SK279166B6 - Sekvencia rekombinantnej dna a spôsob výroby humán - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu výroby humánneho proapolipoproteínu A-I pomocou nových sekvencií rekombinantných DNA, ktoré obsahujú kód humánneho proapolipoproteinu A-I, pomocou klonovacích a expresných vektorov, ktoré túto DNA obsahujú a pomocou hostiteľských buniek, transformovaných týmito expresnými vektormi.

Doterajší stav techniky

Humánny apolipoproteín A-I (apo A-I) je hlavnou proteínovou zložkou lipoproteínov s vysokou špecifickou hmotnosťou (LDH) a chylomikrónov v lymfe. Pečeň a tenké črevo sú primárnymi miestami syntézy apo-A-I. Táto látka sa v uvedených orgánoch syntetizuje vo forme bielkovinového prekurzora, nazývaného preproapo A-I. Ku štiepeniu tohto preparátu dochádza vnútri buniek a proapo A-I je potom vylučovaný do plazmy a lymfy.

Proapo A-I obsahuje navyše šesť aminokyselín (Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln), ktoré sú naviazané na aminotenninálny koniec apo A-I. Len čo sa táto látka dostane do krvi, dochádza k jej rozštiepeniu in vivo špecifickým proteolytickým enzýmom apoA-I-propeptidázou za vzniku apo A-I.

Apo A-I je neglykozylovaný polypeptid so známou sekvenciou, ktorý je zložený z 243 aminokyselín, ako bolo uvedené v publikácii H.B. Brewer a ďalší, Biochem, Biophys. Res. Commun. 80 (1978), str. 623-630. Táto látka je kofaktorom pre plazmatický enzým lecitin cholesterolacyltransferázu, ktorá je zodpovedná za vznik väčšiny esterov cholesterolu v krvnej plazme. Pri vzniku porúch v štruktúre alebo v biosyntéze apolipoproteínu môže dôjsť tiež k poruchám v transportnom systéme plazmatických lipidov a tým aj k ochoreniu koronárnych tepien. Bolo dokázané, že aj keď sú množstvá apo A-I a LHD v krvnej plazme pomerne nízke, predstavujú zmeny v množstve týchto látok dôležité riziko pre vznik srdečných kríz (infarktu myokardu) aj pre vznik iných arteriosklerotických ochorení.

Mutácie génu, ktorý kóduje apo A-I boli spojené so znížením množstva LHD v krvi a tiež boli spojené so znížením predčasných ochorení koronárnych tepien.

Apo A-I a LHD sú hlavnými zložkami, ktoré sa v krvnej plazme zúčastňujú na transporte cholesterolu do periférnych tkanív, hlavne do artérií smerom k pečeni (čo býva tiež nazývané inverzným transportom cholesterolu) s cieľom jeho vylučovania z organizmu. Vzhľadom na to, že hromadenie cholesterolu v cievnom tkanive artérií je charakteristickým mechanizmom vzniku artériosklerózy, malo by byť možné stimuláciou inverzného transportu cholesterolu pôsobením apo A-I spomaliť alebo liečiť arteriosklerotický proces a tým tiež znížiť výskyt srdečných kríz.

Štiepenie prekurzora proapo A-I na apo A-I môže kvantitatívne prebiehať mimo bunky po dosiahnutí krvného riečišťa v čase kratšom ako 12 hodín. Vzhľadom na to, že proapo A-l je hlavným, keď nie jediným prekurzorom zrelého apo A-I, bolo by zrejme možné túto látku využiť na substitučnú liečbu vo všetkých prípadoch, pri ktorých dochádza k zníženiu množstva LHD, napríklad pri vrodených alebo získaných deficienciách tejto látky. V prípade, že by mal byť apo A-I vo všeobecnosti využívaný na liečebné ciele, bolo by potrebné navrhnúť spôsob, ktorým by túto látku bolo možné získať vo veľkých množstvách. Až dote raz sa uvedená látka získavala čistením apo A-I z krvnej plazmy.

V množstve publikácií, napríklad P. Cheung a L. Chán, Nucleic Acids Res. 11 (1983), 3703-3715, J.J. Seilhammer a ďalší, DNA 3 (1984), 309-307 a v japonskej patentovej prihláške č. 96 998-86, podanej 16.10.1984 a zverejnenej 15.5.1986 bolo dokázané, že je možné pripraviť komplementárnu DNA, ktorá kóduje preproapo A-I spôsobmi, ktoré používa genetické inžinierstvo.

R. Lorenzetti a ďalší v FEBS Lett. 194 (1986), 343-346 ukázali, že je možné dosiahnuť expresiu apo A-I v E. coli vo forme bielkoviny, ktorá je viazaná na β-galaktozidázu a nie je odštiepiteľná. Až doteraz boli snahy o expresiu zrelej bielkoviny apo A-I, nenaviazanej na ďalšiu látku, neúspešné.

V uvedenej japonskej patentovej prihláške č. 96 998-86, podanej 16.10.1984 a zverejnenej 15.5.1986 sa opisuje expresia bielkoviny, ktorá je podobná humánnemu apolipoproteínu A-I. Ku expresii došlo v E. coli, ktorá bola transformovaná plazmidom pHAIE-I obsahujúcim gén so štruktúrou génu pre apo A-I riadeným promotorom tac. Štruktúra uvedeného génu však nebola úplná, gén pozostával s kodónov pre aminokyseliny +4 až +243, pred týmito kodónmi bol kodón ATG ako počiatok translácie. V dôsledku toho obsahoval získaný produkt expresie N-terminálny metionín (zodpovedajúci kodónu ATG), ktorý môže vyvolať vznik vedľajších účinkov v prípade, že by sa táto látka použila na liečbu.

