認識部位を含む
８、ＩＯおよび１２塩基ＤＮＡ配列をＴｒｐＬＥ配列に
挿入した。次いで異種配列を３−フレームリンカ−の酵
素認識部位に挿入すると、ＴｒｐＬＥ−（１塩基）＝（
制限部位）−異種配列、ＴｒｐＬＥ−（２塩基）−（制
限部位）−異種配列およびＴｒｐＬＥ−（３塩基）−（
制限部位）−異種配列を有するプラスミドが得られた。

すなわち、異種配列は３つのリーディングフレーム、す
なわち１つの「センス」フレーム（所望のポリペプチド
をコードする）および２つの「ナンセンス」フレームの
各々においてこのプラスミドから発現され得る。発現後
、免疫試薬を用いてセンスポリペプチドは容易に同定さ
れる。

「異種配列」の語は、発現ベクターに本来みられない蛋
白質または蛋白質セグメントをコードするＤＮＡ分子を
指す。具体的な異種配列は、ヒト、ウシまたはブタ成長
ホルモン放出因子、成長因子、ウシ成長ホルモンおよび
抗原ライスルまたは細菌性蛋白質、とくにＡＩＤＳＩＤ
Ｓライスル質（これらに制限されない）を含むポリペプ
チド類をコードする。

開裂されたｄｓＤＮＡ断片に用いる、「３′末端」の語
は、「センス（有意な）」または解読鎖から転写される
ｍＲＮＡの３′末端に対応するｄｓＤＮＡ断片の末端を
指す。

［発明の要約コ この発明の一態様は、ＴｒｐＬＥＤＮＡ遺伝子フラグメ
ント、所望による３−フレームリンカ−５所望による開
裂可能なリンカ−および異種ＤＮＡ配列を含む、融合蛋
白質の発現を目的とする細菌性発現ベクターである。３
−フレームリンカ−および開裂可能なリンカ−の両方を
用いる場合、どちらが先でもよい。

この発明の別の態様は、融合蛋白質の発現を目的とする
細菌性発現ベクターの製造方法であって、↑ｒｐＬ　Ｅ
　　Ｄ　Ｎ　Ａ遺伝子を含むプラスミドを用意し、Ｔｒ
ｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝子を制限エンドヌクレアーゼにより
開裂し、そして異種ＤＮＡ配列を挿入することからなる
方法である。所望による開裂可能なリンカ−の前後に所
望による３−フレームリンカ−を挿入することができる
。所望による開裂可能なリンカ−配列の挿入はこの方法
のどの時点でもよい。

この発明の別の態様は、ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグ
メント、所望により３−フレームリンカ−フラグメント
および異種ポリペプチドまたはそのフラグメントもしく
は誘導体を含む融合蛋白質である。３−フレームリンカ
−および開裂可能なリンカ−の両方を用いる場合、どち
らが先でもよい。

この発明の別の態様は、この発明の融合蛋白質の有効量
を投与することによろ哺乳類における抗体産性の誘導方
法である。抗体はポリクローナルまたはモノクローナル
のどちらでもよく、異種ボリペプヂドの存在を検出する
かまたはウィルス、細菌もしくは菌類感染に対する免疫
性を与えろ場合に用いられ得る。

この発明の別の態様は、この発明の融合蛋白質の有効量
を投与することによる、細胞ウィルス受容体にけっ拮抗
結合することにより哺乳類のウィルス感染を低減または
予防する方法である。

この発明の別の態様は、この発明の融合蛋白質であって
、ウィルス、細胞または菌類に暴露された哺乳類からの
抗体結合に用いられるイムノアッセイ試薬である。

この発明の別のａＩａは、感染に対して動物を免疫化す
るワクチンであって、この発明の融合蛋白質またはその
一部分および医薬的に許容される賦形剤、好ましくはア
ジユバントを成分とするワクチンである。

この発明は、適当な天然細菌ポリペプチド、Ａｓｐ−Ｐ
ｒｏジペプチドリンクおよび異種ポリペプチドを含む、
細菌宿主における生産に適した融合蛋白質に関するもの
である。

この発明はまた、適当な天然ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列、Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドリンクをコード
するＤＮＡ配列および異種ＤＮＡ配列を順に含む、融合
蛋白質生産を目的とするプラスミド発現ベクターに関す
るものである。

この発明はまた、適当な天然ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を含むプラスミドを準備し、Ａｓｐ−Ｐｒｏ
ジペプチドリンクをコードするＤＮＡ配列を挿入し、そ
して異種ＤＮＡ配列を挿入することからなる組換え方法
による融合蛋白質の生産方法に関するものである。

この発明はまた、酸性条件下Ａｓｐ　　［’ｒＯ連鎖を
加水分解することによりＡｓｐ−Ｐｒｏリンクおよび異
種ポリペプチドを有する融合蛋白質から異種ポリペプチ
ドを放出させる方法に関するものである。

この発明の別の態様は、ＡＩＤＳウィルスＥＮＶフラグ
メントＫＡＬ−ＡおよびＫＡＬ−Ｂである。

［図面の記載］ この発明の様々な対象および利益が得られる方法は次の
詳細な記載および添付図面から一層明確なものとなるで
あろう。

第１図は、中間体ベクタープラスミドｐＴ　ｒｐＥ−＃
２２の構造を示す。

第２図は、発現ベクターｐＴｒｐＬＢ−＃１４の構造を
示す。

第３ＡおよびＢ図は、プラスミドｐＴ　ｒｐＬ　Ｅ・Ｓ
ｓｔ■−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７およびプラスミドＰ
ＴｒＰＬＥ・・５ｓｔＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７
から産生された５ＲＮＡをコードすると予測されるＤＮ
Ａおよびアミノ酸配列を示す。末端配列は文献から入手
できる情報に基づいている。）（ｕＧＲＦセグメントの
アミノ酸は頭文字で示す。

第４図は、エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞
からＨｕＧＲＦを産生するのに用いられる精製機序のフ
ローチャートを示す。

第５図は、エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞
からＴｒｐＬＥ、ＴｒｐＬＥ−ＢＳＩＩＩＨ■−ＨｕＧ
ＲＦＬｅｕ２７およびＴｒｐＬＥ−Ｓｓｔ［Ｉ−ＨｕＧ
ＲＦＬｅｕ２７蛋白質を高率で産生ずることを示すＳＤ
Ｓ蛋白質ゲルを描いたものである。

第６図は、ＣＮＢ、ｒ開裂前の細胞溶解および遠心分離
によるエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）からのＴ
ｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の
精製を示すＳＤＳ蛋白質ゲルを描いたものである。

第７Ａ、７Ｂおよび０図は、ＴｒＰＬＥ−Ｓｓｔ■−Ｈ
ｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７（７Ａ）およびＴ　ｒｐＬ　Ｅ
　−ＢｓｇＨ［［ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７（７Ｂ）の
ＣＮＢｒ処理により放出されたペプチドのＨＰＬＣ（高
速液体クロマトグラフィー）プロフィールを描いたもの
である。第７Ｂ図のＨＰＬＣフラクシジンについてアデ
ニル酸シクラーゼ活性化によるＧＲＰ活性アッセイを行
ない、そして結果を第７Ｃ図に示した。第７Ａ図の矢印
は、ピーク活性を有するフラクションを示す。

第８Ａおよび８Ｂ図は、融合蛋白質のＣＮＢｒ開裂およ
びＨＰＬＣ分画後の抗−ＨｕＧｒｔＦ抗血清を用いたＴ
ｒｐＬＥ−ＢｓｓＨｎ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７（８
Ａ）およびＴｒｐＬＥ−Ｓｓｔｆｆ−ＨｕＧＲＦＬｅｕ
２７　（８Ｂ）のウェスタンプロットを描いたものであ
る。

第９Ａおよび９Ｂ図は、クーマシー（（Ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅ）・ブリリアント・ブルー・スティン（Ａ）による
幾つかのＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７製剤の純度、および
抗−ＨｕＧＲＦ抗血清を用いたウェスタンブロッティン
グを描いたものである。標品のＨｕＧＲＦ（Ｓ）をＴｒ
ｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７（レ
ーン１１２）およびＴｒｐＬＥ−８ｓｔＩ［−ＨｕＧＲ
Ｆ　　Ｌｅｕ２７（レーン３）の２種のロットから精製
されたＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７と比較する。マークの
無いレーンは分子量標準値を含む。

第１Ｏ図は、第９Ａ、９Ｂ図記載のロット１．２および
３のＨＰ　Ｌ　Ｃプロフィールを描いたものである。

第１１図は、ウィルスの主なオープンリーディングフレ
ームに関連して記載した特異的クーロンの位置を説明す
るＡＩＤＳウィルスゲノムの地図（ＧＡＧ、ＰＯＬ、Ｅ
ＮＶ、ＡおよびＢ）である。

第１２図は、３名のＡＩＤＳ患者から得た血清のプール
を用いたウェスタンブロッティング法により可視化され
たＴｒｐＬＥ−ＡＩＤＳ融合蛋白質およびＡＩＤＳウィ
ルス感染細胞（ＢＡＧ）の基準パターンを示す。

第１３図は、１９個のヒト血清試料のウェスタンブロッ
ティング分析から得られた結果を図示したものである。

各血清試料を用いて様々なＴｒｐＬＥ−ＡＩＤＳ融合蛋
白質（ＧＡＧ、ＰＯＬＳＥＮＶ）、インサートの無いＴ
ｒｐＬＥベクター（ＶＥＣＴＯＲ）およびＡＩＤＳウィ
ルス感染細胞（ＡＩＤＳ）をプローブした。各パネル上
の数は、積極的に反応する血清試料の数を示す。

第１４図は、ｐＳ　Ｂ　８−　Ｇａｇ−＃　２５により
生産されたＣＮＢｒ処理したＬＥ−ＧＡＣ；融合蛋白質
とｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃　ｌ　Ｏにより生
産されたＬＥ−ＥＮＶ融合蛋白質の免疫反応性を比較し
たウェスタンプロット結果を示す。

第１５Ａ図は、ｐＳＢ１２−８５４ΔＨＢにより生産さ
れた蛋白質を呈示する、クーマジー（Ｃ。

ｏｉａｓ　ｉｅ）ブルー染料で染色された５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲルを示す。第１５Ｂ図は、３５Ｋｄ蛋
白質が唯一の免疫反応性蛋白質の本質であることを示す
。ｐＳＢ−８５４ΔＨＢの同じ大腸菌抽出物のウェスタ
ンプロット分析を描いたものである。

第１６Ａおよび１６Ｂ図は、実施例１６で得られたＣＮ
Ｂｒ開裂フラグメントのＨＰＬＣ分画およびウェスタン
プロット分析を示す。

［詳細な記載および好ましい具体例］ この発明の一態様は、ＴｒｐＬＥ　　ＤＮＡ遺伝子フラ
グメントおよび異種ＤＮＡ配列を含み、融合蛋白質の発
現を目的とする細菌性発現ベクターである。好ましい亜
属はさらに上記ＴｒｐＬＥフラグメントおよび上記異種
ＤＮＡ配列間に３−フレームリンカーセグメントを有す
るベクターである。

この発明の好ましい綱は、さらに上記ＴｒｐＬＥフラグ
メントおよび上記異種ＤＮＡ配列間に開裂可能なリンカ
−配列を有し、特に前記の開裂可能なリンカ−がＭｅｔ
、　Ａｓｐ−ＰｒｏまたはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａ　ｓｐ　
−Ａ　ｓｐ　−Ｌ　ｙｓをコードするベクターである。

好ましい玉網は、上記異種ＤＮＡ配列がひと、うしもし
くはぶた成長ホルモン放出因子またはその生物活性誘導
体もしくはフラグメント、抗原ウィルス蛋白質またはそ
の生物学的に活性な誘導体もしくはフラグメント、また
は成長因子もしくはホルモンまたはその生物学的に活性
な誘導体もしくはフラグメントをコードするベクターで
ある。好ましい種は、抗原ウィルス蛋白質がＡＩＤＳ蛋
白質、特にＥＮＶポリペプチドおよび特にポリペプチド
ＫＡＬ−１０である、抗原ウィルス蛋白質をコードする
ベクターである。別の好ましい種は、抗原ウィルス蛋白
質がＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウィルス）の表面抗原の前Ｓ配列
であるものである。別の好ましい種は、成長ホルモン放
出因子誘導体をコードし、特に前記誘導体がＨｕＧＲＰ
　Ｌｅｕ２７、ＢＧＲＦ　　Ｌ　ｅｕ２７またはＰＧＲ
Ｆ　　Ｌｅｕ２７であるベクターである。別の好ましい
種は、成長ホルモンをコードするベクターであって、特
に成長ホルモンがうし成長ホルモンである場合である。

この発明の好ましい具体例は、プラスミドｐＴｒｐＬＥ
−ＫＡＬＳｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃　１０．
ｐＳＢ１２−８５４、ｐＳＢ１２−８５４ΔＨＢ％ｐＴ
ｒｐＬ　Ｅ　−Ｓ　ｓｔ　■　−ト１ｕＧＲＰ　　　Ｌ
ｅｕ２７、　　ｐ　Ｔ　ｒｐＬ　Ｅ　・Ｂｓ５ＨＩＩ−
ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７　−＃　５、ｐＴｒｐＬＥ　
＊５ａｃｌｌ−ＰＧＲＦ、およびｐＴｒｐＬＥ−Ｂｓｓ
ＨＩＩ−Ｂ　Ｇ　ＲＦ　Ｌｅｕ２７−　＃　１５（実施
例に記載）である。

この発明の別の態様は、融合蛋白質の発現を目的とする
細菌発現ベクターの生産方法であって、ＴｒｐＬＥ　Ｄ
ＮＡ遺伝子を含むプラスミドを準備し、 ＴｒｐＬＥ　　ＤＮＡ遺伝子を制限エンドヌクレアーゼ
により開裂し、そして、 異種ＤＮＡ配列を挿入する ことからなる方法である。好ましい亜属は、さらに異種
配列を挿入する前後に開裂可能なリンカ−配列を挿入す
ることを含む方法である。この発明の好ましい綱は、開
裂可能なリンカ−配列がＭ　ｅ　ｔ　５Ａｓｐ−Ｐｒｏ
または、Ａ　Ｓｐ　　Ａ　８ｐ　　Ａ　ｓｐ　　Ａ　ｓ
ｐ　　Ｌ　ＹＳｓ特にＭｅｔまたはＡｓｐ−Ｐｙｏをコ
ードする方法である。好ましい玉網は、上記異種ＤＮＡ
配列がひと、うしもしくはぶた成長ホルモン放出因子ま
たはその生物活性誘導体もしくはフラグメント、抗原ウ
ィルス蛋白質またはその生物活性誘導体もしくはフラグ
メント、または成長因子もしくはホルモンまたはその生
物活性誘導体をコードする方法である。

好ましい種は、異種配列が抗原ウィルス蛋白質をコード
し、その抗原ウィルス蛋白質がＡｒＤＳ蛋白質、特にＥ
ＮＶポリペプチドおよび特にポリペプチドＫＡＬ−１０
である方法である。別の好ましい種は、抗原ウィルス蛋
白質がＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウィルス）の前−８配列である
場合である。別の好ましい種は、異種配列が成長ホルモ
ン放出因子誘導体をコードし、特にその誘導体がＨｕＧ
ＲＦ　Ｌｅｕ２７、ＢＧＲＦ　Ｌｅｕ２７またはＰ　Ｇ
　Ｒ［’Ｌ　ｅｕ２７である方法である。別の好ましい
種は、異種配列が成長ホルモンをコードし、特にその成
長ホルモンがうし成長ホルモンである方法である。

別の好ましい亜属は、融合蛋白質の発現を目的とする細
菌性発現ベクターの生産方法であって、ＴｒｐＬＥ　　
ＤＮＡ遺伝子を有するプラスミドを選択し、 ＴｒｐＬＥ　　ＤＮＡ遺伝子を制限エンドヌクレアーゼ
により開裂し、 ３−フレームリンカ−を挿入しＪそして３−フレームリ
ンカ−内に異種ＤＮＡ配列を挿入する ことからなる方法である。好ましい玉網は、上記異種Ｄ
ＮＡ配列がひと、うしもしくはぶた成長ホルモン放出因
子またはその生物活性誘導体もしくはフラグメント、抗
原ウィルス蛋白質またはその生物活性誘導体もしくはフ
ラグメント、または成長因子もしくはホルモンまたはそ
の生物活性誘導体もしくはフラグメントをコードする方
法である。

好ましい種は、異種配列が抗原ウィルス蛋白質をコード
し、その抗原ウィルス蛋白質がＡＩＤＳ蛋白質、特にＥ
ＮＶポリペプチドおよび特にポリペプチドＫＡＬ−１０
である方法である。別の好ましい種は、抗原ウィルス蛋
白質がＨＢｖ（Ｂ型肝炎ウィルス）の前−８配列である
方法である。別の好ましい種は、異種配列が成長ホルモ
ン放出因子誘導体をコードし、特に前記誘導体がＨｕＧ
ＲＦ　　Ｌｅｕ２７、ＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７またはＰ
ＧＲＰ　Ｌｅｕ２７である方法である。別の好ましい種
は、異種配列が成長ホルモンをコードし、特に前記成長
ホルモンがうし成長ホルモンである方法である。

この発明のｔｓ様は、ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメ
ントおよび異種ポリペプチド、またはそのフラグメント
もしくは誘導体を含む融合蛋白質である。この発明の好
ましい亜属は、ざらにＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメ
ントおよび異種ポリペプチド間に３−フレームリンカー
オリゴペプチドセグメントを含む融合蛋白質である。好
ましい玉網は、異種ポリペプチドがひと、うしもしくは
ぶた成長ホルモン放出因子またはその生物活性誘導体も
しくはフラグメント、抗原ウィルス蛋白質またはその生
物活性誘導体もしくはフラグメント、または成長因子も
しくはホルモンまたはその生物活性誘導体もしくはフラ
グメントである融合蛋白質である。好ましい種は、抗原
ウィルス蛋白質がＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウィルス）のプレー
Ｓ配列である融合蛋白質である。別の好ましい種は、抗
原ウィルス蛋白質がＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウィルス）の前−
８配列である場合である。別の好ましい種は、異種ポリ
ペプチドが成長ホルモン放出因子誘導体であり、特に前
記誘導体がＨｕＧＲＦ　Ｌｅｕ２７、ＢＧＲＦ　　Ｌｅ
ｕ２７またはＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７である融合蛋白質
である。別の好ましい種は、異種ポリペプチドが成長ホ
ルモンであり、特にその成長ホルモンがうし成長ホルモ
ンである融合蛋白質である。別の好ましい種は、異種ポ
リペプチドが抗原ウィルス蛋白質であり、その抗原ウィ
ルス蛋白質がＡＩＤＳ蛋白質、特にＥＮＶポリペプチド
および特にポリペプチドＫＡＬ−１０である融合蛋白質
である。特に好ましい種は、免疫反応性ＫＡＬ−１０フ
ラグメント、特にＫＡＬ−Ａ、ＫＡＬ−Ｂまたはこれら
２つの混合物であり、ＫＡＬ−ＡおよびＫＡＬ−Ｂが下
記配列を有するものである。

（上記配列中、Ｘはホモセリンラクトンまたはその加水
分解もしくはアミド化生成物、メチオニン、または別の
天然アミノ酸である）上記２Ｎの配列の他のサブセット
（部分集合体）および類縁体ら免疫活性を存し、この発
明の範囲に含まれる。サブセットは、配列のどちらか一
方または両方の末端からアミノアシル残基を欠失するこ
とにより上記配列から産生されるがこうして生成したポ
リペプチドは少なくとも実質的に同じ免疫反応性を保育
している。類縁体は、組換えまたは化学的方法により３
ｇ以下のアミノ酸を当業界の熟練者に知られている他の
天然または合成アミノ酸と置き換えることにより生成さ
れるが、こうして生成したポリペプチドが少なくとも実
質的に同じ免疫反応性を保有するようにしたものである
。類縁体は、配列内の３個以下のアミノアシル残基が欠
失されたサブセットおよび配列を含む。

