PL158064B1

PL158064B1 - Sposób wytwarzania ludzkiej proapolipoproteiny A-l PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL158064B1
Application number: PL1988272698A
Authority: PL
Inventors: Alex Bollen; Jean Gobert; Ernst Wulfert
Original assignee: Ucb Sa
Priority date: 1987-05-28
Filing date: 1988-05-26
Publication date: 1992-07-31
Also published as: PL272698A1; AU1672388A; JPS6416589A; NO179253B; NZ224808A; IL86480A; CN88103118A; CA1323851C; NO882341D0; EP0293357A1; AU615654B2; FI882456A0; DK175686B1; LV5288A3; CY1809A; KR880014110A; NO882341L; US5059528A; SK363888A3; DK289688D0

Abstract

1. Sposób wytwarzania ludzkiej proapoli- poproteiny A-I, znamienny tym, ze w odpo- wiednich warunkach hoduje sie komórke lub drobnoustrój stransformowany wektorem ekspresji zawierajacym zrekombinowana sek- wencje DNA, kodujaca ludzka proapolipopro- teine A-I, zwiazana funkcjonalnie z regulato- rowa sekwencja DNA ludzkiej proapolipo- proteiny A-I, w której to zrekombinowanej sekwencji DNA fragment naturalnej sekwencji kodujacej jest zastapiony fragmentem DNA, kodujacym te same aminokwasy, lecz o innej sekwencji nukleotydów, co ogranicza lub zapobiega tworzeniu sie struktur szpilkowych i odzyskuje sie wytworzona ludzka proapoli- poproteine A-I. FIG 2 PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ludzkiej proapolipoproteiny A-I.

W sposobie według wynalazku stosuje się nowe zrekombinowane sekwencje DNA zawierające sekwencję kodującą ludzką proapolipoproteinę A-I, wektory klonowania i ekspresji zawierające te sekwencje DNA, a także komórki gospodarzy transformowane wymienionymi wyżej wektorami ekspresji.

Ludzka apolipoproteina A-I (apo A-I) jest głównym składnikiem proteinowym lipoprotein o wysokiej gęstości (LHD) i chylomikronów limfy. Wątroba i jelito cienkie są początkowymi centrami syntezy apo A-I. Apo-1 syntetyzuje się w tych organach w postaci prekursora proteinowego (preproapo A-I). Rozszczepienie prepeptydu zachodzi wewnątrz komórki i proapo A-I wydzielana jest w plazmie i w limfie.

158 064

Proapo A-I zawiera sześć dodatkowych aminokwasów (Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln) związanych z terminalną grupą aminową apo A-I. Po dojściu do obszaru naczyniowego proapo A-I ulega rozszczepieniu in vivo przez specyficzny enzym proteolityczny (apo A-I propeptydazę) dając dojrzałą apo A-I.

Dojrzała apo A-I jest pojedynczym polipeptydem nie glikozylowanym o znanej sekwencji, składającym się z 243 aminokwasów (Η. B. Brewer i współprac., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 623-630 (1978) i służy on jako ko-faktor dla enzymu plazmatycznego lecytyny: acylotransferazy cholesterolu, odpowiedzialnej za tworzenie się w plazmie większości estrów cholesterolu. Błędy w strukturach lub w biosyntezie apolipoproteiny mogą prowadzić do zakłóceń w systemie transportu lipidów plazmatycznych i do rozwoju choroby tętnic wieńcowych. Wykazano, że niskie zawartości plazmatyczne apo A-I i LHD stanowią istotny czynnik ryzyka dla chorób serca (zawał mięśnia sercowego) i dla innych chorób miażdżycy naczyń. Mutacje w genie kodującym zwłaszcza dla apo A-I były połączone z obniżeniem zawartości LHD oraz z przedwczesnymi chorobami naczyń wieńcowych.

Apo A-I i LHD są głównymi składnikami plazmy uczestniczącymi w transporcie cholesterolu z tkanek obwodowych (tętnice) do wątroby (zwanym także transportem odwrotnym cholesterolu), w celu wydzielenia przez organizm. Biorąc pod uwagę, że gromadzenie się cholesterolu w tętnicach jest główną cechą charakterystyczną i mechanizmem miażdżycowego stwardnienia tętnic, stymulacja odwrotnego transportu cholesterolu za pomocą apo A-I mogłaby opóźnić i odwrócić procesy miażdżycowe i w związku z tym zmniejszyć zachorowalność na choroby sercowe.

Dojrzewanie proapo A-I do apo A-I może zachodzić ilościowo na zewnątrz komórki, przy czasie przebywania we krwi krótszym od 12 godzin. Ponieważ proapo A-I jest głównym prekursorem, jeśli nie jedynym, dojrzałej apo A-I, mogłaby ona być stosowana w leczeniu zastępczym zawsze w tych przypadkach gdy zmniejsza się poziom LHD, na przykład przy niedoborach dziedzicznych lub nabytych. W związku z użytecznością leczniczą apo A-I, badacze poszukiwali sposobów pozwalających na produkcję apo A-I w dużych ilościach. Zazwyczaj sposoby takie obejmują oczyszczanie apo A-I przy stosowaniu osocza jako surowca.

W licznych publikacjach (P. Cheung i L. Chan, Nucleic Acids Res. 11, 3703-3715 (1983); J. J. Seilhamer i współprac., DNA 3, 309-317 (1984) oraz japońskie zgłoszenie patentowe nr 96998/86) wykazano, że komplementarny DNA kodujący dla preproapo A-I może być otrzymany znanymi sposobami inżynierii genetycznej.

R. Lorenzetti i współprac. [FEBS Lett. 194, 343-346 (1986)] stwierdzili, że apo A-I może być wyrażony w E. coli w postaci proteiny połączonej z beta-galaktozydazą, nie rozszczepialną. Jednakże usiłowania wyrażenia dojrzałej apo A-I w postaci proteiny nie połączonej nie powiodły się.

W przytoczonym wyżej japońskim zgłoszeniu patentowym nr 96988/86 opisano ekspresję proteiny podobnej do apolipoproteiny A-I ludzkiej, w E. coli, którą transformowano plazmidem pHAIE-I zawierającym gen strukturalny apo A-I pod kontrolą promotora tac. Jednakże gen strukturalny jest niekompletny i składa się z kodonów dla aminokwasów +4 do +243, poprzedzonych kodonem ATG inicjacji translacji. Wynika stąd, że otrzymany produkt ekspresji zawiera metioninę N-terminalną (odpowiadającą kodonowi ATG), która może powodować efekty uboczne przy jego stosowaniu w lecznictwie.

J. B. Mallory i współprac. [J. Biol. Chem. 262, 4241-4247 (1987); zgłoszenia międzynarodowe PCT WO 86/04920 i WO 87/02062] opisali ekspresję ludzkiej apolipoproteiny A-I w komórkach jajnikowych chomików chińskich (hodowla komórek zwierzęcych). Zastosowana konstrukcja zawierała kompletny gen preproapolipoproteiny A-I ludzkiej. Komórki jajnikowe chomików chińskich wydawały się przekształcać formę proapo w formę apo dojrzałą, gdyż tylko 5-10% wydzielonej proteiny apo A-I stanowiła proapo A-I, zaś reszta stanowiła dojrzałą proteinę apo A-L Produktywność układu była stosunkowo niewielka, gdyż 0,5T0⁶ komórek wydzieliło zaledwie 25-30/zg/ml apo A-I w ciągu 24 godzin. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT WO 87/02062 kilka przykładów stosowania dotyczyło ekspresji apolipoproteiny A-I ludzkiej u innych gospodarzy, takich jak E. coli (gospodarz bakteryjny) i S. cerevisiae (drożdże). Jednakże żadna z użytych konstrukcji nie zawierała informacji genetycznej dla formy proapo, a wyrażona proteina nie była ludzką proapolipoproteiną A-I.

158 064

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania ludzkiej proapolipoproteiny A-I poprzez technologię zrekombinowanego DNA, to znaczy wytwarzania dojrzałej proteiny proapo A-I nadającej się do rozszczepienia przez specyficzny enzym proteolityczny apo A-I propeptydazy. Przez stosowane tu wyrażenie „dojrzała rozumie się nie tylko ludzką proapo A-I w jej własnej postaci, lecz także odpowiednią proteinę, której pierwszym aminokwasem jest metionina i której obecność jest przypisywana do kodonu ATG inicjacji translacji w konstrukcji wektora ekspresji.

Przy realizacji sposobu według wynalazku stosuje się wektory klonowania i ekspresji zawierające sekwencję DNA kodującą ludzką proapo A-I, zdolne do namnażania się, co umożliwia ekspresję dojrzałej ludzkiej proteiny proapo A-I, jak również met-proapo A-I, jej koniugatów z fuzji lub jej koniugatów z sygnałem N-terminalnym. Ponadto, w sposobie według wynalazku stosuje się hodowle komórek zdolnych do życia, lub hodowle drobnoustrojów genetycznie zmodyfikowanych, zawierających takie wektory, i zdolnych do wytwarzania ludzkiego polipeptydu proapo A-I. Według wynalazku wytwarza się ludzką proapo A-I w stanie fizycznym odmiennym od tego, jaki się znajduje lub jaki się wydziela przy stosowaniu źródła naturalnego, bądź środowiska naturalnego; ludzka proapo A-I jest zasadniczo wolna od typowych protein endogennych i innych materiałów lub substancji naturalnych.

Sposób według wynalazku obejmuje wytwarzanie ludzkiej proapo A-I za pomocą techniki rekombinacji DNA we wszystkich jej aspektach i nie powinien być interpretowany jako ograniczony do specyficznych szczegółów opisanych i zestawionych w ramach tego opisu.