V publikácii J. B. Mallory a ďalší, J. Biol. Chem. 262 (1987), 4241-4247 a v patentových spisoch PCT WO 86-04920, zverejnenom 28.8.1986 a WO 87-02062, zverejnenom 9.4.1987, sa opisuje expresia humánneho apolipoproteínu A-I v ovariálnych bunkách čínskeho škrečka (tkanivová kultúra). V použitej konštrukcii bol využitý úplný gén pre humánny preproapolipoproteín A-I. Ovariálne bunky čínskeho škrečka pravdepodobne sú schopné transformovať prekurzor na zrelý apo A-I, pretože len 5 až 10 % vylučovanej bielkoviny uvedeného typuje proapo A-I, zatiaľ čo zvyšok je zrelý apo A-I. Produktivita získaného systému je však pomerne veľmi nízka, pretože množstvo 0,5 x 1θ6 buniek vylúči len 25 až 30 pg/ml apo A-I v priebehu 24 hodín. V patentovom spise PCT WO č. 87/02062, zverejnenom 9.4.1987 sa niekoľko príkladov uskutočnenia vzťahuje ku expresii humánneho apolipoproteínu A-I v bunkách iných hostiteľov, napríklad v bunkách baktérií (E. colí), v bunkách kvasiniek (S. cerevisiaé) a podobne. Ale napriek tomu ani v jednej z uvedených konštrukcií nebola použitá informácia pre formu proapo a proteínom, ku ktorého expresii došlo, nebol v žiadnom z uvedených prípadov humánny proapolipoproteín A-I.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka spôsobu výroby humánneho proapolipoproteínu A-I použitím rekombinantnej DNA tak, aby bol získaný zrelý proapo A-I, ktorý sa môže štiepiť špecifickým proteolytickým enzýmom apo A-I propeptidázou. Pod pojmom zrelý sa v prihláške nerozumie len humánny proapo A-I ako taký, ale aj zodpovedajúca bielkovina, v ktorej je prvou aminokyselinou metionín, ktorého prítomnosť je dôsledkom použitia iniciačného kodónu pre začiatok translácie ATG pri konštrukcii expresného vektora.

Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu sa používajú klonovacie a expresné vektory, ktoré obsahujú sekvenciu DNA, ktorá je kódom pre humánny proapo A-I tak, že získaná konštrukcia umožňuje amplifikáciu, v dôsledku toho tiež expresiu zrelého humánneho proteínu proapo A-I, ako aj met-proapo A-I, pričom takto získané látky môžu byť konjugované fúziou alebo môžu byť konjugované s Nterminálnym signálom. Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu sa tiež využívajú životaschopné tkanivové kultúry rôznych buniek alebo mikroorganizmov, ktoré boli geneticky pozmenené včlenením uvedených vektorov a sú preto schopné produkovať humánny polypeptid proapo A-

I. Okrem toho by malo byť spôsobom podľa vynálezu možné získať uvedenú látku v pomerne čistom stave bez ďalších bielkovín, ako je to pri izolácii z prirodzeného prostredia. Vzhľadom na špecifický spôsob prípravy je tiež možné získať humánny proapo A-I, ktorý je v podstate bez obvyklých endogénnych bielkovín a iných materiálov obvykle obsiahnutých pri iných spôsoboch výroby.

Vynález sa teda týka spôsobu výroby humánneho proapo A-I použitím techniky rekombinantných DNA. Tento spôsob nie je obmedzený na špecificky opísané príklady, ktoré ho len objasňujú.

Spôsob výroby humánneho proapolipoproteínu A-I spočíva podľa vynálezu v tom, že sa

1. pestuje za príslušných podmienok bunková kultúra alebo mikroorganizmus zo skupiny E. coli, Saccharomysec cerevisiae alebo buniek Spodoptera frugiperda transformovaný expresným vektorom, ktorý obsahuje reťazec rekombinantnej DNA, ktorý je kódom pre humánny proapolipoproteín A-I, viazaný operatívnym spôsobom na regulačnú sekvenciu DNA a včlenený medzi signály pre iniciáciu a termináciu translácie, pričom zo sekvencie reťazca rekombinantnej DNA, ktorý je kódom pre humánny apolipoproteín A-I je vypustený fragment prirodzeného kódového reťazca pre aminokyseliny -6 až +14 a je nahradený fragmentom DNA

5'- ATG AGA C AT TTC TGG CAG CAG GAC GAA CCT CCA CAA TCT CCT TGG GAT AGA GTT AAG GAC TTG-3', ktorý je kódom pre rovnaké aminokyseliny, pričom táto sekvencia navyše obsahuje iniciačný kodón ATG a modifikované kodóny pre aminokyseliny v polohách -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 a +14, čím dochádza k zníženiu alebo vylúčeniu tvorby štruktúr s dvojitým reťazcom a

2. takto získaný humánny apolipoproteín A-I sa izoluje.

Podstatou vynálezu je teda spôsob výroby bielkoviny, ktorá pozostáva zo zrelého humánneho proapo A-I alebo túto látku obsahuje, pričom je možné túto látku previesť in vitro alebo in vivo na zrelý humánny apo A-I pôsobením proteolytických enzýmov, hlavne apo A-I-propeptidázy. Produkt tejto reakcie, ktorým je humánny proapo A-I je možné využiť ako taký na liečebné ciele. Rovnako tak je možné využiť met-proapo A-I vzhľadom na to, že prítomnosť metionínového zvyšku je z farmaceutického hľadiska prijateľná, pretože tento produkt je možné previesť v prirodzených podmienkach a s vysokou účinnosťou v krvnom obehu pôsobením prirodzenej propeptidázy na autentický zrelý humánny apo A-I. Ak je to žiaduce, je možné získať humánny proapo A-I v mikroorganizmoch alebo vo zvolených tkanivových kultúrach buniek, ktoré sú schopné odstraňovať metionín na N-terminálnom konci a v dôsledku toho aj produkovať humánny proapo A-I vo forme, ktorá už neobsahuje N-terminálny metionín. Je tiež možné po stupovať, tak v prípade, že táto látka obsahuje N-terminálny metionín, ako v prípade, že ho neobsahuje, môže byť humánny proapo A-I in vitro rozštiepený a získa sa zrelý humánny apo A-I, ktorý je možné využiť na liečebné ciele. Rovnako v prípade, že je táto látka konjugovaná fúziou a konjugát obsahuje N-terminálny signál proapo A-I, je možné štiepením získať autentický humánny apo A-I, bez N-terminálneho metionínu.