この発明の好ましい亜属は、さらにＴｒｐＬＥポリペプ
チドフラグメントおよび異種ポリペプチド間に開裂可能
なリンカ−オリゴペプチドを含む融合蛋白質である。こ
の発明の好ましい綱は、開裂可能なリンカ−オリゴペプ
チドがＭｅｔｌＡｓｐ−Ｐ「０またはＡ　８ｐ−Ａ　８
＋）　−Ａ　８Ｐ　−Ａ　８９−　Ｌ　ｙ８．特にＭｅ
ｔまたはＡｓｐ−Ｐｒｏである方法である。好ましい玉
網は、異種ポリペプチドがひと、うしまたはぶた成長ホ
ルモン放出因子またはその生物活性誘導体もしくはフラ
グメント、抗原ウィルス蛋白質またはその生物活性誘導
体もしくはフラグメント、または成長因子もしくはホル
モンまたはその生物活性誘導体もしくはフラグメントで
ある融合蛋白質である。好ましい種は、異種ポリペプチ
ドが抗原ウィルス蛋白質であり、前記抗原ウィルス蛋白
質がＡＩＤＳ蛋白質、特にＥＮＶポリペプチドおよび特
にポリペプチドＫＡＬ−１０である融合蛋白質である。

別の好ましい種は、抗原ウィルス蛋白質がＨＢＶ（Ｂ型
肝炎）の前−８配列である場合である。別の好ましい種
は、異種ポリペプチドが成長ホルモン放出因子誘導１体
であり、特に前記誘導体がＨｕＧＲＦ　Ｌｅｕ２７、Ｂ
　Ｇ　ＲＦ　Ｌ　ｅｕ２７またはＰＧＲＦ　Ｌｅｕ２７
である融合蛋白質である。別の好ましい種は、異種ポリ
ペプチドが成長ホルモンであり、特に前記成長ホルモン
がうし成長ホルモンであり融合蛋白質である。

この発明の別の態様は、この発明の融合蛋白質の有効量
を投与することによる哺乳類における抗体形成誘導方法
である。好ましい亜属は、前記抗体がポリクローナルま
たはモノクローナルであり、異種ポリペプチドの存在を
検出するのに有用なものである方法である。この発明の
好ましい綱は、検出されるべき異種ポリペプチドがウィ
ルスである方法である。好ましい種は、前記ウィルスが
ＡＩＤＳウィルスまたはＨＩ３Ｖである方法である。

別の好ましい亜属は、前記抗体かウィルス、細菌もしく
は菌類感染に対する免疫を与えるのに有用な抗体を中和
する方法である。好ましい種は、抗体がＡＩＤＳに対す
る免疫を与える方法である。

別の好ましい種は、抗体がＨＢＶに対する免疫を与える
方法である。

この発明の別の態様は、融合蛋白質の有効量を投与する
ことにより、細胞のウィルス受容体に拮抗結合すること
による哺乳類のウィルス感染を低減または予防する方法
であって、前記融合蛋白質がＴｒｐＬＢポリペプチドフ
ラグメントおよび哺乳類細胞ウィルス受容体により認識
されるウィルスポリペプチドを含んでいる方法である。

好ましい種は、ウィルスポリペプチドがＡＩＤＳウィル
スポリペプチドである方法である。

この発明の別の態様は、ウィルス、細菌または菌類に暴
露された哺乳類からの抗体結合用イムノアッセイ試薬で
あって、ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメントおよび抗
原ウィルス、細菌または菌類ポリペプチドを含む融合蛋
白質である試薬である。

好ましい綱は、上記ポリペプチドがウィルスポリペプチ
ドであるイムノアッセイ試薬である。好ましい玉網は、
ウィルスポリペプチドがＥＮＶまたは表面蛋白質または
そのフラグメントである試薬である。好ましい種は、Ｅ
ＮＶ蛋白質がＡＩＤＳ蛋白質フラグメント、特にＫＡＬ
−１０である試薬である。特に好ましい種は、免疫反応
性ＫＡＬ−１０フラグメント、特にＫＡＬ−ＡＳＫＡＬ
−Ｂまたはこれら２つの混合物、またはＫＡＬ−Ａもし
くはＫＡＬ−Ｈの部分集合体もしくは類縁体である。別
の好ましい種は、表面蛋白質がＨＢＶ表面抗原の前−８
配列である試薬である。

（ＴｒｐＬＥ） ＬＥ蛋白質をコードするＤＮＡ配列および異種ポリペプ
チド間の融合は、同じ翻訳リーディングフレーム内にお
いてＬＥ蛋白質の種々の末端部分（ｄｉｓｔａｌ　ｐｏ
ｒｔｉｏｎ）が異種ポリペプチドと置換されるようによ
り行なわれる。さらに、ＬＥ蛋白質における他のアミノ
酸挿入、欠失および置換が所望の生成物の精製を容易に
するように行なわれ得る。

細胞は、この発明の発現媒体を加えることにより形質転
換され、外生プロモーター・オペレーターが抑制された
条件下で成長する。例えば、エシェリヒア・コリ（／Ｂ
、　ｃｏｌｉ））リブトフアンプロモーター・オペレー
ター（Ｔｒｐプロモーター）の場合、細胞は加えられた
トリプトファンの存在下で成長する。これがＴｒｐプロ
モーターを抑制することにより、融合蛋白質の過剰発現
による欠失作用をともなわずに細胞成長を正常に進める
ことができるのである。組み換え培養物がポリペプチド
の工業生産に適した細胞密度に達したとき、抑制の外的
原因（例、トリプトファン）を除去するか、または別法
として外部誘導物質（例、インドールアクリル酸）を加
える。こうして外生プロモーター・オペレーター（例、
Ｔｒｐプロモーター）を抑制解除し、異種インサートの
高い効率の発現がもたらされる。

この発明は、ＬＥ蛋白質部分により付与された自己集合
特性により細菌蛋白質の残りから容易に分離され得る異
種ポリペプチド−含有融合蛋白質を含む、様々な有用な
中間体および最終生成物を提供する。次に融合蛋白質は
特異的に開裂されて所望の異種ポリペプチドを放出し得
るが、これの精製はＬＥ蛋白質内の融合部位を選択する
ことにより容易になる。別法として融合蛋白質を開裂せ
ずに用いて例えばワクチンまたはイムノアッセイのモノ
クロナール抗体を製造し得る。

ＴｒｐＬＥ蛋白質クローニング領域の最初の単離はエシ
ェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）トリプトファンプロ
モーター・オペレーターの遺伝子操作の結果であった。

バートラン′ド、スカイアーズおよびヤノフスキー、［
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ（Ｊ
、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ）、１０３巻、３１９−３３７
頁（１９７６年）、ミオツァーリおよびヤノフスキー、
「ジャーナル・オブ・バクテリオロジーＪ（Ｊ　、　Ｂ
ａｃｔ）、１３３巻、１４５７−１０００頁（ｒ　９７
８年）参照。これらの最初の欠失（変異）の１例、Ｔｒ
ｐＬＥ　Ｉ　４１３はプラスミドｐＶＶＩについて得ら
れ、［ニコルスおよびヤノフスキー、「メソッズ・イン
ーエンザイモロジーＪ（ＭｅＬｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
　）、１０１巻、１５５−１６４頁（１９８３年）］、
そしてこの明細書中の実施例で用いられるＬＥ蛋白質ベ
クターを構成するのに使用された。この発明のための有
効なＬＥ蛋白質ベクターを生成するのに必要なりＮＡ欠
失の本質的な特徴は、Ｔｒｐプロモーター・オペレータ
ーと関係があり、［ヤノフスキー等、［ニュクレイック
・アシッズ・リサーチＪ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ
、）９巻、６６４７−６６６８頁（１９８１年）］、 ＴｒｐＬペプチドのアミノ酸＃ｌＯをコードする塩基に
近い５′末端ブレークポイント、ＴｒｐＥコード領域全
体の約３分の２、好ましくはアミノ酸＃３３９に近い３
′末端ブレークポイントである。

このような欠失によりＴｒｐプロモーター・オペレータ
ーアテニュエイター域が除去され、高レベルの遺伝子発
現が可能となり、そしてほぼアミノ酸＃３３９からカル
ボキシ末端アミノ酸のＴｒｐＥ蛋白質領域が保たれるが
、これは異種蛋白質がカルボキシコード領域の一部分と
置き換えられた場合でも自己集合能力に対し好ましいこ
とである。

この発明の好ましい具体例はＬＥベクタープラスミドｐ
ＴｒｐＬＥ−＃　１４である。これはエシェリヒア・コ
リ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｔｒｐプロモーター・オペレー
ターおよびｐＶＶｌからの１９１個のアミノ酸のＬＥコ
ード領域に続いて順次ＴｒｐＤ遺伝子の一部分およびエ
シェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＲＡＮポリメラー
ゼ−βサブユニツト遺伝子からの転写ターミネータ−フ
ラグメントを含むｐＢＲ３２２ベースのプラスミドであ
る［ＲｐｏＣ：スカイアー等、「ニュクレイック、アシ
ッズ・リサーチＪ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　
Ｒｅｓ、）、９巻、６８２７〜６８４０頁（１９８１年
）参照］。ターミネータ−が、ｍＲＮＡ合成の終結をも
たらすことにより、プラスミドの複製または安定性を妨
げ得る興味の対象である遺伝子以外の転写を防ぐことに
なる。またターミネータ−領域の写しは減成に対してｍ
ＲＮＡの３′末端を安定化する構造を形成する。

単独または異種遺伝子と融合したＬＥ蛋白質の発現は、
この明細書に記載されたプラスミドｐＴｒｐＬＥ−＃１
４のトリプトファンプロモーターおよびその誘導体によ
り、好都合にもたらされる。

しかしながら、エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）
における遺伝子発現を調節し得ろことが知られている類
似の優れた特性を有するプロモーター・オペレーターＤ
ＮＡ領域をこれらの具体例で使用されたＴｒｐプロモー
ターと置き換えることができるものとする。Ｔｒｐプロ
モーター・オペレーターのプロモーター領域の方が、優
れた特性を有するためこの使用目的に適しており［クロ
ウフォードおよびスト−ファー、［アニュアル・レビュ
ー・オブーバイオケミストリーＪ（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、
　Ｂｉｏｃｈｅａ。

）４９巻、１６３−１９５頁（１９８０年）］、容易に
高レベルのｍ１ｌＮＡ、およびトリプトファンを欠いて
いるかまたは誘導化合物インドールアクリル酸（ＩＡＡ
）を含む媒地で成長させることによる蛋白質生成物の産
生を誘導することができる。

他の適当な制御成分にはＬａｃプロモーター、Ｔａｃプ
ロモーター、アラビノース、ガラクトースもしくはアル
カリホスファターゼオペロン、またはバクテリオファー
ジラムダからのプロモーター−オペレーター、またはこ
れらの選択された領域が含まれ得る。

同様に、ＲｐｏＣＤＮＡ断片による転写終結機能の供給
およびＰＴｒｐＬＥ−＃１４で用いられたアンピシリン
耐性の選択可能なマーカーは一例として用いられたので
あり、この発明の範囲を限定するものではない。

（ＧＲＦ） 成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）は、視床下部により分
泌される小さな（４４個のアミノ酸からなる）ポリペプ
チドであり、哺乳類において下垂体からの成長ホルモン
放出を刺激する。ＧＲＦは、動物の体重を増加させたり
、また泌乳する哺乳類の乳汁生産量を増加させるのに有
用である。異なる種由来のＧＲＦは一般に下に示すよう
に組成物中にわずかなアミノ酸により相異している。

ヒト成長ホルモン放出因子（Ｉ（ｕＧＩｔＦ）のエシェ
リヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）における産生は、Ｈｕ
ＧＲＦ　　ＤＮＡ配列をＴｒｐＬＥ配列に融合すること
により行なわれた。好ましい具体例において、■（ｕＧ
ＲＦおよびＬＥ蛋白質コード領域間の融合はメチオニン
に対するコドン（Ａ’ｒＧ）によるものであるため、Ｃ
ＮＢｒを用いたＭｅｔにおける特異的開裂によりＨｕＧ
ＲＦを放出させることとなった。

ＨｕＧＲＦの２７泣のメチオニンにおける開裂を防ぐた
めに、２７位を合成りＮＡにおいてロイシンＣと変え、
これをＬＥ蛋白質ベクターにクローンした。

ロイシンは自然発生の突然変異において最も頻繁にメチ
オニンと置き換えられるため選ばれたが、他の天然産生
アミノ酸と置き換えてＣＮＢｒ開裂を妨げることもでき
る。計算から予測されることは、ＭｅｔをＬｅｕと置き
換えると最少の２次構造における変化および疎水性がも
たらされることである［チョウおよびファスマン、［ア
ンドパンシーズ・イン・エンサイモロジ−Ｊ（Ａｄｖ、
　ｉｎ　　Ｅｎｚｙ＋Ｉ＋ｏ１．）、４７巻、４５−１
４８頁、（１９７８年）］。しかしながら、他の天然産
アミノ酸を代わりに用いてＣＮＢｒ開裂を妨げることが
できる。合成りＮＡはまた、高度に発現されたエシェリ
ヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）蛋白質に好都合なアミノ
酸コドンの使用を最大限にし［グランサム等、［ニュク
レイック・アシッズ・リサーチ］（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓＲｅｓ、　）、９巻、ｒ４３−ｒ７４頁（１９
８１年）コ、生成したｍＲＡＮにおける可能な２次構造
を最小にし、そして所望のクローンをスクリーンし、Ｄ
ＮＡ配列における将来の選択を容易にするのに有用な都
合のよい制限部位をもたらすことを目的とするものであ
った。ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７をコードする合成りＮ
ＡをＬＥ遺伝子の５ａｃ１１部位にライゲートしてＬＥ
蛋白質のカルボキシ末端の７３個のアミノ酸を置き換え
るか、またはＢｓｇＨ１１部位にライゲートして２個の
アミノ酸を置き換えた。

引用例はメチオニンをＬＥ蛋白質および異種ポリペプチ
ド間に挿入するが、この接合は２０個の天然産アミノ酸
の組み合わせを含み得るか、またぼ−切含まず、イζ学
的または酸素的手段により特異的に開裂できる必要は無
く、かっこの発明の範囲内に帰するものとする。

ＬＥ遺伝子のＢｓ５Ｈｉｌまたは５ａｃＩＩ部位に融合
したＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７をコードするプラスミド
のＴｒｐプロモーター・オペレーターからの発現の良好
な誘導は容易に達成された（第５図）。合成の反応速度
およびＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の蓄積程度は培地の組
成物により異なる。インドールアクリル酸（ＩＡＡ）は
、比較的豊かな培地、Ｌブロスにおける合成を最大限に
誘発するのに必要であった。反対に、最小の培地、Ｍ−
９にＩＡＡを包含させると、ＬＥ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅ
ｕ２７の最終レベルではなく蓄積の速度だけが変わった
。Ｍ−９で成長後のＬＥ−１−１ｕＧＲＦ’　　Ｌｅｕ
２７は全蛋白質ま３５％はどであるのに比べて、Ｌブロ
スおよびＩＡＡの場合は１５〜２０％であった。プラス
ミドの最大安定性は、発現が望まれるまで２０＝１００
μｇ／１Ｉｌ１２のトリプトファンを含有する培地で成
長させることにより得られる。

ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の精製は、低速遠心分離によ
り溶解された細胞からＬＥ−ＨｕＧＲＰ　　Ｌｅｕ２７
蛋白質の不溶性アグリゲートを回収することにより開始
された（第６図）。この物質を７０％蟻酸中ＣＮＢｒに
より処理した。蟻酸は沈澱物におけるＬＥ融融合蛋白質
アクリゲート溶解させることにより次の工程に用いる均
質溶液をもたらすのに好まし溶媒として有用である。融
合蛋白質自体が所望の生成物である場合、ＳＤＳまたは
尿素のような溶媒が後続工程の前にＬＥ融融合蛋白質ア
クリゲート溶解させるのに用いられ得る。過剰のＣＮＢ
ｒおよび蟻酸を除去後、ＩＮ酢酸により不溶性物質から
ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７ペプチドを抽出した。次いで
逆相ＨＰＬＣによる分画前に抽出物を希緩衝液に透析し
た。

逆相ＨＰＬＣまたはカルボキシメチルセルロースおよび
ＨＰＬＣの組み合わせを用いてＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２
７を充分に分割した（第７図および８図）。後者の方が
、ＨＰＬＣのみで分離され得ない汚染物質をカルボキシ
メチルセルロースが除去するためＴｒｐＬＥＳａｃＩＩ
−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７クローンから単離された物
質に対して好ましかった。Ｉ（Ｐ　Ｌ　ＣによりＴｒｐ
ＬＥ−Ｉ３ｓｓ［−ＩＩＩ−１−ＩｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７クローン（第７Ｂ図）またはＴｒｐＬＥ−ＳａｃＩ
Ｉ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７クローン（第７Ａ図）か
ら製造された透析物を分画するとほとんど等しい全蛋白
質のＨＰＬＣプロフィールが得られた。反対に、感受性
ウェスタンブロッティング技術を用いて分析すると（第
８Ｂ図）、Ｓ　ａｃ　［Ｉクローン由来のＨｕＧＲＦ　
　Ｌｅｕ２７がＨＰ　Ｌ　Ｃから高分子量の免疫反応物
質により溶離することがわかった。５ａｃｎクローンＨ
ｕＧＲＰ　　Ｌｅｕ２７からの透析物をまずカルボキシ
メチルセルロースで分別すると、ＨＰＬＣ精製物質が実
質的にこれらの汚染物質から遊離した（第９Ｂ図）。最
高純度のＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７がカルボキシメチル
セルロース段階を経ずにＢｓ５Ｈクローンから単離され
たが、これは免疫反応性汚染物質がＨＰＬＣにより充分
離されたためである（第８Ａ図）。これらの免疫反応性
生成物の同一性は、限定量のＣＮＢｒによりみられる免
疫反応性生成物との同時泳動、インビトロＧＲＦアッセ
イにおけるアデニル酸シクラーゼ刺激能力および抗−Ｈ
ｕＧＲＰ血清との反応性に基づくものであった。

プレパラティブＨＰＬＣにより単離された物質のアミノ
酸配列は、２７位のＭｅｔをＬｅｕと置き換えたことを
含めて正しいことがわかった。９５％より高い純度の試
料（第９および１０図）は、ウシ下垂体細胞抽出物を用
いたインビトロアッセイにおけるアデニル酸シクラーゼ
および培養の下垂体細胞からの成長ホルモン放出の両方
を刺激することがわかった。

例えばブタ視床下部から単離されたＨｕＧＲＦのブタ類
縁体（ＰＧＲＦ）は、アミノ酸配列においてカルボキシ
末端方向の３つの位置がＨｕＧＲＦとは異なる。すなわ
ちＳｅｔ　−３４−＋ＡｒｇＳＡｒｇ　−３８−＊Ｇｌ
ｎ、　Ａｌａ−４２−ｅＶａｌ［ボーレン等、「バイオ
ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーションズＪ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｇｏｏｎ、　）、１１６巻、７２６−
７３４頁（１９８３年）］。したがって、ＴｒｐＬＥ蛋
白質との融合としてのＰＧＲＦのＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２
７類縁体の発現は、制限エンドヌクレアーゼを用いてＬ
Ｅ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７：Ｔ−ド
領域の後半部分を特異的に欠失し、その位置にＰＧＲＦ
のカルボキシ末端をコードする合成りＮＡ断片を挿入す
ることにより行なわれた。ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７ホ
ルモンの場合のように、誘導細胞からＬＥ−ＢｇｓＨＩ
［−ＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７融合蛋白質が高収率で生産
され、多量に沈降し、そしてＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７が
、ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７に対して用いたのと同じ方
法により容易に精製された。プレパラテイブＨＰＬＣに
より単離された物質は、アミノ酸組成物の分析により純
粋であることおよび前記ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７に適
用したのと同じ基準により生物学的に活性であることが
わかった。