Proteina wytwarzana sposobem według wynalazku stanowi lub zawiera dojrzałą ludzką proapo A-I, w związku z tym, może być przekształcona, in vitro i in vivo, w dojrzałą ludzką apo A-I pod proteolitycznym działaniem apo A-I propeptydazy. Ludzką proapo A-I można stosować w lecznictwie w postaci niezmienionej, można również używać met-proapo A-I, jeśli obecność rodnika metionylu jest farmakologicznie dopuszczalna, gdyż produkt ten może być skutecznie przekształcony w sposób naturalny w krwioobiegu przez naturalną propeptydazę w autentyczną dojrzałą ludzką apo A-I. Jeśli potrzeba, ludzką proapo A-I można wytwarzać w drobnoustrojach lub w hodowlach wyselekcjonowanych komórek zdolnych do przerobienia metioniny Nterminalnej i zdolnych w związku z tym do produkowania ludzkiej proapo A-I w postaci nie zawierającej N-terminalnej metioniny. Alternatywnie, jeśli ludzka proapo A-I zawiera lub nie zawiera terminalnego rodnika N-metionylowego, to może ona zostać rozszczepiona in vitro dla uzyskania dojrzałej apo A-I ludzkiej, którą stosuje się w lecznictwie. Podobnie jest w przypadku koniugatów z fuzji i koniugatów włączających sygnał N-terminalnej proapo A-I; rozszczepienie prowadzi do autentycznej ludzkiej apo A-I pozbawionej metioniny N-terminalnej.

W sposobie według wynalazku stosuje się zmodyfikowaną sekwencję kodującą przynajmniej część cząsteczki ludzkiej proapo A-I; taka zmodyfikowana sekwencja kodująca polepsza skuteczność translacji w związku ze zmniejszeniem lub nawet niedopuszczeniem do tworzenia struktur szpilkowych. Możliwe, że R. Lorenzetti i współprac. [FEBS Lett. 194, 343-346 (1986)] nie mogli zaobserwować ekspresji dojrzałej proteiny apo A-I nie połączonej, gdyż ich konstrukcje DNA były zdolne do tworzenia w sposób znaczący struktur szpilkowych, prowadzących do bardzo mało wydajnej ekspresji. Nieoczekiwanie stwierdzono, że wydajną ekspresję można uzyskać przez odpowiednią modyfikację kilku kodonów w sekwencji kodującej aminokwasy -6 do +14 ludzkiej proapo A-I. W „odpowiedniej modyfikacji, takiej jaką zastosowano tutaj, kilkanaście kodonów naturalnych zastąpiono innymi kodonami, które - według kodu genetycznego - reprezentują te same aminokwasy. Wszystkie modyfikacje razem wzięte prowadzą do ograniczenia lub nawet do niedopuszczenia do tworzenia struktur szpilkowych. Należy nadmienić, że modyfikacje sekwencji DNA nie mają żadnego wpływu na rodzaj miejsca rozszczepienia propeptydazą, gdyż sekwencja aminokwasów rozpoznawana przez propeptydazę jest obecna w konstrukcji.

Sposób według wynalazku polega na tym, że w odpowiednich warunkach hoduje się komórkę lub drobnoustrój stransformowany wektorem ekspresji zawierającym zrekombinowaną sekwencję DNA kodującą ludzką proapolipoproteinę A-I, związaną funkcjonalnie z regulatorową sekwencją DNA ludzkiej proapolipoproteiny A-I, w której to zrekombinowanej sekwencji DNA fragment naturalnej sekwencji kodującej jest zastąpiony fragmentem DNA kodującym te same aminokwasy, lecz o innej sekwencji nukleotydów, co ogranicza lub zapobiega tworzeniu się struktur szpilkowych i odzyskuje się wytworzoną ludzką proapolipoproteinę A-I.

158 064

Ludzka proapo A-I wytwarzana sposobem według wynalazku stanowi produkt hodowli komórek lub genetycznie modyfikowanego drobnoustroju. Taka ludzka proapo A-I może występować w postaci dojrzałej proapo A-I, w postaci dojrzałej proapo A-I poprzedzonej resztą metioniny, w postaci proteiny połączonej, takiej jak na przykład betagalaktozydaza - proapo A-I, oraz w postaci związku preproapo A-I. Otrzymany produkt jest zasadniczo wolny od typowych endogennych protein i od innych materiałów lub substancji naturalnych typowych dla źródła naturalnego (plazma krwi) omawianej proteiny. Hodowla stosowanych tu komórek lub drobnoustrojów nie jest ograniczona do linii komórkowych i do specyficznych drobnoustrojów: stosuje się zarówno komórki prokariotyczne jak i komórki eukariotyczne wliczając linie komórkowe zwierzęce i ludzkie. Dla ilustracji można tu podać przykład ekspresji w bakterii E. coli (jako przedstawiciel komórek prokariotycznych) i w drożdżach Saccharomyces cerevisiae oraz w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem (jako przedstawiciel komórek eukariotycznych).

W sposobie według wynalazku wytwarza się ludzką apo A-I przez traktowanie ludzkiej proapo A-I propetydazą apo A-I. Taka ludzka apo-I jest identyczna z autentyczną formą dojrzałej ludzkiej apo A-I i jest pozbawiona całkowicie reszty N-terminalnej metioniny.

Proteinę wytwarzaną sposobem według wynalazku stosuje się do wytwarzania środków farmaceutycznych, zawierających ludzką proapo A-I i/lub apo A-I i ewentualnie przynajmniej jeden nośnik dopuszczalny farmakologicznie, rozpuszczalnik, rozcieńczalnik lub wypełniacz, dogodnie dobrany w zależności od drogi podawania i typowych wymogów formulacji środków farmeceutycznych.

Zrekombinowane sekwencje DNA, stosowane w sposobie według wynalazku, obejmują sekwencję kodującą ludzką proapolipoproteinę A-I, w której naturalna część sekwencji kodującej zastąpiona jest fragmentem DNA kodującym te same aminokwasy, lecz składająca się z innej sekwencji nukleotydów, tak by ograniczyć lub nie dopuścić do tworzenia się struktur szpilkowych. Sekwencja naturalna, kodująca aminokwasy -6 do +14 w proapo A-I została zastąpiona następującą sekwencją (podano pojedynczą nić):

5'-ATGAGACATTTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTG-3', zawierającą dodatkowy kodon ATG inicjacji translacji i kodony modyfikowane dla reszt aminokwasów -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10,+11 i +14.

W sposobie według wynalazku stosuje się replikacyjne wektory klonowania i wektory ekspresji zawierające przytoczoną wyżej zrekombinowaną sekwencję DNA kodującą ludzką proapo A-I.

Zwłaszcza stosuje się zrekombinowane plazmidy pULB-9291, pULB9292, pULB9296, pULB9299, pNIV1612 i pNIV1613, których konstrukcję opisano poniżej. Pierwsze przytoczone plazmidy pULB9291 i pULB9292 zawierają zmodyfikowany gen strukturalny proapo A-I, poprzedzony kodonem ATG i będący pod kontrolą promotora Pl faga lambda. Plazmidy te są wektorami ekspresji, odpowiednimi dla E. coli i kierującymi syntezą ludzkiej proapo A-I, która może być rozszczepiona przez propeptydazę, w celu utworzenia autentycznej dojrzałej ludzkiej apo A-I.

Plazmid pULB9296, wprowadzony do E. coli, kieruje ekspresją proteiny połączonej, zawierającej beta-galaktozydazę i ludzką proapo A-I i jest pod kontrolą regionu promotora lac z E. coli. Ponieważ produkt fuzji zawiera również sekwencję rozszczepienia propeptydazą, może on zostać rozszczepiony, w wyniku czego powstaje autentyczna dojrzała ludzka apo A-I.

Plazmid pULB9299 jest wektorem ekspresji odpowiadającym gatunkom drożdży i zawiera regiony promotora i terminatora transkrypcji ARG3 dla zapewnienia skutecznej ekspresji w drożdżach. Otrzymana ludzka proapo A-I może ulec rozszczepieniu przez propeptydazę, tworząc dojrzałą ludzką apo A-I.

Plazmid pNIV1612 zawiera gen strukturalny proapo A-I połączony z sekwencją DNA peptydu sygnalnego proteiny OmpA z E. coli będącą pod kontrolą promotora Lpp (lipoproteina) oraz promotora-operatora lac. W konstrukcji, sekwencja kodująca peptyd sygnalny ompA poprzedza sekwencję proapo A-I pozbawioną kodonu ATG inicjacji translacji. Plazmid jest wektorem odpowiednim dla E. coli i kieruje syntezą ludzkiej proapo A-I, która może być wydzielona w periplazmie bez metioniny N-terminalnej. Plazmid pNIV1613 jest wektorem transferowym służącym do wprowadzania sekwencji cDNA ludzkiej proapo A-I do bakulowirusa. Plazmid ten obejmuje promotor polihedrynowy bakulowirusa i gen strukturalny proapo A-I, w tym także kodon ATG

158 064 inicjacji translacji. Wspólnie z dzikim szczepem bakulowirusa (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV) plazmid pNIV1613 kieruje syntezą proapo A-I w komórkach owadów i może się odnaleźć w postaci wolnej od metioniny po modyfikacjach posttranslacyjnych w komórkach owadzich.

W sposobie według wynalazku stosuje się również hodowle komórek i drobnoustrojów, które zostały stranformowane wektorem klonowania lub wektorem ekspresji, jak opisano powyżej, a zwłaszcza hodowle stransformowanych komórek i drobnoustrojów zdolnych do wytwarzania ludzkiej proapo A-I. Używane w niniejszym opisie wyrażenie „stransformowane“ obejmuje szeroki sens wyrażenia „genetycznie modyfikowane! i z pewnością nie ogranicza się do wąskiej „transformacji bakteryjnej‘1 W zależności od rodzaju użytego wektora i wyselekcjonowanego gospodarza stosuje się dowolną technikę inżynierii genetycznej prowadzącą do otrzymania pożądanej modyfikacji genetycznej, wliczając w to transfekcję, transdukcję itp.