Ďalšie dôležité hľadisko spôsobu podľa vynálezu spočíva v tom, že sa ako kód pre aspoň časť molekuly humánneho proapo A-I použije modifikovaná kódová sekvencia. Táto modifikovaná sekvencia, ktorá je kódom pre uvedenú látku, zlepšuje účinnosť translácie vzhľadom na to, že znižuje alebo úplne zabraňuje vzniku štruktúry s dvojitým reťazcom. Je pravdepodobné, že R. Lorenzetti a ďalší v publikácii FEBS Letters 194 (1986) 343-346 nemohli pozorovať expresiu zrelej bielkoviny apo A-I bez fúzie preto, že ich konštrukcia DNA vytvárala štruktúry s dvojitým reťazcom, čo mohlo viesť k neúčinnej expresii. Bolo s prekvapením zistené, že je možné dosiahnuť účinnú expresiu tak, že sa uskutoční príslušná modifikácia niektorých kodónov v sekvencií, ktorá je kódom pre aminokyseliny -6 až +14 reťazca pre proapo A-I. Pojem príslušná modifikácie, tak ako je tu používaný, znamená, že sa niektoré z prirodzených kodónov v uvedenej oblasti nahradia inými kodónmi, ktoré sú podľa genetického kódu kódom pre rovnaké aminokyseliny, pričom okrem toho všetky takto prevedené modifikácie vedú k zníženiu alebo dokonca k potlačeniu možnosti vzniku štruktúry s dvojitým reťazcom. Je tiež dôležité, že všetky uvedené modifikácie nemajú vôbec žiadny vplyv na miesto, v ktorom je uvedená látka štiepená enzýmom propeptidázou, pretože miesto v reťazci DNA, kde sa uvedené zmeny uskutočňujú, sú na inom mieste, takže sekvencia aminokyselín, vytvárajúca miesto pôsobenia enzýmu, zostáva zachovaná.

Predmetom vynálezu je teda spôsob výroby humánneho proapolipoproteínu A-I, pričom 1. sa pestuje za príslušných podmienok bunková kultúra alebo mikroorganizmus transformovaný expresným vektorom, ktorý obsahuje reťazec rekombinantnej DNA, ktorý je kódom pre humánny proapolipoproteín A-I, viazaný operatívnym spôsobom na regulačnú sekvenciu DNA a včlenený medzi signály pre iniciáciu a termináciu translácie, pričom zo sekvencie reťazca rekombinantnej DNA, ktorý je kódom pre humánny apolipoproteín A-I je vypustený fragment prirodzeného kódového reťazca a je nahradený fragmentom DNA, ktorý je kódom pre rovnaké aminokyseliny, ale na základe inej nukleotidovej sekvencie, čím dochádza k zníženiu alebo vylúčeniu tvorby štruktúr s dvojitým reťazcom a 2. takto získaný humánny apolipoproteín A-I sa izoluje.

Spôsobom podľa vynálezu je teda možné získať proapo A-I humánneho pôvodu ako produkt bunkovej kultúry alebo geneticky modifikovaného mikroorganizmu. Tento proapo A-I humánneho pôvodu môže byť získaný ako zrelý proapo A-I, vo forme proapo A-I, pred ktorým je uložený zbytok metionínu, vo forme zloženej bielkoviny, ktorou môže byť napríklad β-galaktozidáza-poapo A-I a vo forme zlúčeniny preproapo A-I. Takto získaný produkt je v podstate bez obvyklých endogénnych bielkovín a ďalších látok, ktoré sa obvykle vyskytujú v materiáloch získaných z prirodzených zdrojov, ako je krvná plazma v prípade získavanej bielkoviny. Tkanivové kultúry pre toto použitie alebo mikroorganizmy, využívané na produkciu uvedených látok, nie sú obmedzené na použite bunkovej línie alebo na špecifické organizmy. Na uvedený cieľ je možné použiť živočíšne a humánne bunkové línie. Len ako príklad je možné uviesť možnosť expresie v mikroorganizme Escherichia coli (ako predstaviteľ prokaryotických buniek), ďalej kvasinky Saccharomyses cerevisiae a tiež hmyzie bunky infikované bakulovírusom ako reprezentanti eukaryotických buniek.

Spôsobom podľa vynálezu je teda možné získať humánny apo A-I tak, že sa pôsobí na humánny proapo A-T enzýmom apo A-I-propeptidázou. Takto získaný apo A-I z humánneho proapo A-I, získaného spôsobom podľa vynálezu je identický s autentickou formou zrelého humánneho apo A-I a tiež neobsahuje metionínový zvyšok na N-terminálnom konci.

Pokiaľ ide o použitie takto získaných látok, je možné humánny proapo A-I, získaný spôsobom podľa vynálezu a/alebo humánny A-I spracovať na farmaceutické prostriedky, ktoré budú okrem uvedených látok obsahovať ešte aspoň jeden nosič, prijateľný z farmaceutického hľadiska, rozpúšťadlo, riedidlo a podobne, podľa predpokladaného spôsobu podania a podľa pomocných látok, obvykle používaných vo farmácii k uvedeným cieľom.

Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu sa používa sekvencia rekombinantnej DNA obsahujúca reťazec, ktorý je kódom pre humánny proapolipoproteín A-I, v ktorom bola časť prirodzenej kódovej sekvencie pre túto látku nahradená fragmentom DNA, ktorý je kódom pre rovnaké aminokyseliny ako prirodzená sekvencia, ale pozostáva z odlišnej sekvencie nukleotidov tak, aby bola znížená alebo úplne vylúčená tvorba štruktúr s dvojitým reťazcom. Podľa jedného z veľmi výhodných uskutočnení sa prirodzená sekvencia, ktorá je kódom pre aminokyseliny v polohách -6 až +14 v proapo A-I nahradí nasledujúcou sekvenciou: 5'- ATG AGA CAT TTC TGG CAG CAG GAC GAA CCT CCA CAA TCT CCT TGG GAT AGA GTT AAG GACTTG-3', pričom táto sekvencia navyše obsahuje iniciačný kodón pre transláciu ATG a modifikované kodóny pre aminokyseliny v polohách-6, -1,+1,+3,+4,+5,+6,+7,+10,+11 a+14.

Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu sa používajú klonovacie vektory obsahujúce uvedené rekombinantné DNA a expresné vektory, ktoré obsahujú uvedenú sekvenciu, ktorá je kódom pre humánny proapo A-I. Hlavne sa využívajú rekombinantné plazmidy pULB9291, pULB9292, pULB9296, pULB9299, pNIV1612 a pNIV1613, ktorých konštrukcia bude opísaná nižšie. Prvé z uvedených plazmidov, pULB9291 a pULB9292 obsahujú gén s modifikovanou štruktúrou génu pre proapo A-I, pred ktorým sa nachádza kodón ATG riadený promotorom Pl z fága lambda. Tieto plazmidy sú expresnými vektormi, ktoré je možné použiť v prípade E. coli, a ktorý riadi syntézu humánneho apo A-I v autentickej forme. V prípade, že sa tento plazmid včlení do E. coli, riadi plazmid pULB9296 expresiu bielkoviny, ktorá je viazaná na β-galaktozidázu, pričom je riadená oblasťou lac promotora z E. coli. Vzhľadom na to, že takto získaný produkt, obsahujúci humánny proapo A-I a β-galaktozidázu, obsahuje tiež reťazec, v ktorom dochádza ku štiepeniu pôsobením propeptidázy, je možné rozštiepiť ho za vzniku zrelého autentického humánneho apo A-I.

Plazmid pULB9299 je expresný vektor, ktorý je vhodný na použitie v kvasinkách a obsahuje oblasti promotora a terminátora transkripcie na zaistenie účinnej expresie v kvasinkách. Takto získaný humánny proapo A-I je tiež možné rozštiepiť pôsobením propeptidázy a získať tak zrelý autentický humánny apo A-I. Ako terminátor transkripcie sa v prípade kvasiniek výhodne použije ARG3 na zaistenie účinnej expresie.

Plazmid pNIV1612 obsahuje štruktúrny gén proapo A-I, spojený so sekvenciou DNA pre signálny peptid pre bielkovinu OmpA z E. coli riadený promotorom Ipp (lipoproteín) a promotorom operátora lac. V tejto konštrukcii je sekvencia, ktorá je kódom pre signálny peptid OmpA pred sekvenciou pre proapo A-I bez kodónu ATG pre počiatok translácie. Plazmid je príslušným sekrečným vektorom pre E. coli a riadi syntézu humánneho proapo A-I, ktorý môže byť vylučovaný do periplazmy bez N-terminálneho metionínového zvyšku. Plazmid pNIV1613 je vektor na prenos a včlenenie cDNA pre humánny proapo A-I do bakulovírusu. Obsahuje polyhedrinový promótor bakulovírusu a gén, ktorý je kódom pre štruktúru proapo A-I a obsahuje kodón ATG pre počiatok translácie. V spojení s kmeňom, ktorý je zdrojom bakulovírusu (Autographa californica polyhedrický vírus, AcNPV) riadi plazmid pNIV1613 syntézu proapo A-I v bunkách hmyzu a vzhľadom na zmeny, ku ktorým dochádza v hmyzích bunkách je ho možné týmto spôsobom získať bez N-terminálneho metioninového zvyšku.

Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu sa využívajú bunkové kultúry a mikroorganizmy, ktoré boli transformované klonovacím alebo expresným vektorom, tak ako bolo opísané, hlavne bunkové kultúry a mikroorganizmy, transformované a schopné produkovať humánny proapo A-I. Pod pojmom transformovaný, tak ako je používaný v prihláške, sa rozumie v širokom zmysle organizmus geneticky modifikovaný, takže nie je cieľom prihlášky obmedziť sa na úzky pojem bakteriálna transformácia. Podľa povahy použitého vektora a podľa zvoleného hostiteľa je možné použiť akúkoľvek vhodnú techniku, ktorá sa v súčasnosti v odbore genetiky používa, ako je napríklad transfekcia, transdukcia a podobne.

Kultúru buniek mikroorganizmov je možné využiť na produkciu humánneho proapolipoproteínu A-I tak, že sa uskutoční fermentácia pozmenených mikroorganizmov v priemyslovom meradle.