ウシ視床下部から単離された、ＨｕＧＲＦのウシ類縁体
（ＢＧＲＦ）は、ＨｕＧＲＦとはカルボキシ末端方向の
５つの位置で異なる。すなわち、Ｓｅｔ　−２８−＋Ａ
ｓｎ、　Ｓｅｔ　−３４−＋Ａｒｇ、　Ａｒｇ　−３８
、−４Ｇ　Ｉｎ、　Ａｒｇ　　４１−＋ｌ、ｙｇ、　Ａ
ｌａ　　４２−＊Ｖａｌ。

ＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の構成および発現と同様に、し
Ｅ−ＢｓｓＨＩＩ−ＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７ボリペプチ
ドをコードするクローンが構成され、発現され、そして
ＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７が好都合に精製され、純粋で生
物学的に活性であることがわかった。

これと同じ手順がＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＰＧＲＦＬｅｕ
２７融合ポリペプチドの発現並びに３種の異なる共給源
、ヒト、ブタおよびウシから得られるＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７の精製に好便に適用された。

ＩＤＳ 幾つかの動物由来成長ホルモン放出因子を高収率で生産
するためのエシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉＸ大腸菌
）発現ベクターの作成および用途について既に記載して
きた。このベクター、すなわちｐＴ　ｒｐＬＥとして示
すものはトリプトファンプロモーター・オペレーター由
来のの強力な細菌プロモーターを用いてＬＥとして知ら
れている新規蛋白質を発現する。各々の成長ホルモン放
出因子の発現は、正しい翻訳リーディングフレームにお
いてそれぞれの成長ホルモン放出因子遺伝子をＬＥ遺伝
子のカルボキシ末端に融合させろことにより達成された
。ＬＥ担体蛋白質はそれ自体ＴｒｐＬＥ蛋白質のアミノ
末端およびＴｒｐリーダーのセグメント間の融合蛋白質
である。フレーム内およびＬＥ蛋白質から下流に外来遺
伝子配列を接合させることにより、本発明者はこのベク
ターおよび類縁ベクターを用いて幾つかの異種ポリペプ
チドを高収率で発現させることに成功した。

ｐＴ　ｒｐＬ　Ｅの単−Ｂｓ５ＨＩＩ部位に様々な長さ
く例、８、ｌＯおよび１２個のヌクレオチド）の合成り
ａｍ）（Ｉリンカ−を挿入することにより、融和性の制
限酵素末端の側面のいかなる翻訳オーブンリーディング
フレームの発現でも可能にする発現ベクターの新しいセ
ットを本発明者は作成した。例えば、細菌またはウィル
スＤＮＡは、５ａｕ３Ａ（ＧＡＴＣ認１ｍ）により（完
全または部分的に）開裂され、予めＢａｍＨＩ（ＧＧＡ
ＴＣＣを認識）により開裂し、アルカリホスファターゼ
により処理しておいた３種のベクターにライゲートされ
得る。ＬＥ担体または異種ペプチドに対する抗体を用い
て、組換え免疫反応性蛋白質を産生ずる形質転換体を同
定することができる。

ＡＩＤＳウィルスゲノムについての発現ライブラリーを
生成するために、ｐＢｅｎｎ＃２０由来のＤＮＡフラグ
メントを制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａにより部分
的に開裂し、３種のオーブンリーディングフレームベク
ター、ｐＳＢ８、ｐＳＢｌｏおよびｐＳＢ１２に挿入し
た。プラスミドｐＢｅｎｎ＃２０は、プロウィルスＤＮ
Ａの８Ｋｂセグメントおよび９Ｋｂのフランキング（側
面を向ける）細胞ＤＮＡを含む組換えプラスミドとして
前に作成されたものであった。

ｐＢｅｎｎ＃　２０由来の放射能標識したＤＮＡフラグ
メントを用いたコロニーハイブリダイゼーションにより
ＡＩＤＳウィルスインサートの存在について形質転換体
をスクリーンした。その結果８０％を越える形質転換体
がインサートを含むことがわかった。したがってさらに
、形質転換体を、インサートの由来するＡＩＤＳウィル
スゲノム領域に基づくサブグループに分割することがで
きた。

次にこれらのサブグループから選択されたクローンを、
その抗ＡＩＩ）；ウィルス血清と免疫反応性のある蛋白
質粒子の産生能力について試験した。

誘導された組換え細菌地覆から製造された蛋白質抽出物
を、各々以前に抗ＡＩＤＳウィルス抗体を産生ずること
が確認された３名の患者からプールした血清を用いてウ
ェスタンプロット分析に付した。

次いでプラスミドＤＮＡを陽性反応コロニーから製造し
、それらのヌクレオチド配列を測定した。

ＡＩＤＳプロウィルス内の各々のインサートの位置を、
インサートの境界におけるＤＮＡ配列をＡＩＤＳウィル
スゲノムの公表されたヌクレオチド配列と比較すること
により測定した（第１表）。その結果、各抗体反応性ク
ローンがＬＥ担体蛋白質の転写および翻訳に関して正し
い方向および正しいリーディングフレームにおいて挿入
されたＡｔＤＳウィルスＤＮＡフラグメントを含むこと
が確臆された。第１Ｉ図は、５個の５ａｕａＡ組換えク
ローンのゲノムにおける位置を要約したものであり、第
１２図は、ウェスタンプロット分析により示されたそれ
らの蛋白質プロフィールを示す。

ＡＩＤＳウィルス由来のゲノムライブラリー（これは３
種のオーブンリーディングフレームベクターへの任意の
５ａｕ３Ａフラグメントのインサージョンに基づいた乙
のであった）に加えてさらに、特異的ＡＩＤＳウィルス
ＤＮＡフラグメントを含む２種のクローンを作成した（
第１１図）。

１番目の特異的クローン作成ではＬＥ由来のベクター（
ｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬと称す）を用いたが、そのベクタ
ーにおいて単一のＢｓ５Ｈ■部位に対して遠位にあるヌ
クレオチド配列を、ＫｐｎｌおよびＢａｍＨＩの両方に
より開裂可能な部位を含み、またペンタペプチドＡｓｐ
　−Ａｓｐ　−Ａｓｐ　−Ａｓｐ　−Ｌｙｓをコードす
るように修飾した。このペプチジル連鎖は、エンドペプ
チダーゼエンテロキナーゼによる開裂に対する特異的認
識部位としての役割を果たし得る。

プラスミドｐＩ３ｅｎｎ＃　２０からのＡＩＤＳウィル
スＤＮＡの２．１５ＫｂＫＩ）ｎｌ−ＢａｍＨＩＤＮＡ
フラグメントをｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬに挿入した。

このフラグメントはＥＮＶ遺伝子の主たる部分に及ぶ。

誘導後、生成したプラスミド、通称ｐＴｒｐＬＥ−ＫＡ
Ｌ−ＥＮＶ−＃　ｌ　Ｏ＋；ｉ、ＳＤＳゲル上で蛋白質
性生成物の再現可能なパターンをもたらし、それらは抗
ＡＩＤＳ血清とインキュベートしたウェスタンプロット
において強い免疫反応性を示した（第１２図）。このこ
とはＡｒＤＳウィルス遺伝子が正しい翻訳リーディング
フレームおよびＬＥ遺伝子から下流に挿入されたことを
示すものであった。　ｐＳＢ−Ｇａｇ−＃２５と称する
２番目の特異的クローンは、正しいリーディングフレー
ムおよびＬＥ遺伝子から下流に挿入されたＡＩＤＳウィ
ルスＧＡＧ遺伝子（第１ｔ図）からの０゜９５Ｋｂ　Ｐ
ｖｕＩＩ〜Ｂｇ１２ＩＩＤＮＡフラグメントを用いて作
成された。誘導後直ちにこの形質転換体は抗ＡＩＤＳ血
清と免疫反応性のある多重ポリペプチドを産生じた（第
１２図、レーンＧ）。

ＡＩＤＳまたはその関連疾患の患者から得た血清による
ウスタンブロッティングを用いてウィルス標的抗原を確
認した。この明細書に記載された発現ベクターを用いて
、ウェスタンプロットにおける抗原として用いられるＡ
ＩＤＳ蛋白質を生産した。エンベロープ由来蛋白質は、
リンパ節症、ＡＲＣおよびＡＩＤＳを患う患者から得た
抗体により非常に明白で確実に認識された（第１３図）
。

しかしながら、危険性の高いグループの多勢を占める者
（例、同性愛者および静注麻薬常用者）もまたＥＮＶ蛋
白質に対する抗体を伴っていた。

ＧＡＧおよびＰＯＬ蛋白質に対する抗体はＡＩＤＳウィ
ルス感染の有用な指標であると報告されたが、我々の得
た結果は各々ＥＮＶに対する抗体を有する者の部分集合
的なもののみがまたＧＡＧまたはＰＯＬ蛋白質に対する
抗体を有することを示している。逆に、ＧＡＧまたはＰ
ＯＬに対する抗体を有しなからＥＮＶに対する抗体をも
たない者は確認されなかった。すなわち、ＥＮＶクロー
ンＰＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃　１０により生産
された組換えＡＩＤＳ　ＥＮＶ蛋白質は、ＧＡＧまたは
ＰＯＬのようなウィルスゲノムの他の領域由来の蛋白質
よりＡＩＤＳウィルス感染診断用試薬に適している。ｐ
ＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃ｌＯにより生産された
多重ＥＮＶ関連蛋白質種は、ウェスタンプロットにおい
て再現可能な認識パターンをもたらすため、イムノアッ
セイ結果についての明白な解釈が容易になる。エシェリ
ヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ、大腸菌）におけるこれら
のＥＮＶ関連蛋白質試薬の生産は、ＡＩＤＳ感染した動
物細胞培養を用いた生産より安全で経済的である。

ＡＩＤＳプロウィルスＤＮＡ１特に一般に行なわれてい
るＥＮＶ遺伝子における配列可変性の原因および機能は
まだ知られていない。この明細書中でクローン化および
配列されたウィルスは初めはパスツール研究所のグルー
プからＬＡＶウィルスストックとして人手したものであ
った。細菌において生産されたＬＥ−ＥＮＶ蛋白質は、
普通存在する糖蛋白質化が起こらず、ＥＮＶオープンリ
ーディングフレーム全体の一部分だけした含まないが、
あらゆるＡＩＤＳおよびＡＲＣ５患者から得た抗体はＬ
Ｅ−ＥＮＶ融合蛋白質と強く反応した。すなわち、ＡＩ
ＤＳプロウィルスＤＮＡの配列可変性がＥＮＶオープン
リーディングフレームの部分を用いた診断において問題
をもたらすとは考えられない。すなわちＡＩＤＳ　ＥＮ
Ｖポリペプチドは診断用試薬として有用性がある。

ＬＥ−ＥＮＶ融合蛋白質のある種のフラグメントがイン
タクトな融合蛋白質またはインタクトなＥＮＶ蛋白質の
呈する免疫反応性を保有していることが発見された。幾
つかのＡＩＤＳ株間で比較すると、これらのフラグメン
トは高い（９０％）配列保存性を示すことが見出された
。すなわち、これらのフラグメントは配列が由来してい
る株に関係なく同一またはほとんど同一の配列を含む。

２種の特に好ましいフラグメント、５５−アミノ酸断片
（ＫＡＬ−Ａ）および９１−アミノ酸断片（ＫＡＬ−Ｂ
）は、ＫＡＬ−１０をＣＮＢｒ消化することにより得る
ことができる。これらのフラグメントは下記配列を有す
る。

上記配列中、Ｘはホモセリンラクトンまたはその加水分
解もしくはアミド化生成物を表わすが、これはＣＮＢｒ
開裂の結果である。Ｙは、Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡ　ｒ
ｇ、およびＺは、Ｍｅｔ−ＴｈｒまたはＴｈｒである。

免疫活性を有する前記２種の配列の池のサブセットおよ
び類縁体もこの発明の範囲内に含まれる。このようなサ
ブセットは、３個以下のアミノ酸を当技術分野の熟練者
に周知の他の天然または合成アミノ酸と置き換えること
により生成され得る。類似体は、組換えまたは化学的方
法により３個以下のアミノ酸を当技術分野の熟練者に周
知の他の天然または合成アミノ酸と置き換えることによ
り生成され、こうして生成したポリペプチドは少なくと
も実質的に同じ免疫反応性を保有している。類縁体は、
サブセットおよび配列内の３個以下のアミノアシル残基
が欠失された配列を含む。

さらに、ＫＡＬ−１０のＨ１ｎｄｌｌｌ　−Ｂ　ａｍＨ
Ｉ欠失突然変異の発現により優れた免疫活性を有する切
頭したＥＮＶポリペプチドが生産されることがわかった
。しかも、切頭したポリペプチドは高収率で発現され、
誘導培養中量白質全体の約５％を構成し得る。このクロ
ーンを用いると、診断的アッセイで用いる抗体の産生を
刺激するのに理想的な免疫反応性ポリペプチドの精製が
簡単になる。

［実施例および製造例］ 以下の実施例および製造例の記載は、分子生物学または
生化学専門技術者には明らかなものである。核酸操作の
常用技術、例えばＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼまた
はＤＮＡリガーゼによる処理、電気泳動による分離、エ
タノール沈殿、電気溶出、および他の方法についての更
に詳しい記載は常用テキストで見い出すことができる。

例えばマニアチス等、「モレキユラー・クローニング、
ア・ラボラトリ−・マニュアルＪ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａ
ｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−（１９８２年）参照。

制限酵素消化によるＤＮＡ開裂は、化学製品市販者の一
般的勧告にしたがい行なわれた。

製造例１ 親プラスミド プラスミドＰＢＲ３２２の長さは約４４００個のヌクレ
チオド塩基（４，４ｋｂ（キロベース））であり、抗生
物質アンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（
Ｔｅｔ）の耐性遺伝子を有する。この由来および特性に
ついては既に記載されている［ポリバー等、［ジーンＪ
（Ｇｅｎｅ）、２巻、９５−１１３頁（１９７７年）、
座ｐＢＲ３２２、シーンバンク、ＤＮＡデータベース、
リリース３４（１９８５年）］。ププラスミド作成８お
よびｐＵＣ９はそれぞれ酵素β−ガラクトンダーゼをコ
ードする遺伝子のＬａｃプロモーターおよびアミノ末端
のｌコピーを含む。この遺伝子のアミノ末端領域に幾つ
かの有用な制限酵素により認識されたＤＮＡ配列を含む
「カセット」を挿入する。プラスミドｐｕＣ８およびｐ
ｕｃ９はこの「カセット」の方向のみで異なっているた
め、クローニング中のＤＮＡ断片の操作が容易なものと
なる。ｐＵＣプラスミドの構成および特性についての記
載は既に公表されている［ビエイラおよびメッシング、
「ジーンＪ（Ｇｅｎｅ）、１９巻、２５９−２６８頁（
１９８２年）］。

エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｔｒｐプロモ
ーター・オペレーターは、その完全なヌクレチオド配列
についてはすでに測定および分析されたが［ヤノフスキ
ー等、「ニュクレイック・アシッズ・リサーチＪ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）、９巻、６
６４７−６６６８頁（１９８１年）、座ＥＣ０ＴＲＰ１
シーンバンク、ＤＮＡデータベース、リリース３４（１
９８５年）］、使用されたＴｒｐプロモーター・オペレ
ーターＤＮＡ断片の供給源であった。

用“いられた特定のプラスミドは、ＴｒｐＥ遺伝子に位
置する、Ｔｒｐプロモーターの上流の最も近いＰｖｕ１
１部位から最初のＨｉｎｆ　Ｉ部位までの０．４５ｋｂ
フラグメントのエシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｔ
ｒｐオペロンＤＮＡを含むｐＮＯ３４２であった。ｐＮ
Ｏ３４２を構成するためには、ＴｒｐＤＮＡ上のＨｉｎ
ｆ　Ｉ部位を充填し、そして次に修飾ＤＮＡ断片をｐＢ
Ｒ３２２のＨｉｎｄｎＩ部位に挿入する前に、両末端（
ＰｖｕＩＩ末端および充填されたＨｉｎｆｌ）をＨｉｎ
ｄｌ［［１０塩基対長のリンカ−にライトゲートした。

次いでｐＢＲ３２２母体のＴｒｐプロモーターに続＜Ｅ
ｃｏＲ１部位に最も近いＨｉｎｄＩ［１部位をＨｉｎｃ
ｌＩ［Ｉにより切断し、末端を充填し、再びライトゲー
トすることにより破壊した。すなわちＥｃｏＲＩおよび
Ｈｉｎｄｌｌｌで消化することにより生成したプラスミ
ドからＴｒｐオペロンＤＮＡを除去することが可能とな
った。この最終構築物、ｐＮＯ３４２は、ネイル・オシ
エロフ博士（スタンフォード大学、生色学科、カリフォ
ルニア９４３０５、パロ・アルド）から得られた。

この明細書に開戦された構成に用いられた転写終結配列
を含むＤＮＡはプラスミドｐＶＶ２０２ｔ（カリフォル
ニア９４３０５．バロ・アルド、スタンフォード大学、
生物化学科、ヤノフスキー研究所から購入）から得られ
た。ｐＶＶ２０２ｔから得られた０、３７ＫｂのＢａ５
ＨＩフラグメントはエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ）　ｒｐｏＣ遺伝子の転写終結領域からの３２５塩基
対を含む［スカイアーズ等、「ニュクレイック・アシッ
ズ・リサーチＪ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ
ｓ、　）、９巻、６８１７〜６８４０頁（１９８１年）
、座ＥＣ０ＲＰＬｒ（Ｐ、塩基＃１１２２６−１１５５
１シーンバンク・データベース（１９８４年ｌＯ月）］
。

ＴｒｐＬＥ遺伝子はプラスミドｐＶＶ１から得られたが
（これについては前に記述済み［ニコルスおよびヤノフ
スキー、「メソッズ・イン・エンサイモロジーＪ（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１０１巻
、１５５−１６４頁（１９８３年）コ）ヤノフスキー研
究所から購入された。

プラスミドｐＢｅｎｎ＃２０ＤＮＡを、様々なプラスミ
ド作成に用いるＡＩＤＳウィルスＤＮＡの供給源として
用いた。ｐＢｅｎｎ＃２０は次のようにして作成される
。すなわち、Ｔリンパ球培養（Ａ３０１）［フォークス
等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ９ナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシーズ・オプ・ザ・ユナイテ
ッド・ステーブ・オブ・アメリカＪ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８２巻、４５３９−４
３頁（１９８５年）］をＡＩＤＳウィルスＮＡ−２（マ
ーチン等、原稿準備中）により感染させた。感染９日後
、全部の細胞ＤＮＡを感染した細胞から単離した。高分
子量の細胞ＤＮＡ（１０μｇ）を制限酵素ＢａｍＨＩに
より開裂した。開裂された細胞ＤＮＡ５μ９をＢａｍＨ
■−開裂ラムダＪＩＤＮＡ［ｒネイチ＋−Ｊ（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、３０８巻、８５６−８５８頁、（１９８４年）
］ｌμ９にライゲートした。次いで試験管内封入したラ
イゲートされたＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ（Ｅ
、　ｃｏｌｉ）細胞を感染させた。ＡＩＤＳプロウィル
スＤＮＡを含む組換えファージを、ハイプリダイゼーシ
ョンプローブとして放射能標識したＡＩＤＳウィルスｃ
ＤＮＡを用い、その場でプラークハイブリダイゼーショ
ンにより確認した。