Opisane tu hodowle komórek i drobnoustrojów stosuje się do wytwarzania ludzkiej proapolipoproteiny A-I przez fermentację w skali przemysłowej.

Sposób według wynalazku zrealizowano przy zastosowaniu, między innymi, szczepu MM294 E. coli KI2 (endoA thi~, bad R, supE); szczep ten zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC No. 33625), bez ograniczenia odnośnie jego dostępności. Tym niemniej można również stosować inne szczepy bakteryjne, obejmujące znane szczepy E. coli, takie jak E. coli B, E. coli 1776 (ATCC No. 31537, zdeponowany 3 lipca 1979, bez ograniczenia), E. coli AR58, pochodna N99 (ATCC No. 33956), z clii, cl 857, bio”, gdzie funkcje delta H pozbawione są lambda, sprzedawany przez firmę PL-PHARMACIA [J. E. Mott i współprac., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 82,88-92 (1985); G. Devare i współprac., Celi, 36,43-49 (1984)], E. coli JM 101 (ATCC No. 33876 [J. Messing i współprac., Nueleic AcidsRes. 9,309-321 (1981)] lub E. coli JA221 (Lpp, hdsM+, trpE5, leuB6, LacY, recAI/F', lacl^q, lac+, pro⁺) [J. Ghrayeb i współprac., EMBO J. 3, 2437-2442 (1984)] lub inne szczepy bakteryjne, z których cały szereg jest zdeponowany i dostępny w instytucjach dysponujących znanymi drobnoustrojami, takich jak American Type Culture Collection (ATCC) zgodnie z katalogiem ATCC. Te inne drobnoustroje obejmują, na przykład, Bacilli, takie jak Bacillus subtilis i inne bakterie jelitowe, spośród których można przytoczyć, na przykład, Salmonella Typhimurium i Serratia marcesans, zawierające plazmidy zdolne do replikacji i do ekspresji sekwencji genów heterologicznych.

Plazmidy ekspresji do stosowania u bakterii, na przykład, E. coli, otrzymuje się zazwyczaj z plazmidu pBR322, użytego jako wektor (zdeponowanego w ATCC pod numerem 37017), wprowadzając w dogodny sposób sekwencję genu heterologicznego oraz równocześnie sygnały inicjacji i zakończenia translacji, w fazie odczytu zgodnej z promotorem funkcyjnym, korzystając z naturalnych miejsc restrykacji lub utworzonych syntetycznie. Wektor niesie jeden lub większą liczbę charakterystycznych genów selekcji fenotypowej i miejsce początku replikacji dla zapewnienia namnożenia w gospodarzu. Insert heterologiczny może być wydłużony ponownie tak, aby był wyrażony równocześnie z przyłączoną presekwencją, pochodzącą, na przykład, od genów systemu lac.

Wektory ekspresji dla bakulowirusa, na przykład pAcRP6 i pAcYMl [Y. Matsura i współprac., J. Gen. Virol. 68, 1233-1250 (1987)] i bakulowirusa typu dzikiego (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPY), są obecnie szeroko stosowane. Opisano je szczegółowo w literaturze i mogą być otrzymywane przede wszystkim w Texas Agricultural Experiment Station.

Według wynalazku stosuje się różne komórki owadzie, jako gospodarzy dla odpowiednich wektorów ekspresji, na przykład komórki Spodoptera frugiperda Sf9 [M. D. Summer i G. E. Smith, A. Manuał of Methode for Baculovirus Vectors and Insect celi culture Procedures, Texas University, College Station, (1987); ATCC CRL 1711],

Według wynalazku stosuje się różne szczepy drożdży przyjmujące właściwe wektory ekspresji, takie jak plazmid YRp7 [D. T. Stinchocomb i współprac., Naturę, 282, 39-43 (1979)], który jest zdolny do selekcji i replikacji równocześnie E. coli i w drożdżach, zwłaszcza Seccharomyces cerevisiae.

Spośród stosowanych szczepów drożdży należy wymienić szczep RH218 [G. Miozzari i współprac., J. Bacteriol. 134, 48-59 (1978)] zdeponowany w American Type Culture Collection bez ograniczenia (ATCC No. 44076), szczep 10544c [T. Cabezon i współprac., Proc. Natl. Acad.

158 064

Ί

Sci USA, 81, 6594-6598 (1984)], posiadający genotyp Ieu2-3, leu2-112, pep4-3 [M. Hoyplaerts i współprac., FEBS lett. 204, 83-87 (1986)] i szczep Ic 1697d (arg.J, leu2-l) bradytrof dla Argininy (ATCC No. 20631).

Dla wyrażenia genu heterologicznego, takiego jak cDNA ludzkiej proapo A-I w drożdżach, niezbędna jest konstrukcja wektora plazmidowego, zawierającego cztery składniki.

Pierwszy składnik jest fragmentem, pozwalającym na transformację równocześnie w E. coli i w drożdżach; musi on w związku z tym zawierać gen selekcji, pochodzący od każdego z tych organizmów. Może to być gen odpowiedzialny za odporność na ampicylinę, pochodzący z E. coli (skrót ,,AmpA“) i gen leu2, pochodzący z drożdży. Składnik ten wymaga również oryginału replikacji, pochodzącego od każdego z tych organizmów, aby mógł być zatrzymany jako DNA plazmidowy w obu organizmach. Może to być miejsce początku replikacji E. coli, pochodzące z pBR322 i miejsce początku replikacji arsl chromozomu III drożdży lub miejsce początku replikacji kolistego DNA 2/7.

Drugi składnik plazmidu jest sekwencją umieszczoną w końcu 5' genu drożdży, wyrażoną silnie dla promowania transkrypcji genu strukturalnego, umieszczonego poniżej. Sekwencja umieszczona w końcu 5' może pochodzić z genów TDH3 lub ARG3 drożdży. Fragment zbudowany jest w taki sposób, by usunąć sekwencje strukturalne TDH3 lub ARG3, które zastępowane są przez sekwencję zawierającą alternatywne miejsca restrykcji, takie jak miejsca restrykcji Ncol lub BamHI, dla wygodnego dołączenia tej sekwencji w końcu 5' genu strukturalnego.

Trzecim składnikiem układu jest gen strukturalny, zbudowany w taki sposób, że zawiera równocześnie sygnał ATG inicjacji translacji i sygnał zakończenia translacji.

Czwarty składnik jest sekwencją DNA drożdży, zawierającą sekwencję umieszczoną w końcu 3' genu drożdży obejmującą odpowiednie sygnały zakończenia transkrypcji i poliadenylacji. Na przykład, plazmidy kierujące wytwarzaniem ludzkiej proapo A-I w drożdżach, mogą być zbudowane przez włączenie fragmentów genu polipeptydu ludzkiej proapo A-I w miejscu BamHI plazmidu ekspresji pRIT 10ΊΊ4 opisanego w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 151102.

Dalsze cechy wynalazku będą opisane dalej, w części dotyczącej korzystnych konstrukcji wektorów, zawierających zrekombinowaną sekwencję DNA i warunków stosowania tych wektorów. W tym miejscu należy odwołać się do rysunków, na których: fig. 1A i B przedstawiają sekwencję nukleotydów i aminokwasów ludzkiej preproapo A-I. Sekwencję nukleotydów zwiastuna RNA ludzkiej preproapo A-I oznaczono drogą analizy sekwencji DNA w cDNA klonu pULB1609. Aminokwasy przewidziane w peptydzie sygnalnym, w propeptydzie i w polipeptydzie dojrzałej apo A-I zaznaczono i ponumerowano, począwszy od pierwszej reszty aminokwasu proteiny apo A-I. Podkreślono region, odpowiadający sondzie syntetycznego DNA użytej do izolacji klonu.

Skróty w postaci pojedynczych liter, stosowane do oznaczenia aminokwasów, są następujące: A - alanina, C - cysteina, D - kwas asparaginowy, E - kwas glutaminowy, F - fenyloalanina, G -glicyna, H - histydyna, L - izoleucyna, K - lizyna, L - leucyna, M - metionina, N - asparagina, P -prolina, Q - glutamina, R - arginina, S - seryna, T - treonina, V - walina, W - tryptofan, Y -tyrozyna. Fig. 2 przedstawia schemat syntezy adaptora oligonukleotydowego dla konstrukcji fragmentu DNA, kodującego 6 aminokwasów propeptydu i 14 początkowych aminokwasów polipeptydu dojrzałej apo A-I, z kodonem ATG inicjacji. Strzałki wskazują oligonukleotydy użyte do syntezy fragmentu NCol-Ball w 65/61 parach zasad (pb). Fig. 3 przedstawia konstrukcję plazmidu pULB9291, niosącego reigony regulacyjne Pl lambda i sekwencję nukleotydów proapo A-I. Fig. 4 przedstawia konstrukcję plazmidu pULB9296, niosącego promotor lac E. coli i sekwencję nukleotydów betagalaktozydazy złączoną z odpowiednią sekwencją proapo A-I. Fig. 4 przedstawia konstrukcję plazmidu pULB9299, niosącego regiony regulacyjne ARG3 drożdży i sekwencję nukleotydów proapo A-I. Fig. 6A, B i C przedstawiają konstrukcję plazmidu pNIV1612 niosącego regiony regulacyjne lac i lpp, sekwencję kodującą peptyd sygnalny ompA i sekwencję nukleotydów proapo A-I. Fig. Ί przedstawia konstrukcję plazmidu pNIV1613 obejmującego region regulacyjny genu polihedryny i sekwencję nukleotydów proapo A-I.