Cieľ, ktorý si vynález kladie, je v podstate možné dosiahnuť tiež použitím rôznych kmeňov mikroorganizmov, napríklad kmeňa MM 294 mikroorganizmu E. coli K12 (endoA thí, hsdR, supE), tento kmeň bol uložený vo verejnej zbierke kultúr Američan Type Culture Collection (ATTC č. 33 625), kde je k dispozícii bez obmedzenia, pokiaľ ide o jeho dostupnosť. Je však možné využiť aj ďalšie mikrobiálne kmene, napríklad niektoré známe kmene E. coli, ako E. coli B, E. coli x 1776 (ATCC č. 31537, kmeň uložený 3. júla 1979, dostupný bez obmedzenia), ďalej E. coli AR58, ktorý' je odvodený od kmeňa N99 (ATTC č. 33956) r clll~, cl 857, bio~ funkcie delta H-zbavený lambda (dodáva PL-PHARMACIA), mikroorganizmus bol opísaný v publikácii J.E. Mott a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82 (1985),88-92, G. Devare a ďalší, Celí 36, (1984), 43-49, ďalej je možné využiť kmeň E. coli JM101 (ATCC č. 33876), opísaný v publikácii Messing a ďalší, Nucleic Acids Res. 9 (1981 ), 309-321 alebo E. coli JA221 (Ipp-, hdsM⁺, trpES, leuBó, LacY, recl/F', lacl~, lac⁺, pro⁺), tento kmeň bol opísaný v publikácii L Ghrayeb a ďalší, EMBO J. 3 (1984), 2437-2442 alebo ešte ďalšie mikrobiálne kmene, z ktorých množstvo bolo uložené v rôznych verejných zbierkach, ako napríklad zbierka Američan Type Culture Collection (ATCC), ktorá vydáva katalógy mikro organizmov, ktoré sú v nej uložené. Z ďalších mikroorganizmov by bolo možné uviesť napríklad niektoré Bacili, napríklad Bacillus subtilis a ďalšie Enterobacteriaceae, z ktorých je možné uviesť napríklad Salmonella typhimurium alebo Serratia marcescens, pri ktorých je možné dosiahnuť replikáciu a expresiu reťazcov heterológnych génov.

Expresné plazmidy na použitie v baktériách, napríklad v prípade E. coli, sa obvykle získavajú tak, že sa vychádza z plazmidu pBR322, ktorý sa použije ako vektor (je uložený v zbierke ATCC pod číslom 37017) a do tohto plazmidu sa potom včleňuje príslušným spôsobom sekvencia heterológnych génov a súčasne tiež signál pre začiatok a termináciu translácie v príslušnom čítacom rámci s funkčným promotorom, pričom sa využívajú výhody prítomnosti prirodzene sa vyskytujúcich miest na pôsobenie reštrikčných enzýmov alebo sa také miesta synteticky vytvárajú. Vektor môže niesť jeden alebo väčší počet génov, ktoré sú charakterizované svojím výberom fenotypu a počiatkom replikácie zaisťujúcim amplifikáciu v bunkách hostiteľa. Včlenenú heterológnu sekvenciu je možné uložiť tak, aby dochádzalo k jej expresii súčasne s predchádzajúcou sekvenciou, s ktorou je požadovaná sekvencia spojená, ako je to napríklad v prípade génov systému lac.

Expresné vektory pre bakulovírus, napríklad plazmidy pAcRP6 alebo pAcYMl, opísané v publikácii Y. Matsuura a ďalší, J. Gen. Virol. 68 (1987), 1233-1250 a pre Autographa californica jadrový polyhedrický vírus (AcNPV) je tiež možné široko použiť. Tieto vektory sú podrobne opísané v literatúre a je ich možné získať od Texas Agricultural Experiment Station.

Na uskutočňovanie spôsobu podľa vynálezu je možné ako hostiteľské bunky pre kompatibilné vektory využiť tiež rôzne hmyzie bunky, napríklad bunky Spodoptera frugiperda Sf9, opísané v publikácii M.D. Summer a G.E. Smith: A manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celí Culture Procedures, Texas University College Station (1987). Kmeň bol uložený ako ATCC CRL 1711. Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu je tiež možné využiť expresné vektory, ktoré sú kompatibilné s rôznymi kmeňmi kvasiniek, napríklad plazmid YRp7, opísaný v publikácii D.T. Stinchcomb a ďalší, Náture 282 (1979). 39-43, ktorý je schopný selekcie a replikácie v E. coli aj v kvasinkách, hlavne v Saccharomyces cerevisiae.

Kvasinkové kmene, ktoré je možné použiť na uvedené ciele sú kmeňRH218, opísaný v publikácii G. Miozzari a ďalší, J. Bacteriol. 134 (1978), 48-59, ktorý bol uložený do Američan Type Culture Collection bez obmedzení pod číslom ATCC 44076, ďalej kmeňlOS44c, opísaný v publikácii T. Cabezon a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984), 6594-6598, ktorý je genotypom leu2-3, Ieu2-J12, pep4-3 a bol opísaný v publikácii M. Hoylaerts a ďalší, FEBS Lett. 204 (1986), 83-87 a ďalej kmeň lc 1697d (argj, leu2-ľ), bradytrofný pre arginín (ATCC 20 631 ).

V prípade, že je potrebné dosiahnuť expresiu heterológneho génu, ako je cDNA pre humánny proapo A-I v bunkách kvasiniek, je potrebné skonštruovať vektor, ktorým je obvykle plazmid s obsahom štyroch zložiek.

Prvou zložkou je fragment, ktorý dovoľuje transformáciu tak E. coli, ako kvasiniek, a ktorý preto musí obsahovať gén na selekciu, pôvodom z každého z týchto organizmov. Môže to byť gén rezistencie proti ampicilínu z E. coli (AmpA) a gén leu2 z kvasiniek. Potom uvedená konštrukcia vyžaduje ešte počiatok replikácie pôvodom z každého z uvedených organizmov, ktorý je možné zachovať a ko plazmidovú DNA v oboch uvedených organizmoch. Môže ísť o počiatok z E. coli z plazmidu pBR322 a o počiatok arsl z chormozómu II kvasiniek alebo o počiatok replikácie cirkulámeho typu DNA 2 μ.

Druhou zložkou plazmidu je sekvencia, uložená v polohe 5 'kvasinkového génu, pri ktorej dochádza k silnej expresii spolu s uskutočnením transkripcie štruktúrneho génu, ktorý'je za ňou uložený. Sekvencíou umiestnenou v polohe 5' môže byť sekvencia z génov THD3 alebo ARG3 z kvasiniek. Fragment sa zostrojí tak, že dôjde k vynechaniu reťazcov zo štruktúry génu THD3 alebo ARG3, pričom sa tieto reťazce nahradia reťazcami, ktoré obsahujú alternatívne miesta na pôsobenie reštrikčných enzýmov, napríklad na reštrikčné enzýmy Ncol alebo BamHl, takže je možné jednoducho zapojiť tento reťazec do polohy 5' v štruktúre uvedeného génu.