陽性ファージプラークが確認された。組換えファージ粒
子から精製されたＤＮＡの分析により８Ｋｂのウィルス
ゲノム（左末端の長い繰り返し配列、ＧＡＧ遺伝子、ポ
リメラーゼ遺伝子およびエンベロープ遺伝子の４分の３
）および９Ｋｂの細胞側面配列を含む１７Ｋｂのインサ
ートが明らかになった。続いて１７にインサートを単−
ＢａｍＨ１部位によりプラスミドｐＢＲ３２２に転位さ
せた。新しく形成された（孫）プラスミドをｐＢｅｎｎ
＃　２０と命名した。プラスミドｐＢｅｎｎ＃２０は、
マルコルム・チーティン博士（ナショナル・インスティ
テユーツ・オブ・ヘルス・ベゼスダ、メリーランド）に
より市販されている。

製造例２ オリゴヌクレオチ合成 ティ等の［ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサエティーＪ（Ｊ、　Ａｓ、　Ｃｈｅｗ。

Ｓｏｃ、）１０４巻＋３１６頁（１９８２年）記載にし
“たがい保護デオキシリボヌクレオキシドを製造した。

固相亜燐酸トリエステルアプローチによりすべてのオリ
ゴヌクレオチを合成できる［カルザース等、「ジーン、
アンプリフィケーション・アンド・アナリシスｊ（Ｇｅ
ｎｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａ　ｎａ
ｌｙｓｉｓ）、ババス、ローゼンバーグ、チリキャン編
、エルスピア、ニューヨーク、！−２６頁（１９８３年
）コ。それぞれの鎖は、テトラゾールにより活性化され
た２０モル当量の５’　−０−Ｎ保護デオキシヌクレオ
シド−３′−〇−メチルーＮ−モルホリノホスホルアミ
ダイトを用いて［ドーパ−およびウイネーカー、［ニュ
クレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　
Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ。

）、１１巻、２５７５頁（１９８３年）］脱保護および
宿合し、酸化し、そして未反応部位をブロックすること
から連続サイクルを用いて構成される。

合成完了後、メトキシおよびＮ−保護基を除去し［カル
ザース（１９８３年）前記引用］、粗ジメトキシトリチ
ルオリゴヌクレオチドを逆相）ＩＰＬＣによって精製す
る。８０％酢酸による処理後、充分に脱保護された生成
物を、７Ｍ尿素を含む調製用２０％ポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によりさらに精製する。［γ−”
Ｐ］ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて精
製されたオリゴヌクレオチドをラベルする。次いで２０
％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルを用いた電気泳動
により大きさおよび純度を確かめる。

実施例Ｉ ＴｒｐＬＥプラスミドの製造 プラスミドクローニングベクターｐＴ　ｒｐＬ　Ｅ　−
＃１４の構築は多段階方法によるものであった（第１お
よび第２図）。第１段階において、ＴｒｐＥおよびＤ遺
伝子の両方およびＴ、ｒｐＣ遺伝子の１部分を含むプラ
スミドｐＶＶ２０２ｔを処理して単一のＨｉｎｄｌＩ［
部位をつくった。ＨｉｎｄＩ［［によりｌ。

Ｏμｇ　のｐＶＶ２０２Ｌ　ＤＮＡを消化し、７．ｚ／
−ルーＣＨＣｌ２１で抽出し、エタノール（ＥｔＯＨ）
沈澱後、４０ｎＨの再溶解ＤＮＡをＴ４　　ＤＮＡリガ
ーゼによりセルフライゲートし、生成物をエシェリヒア
・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｈｂ　ｌ　０１に形質転換
した。アンピシリン耐性コロニーをＴｒｐＤ遺伝子の出
発点およびターミネータ−間の単一〇１ｎｄＩ［［部位
の存在についてスクリーンした。ｐＶＶ−△Ｈｉｎｄｌ
ＩＩ−＃３は所望の部位を有していた。

後のクローニングのためにＴｒｐＥ遺伝子に単一のＢｓ
５ＨＩ［制限部位を有するプラスミドを得ることが望ま
しかった。プラスミドｐＶＶ−△Ｈｉｎｄ■−＃３は、
ＴｒｐＥ遺伝子のＢｓ５Ｈ部位以外にさらにＴｒｐプロ
モーターの上流に１１１１またはされ以上のＢｓ５ＨＩ
［制限部位を有することがわかった。

したがってＴｒｐプロモータ一部分を含むｐＶＶ−ΔＨ
ｉｎｄＩ［［−１３の約２．５Ｋｂ断片（ＥｃｏＲＩ〜
Ｈｐａｒ）を機能的に類似したプラスミドルＮ０３４２
由来の２８２　ｂ９　ＥｃｏＲＩ−Ｈｐａｌ断片と置き
換えた。ｐＮ０３４２由来の０．２８ｋｂＥｃｏＲＴ　
〜Ｈｐａ　Ｉ断片を５μｇのＤＮＡ消化消化第５％ポリ
アクリルアミドゲル電気溶離することにより単離した。

次いでこのＤＮＡ断片１０ｎｇを予めＥｃｏＲＩおよび
Ｈｐａｌにより開裂されたｐＶ■−Δｌ−１ｉｎｄＩＩ
Ｉ−＃３．８０ｎｇとライゲート（結合）した。生成物
をエシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｉ−１１０１
細胞に形質転喚し、アンシピリン耐性コロニーをＢｓ５
ｌ■ＩＩで消化することによりスクリーンして所望のク
ローン、ｐＴｒｐＥ−９２２を確認した。

ｐＴｒｐＥ−＃２２のＴｒｐプロモーター−リーダー−
Ｅ遺伝子領域とｐｖｖｔの類似部分との置換は第３番目
で最終段階であった。ｐＶＶ１由来のＤＮＡ（ｌ　ＯＯ
ｕｇ　）をＢｓ５ＨＩＩおよびＨｐａｌで消化し、電気
溶離することにより約６．０．４．０．１．８．０．６
．０．５７および０．５４ｋｂの断片を得た。ＴｒｐＬ
Ｅ遺伝子を含む０．５７ｋｂ断片を、消化生成物の分離
に使用された４％ポリアクリルアミドゲルから電気溶離
により回収した。

フェノール−ＣＨＣＱ３抽出およびＥｔＯＨ沈澱後、再
溶解した０、５７　ｋｂ　ＤＮＡ断片０．２μｇを、Ｂ
ｓ５ＨＩｌおよびＨｐａＩを用いた消化により得られた
ｐＴｒｐＥ−＃２２の５．１　　ｋｂ　ＤＮＡ断片０゜
２５μｇとライゲートした。ライゲーション生成物をＢ
ｓｔＸＩにより消化したが、これはこの認識部位がｐＶ
ＶｌのＴｒｐプロモーター・オペレーターから欠失され
たＤＮＡ部分に存するからである。

アンシピリン耐性コロニーの中で、正しい構造を有する
ものとしてｐＴｒｐＬＥ−＃１４を確認した。

実施例２ ＴｒｐＬＥ−ＳｓｔＩＩ−ＨｕＧＲＦをコードするクロ
ーンの製造。

ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７をコードする合成遺伝子は、
高度に発現されたエシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）
蛋白質において好都合なアミノ酸コドンを最大部に用い
、生成したｍＲＮＡにおける可能な２次構造を最小にし
、所望のクローンをスクリーンするのに用いる好都合な
制限部位を提供し、そしてＤＮＡ配列における将来の代
替を容易にするように設計したものであった。合成遺伝
子配列および合成遺伝子配列を含む１８個の別々のオリ
ゴデオキシヌクレオチドを下記に示すのが、以下のさら
に詳細な記載と関連づけて参照されたい。

クローニングを容易にするために、ＨｕＧＲＦＬｅｕ２
７遺伝子を２つの部分、すなわちＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７のアミノ末端部分をコードする１０個のオリゴデオ
キシヌクレオチド（ＡＩ−ＡｌＯ）からなるＡセグメン
トおよびペプチドのカルボキシ末端部分をコードする８
個のオリゴデオキシヌクレオチドからなるＢセグメント
に分けて（下記に示す）クローンを行なうことにした。

Ａセグメントを会合させるために、１０個のオリゴデオ
キシヌクレオチド（Ａｔ−ＡＩＯ）の各々を個別に燐酸
化した。次いで１０個の燐酸化されたオリゴデオキシヌ
クレオチドの各々５０ピコモルを１個のチューブに合わ
せた。１０分の１容量（２０μｉの３Ｍ酢酸ナトリウム
（ＮａＯＡｃ）溶液および４倍容４！（８００ｕ（１）
（７）無水ＥｔＯＨ（Ｚタノール）溶液を混合しながら
加えた。溶液を１５分間−７０℃に冷却し、次に４℃で
１５分間１２０００ＸＧで遠心分離した。上滑を除去し
、沈澱物を真空乾燥した。次いで乾燥した沈澱物を６６
ミリモルのトリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）、６゜６ミ
リモルのＭｇＣ（ｈ、１０ミリモルのジチオトレイトー
ルおよび０．１ミリモルのＡＴＰ４８μｇに再けん濁し
た。オリゴヌクレオチドをアニールするために溶液を４
０℃に加熱し、次に４時間にわたってゆっくりと２０℃
に放冷した。次いで５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え
、溶液を２０℃で１２時間インキエベートした。アニー
リングおよびライゲーション反応を繰り返し、そして結
合（ライゲート）した混合物をフェノールで抽出し、Ｅ
ｔＯＨ−沈澱を行なった。乾燥したＤＮＡを５０μｇの
滅菌水に再けん濁し、そして結合したオリゴデオキシヌ
クレオチド３５μｇをＨｉｎｄＩ［および５ｓｔＩ［の
各々１００単位により開裂した。反応混合物を４時間３
７℃でインキュベートし、ＥｔＯＨ−沈澱を行なった。

５ＳｔＩ［／Ｈｉｎｄ　ｍ−ＨｕＧ　ＲＦ　Ａ遺伝子や
セグメントを６．７％ポリアクリルアミドゲルを用いた
プレパラティブ電気泳動により未反応及び部分的に結合
したＤＮＡ断片からゲル精製した。回収したＤＮＡをこ
の明細書中では５ｓｔＩＩ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−ＨｕＧ
ＲＦ−Ａ遺伝子セグメントと命名する。

前にＢｓ５ＨＩＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌおよび５ｓｔＩＩに
より開裂されたプラスミドｐＴｒｐＥ−＃２２ＤＮＡ６
２ｎｇを１２℃で１６時間、６６ミリモルのトリス−Ｈ
Ｃｌ２　（ｐＨ７，５）、６．６ミリモルまＭ　ｇ　Ｃ
Ｑｌ、ｌＯミリモルのジチオトレイトール、０．１ミリ
モルのＡＴＰ中に！、０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含
む最終容量２０μｅ中約６．７ｎｇ（０，１４ピコモル
）の５ｓｔｌ［−ＨｕＧＲＦ−へ遺伝子セグメントとラ
イゲートした。ライゲートされたＤＮＡ混合物をエシェ
リヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ）株ＨｂｌＯ１の形質転
換に用いた。形質転換体を５０μｇ／ｒａＱのアンピシ
リンを含むしブロスプレート上アンピシン耐性について
選択した。２４個の個別に単離されたコロニーをスクリ
ーニングした後、その中の８個が予想通りの約７６ｂｐ
の５ｓｔＩＩ〜ＨｉｎｄＩ［Ｉインサートおよびさらに
インサートの由来のＮｄｅ１部位を有するプラスミドを
含むことがわかった。マクサム−ギルバート法による塩
基配列分析ではこれらのうちの１個が予想通りの配列を
有していることが証明された。このプラスミドをｐＴｒ
ｐＥ　ｅ　５ｓｔＩｒ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７−と
命名した。

ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７遺伝子の残りを会合させるた
めに、Ｂセグメント（８２〜Ｂ７）を含む８個のオリゴ
デオキシヌクレオチ中６個を個別に燐酸化した。１０分
間７０℃に加熱することにより燐酸化を終結させた。オ
リゴデオキシヌクレオチドＢｌおよびＢ８については末
端のセルフライゲージジンを防ぐために初めから燐酸化
しなかった各々の燐酸化オリゴデオキシヌクレオチド（
Ｂ２−Ｂ７）２００ピコモルを燐酸化させていないＢｌ
およびＢ８の各々２００ピコモルと合わせた。

オリゴマーを沈澱させ、アニールし、そして前記と同様
にライゲートした。ＨｕＧ　ＲＦ　−Ｂ遺伝子セグメン
トを７．５％のポリアクリルアミドゲル上プレパラティ
ブ電気泳動により未反応および部分的にライゲートした
ＤＮＡ断片から精製した。

回収されたＤＮＡの５′末端が燐酸化されていた。

回収されたＤＮＡを５′燐酸化した。

ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７のＡおよびＢ遺伝子セグメン
トを集合させるために、５マイクログラムのプラスミド
ｐＴｒｐＥ−８ｓｔＩ［−ＨｕＧＲＰ　　Ｌｅｕ２７−
Ａを５単位の制限エンドヌクレアーゼＲａｍＨ１により
部分的に消化した。フェノール抽出およびＤＮＡ−Ｅｔ
ＯＨ沈澱により反応を終結した。

回収されたＤＮＡｆｌＯ単位の制限エンドヌクレアーゼ
ＨｉｎｄｎＩにより完全に消化した。部分開裂生成物を
分離するために０．７％アガロースゲルを用いて電気泳
動させた。最大（６，２１６ｋｂ）断片を切除し、電気
溶離を行なった。回収されたＤＮＡをフェノールで２回
抽出し、ＥｔＯＨ沈澱に付した。

６０μｇの６．２　ｋｂ　Ｈｉｎｄ　Ｉ［およびＢａｍ
ＨＩ−開裂ｐＴｒｐＥ　＊　５ｓｔｌｌ−ＨｕＧＲＦ　
　Ｌｅｕ２７−ＡベクターＤＮＡをおよそ５倍モル過剰
量の７２　ｂｐ　ＨｕＧＲＦ−Ｂ遺伝子セグメントとラ
イゲートシた。ライゲートされたＤＮＡ混合物をニジエ
リピア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）菌株ＨｂｌＯ１の形質
転換に用いた。形質転換体を５０μｇ／ｌａＱアンピシ
リン含有しブロスプレート上アンピシリン耐性により選
択した。幾つかの形質転換体が約０．５ｋｂの５ｓｔＩ
［〜Ｂａ５ＨＩインサートを有するプラスミドＤＮＡを
含むことがわかった（インサート／ターミネータ−接合
はＢａｍＨ１部位を再構成していない）。マキサムおよ
びギルバートによる塩基配列分析［［プロシーディング
ズ・オブ・ザ・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オ
ブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカＪ（
Ｐｒ。

ｃ、’Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）７
４巻、５６０頁（１９７７年）］は、ｐＴｒｐＥ−Ｓｓ
ＬＩ［−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７と命名されたプラス
ミドの１種が所望のＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７コード配
列を有することを示した。

ｐＴｒｐＬＥ−＃１４へのＨｕＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）の
転写 ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の会合したＡおよびＢ遺伝子
セグメントおよび転写ターミネータ−を含む０．５ｋｂ
の５ｓｔＩＩ〜ＢａｍＨＩインサートを５％ポリアクリ
ルアミドゲルを用いたプレパラティブ電気泳動によりｐ
ＴｒｐＥ−ＳｓｔＩＩ−ＨｕＧＲＦＬｅｕ２７ＤＮＡか
ら精製した。

６０μｇのＢｓ５ＨＩＩ、Ｂａｍ１−ＩＩおよび５ｓｔ
ｌＩ　−開裂ｐＴｒｐＬＥ−＃　Ｉ　４プラスミドＤＮ
Ａを約５倍モル過剰の０．５　ｋｂ　５ｓｔＩ［〜Ｂａ
ｍＨＩ断片とライゲートした。ライゲートされた混合物
をエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）菌株ＨｂｌＯ
１の形質転換に用いた。５０μｇ／ｍＱのアンピシリン
を含むＬ−プロスプレート上アンピシリン耐性により形
質転換体を選択駿た。１２個の個別に単離されたコロニ
ーをスクリーニング後、２個が正しいＳｓｔ■〜ＢａＩ
ａＨＩ断片を有するプラスミドＤＮＡを含むことがわか
った。マキサムおよびギルバートによる塩基配列分析［
「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド
・ステーブ・オブ・アメリカＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ）７４巻、５６０頁（１９７７年）］は、プラス
ミドｐＴｒｐＬＥ　φＳｇｔｌｌ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅ
ｕ２７が所望の配列（第３Ａ図）を有していることを示
した。

実施例３ ｐＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩ［−ＨｕＧＲＦ（Ｌｅｕ２７
）の構成 同様にしてＴｒｐＬＥ遺伝子における５ｓＬＵ部位以外
の単−Ｂｓ５Ｈ■部位を用いてＴｒｐＬＥ−ＨｕＧＲＦ
　　Ｌｅｕ２７を発現する遺伝子を構成することができ
る。

ＨｕＧＲＦ　　ＬｅＬ１２７のＡセグメントを含む１０
個のオリゴデオキシヌクレオチドのうち８個（Ａ２〜Ａ
９）を個別に燐酸化した。１０分間７０℃に加熱するこ
とにより反応を終結した。末端におけるセルフライゲー
ションを防ぐためにオリゴデオキシヌクレオチドＡ１お
よびＡＩＯについては初めに燐酸化しなかった。燐酸化
されたオリゴデオキシヌクレオチド（Ａ２−Ａ９）の各
々２００ピコモル（ｐＭ）をＡＩおよびＡＩＯの各々２
００１）Ｍと合わせた。オリゴマーをＥｔＯＨ沈澱に付
し、アニールし、そしてライゲートした。ＨｕＧＲＦ−
Ａ遺伝子セグメントを７．５％ポリアクリルアミドゲル
を用いたプレパラティブ電気泳動法により未反応および
部分的にライゲートしたＤＮＡ断片から精製した。次い
で回収されたＨｕＧＲＦ−Ａセグメントの５′末端を燐
酸化し、予めＢｓ５ＨＩＩおよびＨｉｎｄｌｎで開裂さ
れたプラスミドｐＴｒｐＥ−＃２２とライゲートした。

ライゲーション混合物をエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ）　Ｈｂｌｏｌの形質転換に用いた。形質転換体
をさらにＮｄｅＩ制限部位の存在についてスクリーンし
た。

所望のクローンはｐＴｒｐＥ＊　Ｂｓ５ＨＩＩ−ＨｕＧ
ＲＦ−Ａ命名した。

ＨｕＧＲＦ’　　Ｌｅｕ２７遺伝子配列を完全にするた
めに、ｌ−１ｕＧＲＦ−Ｂ遺伝子やセグメントおよび転
写ターミネータ−をｐＴｒｐＥ−ＳｓｔＩＩ−ＨｕＧＲ
Ｆ　　Ｌｅｕ２７から利用した。プラスミドｐＴｒｐＥ
−９ｓｔＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７を単一のＢａ
ｍＨＩおよびＨｉｎｄｌＩ［部位のところで開裂した。

０．４ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をゲル
電気泳動法により精製した。プラスミドｐＴｒｐＥ−Ｂ
ｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ−ＡをＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄ■により開裂し、最大断片を電気泳動後０．７％アガ
ロースゲルから精製した。これら２つの精製されたＨｉ
ｎｄＩＩ［〜ＢａｍＨｒ断片をライゲートし、Ｅ、　ｃ
ｏｌｔ　　Ｈｂ　１０１に形質転換した。形質転換体中
のプラスミドＤＮＡを３箇所のＰｓｔ（部位（１つのＰ
ｓｔ１部位はインサートにより付与された）の存在につ
いてスクリーンした。この技術によりプラスミドｐＴｒ
ｐＥ　＠　Ｂｓ５ＨＩＩ−ＨｕＧＲＰＬｅｕ２７を確認
した。塩基配列分析（マキサムおよびギルバート法）は
、Ｂｓ５ＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　−Ａ遺伝子セグメントの
出発点に予想外の１個の塩基対欠失があることを示した
。すなわち、配列ＧＣＧ　　ＣＧＡ　　ＴＧ・・・は予
想していた配列ＧＣＧ　　ＣＧＧ　　ＡＴＧ・・・とは
別のものであることがわかった。これはＨｕＧＲＦ　　
Ｌｅｕ２７の残りに対するトリブレットリーディングフ
レームの変化をもたらすが、これを次の段階で修復した
。