Przykład . Wytwarzanie RNA: kompletny RNA z wątroby ludzkiej sporządzono metodą z chlorkiem guanidyny [R. A. Cox, Methods Enzymol. XII, część B, 120-129 (1968)]. Preparat

158 064 kompletnego RNA przepuszczono następnie przez kolumnę z oligo/dT/-celulozą dla uzyskania kompletnych polia⁺RNA [T. Maniatis i współprac., w Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harber, Nowy York, (1982)]. Z lOg wątroby ludzkiej otrzymano 200 pg poliA⁺RNAs.

Synteza in vitro komplementarnego DNA (DNAc).

Reakcje odwróconej transkrypcji, przy użyciu 0,l-5pgpoliA⁺RNA, zaszczepiono za pomocą oligo/dT/12-18/ około 1 pg; oryginał: Bochringer/. DNAc jednoniciowy przekształcono następnie w cząsteczkę o nici podwójnej (DNAcdb) za pomocą enzymu transkryptazy odwróconej. Preparaty DNAcdb, zazwyczaj 1pg, traktowano Sl nukleazą dla utworzenia nowych końców. Procedura ta jest dobrze znana i opisana szczegółowo przez T. Maniatisa i współprac, loc. cit. DNAcdb wydłużono następnie przez rozciąganie oligo/dC/ według procedury opisanej przez L. Villa-Komaroff i współprac., Proc. Natl. Sci. USA, 75, 3727-3731 (1978). Zazwyczaj, 100 ng DNAcdb traktuje się transferazą terminalną enzymu dezoksynukleotydylowego. Przeważnie do końca 3' cząsteczek DNAcdb dochodzą wydłużenia o długości 15 zasad.

Klonowanie wydłużonego DNAcdb w wektorze plazmidów pBR322.

DNA plazmidu pBR322 jest liniowane przez enzym Pstl i wydłużane przez rozciąganie oligo/dG/ metodą opisaną przez R. M. Lawna i współprac., Nuci. Acids Res. 9, 6103-6114 (1981). DNAcdb wydłużony przez rozciąganie oligo/dC/miesza się w stosunku równomolowym z DNA pBR322 wydłużonego przez rozciąganie oligo/dG/. Zazwyczaj, 50/tg mieszaniny hybrydyzuje się dla recyrkulacji plazmidu. Warunki tej operacji są dobrze znane i opisane szczegółowo przez R. M. Lawna i współprac., loc. cit. Mieszaninę po hybrydyzacji stosuje się następnie do transformacji kompetentnych komórek szczepu MM294 E. coli, na przykład metodą opisaną przez R. M. Lawna i współprac., loc. cit. Kilkaset transformantów otrzymuje się przez selekcję poprzez wzrost w środowisku tetracykliny, przy czym oporność na ten antybiotyk nadawana jest przez plazmid pBR322. Transformanty były również testowane na wrażliwość na ampicylinę. Transformanty wrażliwe na ampicylinę zawierają chimeryczny plazmid, gdyż insercja obcego DNA w wektorze dezaktywuje gen ampicyliny.

Odsiewanie banku DNAc.

Transformanty E. coli odsiano za pomocą syntetycznych oligonukleotydów, znaczonych na końcu 5' za pomocą ³²p i odpowiadających fragmentowi genu opo A-l. Sekwencja nukleotydów apo A-l ludzkiej jest znana (patrz P. Cheung i L. Chan. loc. cit., oraz J. J. Seilhamer i współprac., loc. cit.); w rezultacie praktyczna jest synteza chemiczna metodą N. D. Sinha i współprac. [Nucleic Acids Res. 12,4539-4557 (1984)] sondy oligonukleotydów o długości 22 zasad odpowiadających końcowi 5' genu. Wyselekcjonowana sekwencja jest następująca: 5'-GCTGCGGTGCTGACCTTGGCCG-3'. Przed użyciem do hybrydyzacji, syntetyczny oligonukleotyd fosforyluje się na końcu 5' za pomocą kinazy T4 polinukleotydu (P-L Biochemicals) i [ gamma³²p]ATP. Warunki znakowania i hybrydyzacji są dobrze znane i opisane szczegółowo przez T. Maniatisa i współprac., loc. cit. oraz przez A. Bollena i współprac., DNA, 2 255-264 (1983).

Konstrukcja plazmidów ekspresji.

Metody wytwarzania DNA, izolacji fragmentów DNA oraz warunki analizy za pomocą enzymów restrykcyjnych i warunki ligacji fragmentów są dobrze znane i opisane szczegółowo przez R. M. Lawna i współprac., loc. cit, oraz przez T. Cabezona i współprac., loc. cit., i nadają się do stosowania w niniejszym wynalazku.

Syntezę fragmentów łączących promotor wektorów ekspresji na końcu 5' genu opisano poniżej.

Synteza fragmentu Ncol-Ball.

Na rysunku 2 przedstawiono szczegółowo zasady stanowiące podstawę koncepcji oligonukleotydów 35-meru, 30-meru, 18-meru i 43-meru, stosowanych w syntezie fragmentu Ncol-Ball 65/61 pb. Syntetyczne fragmenty 30-meru i 18-meru fosforylowano na końcach 5' za pomocą kinazy T4 polinukleotydu (P-L Biochemicals). 1pg każdego oligonukleotydu, wliczając w to 35-mer i 43-mer nie fosforylowane, hybrydyzowano w ciągu 3 minut w temperaturze 95°C w 30 mM octanu sodu (pH 7,0), po czym oziębiono powoli do temperatury 4°C. Mieszaninę po hybrydyzacji użyto w tej postaci w procesie klonowania dla konstrukcji plazmidów ekspresji.

158 064

Sekwencjonowanie DNA.

Analizę sekwencji DNA prowadzono metodą opisaną przez A. M. Moxama i W. Gilberta [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560-564 (1977)] oraz przez F. Sangera i współprac. [Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)].

Analiza protein.

Osady komórek o gęstości optycznej 1 jednostki równej 630 nm (1 ODe3o) otrzymano w różnych etapach podczas fermentacji szczepów niosących plazmidy ekspresji proapo A-I ludzkiej, pULB9291, pULB9292, pULB9296 i pULB9299 (transformowanych odpowiednio w szczepach AR58 i JM101 E. coli i w szczepie 10S44c drożdży). Każdą próbkę zawieszano w buforze 50 mM Tris-HCl, pH6,8, zawierającym 2% dodecylosiarczanu sodu (DSS), 6mM mocznika, 10% gliceryny i 5% 2-merkaptoetanolu, po czym ogrzewano do wrzenia w ciągu 3 minut. Próbki poddano elektroforezie w żelach poliakryloamidowych [U. K. Laemli, Naturę, 227 (1970)]. Kompletne proteiny wywołano przez barwienie Błękitem Coomassie a zsyntetyzowaną proapo A-I ludzką zidentyfikowano przez rozpoznanie immunologiczne po transferze elektroforetycznym (patrz A. Bollen i współprac., loc. cit.).

Konstrukcja zrekombinowanych wektorów dla ekspresji proapo A-I ludzkiej w bakteriach, w drożdżach i w komórkach owadzich zakażonych bakulowirusem.

1. Klon DNAc dla proapo A-I ludzkiej: pULB1609 (rysunek 1). Kilkaset transformantów pochodzących z klonowania DNAcdb, odpowiadających poliA⁺RNA z wątroby ludzkiej, w miejscu Pstl pBR322, odsiano za pomocą syntetycznej sondy, apo A-I 22-meru opisanego powyżej. Jeden z klonów dał w czasie doświadczenia intensywny sygnał hybrydyzacji. Klon ten, oznaczony jako pULB1609, oddzielono i obecny w zrekombinowanym plazmidzie insert DNA scharakteryzowano przez analizę sekwencji DNA. Jego długość odpowiada 878 parom zasad (pb); koduje on dla kompletnego polipeptydu preproapo A-I. Jak wynika z rysunku 1 klonowany fragment DNAc niesie regiony nie kodujące w 5' i w 3' (19 pb i 55 pb odpowiednio), sekwencję 54 pb kodującą dla prekursora peptydu (aa-24 do aa-7), sekwencję 18 pb kodującą dla propeptydu (aa-6 do aa-1) i sekwencję 732 pb kodującą dla dojrzałej apo A-I (aa-1 do aa-243) i zawierającą kodon zakończenia translacji. Sekwencja proteiny, wynikająca z sekwencji DNA, odpowiada wyjątkowo dobrze sekwencji aminokwasów znalezionej dla preproapo A-I otrzymanej z proteiny i z klonów DNAc wyizolowanych niezależnie [W. C. Barker i współprac., Comp. Biochem. Physiol. 57B, 309-315 (1977)]; japońskie zgłoszenie patentowe nr 96998/86; P. Cheung i L. Chan, loc. cit., oraz J. J. Seilhamer i współprac., loc. cit.).

2. Konstrukcja bakteryjnego wektora ekspresji zawierającej DNAc proapo A-I ludzkiej: pULB9291 (rysunki 2 i 3). pULB9291, plazmid produkujący proapo A-I ludzką, jest skonstruowany przez umieszczenie segmentu pochodzącego z klonu pULB1609 za promotorem regulowanym Pl lambda (rysunek 3). Konstrukcja tego plazmidu ekspresji wymaga syntezy fragmentów DNA zawierających miejsce restrykcji Ncol, kodon ATG inicjacji translacji i sekwencję nukleotydów kodującą dla aminokwasów na aminowanym końcu genu strukturalnego proapo A-I ludzkiej, do pierwszego pojedynczego miejsca restrykcji, Bali (rysunek 2).

Adaptor ten syntetyzuje się sposobami chemicznymi (N. D. Sinha i współprac., lac. cit.). Sporządza się cztery syntetyczne oligonukleotydy; po hybrydyzacji kodują one dla metioniny odpowiadającej kodonowi ATG inicjacji translacji, dla 6 aminokwasów odpowiadających propeptydowi i dla 14 początkowych aminokwasów dojrzałej apo A-I ludzkiej (rysunek 2). Syntetyczny adaptor jest przeznaczony do zmniejszenia tworzenia się struktur ubocznych na końcu 5' genu. Aby to zrealizować, kodony wyselekcjonowane do kodowania reszt aminokwasów-6,-1,1,3,4, 5,6,7, 10, 11 i 14 nie odpowiadają kodonom naturalnym, co obserwuje się w DNAc klonu pULB1609.