Treťou zložkou uvedenej konštrukcie je gén, ktorého štruktúra je skonštruovaná tak, že obsahuje zároveň signál ATG na počiatok translácie a signál na termináciu translácie.

Štvrtou zložkou uvedenej konštrukcie je reťazec DNA kvasinky, ktorý obsahuje sekvenciu uloženú do polohy 3 'génu kvasinky a obsahuje príslušné signály na termináciu transkripcie a na polyadenyláciu. Napríklad plazmidy, ktoré riadia produkciu humánneho proapo A-I v kvasinkách, môžu byť konštruované tak, že sa fragmenty génu pre humánny polypeptid proapo A-I uložia do miesta kde pôsobí reštrikčný enzým BamHl v expresnom plazmidc pRIT 10774, ktorý bol opísaný v európskej patentovej prihláške č. 151102, zverejnenej 7. 8. 1985.

Spôsob podľa vynálezu bude opísaný v súvislosti s priloženými výkresmi a tiež v súvislosti s opisom výhodných uskutočnení spôsobu podľa vynálezu, hlavne pokiaľ ide o konštrukciu vektorov a rekombinantnej DNA.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 A a 1 B je znázornená nukleotidová sekvencia a reťazec aminokyselín humánneho preproapo-A-I. Nukleotidová sekvencia mRNA humánneho proproapo A-I bola zistená na základe analýzy sekvencie DNA a cDNA klonu pULB1609. Aminokyseliny, ktorých prítomnosť je predpokladaná v signálnom peptide, propeptide a vlastnom úplnom polypeptide apo A.I sú uvedené a označené od prvého zvyšku aminokyseliny bielkoviny apo A-I. Podčiarknutá oblasť, ktorá zodpovedá syntetickej sonde DNA, bola použitá na izoláciu uvedeného klonu.

Boli použité nasledujúce jednopísmenové skratky na označenie aminokyselinových zvyškov:

A-alanín, C-cysteín, D-kyselina asparágová, E-kyselina glutámová, F-fenylalanín, G-glycín, H-histidín, I-izoleucín, K-lyzín, L-leucín, M-metionín, N-asparagín, P-prolin, Q-glutamín, R-arginín, S-serín, T-treonín, V-valín, W-tryptofán a Y-tyrozín.

Na obr. 2 je znázornená schéma na syntézu oligonukleotidového reťazca, ktorý bol použitý na konštrukciu fragmentu DNA, ktorý je kódom pre 6 aminokyselín propepetidu a pre prvých 14 aminokyselín úplného polypeptidu apo A-I spolu s iniciačným kodónom ATG. Označené sú oligonukleotidy použité na syntézu fragmentu Ncol-Ball s 65/61 bázovými pármi (bp).

SK 279166 Β6

Na obr. 3 je znázornená konštrukcia plazmidu pULB9291, ktorý obsahuje regulačnú oblasť P[Jambda a nukleotidovú sekvenciu pre proapo A-I.

Na obr. 4 je znázornená konštrukcia plazmidu pULB9296, ktorý obsahuje promotor lac z E. coli a nukleotidovú sekvenciu, ktorá je kódom pre β-galaktozidázu, spojenú so sekvenciou pre proapo A-I.

Na obr. 5 je znázornená konštrukcia plazmidu pULB9299, ktorá obsahuje regulačné oblasti ARG3 kvasiniek a okrem toho nukleotidovú sekvenciu pre proapo A-I.

Na obr. 6A, 6B, a 6C je znázornená konštrukcia plazmidu pNIV1612, ktorý obsahuje regulačnú oblasť lac a Ipp, ďalej kódovú sekvenciu pre signálny peptid ompA a nukleotidovú sekvenciu pre proapo A-I.

Na obr. 7 je znázornená konštrukcia plazmidu pNIV1613, ktorý obsahuje regulačnú oblasť polyhedrinového génu a nukleotidovú sekvenciu, ktorá je kódom pre proapo A-I.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príprava RNA

Celková RNA z ľudskej pečene sa pripraví spôsobom s použitím guanidiniumchloridu, opísaným v publikácii Cox R.A., Methods Enzymol. XII, časť B (1986), 120-129. Takto získaná RNA sa potom nechá prejsť cez kolónu s obsahom oligo(dT)-celulózy s cieľom získať celkovú polyA⁺RNA spôsobom podľa publikácie Maniatis a ďalší, Molecular Cloning (Cold Sprig Harbor Laboratory, Cod Spring Harbor, New York 1982). Z 10 g ľudskej pečene je týmto spôsobom možné získať 200 pg celkovej polyA+RNA.

Syntéza komplementárnej DNA (cDNA) in vitro

Reverzná transkripcia sa s použitím 0,1 až 5 pg polyA⁺RNA zaháji s použitím približne 1 pg oligo(dT) j 2-18 (Boehringer). Získaná cDNA s jedným reťazcom sa potom transformuje na cDNA s dvojitým reťazcom (dscDNA) pôsobením enzýmu reverznej transkriptázy. Vzorky tejto látky v množstve približne 1 pg sa spracovávajú pôsobením SI nukleázy s cieľom získať viazané zakončenia. Tento postup je v odbore dobre známy a bol podrobne opísaný v publikácii T. Maniatis a ďalší, tak ako bola uvedená. Potom sa na tieto voľné zakončenia naviaže oligo(dC) spôsobom, opísaným v publikácii Villa-Komaroff a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 (1978), 3727-3731. Obvykle sa pôsobí na 10 ng dscDNA enzýmom deoxynukleotidyltransferázou (terminálnou). Na 3'zakončení molekuly cdsDNA sa naviaže obvykle zvyšok s dĺžkou 15 báz.