Ｔｒｌ）ＬＥＤＮＡセグメントによるプラスミドｐＴｒ
ｐＢ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７のＴｒ
ｐＥＤＮＡセグメントの置換は、合成オリゴヌクレオチ
ドにより２種の既述したプラスミドの結合部分により達
成された。このオリゴヌクレオチドは、Ｂｓ５ＨＩＩお
よびＮｄｅＩ部位間でＨｕＧＲＦ−ＡＤＮＡ配列を置換
することによりＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７合成のための
正しい翻訳リーディングフレームを修復することを目的
として設計したものであった。異種ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅ
ｕ２７コード遺伝子をもたらすために、１２．５μｇの
ｐＴｒｐＥ　−Ｂｓ５ＨＩ［−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２
７ＤＮＡをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより開裂し、所
望の０．５ｋｂ断片をアガロースゲルから単離した。次
に、自己相補性合成オリゴヌクレオチドＴＡＧＣＧＣＧ
ＣをＴ４キナーゼで処理し、モして３００ｎＨの単離し
た断片にライゲートした。次にこの反応混合物を１５分
間６０℃に加熱してキナーゼを不活性化し、次いでＢｓ
５ＨＩＩにより開裂して０．５ｋｂのＮｄｅ　Ｉ　−Ｂ
ａｍＨＩ断片のＮｄｅｌ末端をＢｓ５ＨＩ［部位に変換
した（これらを下式に示す）。

ＴｒｐＬＥコード遺伝子は、プラスミドｐＴｒｐＬＥ−
＃　ｌ　４をＢｓ５ＨＩＩおよびＢａｍＨＩで消化する
ことによりもたらされた。１１００ｎの０．５　ｋｂＢ
ｓｓＨ■−ＢａｍＨＩ断片およびｌｏＯｎｇの二重消化
されたｐＴｒｐＬＥ−＃１４ＤＮＡ間のライゲーション
が行なわれた。ライゲーション生成物を受容能力のある
エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＨｂｌＯ１細胞
に形質転換し、アンピシリンプレート上に置いた。Ｂｓ
５Ｈ（Ｉ　＋　Ｂａａ＋Ｈ（またはＰｓｔ■を用いた消
化により生成したコロニーからのＤＮλの制限酵素スク
リーニングにより予想された構造を有するものとして２
４個中７個の候補が確認された。プラスミドｐＴｒｐＬ
Ｅ−Ｂｓ５ＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７−＃１５
のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列分析により確かめた（第３Ｂ
図）。

実施例４ ＬＥ−ＨｕＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）の発現および精製ここ
に記載する方法を用いて、ＴｒｐＬＥ蛋白質とのＢｓ５
ＨＩＩまたは５ａｃｌＴ融合部位を用いたＬＥ−ＨＰ　
Ｇ　ＲＦ　　Ｌ　ｅｕ２７クローンからＨｕＧＲＦを精
製することができる。開始前に、誘導範囲を染色したＳ
ＤＳゲルで洗浄した細胞ベレット１アリコートを分析す
ることによりモニターすることができる。どちらかのク
ローンを用いた透析点まで発現レベルまたは精製段階に
おける違いは無い（第４図）。透析中、Ｂｓ５Ｈ■クロ
ーンは大きな沈澱をおこすが、Ｓａｃ■クローンの方は
これより小さい沈澱を形成する。すなわちＢｓ５ＨＩＩ
透析物を遠心分離するとさらに大きい沈澱物をもたらす
が、これを徹底的に洗浄して充分にＬＥ−ＨＰＧＲＦ’
Ｌｅｕ２７を回収しなければならない。

ＴｒｐＬＥ−ＨｕＧＲＦの誘導 この場合、５０μｇ／ｍＱのアンピシリンおよびｌＯ″
θμｓ／ｍＱのトリプトファンを含むＬＢｒ培養培地［
この明細書に記載されたＬＢｒおよびＭ９培地の製造に
ついてはミラー、（１９７２年）「エクスペリメンツ・
イン・モレキュラー・ジエネテイツクスＪ（Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔ
　１ｃｓ）、４３１頁参照１５０ｍｅのスターター培養
をプラスミドすなわち、ｐＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ　
−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７を含むエシェリヒア・コリ
（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞と接種し、激しく振盪しながら
一夜３７℃で約６の最終Ａ。。になるまで成長させる。

４リツトルの生産用Ｍ９培養培地を３７℃に予熱し、４
０ｓｅのＬＢｒスターター培養物を播種して約０．６の
最終Ａ％ｉｏを得る。次いで培養物を激しく振盪しなが
ら約０．２〜０．５のＡｓｓ。まで成長させ、そこにＥ
ｔＯＨ中インドールアクリル酸（ＩＡＡ）の１０ｍ＠／
−溶液４＋ａＣを加えてＩＡλの最終濃度ｌＯμｇ／ａ
１２溶液を得る。次いで良好・　　なエアシーションを
保ちながら約！６時間約５（一般には約５〜１０）の最
終Ａ　ｓ　ｓ。になるまで成育を続ける。Ｍ９培地で成
長中にＩＡＡを加えても最終収量ではなく生成物の蓄積
速度を増すだけであるからどちらでもよい。別の同程度
に効果的な細胞成長方法はＭ９の代わりにＬＢｒを用い
るが、この場合適当な産生ｌを得るためにはＩＡＡを加
えることが必要である。細胞を遠心分離により濃縮し、
５０ミリモルのトリス−ＨｅｌｐＨ７゜１）５００ｍ１
２（一般的には初めの培養容量のｌ／■θ〜１／２０）
に再けん濁し、そして再沈澱させた。洗浄された細胞は
この段階で一２０℃で好都合に貯蔵され得る。

（超）音波処理 洗浄した細胞を音波破壊により溶解する。細胞を５０ミ
リモルのトリス−ＩＣ（２（ｐＨ７，５）、０．１ミリ
モルのＥＤＴＡ、１ミリモルのフェニルメチルスルホニ
ルふう化物（ＰＭＳＦＸこの緩衝液をｒＴＥ−ＰＭＳＦ
Ｊと省略する）９００＋＋ｅにけん濁し、４℃に冷却し
、数滴のオクタツールを加え、Ｎ、ガスを溶液中でに吹
き込む。これらの段階により音波処理中の試料の加熱お
よびメチオニン残基の酸化を最少にすることができる。

製造者の勧告にしたがいモデルＷ２２０Ｆ’ヒート・シ
ステムズ・ウルトラソニックス社製ソニケータ−（３／
４″ホーンを備えている）を用いてけん濁液を超音波処
理する。ソニケーターは一般に過熱を避けるため全工程
時間の５０％のみ作動する。

遠心分離 細胞リゼートを約３６００　Ｘｇｍａｘで１５分間遠心
分離してｐＴｒｐＬＥ−Ｉ−ＩｕＧｎＦ　　Ｌｅｕ２７
を沈澱させ、上清を棄てる。沈澱物を４５０ｍ（ＪのＴ
Ｅ−ＰＭＳＦ（一般的には４０　　ｓ　ＯＡ　ｓｓｏ／
ｍｆ２）に再けん濁し、そして前と同様に遠心分離によ
り沈澱物を集めた。

実施例５ ＨｕＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）の精製 ＴｒｐＬＥ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７融合蛋白質のメ
ヂオニン残基をＣＮＢｒにより開裂すると所望の異種Ｈ
ｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７蛋白質が−ＯＨ形で放出される
がこれを下記のように精製することができる。

沈澱物のＣＮＢｒ処理 ＴｒｐＬＥ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の洗浄した沈澱
を穏やかに撹拌するかまたは渦を巻かせることにより６
０ｍＱの７０％ぎ酸（約２０１１Ｆ／ｌａＱの総蛋白質
、一般的には１０００　Ａｓ５ｏ単位の細胞からの物質
を３ｔａＱに溶解する）に再けん濁した。数滴のオクタ
ツールを加え、５．５ｇのＣＮＢｒを加える前に２０分
間Ｎｔを溶液中でに吹き込んだ。

この反応を２５℃で６時間進行させた後、続く濃縮階段
を容易にするために等容積の５０：５０Ｍｅｏ　Ｈ：Ｈ
２０を加える。体積が半分に減少するまで揮発性の過剰
のＣＮＢｒ　、水および有機溶媒を回転蒸発により除去
した。さらに５０：５０ＭｅＯＨ：ＨｔＯを試料と混合
し、続いて回転蒸発により除去した。この工程を２〜４
回繰り返すと大半のぎ酸およびＣＮＢｒは除去されてし
った。次いで試料を濃縮乾固し、２００ｍＱの水に再溶
解させて凍結乾燥した。

酢酸抽出 凍結乾燥した試料を８０ｍｇのＩＮ酢酸に溶かし、少な
くとも３０分間２５℃で抽出した。１２００ＱＸｇｌａ
Ｘで１０分間遠心分離後、上清を回収し、沈澱物を前と
同様に７０１１ＱのＩＮ酢酸により再抽出した。沈澱物
のフラクションを棄て、ＨｕＧ　ＲＰＬｅｕ２７’を含
む上清を合わせた。

透析 次にＩＮ酢酸抽出物を３５００の分子量カットオフを有
する透析チュービングに入れ、全体で１８時間ｌＯミリ
モルの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（ｐＨ５，０、各
々４Ｌ）を４回取りかえて透析した。透析の前半は２５
℃、後半は４℃で行なった。

生成する沈澱を１０分間１０００１００００Ｘで遠心分
離により除去した。正当には沈澱物を緩衝液で洗浄する
ことにより可溶性フラクションにおけるＨｕＧＲＦの回
収を最大にした。

カルボキシメチルセルロースクロマトグラフィ次に清澄
した透析物を冷室（０〜４℃）中１．５ｍＱ１分の速さ
で５０＋ａ１２のベッド容積のオルトカルボキシメチル
セルロースカラム（２，５ｘｌＯｃｍ）に通した５０ミ
リモルのＮａＯＡｃ（ｐＨ５）で洗浄後５０〜５００ミ
リモルのＮａＯＡｃ（ｐＨ５）から勾配を用いてＨｕＧ
ＲＦ　　Ｌｅｕ２７を溶離した。

カラムフラクションの免疫プロッティング（ウェスタン
分析）によりＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７のピークを測定
することができた。

ＰＬＣ カルボキシメチルセルロースカラムからプールされたフ
ラクションをマイレックス（ｍｉｌｅｘ）−ＧＶｏ、２
２μｍフィルター（ミリボア）に通して濾過し、４　ｍ
（１／分の速さで直接、溶媒「Ａ」（水中０゜１％トリ
フルオロ酢酸）中で平衡に達しているバイデック（Ｖｙ
ｄｅｃＸＣ１８ＴＰ　２０１　　Ｎ−キャップ（１０μ
ｌ１１）３００人孔ビーズでバックされた０、８Ｘ２５
ｃｍＨＰＬＣカラム上に適用した。次いで基線がゼロに
戻るまで７５：２５　の溶媒Ａ二溶媒Ｂ（アセトリドニ
ル中０．１％トリフルオロ酢酸）により洗浄した。次い
でＨｕＲＦ　　Ｌｅｕ２７を３０分の間にわたって２５
〜３５％の溶媒Ｂから流れる勾配により溶離した。Ｈｕ
ＧＲＦを含むクロマトグラムの主要ピークが約２６分後
に溶離し、集められた。溶媒を３〜４サイクルの回転蒸
留により水から除去した。

ゲル濾過 最終精製段階として、残存する痕跡量のＣＦ３Ｃ０ｔ−
をＣＱ−と置き換えるために、乾燥した試料を４ｍ１２
の２５ミリモルＨＣｌ２に溶かし、溶媒中平衡に達して
いるセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ＝５０
の２５ｍＱカラム（２，５ｘ５ｃｍ）に適用する溶離液
を２８０ｎｍの吸光度によりモニターし、ｌ−１ｕＧＲ
Ｐ　　Ｌｅｕ２７を含むボイドボリュームビークをプー
ルした。溶液のｐｔｒが５を越えるまでこの物質を数回
水から凍結乾燥した。白色のけば状物質が得られた。

実施例６ ＨｕＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）の特性および生物活性最終の
ＨｕＧＲＦ　Ｉ、ｅｕ２７生成物について９５％を越え
る純度が、全蛋白質に対して染色または抗−（１；ＲＦ
抗血清を用いたウェスタンブロッティングにより可視化
されたＳＤＳゲル［プルおよびプル、［メソッズ・イン
・エンサイモロジ−Ｊ（Ｍｅｔｈ。

Ｅ　ｎｔ、）、９６巻、２３９−２４４頁（１９８３年
）］により立証された（第９図）。さらに、ＨＰＬＣプ
ロフィールが得られた（第１０図）。測定された最終生
成物の乾燥重量および全アミノ酸含有量から計算された
理論上の重量は５％以内の差異でほぼ一致した、さらに
、アミノ酸組成および配列は予想された結果と一致して
いた。

４４−アミノ酸ペプチドＧＲＦは、下垂体前葉からの成
長ホルモン分泌を誘発した。作用機序にはアデニル酸シ
クラーゼの受容体−媒介活性化および細胞内の環状ＡＭ
Ｐの上昇がともなう［ラブリー、ガグネおよびレフェベ
レ、［ライフ、サイエンシーズＪ（Ｌ　ｉｒｅ　　Ｓ　
ｃｉｅｎｃｅｓ）、３３巻、２２２９〜２２２３頁（１
９８３年）コシたがってＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の生
物学的有効性は、アデニル酸シクラーゼの活性化能力、
下垂体細胞との特異的結合および下垂体細胞からのＧＲ
Ｆ放出刺激能力により示された。

アデニル酸シクラーゼ酵素活性化アッセイＧＲＦによる
アデニル酸シクラーゼ活性化をアッセイするために、ウ
シの下垂体を選んだ。下垂体膜を凍結乾燥し、確立した
方法［アルパレスおよびブルーノ、「プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・
アメリカＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ　）、７４巻、９２−９５頁（１９７７年
）］にしたがい酵素活性のアッセイを行なった。ＨｕＧ
ＲＦ　Ｌｅｕ２７のＥＣ５゜は２マイクロモルであった
。応答曲線の形およびモルホテンシーは本来のＨｕＧ　
ＲＰ　−ＮＨｌの場合と同様であった。組換えＤＮＡ技
術により生産されたペプチドは明確な生物活性を有して
いるという結論に達した。

結合アッセイ 下垂体細胞にたいするＧＲＦの特異的結合を次のように
して測定した。

ＧＨ３ラット下垂体腫瘍細胞、成長セルライン［ゴスボ
ダロビッシ博士（カルフォルニア大学、サンフランシス
コ）から入手］をダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の最
少必須培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ）中において成長させた。

合成Ｈｕ　Ｇ　ＲＦ　　Ｎ　Ｈｔをペニンスラ・ラボラ
トリーズ（サンカルロス、カルフォルニア）から購入し
、エンザイモビーズ（Ｅ　ｎｚｙｍｏｂｅａｄｓ。

バイオラド社）を用いてＮａ　［’″５１］により放射
能標識を２００００ｃｐｍ／ｎｇ蛋白質の特異的活性に
対して行なった。０１１％のウシ血清アルブミンを含有
し、２０ミリモルのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）を用いたＤＭ
ＥＭ緩衝液（ｐＨ７，４）（ＤＭＥＭ−ＢＳＡ）により
洗浄した２４ウエルのコスタ−（Ｃｏｓｔａ’ｒ））レ
イにおいて細胞を全面成長させた。細胞を４℃で１時間
最終容積２５０　μｍ２　ｃ）ＤＭＥＭ−ＢＳＡＳ項中
する濃度の組み換えＧＲＦ類縁体の非存在下または存在
下に２Ｘ１０−’モル［１″’Ｉ］−ＨｕＧＲＦ（１−
４４）とインキエベートした。

細胞をＤＭＥＭ−ＢＳＡにより３回洗浄し、０゜ｌＮ−
ＮａＯＨにより溶解させ、細胞と結合した放射能をガン
マカウンターで測定した。非特異結合を１Ｏ−７モルの
合成Ｈｕ　Ｇ　ＲＦ　　Ｎ　Ｈｔの存在下測定したが特
異的結合の１５％を越えていなかった。

独立した実験において、Ｇ　Ｈ３細胞がＨｕＧＲＦ−Ｎ
Ｈ，に対する特異的受容体を有することが確認された。

結合は飽和可能であり、可逆的であった。このデータの
スカッチャード（Ｓ　ｃａｔｃｈａｒｄ）分析は、約１
．０ｘｌＯ”Ｍ−１のＧＲＦ’−（１−４４）に対する
明白なＫｄを示す細胞１個当たり約２００００個の結合
部位の存在を示した。

組換え−ひとおよびぶたＧ　ＲＦは、その受容体結合能
力に関して合成ひとＧＲＦ（２〜３倍低い親和力）とほ
とんど同等であった。

成長ホルモン分泌アッセイ ＧｎＦの下垂体細胞からの成長ホルモン放出の刺激能力
についてもアッセイを行なった。正常なラットの前部下
垂体細胞を次のように１次培養物中に確立させた。雄の
成体スプラーグ・ドーリ−（Ｓ　ｐｒａｑｇｕｅ　−Ｄ
　ａｗｌｅｙ）ラットを断頭により殺した。

下垂体前葉を切開し。１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭに置き、
１ＩＩＩＩＩＩ片に切り刻んだ。ＤＭＥＭ−ＢＳＡによ
り数回洗浄後、組織を３７℃で３５分間穏やかに振盪し
ながら０．２単位のトリプシン／ｍＱおよび１１１９／
　ｍＱ（Ｄ　Ｎ　Ａ　ａｓｅ、デオキシリボヌクレアー
ゼ）／＋＋＋（ｌとインキュベートした。次いで組織片
をさらにパスツールピペットを用いて物理的シャーリン
グにより分散させた。大きな断片を沈澱させて除去した
。次いで上清中の細胞を沈澱させ、洗浄し、実験前に４
日間ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で組織培養にかけた。生
存能力のある細胞の平均収量はｌ下垂体当たり約２Ｘ１
０’細胞であった。

細胞を２４ウ工ル皿に置き、３７℃で３時間ＧＲＦまた
はアナログ類とインキュベートした。

培地中のＧＨａ度をエヌアイエッチ・ピチュイタリー・
エージエンシーから得た試薬を用いて固相ＲＩＡにより
測定した。９６ウエルのポリビニルクロリドプレートを
一夜４℃で燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．Ｉ巧／ｍ
（ｌの濃度でウサギ抗−モンキー■ｇ抗体［ベル・フリ
ーズ（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚｅ）　］により被覆した。プ
レートに少なくとも１時間３７℃でＰＢＳ中３％ＢＳＡ
溶液によりカウンターコーティングを行なった。プレー
トを洗浄し、２時間またはそれ以上の間３７℃でモンキ
ー抗うットＧＨ抗血清（１／１００００の最終希釈率）
とインキュベートした。ＰＢＳ−０，１％ＢＳＡにより
数回洗浄後、非標識ＧＨまたは細胞調整培地の希釈液の
存在または非存在下にプレートを２０　ｎｇ／ｍＱの［
′！Ｊ］　　ＧＨと３７℃で２時間インキュベートした
。数回洗浄後、プレートを乾燥し、個々のウェルを切断
し、ガンマカウンターで数えた。