Opisany wyżej syntetyczny adaptor stosuje się do przyłączenia fragmentu DNA 744 pb, pochodzącego z pULB1609, do promotora Pl lambda plazmidu ekspresji pULB1221.

Konstrukcję wektora ekspresji pULB1221 opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 186 643. Obejmuje ona trzy etapy główne przy stosowaniu plazmidu pCQV2. Plazmid pCQV2, opisany przez C. Queena w J. Mol. Appl. Genet. 2, 1-10 (1983), jest łatwo dostępny. Wybór tego szczególnego wektora nie jest obowiązkowy; można stosować każdy inny wektor posiadający promotora i, poniżej niego, odpowiednie miejsce Ncol. Około 0,1//g fragmentów syntetycznych, takich jak opisane powyżej, łączy się za pomocą ligazy T4 DNA, z około 1pg fragmentu BalT10 158 064

Pstl 744 pb, pochodzącego od pULB1609, i z około lpg wektora plazmidowego pULB1221 przeciętego Ncol i Bali.

Przed przeprowadzeniem połączenia, fragment BalI-PstI744 pb potraktowano polimerazą T4 DNA, tak, by przekształcić końce zajęte w 3' w końce wolne. Sposób ten jest dobrze znany i opisany szczegółowo przez T. Maniatisa i współprac, loc. cit.

Po powiększeniu w kompetentnych komórkach szczepu AR58 E. coli, zrekonstruowane plazmidy charakteryzuje się przez analizę miejsc restrykcji i przez sekwencję DNA fragmentów syntetycznych i miejsc łączenia. Zrekombinowany plazmid, pULB9291, jest zadowalający pod każdym względem, gdyż posiada fragmenty prawidłowo zorientowane i uporządkowane; może on być użyty do prób ekspresji.

3. Konstrukcja bakteryjnego wektora ekspresji zawierającego sekwencje połączone odpowiadające beta-galaktozydazie i proapo A-I ludzkiej i pULB9296 (rysunek 4). W konstrukcji tej sekwencja DNA kodująca dla proapo A-I ludzkiej jest włączona do fazy poprawnego odczytu, poniżej sekwencji DNA beta-galaktozydazy. Gen beta-galaktozydazy występuje w plazmidzie ekspresji E. coli pUR288, łatwo dostępnym [U. Ruther i B. Muller-Hill, EmBo J. 2, 1791—1794 (1983)], niosącym promotora lac skutecznie indukowanego i odpowiednie miejsce restrykcji w sekwencji beta-galaktozydazy. Odpowiedni zrekombinowany plazmid jest skonstruowany w sposób pokazany na rysunku 4. W pierwszym miejscu, DNA plazmidu pUR288 jest, kolejno, przecięta przez BamHI, potraktowana polimerazą T4 DNA i ponownie przecięta przez Sali. W drugim miejscu, fragment DNA 805pb wyizolowano z pULB9291 kolejno przez trawienie KpnI, traktowanie polimerazą T4 DNA i na końcu trawienie Sali. Oba fragmenty łączy się razem, w stosunku równomolowym za pomocą ligazy T4 DNA a otrzymany plazmid stosuje się do transformacji odpowiednich komórek szczepu JM 101 E. coli, który to szczep jest szeroko dostępny (ATCC No. 33876). Transformanty sprawdza się przez analizę restrykcyjną poprawnej orientacji sekwencji proapo A-I ludzkiej w stosunku do genu beta-galaktozydazy i w obecności miejsca BamHI rekonstytuowanego przy połączeniu obu sekwencji. Analiza ta wykazuje, że sekwencja proapo A-I ludzkiej jest dobrze przyłączona poniżej sekwencji DNA beta-galaktozydazy i w fazie popra wnego odczytu. Jeden z transformantów, zawierający plazmid pULB9296, jest zadawalający pod każdym względem i będzie stosowany w próbach ekspresji.

4. Konstrukcja plazmidu ekspresji drożdży niosącego sekwencję DNAc proapo A-I ludzkiej: pULB9299 (rysunek 5). W konstrukcji tej sekwencja DNAc, kodująca dla proapo A-I ludzkiej, jest klonowana pomiędzy sygnałami promotora i terminatora niesionymi przez plazmid ekspresji drożdży. Do tego doświadczenia wybrano wektor ekspresji drożdży pRIT 10774. Konstrukcję plazmidu ekspresji pRIT 10774 opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 151102. Skonstruowano go, z jednej strony, z plazmidu pRIT zdeponowanego w ATCC pod numerem 39133 zgodnie z dyspozycjami Traktatu Budapesztańskiego, i z drugiej strony, z wektora-czółenka YEp 13 dla E. coli-S. cerevisiae, opisane przez J. R. Broach i współprac., Gene, 8, 121-133 (1979), dostępnego w ATCC pod numerem 37115. Wektor pRIT 10774 może się replikować równocześnie w E. coli i w drożdżach; niesie on promotora i terminatora transkrypcji ornitynotransferazy karbamylowej (ARG3), rozdzielonych pojedynczym miejscem restrykcji BamHI dogodnym dla insercji obcego DNA posiadającego własny kodon ATG inicjacji translacji. Ponadto, wektor niesie sekwencję 2μ drożdży, markery metaboliczne dla selekcji w drożdżach i marker selekcji AmpA dla tworzenia łódeczki w E. coli. Nie jest to jedyny wektor jaki może być użyty do ekspresji proapo A-I ludzkiej w drożdżach; dowolny inny wektor dla drożdży niosący sygnały regulacyjne może być stosowany i będzie prowadzić do jakościowo podobnych rezultatów. Konstrukcja przedstawiona na rysunku 5 przebiega w sposób następujący. DNA plazmidu pRIT 10774 jest liniowane za pomocą enzymu BamHI i traktowane polimerazą T4 DNA.

Z drugiej strony, fragment DNA 810 pb jest wydzielany z pULB9291 przez trawienie enzymami Asp718 i Sali, a następnie traktowanie polimerazą T4 DNA. Fragment ten koduje dla proapo A-I ludzkiej i zawiera kodon ATG inicjacji translacji. Oba fragmenty, otrzymane jak opisano powyżej, łączy się razem, w stosunku równomolowym, za pomocą ligazy T4 DNA i mieszaninę stosuje do transformacji kompetentnych komórek E. coli MM294. Transformanty kontrolowane są przez analizę restrykcyjną dla sprawdzenia prawidłowej orientacji sekwencji DNA w proapo A-I ludzkiej w stosunku do sekwencji promotora ARG3. Jeden z transformantów

158 064 zawiera plazmid zrekombinowany, pULB9299, spełniający ten warunek. Plazmid pULB9299 jest poszerzony w E. coli i stosowany do transformacji sferoplastów drożdży Saccharomyces cerevisiae, szczep 10S44c (pep4-3, leu2-3, leu2-112); (T. Cabezon i współprac., loc. cit.).

Użycie szczepu Ic 1679d(ATCCNo. 20631) prowadziło do jakościowo podobnych rezultatów. Transformanty drożdży testowano następnie dla ekspresji proapo A-I ludzkiej.

5. Konstrukcja bakteryjnego wektora sekwencji zawierającego sekwencję DNAc proapo A-I ludzkiej i pNIV1612 (rysunki 6A, B i C). W konstrukcji tej, sekwencja DNA kodująca dla proapo A-I ludzkiej jest przyłączona, w fazie poprawnego odczytu, poniżej sekwencji DNA peptydu sygnalnego proteiny OmpA E. coli. Do próby tej wybrano wektor sekwencji pIN-III-ompA-2 [J. Ghrayeb i współprac. EMBO J. 3, 2437-2442 (1984)]. Wektor ten i jego szczep gospodarz E. coli JA221 są dostępne na zamówienie w „Department of Biochemistry of the State University of New York w Stany Brook.

Wektor sekrecji niesie silnego promotora Spp (lipoproteina), fragment promotor-operator lac, sekwencję lacl represora 1 ac i odpowiednie miejsca restrykcji usytuowane bezpośrednio za sekwencją kodującą dla peptydu sygnalnego genu ompA. Odpowiedni zrekombinowany plazmid jest skonstruowany jak to pokazano na rysunkach 6A, B i C. W pierwszym miejscu, wektor sekwencji pIN-III-ompA-2 jest liniowany EcoRI i traktowany polimerazą T4 DNA. W drugim miejscu, fragment DNA 805pb jest odcięty od pULB9291 przez trawienie, kolejno enzymami restrykcji Kpnli Sali a następnie traktowanie polimerazą T4 DNA. Fragment ten koduje dla proapo A-I ludzkiej i zawiera kodon ATG inicjacji translacji. Oba fragmenty otrzymane jak opisano wyżej łączy się razem, w stosunku równomolowym, za pomocą ligazy T4 DNA i mieszaninę stosuje do transformacji kompetentnych komórek szczepu JA221 E. coli hodowanych w środowisku MG (J. H. Miller, w „Experiments in Molekular Genetis, Cold Spring Harbor Laboratory, Nowy Jork, 1972, str. 431) zawierającym 20mg/l tryptofanu, 20mg/l leucyny, 2 g/1 laktozy i 50mg/l ampicyliny. Transformanty selekcjonuje się na oporność na ampicylinę i odsiewa z syntetycznym oligonukleotydem 18-merem (tym samym co stosowany w syntezie adaptora jak to pokazano na rysunku 2).