Klonovanie cdsDNA s kohéznymi zakončeniami v plazmide pBR322

DNA plazmidu pBR322 sa linearizuje pôsobením enzýmu PstI a zakončenie sa vyplní oligo(dG) pôsobením podľa publikácie Lawn R.M. a ďalší, Nucleic Acids Res. 9 (1981), 6103-6114. Potom sa cdsDNA s kohéznymi zakončeniami oligo(dC) zmieša v ekvimolekulámom pomere s DNA plazmidu pBR322 s kohéznymi zakončeniami oligo(dG). Obvykle pri recirkularizácii plazmidu hybridizuje 50 pg zmesi. Podmienky tejto reakcie sú v odbore dobre známe a boli podrobne opísané v publikácii R.M. Lawna, tak ako bola uvedená. Hybridizačná zmes sa potom použije na transformáciu príslušných buniek kmeňa MM294 E. co li, napríklad spôsobom, opísaným v uvedenej publikácii R.M. Lawna a ďalší Selekciou pestovaním v prostredí s obsahom tetracyklínu je možné získať niekoľko stoviek transformantov, odolnosť proti tomuto antibiotiku je vlastnosťou plazmidu pBR322. Transformanty boli tiež skúšané na citlivosť na ampicilín. Tie, ktoré boli citlivé, obsahujú chimérny plazmid, takže včlenenie cudzorodej DNA do vektora inaktivuje gén na rezistenciu na ampicilín.

Triedenie získanej zostavy cDNA.

Transformanty E. coli boli triedené použitím syntetických oligonukleotidov a označené na ich 5'-zakončení pomocou 32p_; zakončenie zodpovedá fragmentu génu pre apo A-I. Sekvencia nukleotidov pre humánny apo A-I je známa napríklad z uvedených publikácií Cheunga a Chana a tiež J.J. Seilhamera a ďalší a je teda v dôsledku toho možné chemicky ju syntetizovať spôsobom, opísaným v publikácii N. Sinha a ďalší, Nucleic Acids Res. 12 (1984), 4539-4557 vo forme nukleotidovej sondy, ktorá obsahuje 22 báz, zodpovedajúcich 5'-zakončeniu uvedeného génu. Vybraný reťazec má nasledujúcu sekvenciu: 5'-GCTGCGGTGCTGACCTTGGCCG-3'. Pred použitím na hybridizáciu bol syntetický oligonukleotid fosforylovaný na svojom 5'-zakončení pôsobením T4-polynukleotidkinázy (P-L Biochemicals) a (gamma32p)ATP. Podmienky na ukončenie hybridizácie sú v odbore známe a boli podrobne opísané v uvedenej publikácii T. Maniatisa a ďalší a v publikácii A. Bollen a ďalší, DNA 2 (1983), 255-264.

Konštrukcia expresných plazmidov

Spôsob výroby DNA, izolácia fragmentov DNA, ako aj podmienky analýzy pôsobením reštrikčných enzýmov a podmienky naviazania fragmentov sú v odbore známe a boli podrobne opísané v publikáciách R.M. Lawna a ďalší a T. Cabezona a ďalší tak, ako boli uvedené a je ich možné v tomto prípade použiť.

Ďalej bude opísaná syntéza fragmentov na väzbu promótora expresného vektora na 5 'koniec génu.

Syntéza fragmentu Ncol-Ball

Na obr. 2 sú podrobne opísané princípy, ktoré sú podkladom pre oligonukleotidy s obsahom 35,30, 18 a 43 báz, ktoré sa používajú pri syntéze fragmentu Ncol-Ball s 65/61 bp. Syntetické fragmenty s 30 a 18 bázami sa na svojich 5 '-koncoch fosforylujú pôsobením enzýmu T4-polynukleotidkinázy (P-L Biochemicals). Potom sa 1 pg každého oligonukleotidu vrátane oligonukleotidov s 35 a 43 bázami, niektoré nie sú fosforylované, hybridizuje 3 minúty pri teplote 95 °C v 300 mM octane sodnom s pH 7,0, a potom sa zmes nechá pomaly schladiť na teplotu 4 °C. Potom sa hybridizačná zmes použije ako taká v priebehu klonovania na konštrukciu expresných plazmidov.

Určenie sekvencie DNA

Analýza sekvencie DNA bola urobená spôsobom, opísaným v publikáciách A.M. Maxam a W. Gilbert Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560-564 a F. Sanger a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 % 1977, 5463-5467.

Analýza bielkovín

Usadeniny buniek s hustotou 1 jednotky pri 630 nm (1 OD630) sa získajú v rôznych stupňoch v priebehu fermentácie kmeňov, ktoré obsahujú plazmidy na expresiu humánneho proapo A-I, pULB9291, pULB9292,

SK 279166 Β6 pULB9296 a pULB9299 (použité na transformáciu kmeňov AR58 a JM101 E. coli a kmeňa 10S44c kvasiniek). Každá vzorka sa znova rozsuspenduje v pufri 50mM trisHCl s pH 6,8 s obsahom 2% dodecylsíranu sodného (DSS), 6 M močoviny, 10 % glycerolu a 5 % 2-merkaptoetanolu, zmes sa zahreje na 3 minúty na teplotu varu, a potom sa vzorky podrobia elektroforéze na polyakrylamidovom géli podľa publikácie U.K. Laemmli, Náture 227, (1970), 680685. Na detekciu bielkovín sa použije Coomasi modrá a syntetizovaný humánny proapo A-I sa identifikuje po elektroforetickom prenose imunologický (A. Bollen a ďalší).

Konštrukcia rekombinantných vektorov na expresiu humánneho proapo A-I v baktériách, kvasinkách a bunkách hmyzu, infikovaných bakulovírusom.