組換えひとおよびぶたＧＲＦは、ＧＨ放出誘導について
合成ひとＧＲＦと等力で等しい効果を示すと思われた。

実施例７ ｐＴｒｐＬＥ−ＰＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）の構成および用
途 実施例２〜３に記載のものと類似のアプローチおよび方
法を用いて、ｐＴｒｐＬＥ−＃１４ベクターの単−Ｂｓ
５Ｈ１１部位または単一５ｓｔ１１部位がＴｒｐＬＥ蛋
白質およびＰＧＲＦのＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７類縁体間
の融合蛋白質をコードするのに用いられているプラスミ
ドを組み立てた。これはＨｕＧＲＦＤＮＡセグメント内
の５ａｉｌ部位およびターミネータ−ＤＮＡセグメント
の近位末端のＢａｎ＋Ｈ１部位間に位置するＨｕＧＲＦ
をコードする合成りＮＡのその部分をＰＧＲＦをコード
する合成りＮＡと置き換えることにより行なわれた。Ｈ
ｕＧＲＦ合成りＮＡのＰＣＩ’ｔＦ合成りＮＡとの置換
は初めにＨｕＧＲＦ遺伝子内の５ａｌ１部位およびその
末端をちょうど越えたところのＢａｍＨ１部位が共に単
一であるプラスミドｐｐ　Ｓ　ｅ　８をつくることによ
り容易となった。

ベクタープラスミドｐｐ　Ｓ　＃　８の作成プラスミド
ｐＴｒｐＥ−＃２２のＢａｍＨＩ部位はＴｒｐＬＥ遺伝
子から最も離れたところに位置しているが、これをまず
Ｂａｏ＋ＨＩおよび５ａｌｌによりプラスミドを消化し
、ＤＮＡをＥｔＯＨ沈澱に付し、そして混合物をＴ４リ
ガーゼで処理することにより除去した。（ＢａｍＨＴは
ターミネータ−ＤＮＡセグメントの各末端で切断し、そ
して５ａｉｌはｐＢＲ３２２ＤＮＡ領域内およびターミ
ネータ−内でＨｉｎｄＩ１１部位に非常に近いところを
切断する。）ライゲーション生成物をＳ　ｐｈ　Ｉ　（
これはｐＢＲ３２２ＤＮＡ領域内て切断する）で処理し
、受容力のあるＨｂｌＯ１細胞に形質転換した。生成し
たプラスミドの！っであるｐＶＶΔＨｉｎΔＳａｌ＃１
５は単一のＢａｍＨＩおよび５ａｌ１部位が両側に位置
したｐＴｒｐＥ−１＃２２の転写ターミネータ−領域由
来の０．３３ｋｂのＢａｍＨＩ　−５ａｌ　Ｉ断片を含
むことが示された。この断片はｐＴ　ｒｐＥ−＃２２と
比べた場合ｐＶＶΔＨｉｎΔＳａｌ＃　１５において反
対の方向であったが、両方向に有効に機能する。

次１：ｐＶＶΔＨｉｎΔＳａｌ＃１５の５ａｉｌ部位を
、ベクターのｐＢＲ３２２部分の５ａｌＩおよびＰｖｕ
部位間のＤＮＡを欠失することにより除去した。

これは５ａｌｌおよびＰｖｕ■によりｐＶＶδＨｉｎδ
Ｓａｌ＃１５を消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ
断片とインキュベーションして５ａｌＩ末端を充填する
ことにより達成された。次いで生成したＤＮＡを５ａｌ
ｔにより開裂し、Ｈｂ１０１細胞に形質転換した。生成
したプラスミド、ｐｐ　Ｓ　＃　３は予想通りの欠失を
含み、５ａｉｌ部位を欠いていた。記載された手順によ
り５ａｉｌ部位の再生が予測されるため、ｐＰ　Ｓ　＃
　３において５ａｉｌ部位が欠けた場合、５ａｌｌ−開
裂線状ＤＮＡと比較して５ａｉｌ部位を欠く環状ＤＮＡ
の形質転換効率が高くなるｔ・のと思われろ。

次に、ＴｒｐＬＥ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７をコード
する１、３５ｋｂのＢｃｏＲＩ　＝ＢａｍＨ１断片をｐ
ＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨ［［−ＨｕＧＲＦ＃５から切除し
、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨｒにより開裂されたｐＰＳ
＃３ＤＮＡとライゲートした。ライゲーション混合物を
ＢｓｔＸＩ（これは最終構造において所望されていない
ｐＰＳ＃３ＤＮＡ断片のみを開裂する）により処理し、
受容力のあるＨｂ１０１細胞に形質転換した。生成した
プラスミド、ｐＰＳ＃８は、ＴｒｐＬＥ−ＨｕＧＲＦ蛋
白質をコードする遺伝子、その５ａｉｌ部位、次に転写
ターミネータ−ＤＮＡセグメント、再び５ａｉｌ部位、
続いて単一のＢａｍＨ１部位、次いで５ａｉｌ部位をも
たない転写ターミネータ−ＤＮＡセグメントを含む。

ＰＧＲＦをコードする合成りＮＡの挿入ＰＧＲＦとＨｕ
ＧＲＦに相違をもたらす３箇所のアミノ酸置換部分はす
べてｐＰ　Ｓ　＃　８のＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７遺伝
子配列の５ａｉｌ部位を越えたところにある。ｐＰ　Ｓ
　＃　８のＢａｍＨ１部位の上方の配列は機能的転写タ
ーミネータ−を含むため、ＰＧＲＦ’をコードする合成
りＮＡはｐＰ　Ｓ　＃　８のこれら２つの部位間のＤＮ
Ａと置換するために用いられた。６個のオリゴヌクレオ
チドを合成し、ライゲートし、５ａｉｌおよびＢａｍＨ
Ｉにより開裂し、そして下記に示す５４　ｂｐのオリゴ
ヌクレオチドを５％ポリアクリルアミドゲルから単離し
た。

この５４ｂｐ断片を予めＳａｌ！およびＢａｍＨｒによ
り開裂されたｐｐ　Ｓ　＃　８とライゲートし、生成し
たクローンを合成ＰＧＲＦ　　ＤＮＡに組み入れられる
べき単一のＸｂａ［部位の存在についてスクリーンした
。こうしてプラスミドｐＴ　ｒｐＬ　Ｅ・Ｂｓ５ＨＩｒ
−ＰＧＲＦ＃　Ｉ　Ｏを同定し、ＤＮＡ配列の実験的確
認を行なった。

ｐｐ　Ｓ　＃　８と類似のベクター（ただしＴｒｐＬＥ
の５ａｃｕ部位に融合したＨｕＧＲＦ遺伝子を含む）に
よる同様のアプローチにより、プラスミドｐＴｒｐＬＥ
−ＳａｃＵ−ＰＧＲＦを作成した。

ＰＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）の精製および生物学的活性実施
例４−６に記載した手順を用いて、ＴｒｐＬＥ−ＰＧＲ
Ｆ　　Ｌｅｕ２７融合蛋白質をコードするプラスミドを
含むエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞（菌株
Ｗ３１１０原栄養株、ＡＴＣＣ第２７３２５号）を成長
させ、融合蛋白質の発現を誘導し、ＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７をＣＮＢｒ処理により放出させて精製した。最終生
成物の純度および生物学的活性はＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２
７について記載したものに匹敵し得るしのであった。

実施例８ ｐＴｒｐＬＥ−ＢＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）ベクターの作成
および用途 既に概略を示したアプローチにしたがい、プラスミドｐ
ｐ　Ｓ　＃　８のＨｕＧＲＦ部分のカルボキシ末端コー
ド領域をＢＧＲＦのＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７類縁体をコ
ードするように部分改変した。ＢＧＲＦとＨｕＧＲＦ　
　Ｌｅｕ２７に相違をもたらす５個のアミノ酸相違部分
がすべてプラスミドｐｐ　Ｓ　＃８のＨｕＧＲＦ　　Ｌ
ｅｕ２７コード領域のＨｉｎｄＩ［［部位の上方に存在
するため、８個のオリゴヌクレオチドはＢＧＲＦアミノ
酸配列音配列ドし、ＨｉｎｄｌおよびＢａｍＨＩ間のＤ
−Ａ断片を置換するために用いられた。これらのオリゴ
ヌクレオチドを合成し、ライゲートし、そしてｐｕｃｓ
にクローンした後、ＨｉｎｄｌｎおよびＢａｏ＋ＨＩに
より開裂すると下記７５ｂｐＤ　Ｎ　Ａフラグメントが
産生された。

次にこのフラグメントをＨｉｎｄｌｌ［およびＢａｍＨ
［で開裂したプラスミドｐＰ　Ｓ　＃　８にライゲート
すると、所望のプラスミドｐＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ
−ＢＧＲＰ　Ｌｅｕ２？　＃　ｌ　５が生成された。

実施例４〜６に記載した方法を用いてプラスミドｐＴｒ
ｐＬＥ　６　Ｂｓ５ＨＩ［−ＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７　
　＃　ｌ　５を含むエシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌＤ
大腸菌細胞（菌株Ｗ３１１０原栄養体、ＡＴＣＣ第２７
３２５号）を成長させ、融合蛋白質を発現させ、ＣＮＢ
ｒ開裂により放出されたＢＧＲＦ　Ｌｅｕ２７を精製し
、そして生物活性を試験した。結果はＨｕＧＲＦ　Ｌｅ
ｕ２７およびＰ′Ｇ　ＲＦ　　Ｌｅｕ２７に匹敵し得る
活性を示していた。

実施例９ 処方 約１〜５ｕｇ／ａ＆の濃度でＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７
、ＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７またはＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２
７を生理食塩水に溶解またはけん渇する。所望により他
の医薬上許容される賦形剤を加え得る。生成した溶液２
ｍｇを１日１〜４回筋肉内または皮下注射により投与す
る、一般的な哺乳類に対する用ｍは１日に体重ＩＫｇ当
たり約０．１〜０．５μｇである。

別法として、ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７、ＢＧＲＦ’Ｌ
ｅｕ２７またはＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７を生理食塩水に
溶解またはけん濁し、溶液またはけん濁液を連続投与用
制御放出装置に設置し得る。一般的な連続放出速度は１
時間に体重ＩＫｇ当たり約１〜約５μｇである。

実施例１０ ３種のオープンリーディングフレームベクターの作成 ＴｒｐＬＥ蛋白質との融合として任意のオープンリーデ
ィングフレームの発現に適した３種のベクターからなる
セットを作成するために、Ｂａｎ＋ＨＩ認識配列ＧＧＡ
ＴＣＣをコードするオリゴヌクレオチドをＴｒｐＬＥコ
ード遺伝子に関連した３個の可能な翻訳リーディングフ
レームの各々においてＴｒｐＬＥ遺伝子の単−Ｂｓ５Ｈ
１１部位の近くに挿入した。

これらのオリゴヌクレオチドのライゲーションに必要な
基質をもたらすために、プラスミドｐＰＳ＃８ＤＮＡ（
２μ９）（実施例７参照）を５０℃で１時間４単位の制
限エンドヌクレアーゼｌ３ｓｓＨＩＩにより開裂した。

、フェノールで抽出し、ＤＮＡエタノール沈澱に付すこ
とにより反応を終結させた。

Ｂｓ５ｌ−ＩＩＩ−生成５′突出部分を満たすためにＤ
ＮＡを４０ミリモルのＫＨＰＯ，（ｐＨ７，５）、６，
６ミリモルのＭｇＣ（ｂ、１．０　ミリモルの２−メル
カプトエタノール、４個のデオキシヌクレオチドの各々
２５０マイクロモルを含む２０μｇの緩衝液に再懸濁し
た。１単位のフレノウフラグメント（大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼ大フラグメント）を加え、混合物を１５分間室
温でインキュベートした。

３種のリーディングフレームベクターを作成するために
、平滑末端Ｂｓ５ＨＩ［−開裂ｐＰ　Ｓ　＃　８　ＤＮ
Ａを３反応に分割した。各反応は、０．５μ２のライゲ
ーション緩衝液［５０ミリモルのトリスＨＣｉ２（ｐＨ
７，８）、ｌＯミリモルのＭｇＣＱｔ、２０ミリモルの
ジチオトレイトール］中ＤＮＡ、１００マイクロモルの
ＡＴＰ、２単位のＴ４リガーゼおよび１００倍過剰の３
つの合成りａｍＨＩリンカ−（ＣＧＧＡＹＣＣＧｌＣＣ
ＧＧＡＴＣＣＧＧまたはＣＣＣＧＧＴＣＣＧＧＧ）のう
ち１つを含むものであった。１２℃で一夜インキュベー
ト後、反応混合物を１５０ミリモルのＮａＣＱ、６ミリ
モルのトリスＨＣｌ２（ＰＨ７，９）および６ミリモル
のＭｇＣ（ｂと合わせ、１単位のＢａ５ＨＩで処理した
。３７℃で１時間インキュベートした後、フェノール抽
出により反応を終結した。エタノール沈澱により各反応
からＤＮＡを回収した。沈澱したＤＮＡの各々をｌＯμ
ｇのライゲーション緩衝液に再懸濁し、１単位のＴ４リ
ガーゼで処゛理した。次いでライゲーション混合物を用
いて受容能力のある大腸菌Ｈｂｌ　０１細胞を形質転換
した。ＢａｍＨＩ部位がＴｒｐＬＥのＢｓ５ＨＩ［部位
（ＧＣＧＣＧＣ）およびターミネータ−ＤＮＡセグメン
ト間に存在する新しく生成した（子孫）クローンを、ｐ
ＳＢ８、ｐＳＢｌｏおよびｐＳＢ１２と命名した。ヌク
レオチド配列からこれら３′Ｂ、のベクターは下式によ
り適当なりａＩＩＩＨＩリンカ−を含むことが立証され
た。

Ｂａｌ１ｌ　１ ｐＳＢ８　−−−−ＣＴＧ　ＣＧＣＧＣＧ　ＧＡＴ　Ｃ
ＣＧ　ＴＣＧ　−−−一−−−−−−Ｌｅｕ　Ａｒｇ　
Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　−−−−−−ａｍＨ
Ｉ ｐＳＢｌｏ　　−−−−ＣＴＧ　ＣＧＣＧＣＣＧＧＡ　
ＴＣＣＧＴＣ−−−−−−−−−−Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　−−−−−−ａｍＨＩ ｐＳＢ１２　−−−−ＣＴＧ　ＣＧＣＧＣＣＣＧＧ　Ａ
ＴＣＣＧＴ　−−−−−−−−−−Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａ
ｌａ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　−−−−−一実施例１
１ ＡＩＤＳについてのゲノムライブラリーの作成ＴｒｐＬ
Ｅ蛋白質と融合したＡＩＤＳウィルスのオープンリーデ
ィングフレームを発現することができるクローンのライ
ブラリーの作成は、３つのオープンリーディングフレー
ムベクター、ｐＳＢ８、Ｉ）ＳＲＩＯおよびｐＳＢ１２
のＢａｍＨ１部位にＡＩＤＳ　ＤＮＡの部分的５ａｕ３
Ａ消化物をライゲーションすることにより達成された。

ＡＩＤＳＤＮＡの部分的５ａｕ３Ａ消化物を用いろこと
により、１個またはそれ以上の５ａｕ３Ａ部位により中
断され得ろ大きなオープンリーディングフレームが（中
断されず）そのままの状態を呈する機会が増す。

プラスミドｐＢｅｎｎ＃　２０　（１０ｕ９）を、３７
℃で９０分間ＢａｍＨＩに適した緩衝条件を用いて制限
酵素ＢａｍＨＩおよび５ｓｔｌ（各々１０単位）により
二重消化した。生成したＤＮＡフラグメントを０．７％
調製用アガロースゲル上で分離させた。

ＡＩＤＳウィルスゲノムの５分の４を含む８Ｋｂフラグ
メントがアガロースゲルから溶離し、これをエタノール
沈澱により濃縮した。再懸濁したＤＮＡ［５０ミリモル
のＮａＣ（７，６ミリモルのトリスＨ（Ｊ！（ｐＨ７，
５）および５ミリモルのＭ　ｇ　ＣＱ　ｔを含む緩衝液
中］を３反応に分割し、各々室温で１５分間０．１また
は０．Ｏ１単位の５ａｕ３Ａで消化した。フェノール抽
出により反応を終結した後、５ａｕ３Ａの消化程度をア
ガロースゲル上の開裂生成物を分析することによりモニ
ターした。０．１単位の５ａｕ３Ａで処理したＤＮＡ試
料は適度の部分消化状態を示し、後続の３種のオープン
リーディングフレームベクターとのライゲーションのた
めに選ばれた。約２００ｎｇの部分的５ａｕ３Ａ消化Ｄ
ＮＡは、予め３０μＱのライゲーション緩衝液中Ｂａｍ
ＨＩおよびアルカリホスファターゼで処理しておいた３
種のベクター各々１１００ｎと混合した。

反応の各々にｌ単位のＴ４リガーゼを加え、混合物を６
時間１２℃でインキュベートした。次いで３つのライゲ
ージジン反応の各々からライゲートされたＤＮＡを別々
に受容能力のあるエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ
））Ｈｂｌ　Ｏ１細胞に形質転換させた。

最初の形質転換から全部で約４００のクローンが得られ
た。これらのクローンの８０％以上が、ｐＢｅｎｎ＃２
０のフラグメントに対する陽性ハイブリダイゼーシジン
により明らかなように、ＡＩＤＳウィルスＤＮＡインサ
ートを含んでいた。さらにＡＩＤＳ患者から得られた抗
ＡＩＤＳウィルス血清と免疫反応性のある新規蛋白質分
子を産生ずる能力について新しく生成した（子孫）クロ
ーンをスクリーンした（第１２図）。幾つかのクローン
についてヌクレオチド配列決定を行ない、各々のベクタ
ー・インサート接合における配列を測定した。

その結果から（第１表、第１１図）、陽性クローンがＬ
Ｅ担体蛋白質の転写および翻訳に関して正しい方法およ
び正しいリーディングフレームに挿入されたＡＩＤＳウ
ィルスフラグメントを含むことが立証された。さらに、
基準として公表されたＡＩＤＳウィルスＤＮＡ配列を用
いて、Ａ４ＤＳウィルスゲノム内のインサートの起点お
よび境界を明らかにした。［ウニイン・ホブソン等、「
セルＪ（Ｃｅ１１）、４０巻、９−１７頁（１９８５年
）、サンチェ・ペスカドール等、「サイエンスＪ（Ｓ　
ｃｉｅｎｃｅ）、２２７巻、４８４−４９２頁（１９８
５年）、ラトナー等、「ネイチャーＪ（Ｎａｔｕｒｅ）
、３１３巻、２７７−２８４頁（１９８５年）、ミュー
シング等、［ネイチャーＪ（Ｎａｔｕｒｅ）、３１３巻
、４５０−４５８頁（１９８５年）］。

実施例１２ 他の特異的ＡＩＤＳウィルスクローンの作成任意の５ａ
ｕ３Ａフラグメントを３つのオープンリーディングフレ
ームベクターに挿入することに基づく前記のＡＩＤＳゲ
ノムライブラリー以外にさらに特異的ＤＮＡフラグメン
トを含む２種のクローンを作成した（第１表、第１１図
）。

１つめの特異的クローンは、単一のＢｓ５Ｈｎ部位（Ｇ
ＣＧＣＧＣ）に対して遠位のヌクレオチド配列が下記の
ようにオリゴヌクレオチドを導入することにより修飾さ
れたｐＴｒｐＬＥ−ＬＥ由来のベクター（ｐＴｒｐＬＥ
−ＫＡＬと称す）を用いて作成された。