Wyselekcjonowane transformanty są kontrolowane przez analizę restrykcyjną dla sprawdzenia poprawnej orientacji sekwencji DNA proapo A-I w stosunku do sekwencji sygnalnego peptydu niesionego przez wektor sekrecji (miejsce EcoRI rekonstytuowane w połączeniu obu sekwencji). Jeden z transformantów niesie zrekombinowany plazmid, spełniający ten warunek. Sekwencja nadwyżkowa pochodząca z konstrukcji z adaptorem, podkreślona w następującej sekwencji nukleotydowej, 5' GTA GCG GAG GCC GCT GAA TTC ATG AGA CAT TTC TGG 3'

Val Ala Gin Ala Ala Glu Phe Met Arg His Phe Trp

QQ.-e zostaje usunięta przez sterowaną mutagenezę. W tym celu syntetyzuje się następujący oligonukleotyd 24-mer peptyd sygnalny proapo A-I

5' GTA GCG GAG GCC AGA CAT TTC TGG 3'

Val Ala Gin Ala Arg His Phe Trp pozbawiony 12 zasad nadwyżkowych. Stosuje się go do usuwania nadwyżkowej sekwencji 12 zasad pochodzącej z adaptora.

Do mutagenezy stosuje się układ Amershama. Układ ten opiera się na metodzie F. Ecksteina i współprac. [Nucleic Acids Res. 13, 8765-8785 (1985)]. Metoda daje wysoką wydajność pól i najwyższą skuteczność do dyspozycji i do 95%.

W pierwszym miejscu, region DNA klonuje się przed mutagenezą w wektorze M13. W tym celu, fragment DNA plazmidu zrekombinowany pIN-III-ompA-2 niosący gen proapo

A-I poddaje się insercji w wektorze M13mpl9 przeciętym przez Xbal i Hindll. Wektor M13mpl9 jest dostępny w handlu, można zakupić go u Amershama (Buckinghamshire, Wielka Brytania). Następnie, mutagenowany oligonukleotyd 24-mer hybrydyzuje się z matrycą monołańcuchową i wydłuża fragmentem Klenowa polimerazy DNA w obecności ligazy T4 DNA, uzyskując, mutant heterodupleksowy.

Selektywne usunięcie nici nie zmutowanej jest możliwe przez wprowadzenie tionukleotydu do nici zmutowanej podczas syntezy in vitro i rozszczepienie za pomocą Nall nici nie ulegającej

158 064 tionofosforylacji. Rozszczepienia takie posiadają miejsca dla egzonukleoazy III, która trawi nić nie zmutowaną. Nić zmutowaną stosuje się następnie jako matrycę dla konstrukcji cząsteczki kolistej dwuniciowej, tworząc w ten sposób zmutowaną cząsteczkę homodupleksową. Mutagenezę sprawdza się przez sekwencjonowanie łączenia pomiędzy peptydem sygnalnym i początkiem genu proapo A-I. Zrekombinowany plazmid pNIV1612 rekonstruuje się przez złączenie fragmentu Xba-I-HindIII wektora pIN-III-ompA-2 z fragmentem Xbal-Ball pozbawionym 12 zasad nadwyżkowych, z fragmentem Bal-I-HindIII genu proapo A-I.

Trzy fragmenty łączy się za pomocą ligazy T4 DNA a otrzymaną mieszaninę stosuje się do transformacji kompetentnych komórek E. coli JA221, jak opisano wyżej. Transformanty selekcjonuje się dla oporności na ampicylinę i odsiewa z oligonukleotydem 18-merem przytoczonym powyżej. Jeden z transformantów, niesie zrekombinowany plazmid pNIV1612. W końcowej konstrukcji sekwencja kodująca dla peptydu sygnalnego ompA poprzedza kompletną sekwencję proapo A-I bez kodonu ATG (rysunki 6A, B i C). Transformanty E. coli testuje się następnie na ekspresję proapo A-I ludzkiej.

6. Konstrukcja wektora transferowego dla wprowadzenia sekwencji DNAc proapo A-I ludzkiej do bakulowirusa: pNIV1613 (rysunek 7). Plazmid pNIV1613, niosący sekwencję DNA proapo A-I ludzkiej, skonstruowano przez umieszczenie segmentu pochodzącego z klonu pULB9291, poniżej promotora, genu polihedryny bakulowirusa (rysunek 7). W próbach tych stosowano wektor transferowy pAcRPó Bakulowirusa [Y. Matsuura i współprac. J. Gen. Virol. 67, 151^^1529 (1986)]; może on być otrzymany z „Department of Microbiology and Immunology Uniwersytetu w Ottawie. Plazmid niesie promotora genu polihedryny aż do nukleotydu-7 w sekwencji lidera w 5'; brak mu kodonu ATG polihedryny i 170 pierwszych nukleotydów sekwencji kodującej polihedryny. Odpowiednie miejsce BamHI jest zlokalizowane poniżej nukleotydu-7. Konstrukcję przedstawioną na rysunku 7 zrealizowano w sposób następujący: DNA plazmidu pAcRPó liniowano za pomocą BamHI. Z drugiej strony, fragment DNA 810 pb odcięto od pULB9291 przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Asp718 i Sali. Fragment ten koduje dla proapo A-I ludzkiej i zawiera kodon ATG inicjacji translacji. Oba fragmenty, w stosunku równomolowym, potraktowano razem polimerazą T4 DNA złączono za pomocą ligazy T4 DNA i użyto do transformacji kompetentnych komórek szczepu AR58 E.coli. Transformanty wyselekcjonowano dla ich oporności na ampicylinę, odsiano za pomocą syntetycznego oligonukleotydu 35-meru znakowanego ^3ZP (patrz rysunek 2), odpowiadającego części sekwencji DNA proapo A-I, i kontrolowano przez analizę restrykcyjną dla sprawdzenia poprawnej orientacji sekwencji DNA proapo A-I w stosunku do promotora genu polihedryny. Jeden z transformantów niesie zrekombinowany plazmid, pNIV1613, spełniający ten warunek; użyto go w próbach ekspresji.

7. Produkcja proapo A-I ludzkiej za pomocą transformowania mikroorganizmów. Hodowle 20 ml szczepu AR58 lub JM101 E. coli transformowane odpowiednio przez pULB9291 i przez pULB9296 hodowano w bogatym środowisku z dodatkiem 50//g/ml ampicyliny (bulion hodowlany LB, patrz T. Maniatis i współprac., loc. cit. dla szczegółów eksperymentalnych) do osiągnięcia gęstości optycznej 0,6 przy 630 nm. W przypadku pULB9291, indukcję promotora Pl lambda zrealizowano przez podniesienie początkowych warunków wzrostu hodowli z 30°C do 42°C, tak by inaktywowaćrepresor promotora Pl lambda [M. Rosenberg i współprac.: Methods Enzymol. 101, 123-138 (1983)]. Indukcję prowadzono w ciągu 20 minut.

W przypadku pULB9296, indukcję promotora lac prowadzono przez dodanie do hodowli, inkubowanej w temperaturze 37°C, induktora chemicznego IPTG (izopropylo-beta-D-tiogalaktozyd) do uzyskania stężenia końcowego 1 mM (R. Lorenzetti i współprac, loc. cit.). Indukcję prowadzono w ciągu 60 minut.

Z drugiej strony, hodowle 20 ml komórek drożdży 10S44c, transformowanych przez pULB9299, hodowano w temperaturze 30°C w środowisku zasady azotowej dla drożdży (Difco) z dodatkiem glukozy (1%), do uzyskania gęstości optycznej 0,3 przy 630 nm. Nie był potrzebny żaden induktor, gdyż w tym szczególnym przypadku ekspresja była konstytutywna.

Pobrano 1 ml próbki powyższych hodowli i wirowano je przy 15000.g w ciągu 5 minut. Otrzymane osady rozpuszczono we wrzącym dodecylosiarczanie sodu (DSS), postępując jak niżej. Osady zawieszono w 50μ1 buforu próbki zawierającej DSS 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% DSS, 6M mocznika, 5% 2-merkaptoetanolu i 10% gliceryny) i ogrzewano we wrzeniu w ciągu 3 minut w

158 064 temperaturze 100°C. Ekstrakty wirowano następnie przy 15000.g w ciągu 10 minut. Próbki poddano analizie przez elektroforezę na żelach poliakryloamidowych o stężeniu 15% lub 7,5%, w obecności DSS, w warunkach denaturacji (U. K. Laemmli, loc. cit.).

Po elektroforezie, żele poliakryloamidowe przemyto szybko 40 ml wody destylowanej i 40 ml buforu fosforanu sodu 50 mM o pH7,5. Proteiny przeniesiono następnie elektrycznie z żeli na arkusze nitrocelulozy w ciągu 2 godzin przy 60 V i 1,5A w tym samym buforze fosforanowym (T. Cabezon i współprac., loc. cit.). Arkusze nitrocelulozy nasycone albuminą (1%) w 50mM buforu fosforanu sodu o pH 7,5, po czym inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu nocy w obecności surowicy królika anty-apo A-I ludzkiej przy rozcieńczeniu 1/500 i (przeciwciał monoklonowanych anty-beta-galaktozydazy myszy w przypadku pULB9296) w takim samym buforze pozbawionym albuminy.

Arkusze przemyto 5 razy 40 ml tego samego buforu fosforanowego a następnie inkubowano w 40 ml buforu fosforanowego zawierającego 10pg/ml surowicy koziej anty-przeciwciał króliczych (lub anty-przeciwciał mysich i znakowanej peroksydazą. Po 4 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej arkusze przemyto ponownie 5 razy 40 ml buforu fosforanowego i ostatecznie wywołano przez dodanie 50 ml roztworu substratu chromogenu (10 mg diaminobenzydyny, 100μ1 nadtlenku mocznika o stężeniu 10% i 100 mM Tris-HCl o pH7,6).