（以前からの） ＢｓｓＨＩＩ　　　　　　　　　　　Ｋｐｎ　Ｉ　　Ｂ
ａ５ｆｌ　ＩＣＴＧ　ＣＧＣＧＡＴ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　
ＧＡＴ　ＡＡＧ　ＧＴＡ　ＣＣＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧＡｓ
ｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ導入されたアダプ
ターは、ＫｐｎＩおよびＢａｍＩ−ＩＩの両方に対する
開裂部位を含み、またペンタペプチドＡ　ｓｐ　−Ａ　
ｇｐ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｐ　−Ｌ　ｙｓ、エンドペ
プチダーゼエンテロキナーゼにより特異的に認識される
ペプチジル連鎖をコードするものである。

標準的実験方法を用いて、プラスミドｐＢｅｎｎ＃２０
の２　、１５　Ｋｂ　Ｋｐｎ　Ｉ−ＢａｍＨフラグメン
トでＥＮＶ遺伝子の大部分に及ぶフラグメントを同じ２
ｔＩの制限部位によりプラスミドｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ
へ転移させた。生成したプラスミド（ｐＴ　ｒｐＬＥ−
ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃　ｌ　Ｏ）は導入後直ちに抗ＡＩＤ
ＳＩｆＩＬ清と強反応性のＳＤＳゲル上に再生可能な蛋
白質生成物のパターンをもたらした（第１２図）。　も
う１つの特異的クローンは、ＡＩＤＳウィルスのＧＡＧ
遺伝子内でＰｖｕＩＩおよびＢｇＱＵ部位間に９５０塩
基対のフラグメントを含むように作成された。このクロ
ーンを作成するために、ＧＡＧオープンリーディングフ
レームの中央領域のコード遺伝子を含む１．ＩＫｂＳａ
ｕ３Ａフラグメントを精製し、ｐＳＢ８の単一のＢａｍ
Ｈ１部位にクローンした。我々はＬＥ蛋白質に関して「
誤った」翻訳リーディングフレームに５ａｕ３Ａフラグ
メントを挿入するためにこの特定のベクターを選んで用
いることにした。我々の以前の経験では、このフラグメ
ントの「正しい」リーディングフレームでの挿入を試み
ても正しい翻訳はされないことが示されていた。Ｉ）Ｓ
Ｂの「誤った」リーディングフレームを用いろことによ
り、所望のインサーンヨンを含む多くの形質転換体が得
られた。これらをｐｓＩ３Ｂ−ＧＡＧｌ、１と命名した
。正しい翻訳リーディングフレームを再生するために、
ｐＳＢ８−ＧＡＧｌ、ｌＤＮＡを５ｓｔＩＩ（ＬＥ内）
およびＰｖｕ（Ｓａｕ３Ａフラグメント中約１３０　ｂ
ｐ）により開裂した。次いで前記ＤＮＡポリメラーゼＩ
を用いて５ｓｔＵ部位の３′突出部を除去し、モしてＴ
４リガーゼを用いて２つの平滑末端を再環状化した。導
入後直ちに、新しく生成した形質転換体の１つ、ｐＳＢ
−Ｇａｇ−＃２５は抗ＡＩＤＳ血清と免疫反応性のある
多重ポリペプチドを産生じた（第１２図）。

実施例１３ ＬＥ−ＡＩＤＳ融合蛋白質によるＡＩＤＳ患者血清の分
析 ウェスタンブロッティング分析を用いてＡＩＤＳ患者の
血清の抗体検出に大腸菌で生産された種々の組換えウィ
ルス蛋白質が有用であることを立証した。血清試料は、
任意の健康な血液提供者、ＡＩＤＳにかかる危険性の高
い人およびリンパ節症ＡＲＣ９またはＡＩＤＳの患者か
ら得られた。

陰性対照としてのエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ
）ｐＳＢ８ベクターのみの抽出物および陽性対照として
のＡＩＤＳ感染ひと白血球の抽出物を電気泳動させ、各
血清のアッセイに含ませた。第１３図は１９個の血清試
料から得られた代表的データを示したものである。

陽性試験結果およびＡＩＤＳｌＡＲＣＳ、およびＬＡＶ
感染間の強い相関関係が立証された。

ＡＩＤＳウィルスおよび／またはＥＮＶクローンに対す
る抗体について陽性の被験血清の１サブセツトのみがＧ
ＡＧクローン（ｐＳＢ、８−＃４５、ｐＳＢ−Ｇａｇ−
＃２５およびｐＳＢ１２−＃３１）またはＰＯＬクロー
ン（ｐＳＢ１２−＃６７、ｐＳＢＩ２−＃６８およびｐ
ＳＢ１２−＃３３）と反応した。

ウェスタンプロット分析は、次のようにして行なわれた
。大腸菌抽出物またはＡＩＤＳウィルス感染細胞抽出物
（０、４ｆｆｉ？）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル（
幅２０ｃｘｘ高さ１４ｃＪＩＸＯ，１５ＱＩ）に適用し
、ラエメリの方法［「ネイチャーＪ（Ｎａｔｕｒｅ）、
２７７巻、６８０頁（１９７０年）コにしたがい電気泳
動した。プルネット記載の方法［［アナリティカル・バ
イオケミストリーＪ（Ａ　ｎａ！、　Ｂ　１ｏｃｈ、　
）、１１２巻、１９５−２０３頁（１９８１年）］によ
りウェスタンプロットトランスファーを行なった。

ついでプロツトされたニトロセルロース（シュライヒエ
ルおよびシュエル、ＢＡ８３．０．２μ度孔サイズ）フ
ィルターを、初めは５％脂肪粉乳を含むＴＮ緩衝液（１
０ミリモルのトリス）［Ｃｅ５ｐｌ−１７，４、および
１５５ミリモルのＮａＣｅ）により４２℃で３０分間、
続いて１％ＢＳＡを含むＴＮ−ＴＮｔｉＩｉ衝液（１０
ミリモルのトリス−１（Ｃｅ、Ｐｌ（７，４，１５５ミ
リモルのＮａＣＱ、０．３％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）
　−２０，０，０５％のノニテヅト（Ｎｏｎｉｄｅｔ）
Ｐ　−４０）により室温で１０分間ブロックした。次い
でニトロセルロースフィルターを幅１７４インチのスト
リップに縦に薄く切った。血清試料は、健康な血液提供
者、「危険性の高い」グループの者またはリンパ節症Ａ
ＲＣもしは＜ＡＩＤＳ患者のいずれかから得られた。各
提供者からの血清をＴＮ−ＴＮ−３％ＢＳＡ中１０００
倍に希釈し、８ｘＱを多槽式プラスチックインキュベー
ショントレイのそれぞれ別のチャンバに加えた。様々な
エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）クローンまたは
Ａ’ｌＤＳウィルス感染細胞から得られた蛋白質抽出物
を含むニトロセルロースストリップのセットを各チャン
バに入れた。絶えず振りながら４℃で一夜インキュベー
ションを行なった。血清を除去後直ちに、ストリップを
２５ｉ１２ＴＮ−ＴＮ緩衝液で２回（それぞれ５分間）
および２５ｙｔＱＴＮ−ＴＮ緩衝液（ＮＰ−４０を除＜
ＴＮ−ＴＮ）で２回洗浄した。次いでフィルターを８ｘ
Ｑの希釈した放射能標識された蛋白質（ＴＧＮ−Ｔ−３
％Ｂ５Ａ２０００００　ｄｐｍ／ｉ＋ｆｆの［”’Ｉコ
蛋白質Ａ）とインキュベートした。絶えず振盪しながら
少なくとも４５分間室温でインキュベーションを行なっ
た、次いでストリップを２５ＲＱのＴＮ−ＴＮおよびｌ
ＯミリモルのＥＤＴＡＩ衝液で３回、続いて２５畦のＴ
Ｎ緩衝液で１回洗浄（それぞれ５分洗浄）した。

次いで洗浄されたニトロセルロースストリップを風乾し
、Ｘ線フィルムにさらした。

実施例１４ ＬＥ−ＥＮＶおよびＬＥ−ＧＡＧの発現５０μｙ／ｘ（
ｌのアンピシリンおよび１００μ９／１１Ｑのトリプト
ファンを含む５０１１１２のＬＢ培養培地のターター培
養に、ｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃１０またはｐ
ＳＢ８−Ｇａｇ−＃２５のプラスミドを含む大腸菌細胞
を接種した。培養物を一夜生育し、超音波処理し、遠心
分離し、ＣＮＢｒ開裂し、モしてＨＯＡｃで抽出し、そ
して透析した（前記実施例４記載と同様）゛。

実施例１５ ＣＮＢｒ開裂されたＥＮＶＮジペプチド類疫反応性 ウェスタンブロヅト分析法を用いて抗−ＡＩＤＳ抗体に
より様々なＣＮＢｒポリペプチドフラグメントの免疫反
応性を測定した。ＣＮＢｒ処理を行なった、または行な
っていない、ｐＴ　ｒｐＬ　Ｅ　−Ｋｉｔ、−ＥＮｖ−
ｓｌ　０またはｐＳＢ８−Ｇａｇ−＃２５を含む誘導培
養から得られた蛋白質試料を５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルに適用し、電気泳動させた。ＣＮＢｒで処理した
試料についてはプルおよびプルの方法［「メソッズ・イ
ン・エンサイモロジーＪ（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、）、９６
巻、２３９−２４５頁］を用い、処理しなかった試料に
ついてはラエメリの方法［「ネイチャーＪ（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、２７７巻、６８０頁（１９７０年）コを用いた。

実施例１３記載と同様にウェスタンプロットトランスフ
ァーを行なった。

ウェスタンプロット結果が示すところでは、ｐＳＢ８−
Ｇａｇ−＃２５により産生されたＬＥ−ＧＡＧ融合蛋白
質にＣＮＢｒ処理をすると、免疫反応性エピトープが完
全に破壊されたが、ｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃
　ｌ　ｏ＋、：より産生されたＬＥ−ＥＮＶ融合蛋白質
に同様な化学的処理をすると、強い免疫反応性を保有す
るペプチドかもたられた（第１４図）。事実、これらの
ペプチド類はインタクトな融合蛋白質より幾分強免疫的
に抗−ＡＩＤＳと反応すると思われる。

実施例１６ 高発現ＥＮＶクローンの作成 上記の結果は、重要な抗原領域に対するコード配列を保
有するＫａＱ−１０の欠失突然変異体が診断適用に役立
つことを示唆するものであった。たとえば膜結合領域を
コードする配列のような外来遺伝子配列を欠失すると、
更に高いレベルへ興味の対象の蛋白質を合成することが
できる子孫クローンがしばしばもたらされる。

この原理にしたがい、我々は次のような新しいプラスミ
ド（ｐＥＮＶ−８５４ΔＨＢと命名する）を作成した。

まずｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃　ｌ　Ｏの８５
４ｂｐのＢｇＱ　Ｉ　〜ＢａｍＨＩフラグメントをプラ
スミドＰＳＢ１２の単−Ｂａｍ８１部位にクローンして
プラスミドｐＳＢ１２−８５４を得た。さらにプラスミ
ドｐＳＢ１２−８５４ＤＮＡをＨｉｎｄｌＩ［およびＢ
ａｍＨＩにより開裂した。ついで５′突出部をフレノウ
フラグメントを用いて満たし、生成した平滑末端をＴ４
リガーゼにより再環状化することにより配列ＡＡＧＣＴ
ＧＡＴＣＣを生成した。

この方法により生産された翻訳終結コドン（ＴＧＡ）は
Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ　−Ｂ　ａｍＨＩ融合部位でＬＥ−ＥＮ
Ｖ融合蛋白質を終結させる。子孫形質転換体、ｐＳＢ１
２−８５４ΔＨＢはクーマジーブルーで染色されたＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルで観察されるように（第１５
Ａ図）、誘導後直ちに細胞蛋白質′全体の５％より多い
独立した３５Ｋｄのポリペプチドを産生じた。ｐＳＢ−
８５４ΔＨＢの大腸菌抽出物全体のウェスタンプロット
分析により３５Ｋｄの蛋白質が唯一の免疫反応性蛋白質
の本質であることが立証された（第１５Ｂ図）。

前述の方法にしたがい、３５Ｋｄ蛋白質をＣＮＢｒ開裂
に付した。ウェスタンプロット分析が示したところでは
、生成したポリペプチドフラグメントは抗ＡＩＤＳ抗体
、との優れた免疫反応性を保有していた。

実施例１７ ＣＮＢｒ−ＥＮＶペプチドフラグメントのＨＰＬＣ分画 実施例１６で得られたＣＮＢｒ−開裂フラグメントを、
２０％溶媒Ｂ（ＣＨ３ＣＮ＋Ｏ，Ｉ％ＣＦ。

Ｃ００Ｈ）で洗浄しておいたＣ１８シリカビーズ［ビダ
ック（Ｖｙｄａｃ）Ｔ　Ｐ　２０１、Ｎキーｔ’ツブ、
５マニクロモル］を詰めたｏ、４６Ｘ２５ｃｘＨＰＬＣ
カラムに適用した。溶媒Ａは０．１％ＣＦ　ｓ　ＣＯＯ
Ｈ水溶液であった。ペプチドフラグメントを３０分間に
わたり１　、５　ｚＱ１分の流速で溶媒Ｂの２０％〜４
０％の勾配、次いでさらに２０分間にわたり溶媒Ｂの４
０％〜８０％の勾配により溶離した。カラムフラクショ
ンを集め、ウェスタンプロットによりイムノアッセイを
行なった。注入後３４および４０分の間に溶離したフラ
クションは免疫反応性ＥＮＶフラグメントを含んでいた
（第１６Ａおよび１６Ｂ図）。