W przypadku pULB9291 i pULB9299 znaleziono pojedynczy produkt reagujący z przeciwciałami anty-apo A-I ludzkiej. Ma on masę cząsteczkową zgodną z masą cząsteczkową wzorca apo A-I naturalnej. W przypadku pULB9296 znaleziono, w wymiarze przewidzianym dla sumy polipeptydów beta-galaktozydazy i proapo A-I (144 kDA), polipeptyd połączony reagujący z surowicą anty-apo A-I ludzkiej i z surowic anty-beta-galaktozydazy. Wymiary te oznaczono wcześniej za pomocą krzywej kalibracji opartej na migracji masy cząsteczkowej wzorców umieszczonych na takich samych żelach jak ekstrakty komórkowe.

W innym doświadczeniu, hodowle 20 ml szczepu JA221 E. coli transformowane przez pNI V1612 hodowano w bogatym środowisku z dodatkiem 50p/ml ampicyliny (bulion hodowlany LB, patrz T. Maniatis i współprac., loc. cit.). Do uzyskania gęstości optycznej 0,6 przy 630 nm. Indukcję promotora lac przeprowadzono przez dodanie do hodowli, inkubowanej w temperaturze 37°C, induktora chemicznego IPTG (izopropylo-beta-D-tiogalaktozyd) do stężenia końcowego 2 mM. Indukcję kontynuowano w ciągu 60 minut. Pobrano 1 ml próbki tych hodowli i odwirowano je przy 15000.g w ciągu 5 minut. Otrzymane osady poddano lekkiemu szokowi osmotycznemu w celu uwolnienia frakcji peri-plazmowej [D. Koshland i D. Botstein, Celi, 20, 749-760 (1980)]. Uwolnioną frakcję zawieszono w buforze próbki zawierającym wymieniony wyżej DSS, lecz pozbawionym mocznika, ogrzano do wrzenia, odwirowano i poddano elektroforezie na żelu poliakryloamidowym o stężeniu 12,5% w obecności DSS, a następnie immunodetekcji po transferze elektroforetycznym. Frakcję zsyntetyzowanej proapo A-I znaleziono w komórce a nie w periplazmie. Wynika to bądź z faktu, że proapo A-I nie została wydzielona bądź stąd, że skuteczność szoku osmotycznego nie była optymalna. Frakcję główną proapo A-I znaleziono uwolnioną w środowisku po szoku osmotycznym, co wskazuje, że proteina jest dobrze wydalana przez komórki.

Produkcja proapo A-I ludzkiej przez komórki owadzie zakażone bakulowirusem. Zrekombinowany plazmid pNIV1613 użyto wspólnie z dzikim szczepem bakulowirusa dla zakażenia komórek Spodoptera frugiperda w hodowli. Sortowanie wirusów zrekombinowanych pozbawionych polihedryny dostarcza pól zrekombinowanych. Zrekombinowany wirus został użyty do zakażenia komórek owadzich. Sposób postępowania jest dobrze znany i szczegółowo opisany przez M. D. Summers i G. E. Smith w „A Manuał of Methods for Baculovirus Vectors and Insect celi culture Procedures, Texas University, College Station, (1987)“. Zrekombinowany wirus testowano na produkcję proapo A-I immunologicznie po transferze elektroforetycznym i przez elektroforezę na żelu poliakryloamidowym o stężeniu 12,5% w obecności DSS, po rozpuszczeniu komórek za pomocą buforu RIPA [0,05 M buforu Tris-HCl, pH 7,2, zawierającego 0,15M Na Cl, 1% Trytonu Χ100,0,1% DSS, 0,1% dezoksycholanu sodu i 1 mM fluorku fenylometylisulfonylowego (FMPS)] i traktowaniu wrzącym DSS. Znaleziono jeden produkt reagujący z przeciwciałami anty-apo A-I ludzkiej. Ma on masę cząsteczkową zgodną z masą cząsteczkową wzorca apo A-I naturalnej a

158 064 wyrażona proteina stanowi główny składnik sumy wszystkich protein. Stężenie proapo A-I na litr hodowli, mierzone przez immunodyfuzję radialną prostą [G. Mancini i współprac. Immunochem. 2, 235-253 (1965)] oceniono na około 100 mg.

9. Produkcja cytoplazmowa proapo A-I ludzkiej w E.coli. Stosowanie minimalnego środowiska zdefiniowanego. Plazmid pULB9292 użyto do produkcji cytoplazmowej proapo A-I ludzkiej przez E. coli w środowisku minimalnym. pULB9292 skonstruowano wymieniając fragment EcoRI-NcoI plazmidu pULB9291, kodujący dla promotora Pl lambda, na taki sam fragment EcoRINcol plazmidu pOTS [M Rosenberg i współprac., Methods Enzymol. 101, 123-138 (1983)]. Fragment EcoRI-Ncol wektora pOTS [G. Devare i współprac., Celi, 36, 43-49 (1984)] zawiera także promotor Pl, skuteczny i regulacyjny, faga lambda. Prowadzono rozwój w środowisku minimalnym zdefiniowanym hodowli 20 ml szczepu AR58 E. coli transformowanego pULB9292. Skład środowiska minimalnego wynosił (na litr): 3 g Na2HPO4'2HzO, 3 g KH2PO4,0,5 g NaCl, 1 g NH4CI, 1,37 mM MgSO4'7H2O, 29,5 μΜ FeClr6H2O, 236μΜ MnSO4-H2O, lOg glukozy, 1 mg witaminy BI, 50mg ampicyliny, bulion hodowlany LB 1/20 (obj.). Komórki hodowano w tym środowisku do osiągnięcia gęstości optycznej 0,5 przy 630 nm. Indukcję promotora Pl lambda przeprowadzono przez podwyższenie początkowych warunków wzrostu hodowli z 30°C do 42°C, tak by inaktywować represor promotora Pl lambda (M. Rosenberg i współprac., loc. cit.). Indukcję kontynuowano w ciągu 60 minut. Pobrano 1 ml próbki hodowli i przepuszczono je przez prasę Frencha lub wirowano przy 15000.g w ciągu 5 minut. Otrzymany całkowity ekstrakt komórkowy lub osad traktowano DSS we wrzeniu, jak to opisano w punkcie 7. Po elektroforezie i transferze elektroforetycznym znaleziono pojedynczy produkt reagujący z przeciwciałami anty-Apo A-I ludzkiej. Ma on masę cząsteczkową zgodną z masą cząsteczkową wzorca apo A-I naturalnej. Zawartość proapolipoproteiny A-I wyrażona w środowisku minimalnym zdefiniowanym wynosi 13,5% wszystkich protein, a więc stężenie proapo A-I szacuje się na około 270 mg na litr hodowli.

Lo. izolacja, oczyszczanie i charakterystyka proapo A-I ludzkiej wyprodukowanej przez mikroorganizmy transformowane

10.1. Izolacja i oczyszczanie. Surowe ekstrakty proapo A-I zrekombinowanej wirowano przy 4000.g w ciągu 15 minut i odrzucono osad. Nadsącz wirowano przy 10000.g w ciągu 2 godzin. Otrzymany osad zawieszono w minimalnej objętości buforu (TEN 100) składającego się z 20 mM Tris-HCl,pH7,5; 1 mMEDTA, 100 mM NaCl; l,75pg/ml FPMS i 100pg/mlmertiolanusodu (sól sodowa kwasu etylo-rtęcio-tiosalicylowego) i objętości zawiesiny i nadsączu doprowadzono oddzielnie do objętości początkowej ekstraktu za pomocą tego samego buforu. Następnie wytrącono proteinę z obu zawiesin, stosując rosnące stężenia alkoholu izopropylowego. Oznaczono za pomocą immunodyfuzji radialnej (G. Mancine i współprac., loc. cit.), stosując handlowy wzorzec apo A-I, frakcję wytrąconej proteiny z każdej zawiesiny zawierającą główną część immunoreaktywności odpowiadającej apo A-I ludzkiej. Każdą tak otrzymaną frakcję oczyszczano przez chromatografię na kolumnie z Sephacrylem S200, stosując jako eluent ten sam bufor. Zbierano frakcje po 0,9 ml i w każdej z nich oznaczano, przez immunodyfuzję radialną, całkowitą ilość proteiny o immunoreaktywności odpowiadającej immunoreaktywności apo A-I. Masę cząsteczkową eluowanej proteiny we frakcjach oznaczano przez kalibrowanie kolumny wzorcami o znanej masie cząsteczkowej, takimi jak aldolaza, albumina, albumina surowicy bydlęcej, owalbumina, chymotrypsynogen i cytochrom C, w jednakowych warunkach. Czystość proapo A-I ma mg proteiny łącznej w głównych frakcjach zawierających zrekombinowaną proapo A-I, wyrażona w mg proteiny o takiej samej immunoreaktywności jak wzorzec handlowy apo A-I, oceniono na 95%.

10.2. Charakterystyka.

10.2.1. Własności fizyczne zrekombinowanej proapo A-I. Jeśli zrekombinowaną proapo A-I oczyszczoną i wyizolowaną z nadsączu i z osadu z wirowania przy lOOOOO.g, podda się ogniskowaniu izoelektrycznemu według procedury N. Catsimpoolas [9Anal. Biochem. 26, 54-62 (1969)], stosując gradient autogenerowany od pH 4 do pH 6, otrzyma się pojedyncze pasmo o punkcie izoelektrycznym ocenianym na 4,95. Plazmatyczna apo A-I ludzka okazuje się nieco bardziej kwaśna i ma punkt izoelektryczny oceniany na 4,75. Różnica 0,2 jednostki pH pomiędzy wartościami punktów izoelektrycznych zrekombinowanej proapo A-I i plazmatycznej apo A-I jest wyraźnie zgodna ze znaną różnicą pomiędzy wartościami punktów izoelektrycznych plazmaty158 064 cznej apo A-I i plazmatycznej proapo A-I, która wynosi 0,17 [G. L. Mills i współprac., Lab. Techn. Niochem. Mol. Biol. 14, 244-245 (1984)].

Jeśli chodzi o masę cząsteczkową, zrekombinowane proapo A-I z osadu i z nadsączu zawierają, oba pojedynczy łańcuch polipeptydowy o identycznych masach cząsteczkowych równych 29,9±l,4kDa. Plazmatyczna apo A-I ludzka okazuje się nieco mniejsza, gdyż ma masę cząsteczkową równą 29,3±l,3kDa.

10.2.2. Ustalanie mapy peptydów zrekombinowanej proapo A-I za pomocą BNPS-skatolu. Rozszczepienie chemiczne przeprowadzono za pomocą 3-bromo-3-metylo-2-[/2-nitrofenylo/tio]3H-indolu (BNPS-skatol) według procedury A. Fontana [Methods Enzymol. 25,419-423 (1972)]. Rozpuszczono 5-10 pg preparatów oczyszczonej proteiny w 100 μ\ roztworu o stężeniu 0,15% (obj.) fenolu w 50% roztworze wodnym (obj.) kwasu octowego. Następnie dodano 50pi roztworu 4,8 mg BNPS-skatolu na ml lodowatego kwasu octowego i inkubowano w temperaturze 25°C w ciągu 72 godzin. Następnie dodano 50/1 2-merkaptoetanoIu i inkubowano ponownie w ciągu 5 godzin w temperaturze 37°C. Próbki zatężono, rozpuszczono ponownie w H^Opl wody i ekstrahowano 3 razy 200pl octanu etylu. Fazy organiczne odrzucono a fazy wodne liofilizowano i analizowano przez elektroforezę na żelu poliakryloamid-DGG.

W przypadku rozszczepienia chemicznego przez BNPS-skatol liczba i rozmiar fragmentów pochodzących od apo A-I może być mniej więcej przewidziana, gdy weźmie się pod uwagę, że w zastosowanych warunkach eksperymentalnych BNPS-skatol odcina selektywnie po reszcie tryptofanu. Zakładając 100% skuteczność w każdym miejscu rozszczepienia, największym fragmentem jakiego należy się spodziewać będzie fragment C-terminalnej o 15,4kDa. Masy cząsteczkowe pozostałych fragmentów wynoszą od 0,5 do 5,3 kDa i są w związku z tym zbyt małe dla oznaczenia.

W przypadku rozszczepienia nie kompletnego fragmentu o 15,4 kDa będzie „wydłużony w kierunku końca N-terminalnego, tworząc fragmenty o 20,7 kDa, 23,1 kDa i 27,6 kDa, odpowiednio. Przewidywania te spełniają się bardzo dobrze dla plazmatycznej apo A-I ludzkiej, podobnie jak dla różnych oczyszczonych preparatów zrekombinowanej proapo A-I.

kufi

Asp718

SalI

AT6

A-I

810PB

AwA

FIG6C

FIG6B

SYNAt OOPA EcoOI (MBU00WA)

PROAPO A-I

FIG.6A

FIG.5

FIG. 3 ( _pULB 9291 jLow Af \ c^stop

5' <-35-mere-* 3' 5' <-30-mere-► 3'

CATD AGA CAT TTC TOG CA3 CA3 G^C GAA (ET CEA C AA TCT CETTCG GATAGA GTTAAG GAC TTC G

J <-18-mere->5' 3'«-43mere->5'

TCT GTAAAjAEEGTCGTCCIDCTTGGAGGTG TT AGA GGA ACCCATCT(AATTCCTOAACC

Met Arg His Phe Trp Gin Gin -6 -3 -1 terminalny NH2 propeptyd metioniny k-e-⁰⁰-!¹

Asp Glu Pro Pro ♦1 +3 apo A-I

Gin Ser Pro Trp Asp Arg Mol Lys Asp Leu Alla)

♦6 +9	+12	+14
Caoi -ao^) dojrzoTy

rozszcziepeeui propeptydtao apo A-I

FIG.2 ciąg dalszy Fl6 18

720 730 HA 750 760 770 780

TCAA(j(E(ϊ<GCT(]JA(GGACT(TGCEAAGGCCTGTC(GT(L·TCDΊCDGGACTJTCAAGGCTAKTT(ETCAG(]JTC AKPALE DL R 0 GLLPVL E SF KVSFL SA

210 220 230

790 800 810 820 830 840 850 860 (TCG^GAiTAEAl^AAGAA^^^ACECAGIGAGGCGHCGCCGCCG^CCCTTIEOG^^t^^/AGAATAAACGT LEEYTKKLNTO

240 Stop

870 878

HTG^AAAGT^GGG

FIG.1B

20 30 40 50 6 0 70

TCCC(^CTC(^it^trTTCAGG/TG^\/mrPKGCTG(JGAT^GG(nTGCTCTT(riGACGGGGAG(IAQGCTCGGCA

MKAAVLTLAVLFLTGSOARH

-20 -10

90 100 110 120 130 140 150 n7CTGGO^C5^CGK^Ci^C(ECA:GAGCiTGCGAr(I^OGAAIjGA(riGGCCACTGTGlACGTGGATGTG(:TC

F W O 0 DE PPO S P W D R V KDLATVYVDVL 1 10 20

160	170	180	130	200	210	220 230
CAC(ALA(AGGTC(CGCC7CTGTGTOITCjT^TTGCAύGA(ATGC(CTTG(GACCCACCAACCCA^ACAGATTTΓΓGACA
KOS	G R D	Y V	S 0 F	E G S A L	G K	0 L N L K L L D
		30		FIG.1A	40
ciqg dalszy	FIG 1A
240	250	260	270	280	290	300 310

ACIGGGACAG^(^Ai3CCCA£T^G^GAG030GAICAGCTCGC(CC^C(GTGAACCAGGAGiTTTGGGA^TAA^CCT NWDSVTSTFSKLREOLGPVTOEF WDNL

60 70

320 330 340 350 360 370 380 390

GGAACVGGAGCDL(&(G½ACCTA(GACGGC]GCAGcGTCAΔGCATCGlJGAGAACTTCAGGAACCG£TGACGACTΠCGATG

E KETEGLROEMSKDLEEVKAKOOPYL 80 90 100

400 410 420 430 440 450 460 470

GCTGACTTA^CGCCGGCATT^^GGAGΪA(ATπGC£ATTTAΪACCCGACGGlGίCCAEGC'n^G3AGACGA:AT^TTACG

DDFO K KWOE E Η E L Y R O K V E P L R A E L O
110	120
	FIG.1A
480 490 500	510 520	530 540	550

AGGGCGGGCGT/AGAAiCiaCAOGAGCnGjAAjAGAAjCfGAGaijCCnGGOKAGGAGAflGCGOjACCGOjCGCGCGC E GAROKLHELOE KLSPLGE EMRDRARA

130 140 150

560 570 580 590 600 610 620 630

CCATGΓGGACGC((CΓ(G(GCCOCATCTGG(ICCCTCCCGCGACCGCGAGCK(ACGA(Π^GG(OACAGAΓΠDCGGCT

Η V DAL RTHL APYSDE LRORLAARLE A 160 170 180

640 650 660 670 680 690 700 710

CTCAC£^CG^CC^G3(TΪ½CGCCAGA^C^^CGAG^^CttACL·C(ACC^G^(AC^ACGCiCA^CCACGCΪACAGATTCGAACιACCG L KE NGGARLAEYHAKATEHL STLSE K

190 200

FIG.1B

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 5000 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania ludzkiej proapolipoproteiny A-I, znamienny tym, że w odpowiednich warunkach hoduje się komórkę lub drobnoustrój stransformowany wektorem ekspresji zawierającym zrekombinowaną sekwencję DNA, kodującą ludzką proapolipoproteinę A-I, związaną funkcjonalnie z regulatorową sekwencją DNA ludzkiej proapolipoproteiny A-I, w której to zrekombinowanej sekwencji DNA fragment naturalnej sekwencji kodującej jest zastąpiony fragmentem DNA, kodującym te same aminokwasy, lecz o innej sekwencji nukleotydów, co ogranicza lub zapobiega tworzeniu się struktur szpilkowych i odzyskuje się wytworzoną ludzką proapolipoproteinę A-I.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się fragment naturalnej sekwencji kodującej aminokwasy -6 do +14 ludzkiej proapolipoproteiny A-I, zastąpiony fragmentem DNA o następującej sekwencji pojedynczej nici:

5' - ATGAGACATTTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTG-3', który koduje te same aminokwasy i zawiera dodatkowy kodon ATG inicjacji translacji oraz zmodyfikowane kodony dla następujących reszt aminokwasowych: -6, -1, +3, +4, +5, +6, +7, + 10, +11 oraz +14.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresji, zawierający sekwencję regulatorową DNA, obejmującą region promotora Pl faga lambda.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresji, zawierający sekwencję DNA, kodującą ludzką proapolipoproteinę A-I, przyłączoną poniżej sekwencji DNA beta-galaktozydazy oraz zawierający sekwencję regulatorową DNA, obejmującą region promotora lac.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresji, zawierający sekwencję regulatorową DNA, obejmującą regiony promotora i terminatora transkrypcji ARG3 drożdży.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresji, zawierający sekwencję DNA kodującą ludzką proapolipoproteinę A-I pozbawioną ATG, przyłączoną poniżej sekwencji DNA peptydu sygnalnego proteiny Ompa z E. Coli tak, że sekwencja regulatorowa DNA obejmuje regiony promotora lpp, promotora-operatora lac oraz sekwencję lac I represora lac.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresji, zawierający sekwencję regulatorową DNA, obejmującą region promotora genu polihedryny bakulowirusa.
8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresji w postaci zrekombinowanego plazmidu wybranego z grupy obejmującej pULB9291, pULB9292, pULB9296, pULB9299, pNIV1612 oraz pNIV1613.