実施例１８ ＡＩＤＳ患者の血清を用いたウェスタンプロット ウェスタンプロット分析を用いて、患者の血清に存在す
る抗ＡＩＤＳ抗体の検出におけるＥＮＶ由来のＣＮＢｒ
ペプチドの有用性を立証した。結果が示すところでは、
１）ＴｒＰＬＢ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃１０、ｐＳＢ１２
−８５４およびＰＳＢ１２−８５４ΔＨＢから産生され
たＬＥ−ＥＮＶ融合蛋白質と同様に、５Ｂ１２−８５４
ΔＨＢｆ）ＣＮＢｒフラグメントはＡＩＤＳウィルス感
染の理想的な診断用マーカーとして有用であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、中間体ベクタープラスミドＰＴ　ｒｐＥ−＃
２２の構造を示す。 第２図は、発現ベクターｐＴｒｐＬＥ−＃１４の構造を
示す。 第３Ａおよび３Ｂ図は、それぞれプラスミドｐＴｒｐ−
５ｓｔｌＩ−ＨｕＧＲＰから産生されたｍＲＮＡをコー
ドすると予測されるＤＮＡおよびア番ノ酸配列を示す。 第４図は、ＴｒｐＬＥ−ＨＧＲＦ融合蛋白質を産生ずる
エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞からト■Ｇ
ＲＦＬｅｕ２７の精製を示す。 第５図は、エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞
からＴｒｐＬＥ、ＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩ［−ＨｕＧＲ
ＦＬｅｕ２７およびＴｒｐＬＥ−ＳｓｔＩＩ−ＨｕＧＲ
Ｆ　Ｌｅｕ２７蛋白質を高率で産生ずることを示すＳＤ
Ｓ蛋白質ゲルを描いたものである。 第６図は、ＣＮＢｒ開裂前の細胞溶解および遠心分離に
よるエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）からのＴｒ
ｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＰ　　Ｌｅｕ２７の精
製を示すＳＤＳ蛋白質ゲルを描いたものである。 第７ＡおよびＢ図は、それぞれＴｒｐＬＥ−９ａｔｎ−
ＧＲＦおよびＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩＧＲＦのＣＮＢ
ｒ処理により放出されたペプチドのＨＰＬＣ（高速液体
クロマトグラフィー）プロフィールを描いたものである
。第７Ｃ図は、第７Ｂ図のＨＰＬＣフラクションのアデ
ニル酸シクラーゼ活性を示す。 第８Ａおよび８Ｂ図は、それぞれ融合蛋白質のＣＮＢｒ
開裂およびＨＰＬＣ分画後の抗−ＨｕＧＲＦ抗血清を用
いたＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＧＲＦおよびＴｒｐＬ
Ｅ−９ａｔ■−ＧＲＦのウェスタンプロットを描いたも
のである。 第９Ａおよび９Ｂ図は、それぞれクーマシ−（（Ｃｏｏ
ｍａｓｓ　ｉｅ）・ブリリアント・ブルー・スティンに
よる染色ゲル、および抗−ＨｕＧＲＦ抗血清を用いたウ
ェスタンブロッティングを描いたものである。 第１０Ａ、ＩＯＢおよびｔＯＣ図は、それぞれ第９Ａ図
記載のロット１．２および３のＨＰＬＣのプロフィール
を描いたものである。 第１１図は、ウィルスの主なオープンリーディングフレ
ームに関連して記載した特異的クローンの位置を説明す
るＡＩＤＳウィルスゲノムの地図（ＧＡＧ、ＰＯＬＳＥ
ＮＶ、ＡおよびＢ）である。 第１２図は、３名のＡＩＤＳ患者から得た血清のプール
を用いたウェスタンブロッティング法により可視化され
たＴｒｐＬＥ−ＡＩＤＳ融合蛋白質およびＡＩＤＳウィ
ルス感染細胞（ＢＡＧ）の基準パターンを示す。 第１３Ａ−１３Ｉ図は、１９個のヒト血清試料のウェス
タンブロッティング分析から得られた結果を図示したも
のであり、そのうち第１３Ａ、１３Ｂ、１００図はＴｒ
ＰＬＥ−ＡＩＤＳ融合蛋白質ＧＡＧ、第１３Ｄ、１３Ｂ
％　１３Ｂ図は同じくＰＯＬ、第１３０図は同じ＜ＥＮ
Ｖ、第１３Ｉ］図はインサートの内ＴｒｐＬＥベクター
Ａ■Ｄｓウィルス感染細胞をプローブしたものである。 各パネル上の数字は、積極的に反応する血清試料の数を
示す。 第１４図は、ｐＳＢ８−Ｇａｇ−＃２５により生産きれ
たＣＮＢｒ処理したＬＥ−ＧＡＧ融合蛋白質とｐＴｒｐ
ＬＥ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃１０により生産されたＬＥ−
ＥＮＶ融合蛋白質の免疫反応性を比較したウェスタンプ
ロット結果を示す。 第１５Ａ図は、ＰＳＢ１２−８５４ΔＨＢにより生産さ
れた蛋白質を呈示する、クーマジ−（Ｃ。 ｏｓａｓｉｅ）ブルー染料で染色された５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルを示す。第１５Ｂ図は、３５Ｋｄ蛋白
質が唯一の免疫反応性蛋白質の本質であることを示す。 ｐＳＢ−８５４ΔＨＢの同じ大腸菌抽出物のウェスタン
プロット分析を描いたものである。　第１６Ａおよび１
６Ｂ図は、実施例１６で得られたＣＮＢｒ開裂フラグメ
ントのＨＰＬＣ分画およびウェスタンプロット分析を示
す。 なお、第５．６．８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１２．１３
Ａ−１３１，１４，１５Ａ、１５Ｂおよび１６Ｂ図は写
真の模写図である。 図１；１１の、゛コ゛ト１’＞：内、２．ｉこ変更な誉
予薔 ＾ＧＡ　ＧＡＴ　　ＣＴＣＧＡＣ＾６ＣＣＧＴ　ＡＴＴ
　　Ｇ＾Ａ　　ＣＴＧ　Ｇｉｎ　＾ＴＧ＾ｒ９　八ｓｇ
　　Ｌｅｕ　　＾ｓＯＳｅｒ　　Ａｒｑ　　［１ｅ　　
Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　ＭｅｔＳｌａ 壜　　　　　　　　　　蒼　　　　　　　　　　　畳Ｃ
ＡＴ　　ＣＴＧ　　ＡＴＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＴ　　Ｇ
ＡＴ　　ＣＴＣＧＣＣＣＧＴ　　８６丁　６ＡＴＨｉｓ
　　Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　υａｌ　　八ｓｐ
　　Ｌｅｕ　　ＡＬａ　　ハｒｇ　　＾５ｎ　＾５Ｇ）
２のｅ 鰺　　　　　　　　　　　　４　　　　　　　　　　　
　　　ＪＦＣＧＣＴＡＣＣＴＣＧＣＣＧＡＴ　　ＣＴＣ
ＡＣＣ＾＾＾　ＧＴＴ　　ＧＡＣＣＧＴ＾ｒｇ　　Ｔｙ
ｒ　　Ｖａｌ　　＾１ａ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｌｙｓ　　ｕａｌ　　Ａｓｐ　　＾ｒ９２５の 簀　　　　　　　　　　　　優　　　　　　　　　　　
　　優ＣＧＣ６ＴＡ　　ＧＴＣＧＧＣＧｉｎ　ＣＴＧ　
　ＣＧＴ　　ＣＡＣＧＡＴ　　ＧＴＴ　　ＧＡＣＡｒｇ
　　リａｌ　　リａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ
　　Ａｒｇ　　Ｈｉｓ　　Ａｓｐ　　Ｌｇｕ　　＾５０
骨　　　　　　　　　　　−着 ＾＾Ｔ　ＡＴＧ　　ＧＧＣＡＣＧ　　ＴＴ＾＾６ＣＧＧ
Ｔ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　＾＾＾ＧＴ＾＾ｓｎ　　Ｍａｔ　
　Ｇｌｙ　　ｒｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　
　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ憂　　　　５
ｓｔ　　［４４ ＧＡＡ　　ＧＧＴ　　Ｃ６丁　ＣＧＣＣＧＣＧＧＧ　　
ＡＴＧ　　ＧＴＣＣＡＴ　　ＡＴＧ　　ｒＡＣＧｌｕ　
　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　＾ｒｇ　　Ｇｌｙ　
　Ｍｅｔ　　（／ａｌ　　Ｈｉｓ　　Ｍｅｔ　　ＴＹＲ
憂　　　　　　　　　　　寧 八ＴＴ　　丁ＴＣ６ＴＡ　　ＣＴＧ　　６八＾　ＧＧＴ
　　ＴＣＡ　　ＣＴＧ　　ＧＡＣｒｌａ　　Ｐｈｅ　　
リａｌ　　Ｌａｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　
ヒａｕ　　八５゜ｌθｅ 斧　　　　　　　　　　４＃　　　　　　　　　　　　
ネＣＧ丁　八ＣＣＧＡＴ　　ＣＡＴ　　八＾＾　ＧＡＧ
　　ＣＴＧ　　ＴＣＴ　　Ｇ＾八へｒｇ　　Ｔｈｒ　　
Ａｓｏ　　Ｈｉｓ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｌａｕ　　
Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ４Ｉ　　　　　　　　　　　　　　憂
　　　　　　　　　　　　　　薔ＣＴ６　６ＣＡ　　Ｃ
ＧＣ＾丁Ｔ　丁ＧＣＡＣＣＣＣＣＧＧＣ八６ＣＬｅｕ　
Ａｌａ　Ａｒｇ　［Ｌｅ　Ｃｙｓ　ｒｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｙ　Ｓｅｒ費　　　　　　　　蒼　　　　　　　　オ
ＴＡＴ　　ＴＣＣＴＡＴ　　ＣＴＧ　　ＡＴＧ　　ＣＡ
ＣＣＴＣＧＴＣｒＣＴＴｙｒ　　Ｓｅｒ　　ｒｙｒ＋　
リａｌ　　門ｅｔ　　Ｈｉｓ　　Ｌａｕ　　υａｔ　　
５ｅＰｅｅ Ｊｌ　　　　　　　　　　井　　　　　　　　　　彎Ｇ
ＣＣＣＴＧ　　ＣＡＣＧＣＴ　　ＴＡＴ　　ＣＧＣＧＣ
Ｃ丁６Ｔ　＾丁ＧＰＬａ　　Ｌｅｕ　　ＨＬｓ　　Ａｌ
ａ　　Ｔｙｒ　　八ｒｑ　　Ａｌａ　　Ｃｙｓ　　門ｅ
ｔ５Ｇ 畳　　　　　　　　　　　４ｋ　　　　　　　　　　　
　　着ＣＧＣＧＣＴ　ＡＴＧ　　ＣＡ６　　ｒＴＡ　　
ＡＴＴ　　ＧＣＣＧＡＧ　　ＧＣＧ＾ｒ９　＾１ａ　　
門ｅｔ　　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ　　ｒｌａ　　＾Ｉａ　　
Ｇｌｕ　　八１ｄＧＣＴ　　ＧＡＴ　　ＧＣＴ　ＡＴＡ
　　ｒＴｃ　　ＡＣＴ　　ＡＡＣＴＣＴ　　ＴＡＣ＾Ｌ
Ａ　ＡＳＰ　ＡＬＡ　　［ＬＥ　ＰＨＥ　Ｔ）ＩＲＡＳ
Ｎ　ＳＦＪ４ＴＹＲ′図、’ｉｉｌのｉ’ｔ″：：内、
ｉ；こ７２史２０の ５Ｇ ’！Ｌ、） ａ ｅｅ ＳＬａ ４ｊａの ５ｌａ ５ａｒ＾ｌａ　Ｌｅｕυａｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ
　　Ｉｌｅ　Ａｌａ　　ｒｈｒ　！ａｌ　　Ｇｉｎ第４
図 訳趙吻）−１（１）ＧＲＦ、□２□ 図面の浄；！：１白Ｊメ：こ・ｚｉ更なし）第５図 図面の？’４１；ｔ：’！：’；σに変更なし１第７Ａ
図 ＋０　　　２０　　　３０　　　４０ 時間（勺 ｍ７８図 ＋０　２０　　３０　４０咽（勺 ＊７Ｃ図 ＋０　　　　２０　　　３０　　　４０ｇＦｒ間（９ｉ
） 図面の；°）〕♂ｉ：　ｊ　＋　ｆシ：：：　：ど変更
なし）第８Ａ口 図面のテ））ぞ１：′°″シ・°語′（更なし）第８Ｂ
図 嶋 ；し り（コ　（エノ　　　「−− 図面の？ｒ力ｉ、：’１　、：、嘗こ変更なし）第９Ｂ
図 １２３５１２３Ｓ１２３５ 図面の浄書（内含に変更なし） 第ＩＬＩＡ図 図面の浄Ｚ１（内胡ζ変更なし） 第１０８図 第＋ＵＣ図 図１“１１す１”Ｎ’；“：′、：“、Ｈ、：ｐ　ｊこ
ズ更なし）第１２図 図面の浄書（内容に変更なし） 館Ｉ３へ図　　　　　　　　　　　　　　　　　　第１
３１３図４１３Ｃ口 図面の浄書（内容に変更なし） ネ１３犯　　　　　　　　　第１３Ｅ回％１３Ｆ口 図面の浄書（内容に変更なし） ＃１３０図　　　　　　　　　　　　４１３Ｈ口茅１３
１図 第１４（２） 犀１５八図　　　　　第１５Ｂ図 （ゴ　　　エ 図面の浄：Ｊｌ（内容に変更なし） 第１６Ｂ口 ２　４　６　８　１０°ｊラ　１４１６　１８２０手続
補正書動式） 特許庁長官殿　　　昭和６１・年１１月２７０２　発明
の名称 融合蛋白質の製造法 ３、　補正をする者 二１シ件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国カリ７ｔルニア９４３０４、パー
口・アルド、ヒルビ１−・７ベ二、−３４０１番名称　
　シンテックス（ニー働ニス・エイ）インコーホレイテ
ッド （ほか１名） ４、代理人 ５、　補正命令の１１付　：　昭苓１Ｆ６１年１０月２
８日（５？！送日）７、補正の内容　：　別紙の通り、
（第５．６．８．９．１２−１５および１００図につい
ては、原図に基づいてできるだけ正確に手書きした図面
を提出致します、）

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. （１）融合蛋白質の発現を目的とする細菌性発現ベクタ
   ーであって、 ＴｒｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝子断片、 ＡＩＤＳウィルスＤＮＡ遺伝子配列、 所望により上記ＴｒｐＬＥ断片および上記異種ＤＮＡ配
   列間に３−フレームリンカーセグメント、および、 所望により上記ＴｒｐＬＥ断片および上記ＡＩＤＳウィ
   ルスＤＮＡ配列間に開裂可能なリンカー配列を含むベク
   ター。
2. （２）上記開裂可能なリンカーがＭｅｔ、Ａｓｐ−Ｐｒ
   ｏ、またはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを
   コードする特許請求の範囲第１項記載のベクター。
3. （３）上記ＡＩＤＳウィルスＤＮＡ配列がＥＮＶ遺伝子
   またはその一部分であり、好ましくはポリペプチドＫＡ
   Ｌ−１０をコードする。特許請求の範囲第１項記載のベ
   クター。
4. （４）ｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ、ｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ−
   ＥＮＶ−＃１０、ｐＳＢ１２−８５４またはｐＳＢ１２
   −８５４ΔＨＢである特許請求の範囲第３項記載のベク
   ター。
5. （５）融合蛋白質の発現を目的とする細菌性発現ベクタ
   ーの製造方法であって、 ＴｒｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝子を含むプラスミドを選択し、 制限エンドヌクレアーゼによりＴｒｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝
   子を開裂し、そして ＡＩＤＳウィルスＤＮＡ配列を挿入することからなる方
   法。
6. （６）さらに、上記ＡＩＤＳウィルス配列を挿入する前
   後に開裂可能なリンカー配列を挿入することを含む特許
   請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）上記開裂可能なリンカー配列がＭｅｔ、Ａｓｐ−
   ＰｒｏまたはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
   をコードする特許請求の範囲第６項記載の方法。
8. （８）融合蛋白質の発現を目的とする細菌性発現ベクタ
   ーの製造方法であって、 ＴｒｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝子を含むプラスミドを選択し、 制限エンドヌクレアーゼによりＴｒｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝
   子を開裂し、 ３フレームリンカーを挿入し、そして ３フレームリンカー内にＡＩＤＳウィルスＤＮＡ配列を
   挿入することからなる方法。
9. （９）上記ＡＩＤＳウィルスＤＮＡ配列がＫＡＬ−１０
   またはその一部分である、特許請求の範囲第８項記載の
   方法。
10. （１０）上記ＡＩＤＳウィルスＤＮＡ配列がＫＡＬ−Ａ
    、ＫＡＬ−Ｂ、ＫＡＬ−ＡもしくはＫＡＬ−Ｂの類縁体
    もしくはサブセット、またはこれらの混合物を含み、Ｋ
    ＡＬ−ＡおよびＫＡＬ−Ｂが下記配列を有する特許請求
    の範囲第８項記載の方法。 ￥Ｋａｌ−Ａ￥：【ＤＮＡ配列があります】；￥Ｋａｌ
    −Ｂ￥：【ＤＮＡ配列があります】（上記配列中、Ｘは
    、ホモセリンラクトンまたはその加水分解もしくはアミ
    ド化生成物、メチオニン、または別の天然アミノ酸、Ｙ
    は、Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡｒｇおよびＺは、Ｍｅｔ−
    ＴｈｒまたはＴｈｒである）
11. （１１）さらに開裂可能なリンカー配列を挿入すること
    を含む特許請求の範囲第８項記載の方法。
12. （１２）上記開裂可能なリンカー配列がＭｅｔ、Ａｓｐ
    −Ｐｒｏ、またはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌ
    ｙｓをコードする特許請求の範囲第９項記載の方法。
13. （１３）ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメント、ＡＩＤ
    Ｓウィルスポリペプチドまたはそのサブセットまたはア
    ナログ、 所望により上記にＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメント
    および上記ＡＩＤＳウィルスポリペプチド間に開裂可能
    なリンカーオリゴペプチド、および所望により上記Ｔｒ
    ｐＬＥポリペプチドフラグメントおよび上記ＡＩＤＳウ
    ィルスポリペプチド間に３−フレームリンカーオリゴペ
    プチドセグメント を含む融合蛋白質。
14. （１４）上記開裂可能なリンカーオリゴペプチドがＭｅ
    ｔ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
    −Ｌｙｓである特許請求の範囲第１３項記載の融合蛋白
    質。
15. （１５）上記ＡＩＤＳウィルスポリペプチドがＥＮＶ蛋
    白質またはそのフラグメント、好ましくはＫＡＬ−１０
    である、特許請求の範囲第１３項記載の融合蛋白質。
16. （１６）下記配列、その免疫反応性サブセットおよび類
    縁体を含むＡＩＤＳポリペプチドフラグメント。 【ＤＮＡ配列があります】； （上記配列中、Ｘは、ホモセリンラクトンまたはその加
    水分解もしくはアミド化生成物、メチオニンまたは別の
    天然もしくは合成アミノアシル残基およびＹはＭｅｔ−
    ＡｒｇまたはＡｒｇである）
17. （１７）下記配列、その免疫反応性サブセットおよび類
    縁体を含む、ＡＩＤＳポリペプチドフラグメント。 【ＤＮＡ配列があります】； （上記配列中、Ｘはホモセリンラクトンまたはその加水
    分解もしくはアミド化生成物、メチオニンまたは別の天
    然もしくは合成アミノアシル残基およびＺはＭｅｔ−Ｔ
    ｈｒまたはＴｈｒである）
18. （１８）抗原ウィルス蛋白質またはその生物活性誘導体
    もしくはフラグメントに暴露された哺乳類から産生され
    る抗体結合用イムノアッセイ試薬であって、 ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメント、 ＡＩＤＳウィルスポリペプチド、および、 所望により上記ＴｒｐＬＥオリゴペプチドフラグメント
    および上記抗原ウィルス蛋白質問に３−フレームリンカ
    ーオリゴペプチドセグメント を含む融合蛋白質である試薬。
19. （１９）上記ＡＩＤＳウィルスポリペプチドがＥＮＶ蛋
    白質もしくはそのフラグメント、好ましくはＫＡＬ−１
    ０である、特許請求の範囲第１８項記載のイムノアッセ
    イ試薬。
20. （２０）ＡＩＤＳウィルスに暴露されたひとからの抗体
    結合用イムノアッセイ試薬であって、下記配列を有する
    ＡＩＤＳポリペプチド配列またはその類縁体もしくはサ
    ブセットである試薬。 【遺伝子配列があります】； （上記配列中、Ｘは、ホモセリンラクトンまたはその加
    水分解もしくはアミド化生成物、メチオニンまたは別の
    天然もしくは合成アミノアシル残基およびＹはＭｅｔ−
    ＡｒｇまたはＡｒｇである）
21. （２１）ＡＩＤＳウィルスに暴露されたひとからの抗体
    結合用イムノアッセイ試薬であって、下記配列を有する
    ＡＩＤＳポリペプチド配列またはその類縁体もしくはサ
    ブセットである試薬。 【遺伝子配列があります】； （式中、Ｘはホモセリンラクトンまたはその加水分解も
    しくはアミド化生成物、メチオニンまたは別の天然もし
    くは合成アミノアシル残基およびＺはＭｅｔ−Ｔｈｒま
    たはＴｈｒである）
22. （２２）ＡＩＤＳウィルスに暴露されたひとからの抗体
    結合用イムノアッセイ試薬であって、下記配列を有する
    ２個またはそれ以上のＡＩＤＳポリペプチド配列、また
    はその類縁体もしくはサブセットの混合物である試薬。 【遺伝子配列があります】； （上記配列中、Ｘはホモセリンラクトンまたはその加水
    分解もしくはアミド化生成物、メチオニンまたは別の天
    然もしくは合成アミノアシル残基、ＹはＭｅｔ−Ａｒｇ
    またはＡｒｇおよびＺはＭｅｔ−ＴｈｒまたはＴｈｒで
    ある）
23. （２３）融合蛋白質の有効量を投与することによる哺乳
    類における抗体形成誘発方法であって、前記融合蛋白質
    が、 ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメント、 ＡＩＤＳウィルスポリペプチド、 所望により上記ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメントお
    よび上記ＡＩＤＳウィルスポリペプチド間に開裂可能な
    リンカーオリゴペプチド、および所望により上記Ｔｒｐ
    ＬＥポリペプチドフラグメントおよび上記ＡＩＤＳウィ
    ルスポリペプチド間に３−フレームリンカーオリゴペプ
    チドセグメント を含んでいる方法。
24. （２４）上記ＡＩＤＳウィルスポリペプチドがＥＮＶポ
    リペプチドまたはそのフラグメント、好ましくはＫＡＬ
    −１０である特許請求の範囲第２３項記載の方法。
25. （２５）上記抗体がポリクローナルまたはモノクローナ
    ルであり、ＡＩＤＳウィルスの存在検出に有用性がある
    特許請求の範囲第２３項記載の方法。
26. （２６）上記ＡＩＤＳウィルスポリペプチドがＥＮＶポ
    リペプチドまたはそのフラグメント、好ましくはＫＡＬ
    −１０である特許請求の範囲第２５項記載の方法。
27. （２７）上記抗体がＡＩＤＳウィルス感染に対する免疫
    を与えるのに有用な抗体を中和する、特許請求の範囲第
    ２３項記載の方法。
28. （２８）上記ＡＩＤＳウィルスポリペプチドがＥＮＶポ
    リペプチドまたはそのフラグメント、好ましくはＫＡＬ
    −１０である特許請求の範囲第２７項記載の方法。
29. （２９）ＡＩＤＳポリペプチドフラグメントの有効量を
    投与することによる哺乳類における抗体形成誘発方法で
    あって、前記フラグメントがＫＡＬ−Ａ、ＫＡＬ−Ｂ、
    ＫＡＬ−ＡもしくはＫＡＬ−Ｂの免疫反応性サブセット
    もしくは類縁体、またはこれらの混合物を含み、前記Ｋ
    ＡＬ−ＡおよびＫＡＬ−Ｂが下記配列を有している方法
    。 ￥Ｋａｌ−Ａ￥：【ＤＮＡ配列があります】；（上記配
    列中、Ｘはホモセリンラクトン、メチオニンまたは別の
    天然もしくは合成アミノアシル残基、ＹはＭｅｔ−Ａｒ
    ｇまたはＡｒｇおよびＺはＭｅｔ−ＴｈｒまたはＴｈｒ
    である）
30. （３０）ＡＩＤＳポリペプチドフラグメントの有効量を
    投与することによる、細胞ウィルス受容体に拮抗結合す
    ることによる哺乳類におけるＡＩＤＳＡウィルス感染の
    低減または予防方法であって、前記フラグメントがＫＡ
    Ｌ−Ａ、ＫＡＬ−Ｂ、ＫＡＬ−ＡもしくはＫＡＬ−Ｂの
    免疫反応性サブセットもしくは類縁体、またはそれらの
    混合物であり、ＫＡＬ−ＡおよびＫＡＬ−Ｂが下記配列
    を有している方法。 ￥Ｋａｌ−Ａ￥：【ＤＮＡ配列があります】；￥Ｋａｌ
    −Ｂ￥：【ＤＮＡ配列があります】；（上記配列中、Ｘ
    はホモセリンラクトン、メチオニン、または別の天然も
    しくは合成アミノアシル残基、ＹはＭｅｔ−Ａｒｇまた
    はＡｒｇ、およびＺはＭｅｔ−ＴｈｒまたはＴｈｒであ
    る）
31. （３１）ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメントおよび哺
    乳類細胞ウィルス受容体により認識されるＡＩＤＳウィ
    ルスポリペプチドを含む融合蛋白質の有効量を投与する
    ことにより、細胞ウィルス受容体に拮抗結合することに
    よる哺乳類におけるＡＩＤＳウィルス感染を低減または
    予防する方法。