1. Kloň cDNA pre humánny preproapo A-I: pULB1609 (obr. 1 ).

Niekoľko stoviek transformantov, získaných klonovaním cdsDNA, zodpovedajúcich polyA⁺RNA z ľudskej pečene, v Pstl mieste plazmidu pBR322 sa selektuje pomocou syntetického oligonukleotidu ako sondy s 22 nukleotidmi pre apo A-I, tak ako bola opísaná. Pri jednom z klonov bolo možné pozorovať v priebehu sledovania intenzívny hybridizačný signál. Tento kloň, ktorý bol označený pULB1609 bol izolovaný a včlenená DNA obsiahnutá v tomto plazmide bola charakterizovaná analýzou jej sekvencie. Dĺžka tejto včlenenej sekvencie je 878 bázových párov (bp). Táto DNA je kódom pre úplný humánny polypeptid preproapo A-I. Ako je znázornené na obr. 1, klonovaný fragment cDNA obsahuje nekódové oblasti na 3' a 5' konci s 19 bp a 55 bp, ďalej 54 bp sekvenciu, ktorá je kódom pre prekurzor (aminokyselina -24 až -7), 18 bp sekvenciu pre propeptid (aminokyseliny -6 až -1 ) a 732 bp sekvenciu, ktorá je kódom pre úplný apo A-I (aminokyseliny 1 až 243) spolu s terminačným kodónom na ukončenie translácie. Bielkovinový reťazec odvodený od tejto sekvencie DNA presne zodpovedá sekvencii aminokyselín, ktoré sú obsiahnuté v proproapo A-T v nezávisle izolovaných klonoch cDNA (W.C. Barker a ďalší, Comp. Biochem. Physiol. 57B, (1977), 309-315, japonská patentová prihláška č. 96998/86, P. Cheung a L. Chán a J,J. Seilhamer a ďalší).

2. Konštrukcia bakteriálneho expresného vektora, ktorý obsahuje sekvenciu cDNA humánneho proapo A-I: pULB9291 (obr. 2 a 3).

Plazmid pULB9291, pri ktorého expresii vzniká humánny proapo A-I je možné skonštruovať tak, že sa vloží segment z klonu pULB1609 za regulačnú oblasť promotora PL lambda, ako je znázornené na obr. 3. Konštrukcia tohto expresného plazmidu vyžaduje syntézu fragmentov DNA, ktoré obsahujú miesto pôsobenia reštrikčného enzýmu Ncol, iniciačný kodón ATG pre počiatok translácie a sekvenciu nukleotidov, ktorá je kódom pre aminokyseliny štruktúrneho génu humánneho proapo A-I až po prvé miesto pôsobenia reštrikčnej endonukleázy Balí, ako je znázornené na obr. 2.

Pomocný reťazec sa pripraví syntetickým spôsobom (N.D. Sinha a ďalší). Pripravia sa štyri syntetické oligonukleotidy, po hybridizácii sú kódom pre metionín, zodpovedajúci iniciačnému kodónu ATG pre počiatok translácie, pre 6 aminokyselín, zodpovedajúcich propeptidu a pre 14 prvých aminokyselín úplného humánneho apo A-I, ako je znázornené na obr. 2. Pomocný reťazec bol syntetizovaný preto, aby bola tvorba sekundárnych štruktúr na 5'konci génu znížená na najnižšiu mieru. Na tento cieľ boli vybrané kodóny, ktoré sú kódom pre aminokyseliny -6,-1, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 a 14 tak, že nezodpovedajú prirodzeným kodónom pre tieto aminokyseliny, ktoré je možné nájsť v cDNA klonu pULB 1609.

Uvedený pomocný reťazec sa použije na spojenie 744 bp fragmentu DNA z plazmidu pULB1609 s promotorom PL lambda v expresnom plazmide pULB 1221.

Konštrukcia expresného vektora pULB 1221 je opísaná v európskom patentovom spise č. 186 643. Táto konštrukcia pozostáva z troch základných etáp, vychádza sa z plazmidu pCOV2. Plazmid pCOV2 je opísaný v publikácii C. Queen, J. Mol. Appl. Genet. 2 (1983), 1-10 a je voľne dostupný.

Voľba určitého vektora nie je záväzná. Je možné použiť akýkoľvek iný vektor, ktorý obsahuje promotor a pred ním príslušné miesto na pôsobenie reštrikčného enzýmu Ncol. Naviaže sa približne 0,1 pg opísaných syntetických fragmentov pôsobením T4 DNA-ligázy na približne 1 ug 744 bp fragmentu Bal-Pstl z plaumidu pULB 1221 a približne 1 pg vektora, ktorým je plazmid pULB1221, rozštiepený Ncol a Balí.

Pred uskutočnením väzby sa 744bp fragment Ball-Pstl spracováva pôsobením T4 DNA-polymerázy tak, že sa zakončenia zmenia na 3' kohézne konce. Tento postup je v odbore známy a bol opísaný v uvedenej publikácii T. Maniatis a ďalší.

Po amplifikácii v príslušných hostiteľských bunkách kmeňa AR58 E. coli boli rekonštruované plazmidy charakterizované analýzou reštrikčných miest a určením sekvencie DNA syntetických fragmentov a miest spojení. Jeden z rekombinantných plazmidov, pULB9291 spĺňal všetky kritéria, pretože obsahoval všetky fragmenty v správnom poradí a smere, tento plazmid bol použitý na štúdium expresie.

3. Konštrukcia bakteriálneho expresného vektora, ktorý obsahuje zloženú sekvenciu β-galaktozidázy a humánneho proapo A-I: plazmid pULB9296 (obr. 4).

Pri tejto konštrukcii sa sekvencia DNA, ktorá je kódom pre humánny proapo A-I vloží pred sekvenciu DNA, ktorá je kódom pre β-galaktozidázu v správnom poradí a spojí sa s touto sekvenciou. Gén na β-galaktozidázu sa nachádza v E. coli expresnom plazmide pUR288, ktorý je voľne dostupný, bol opísaný v publikácii U. Ruther a B. Muller-Hill, EMBO J., 2 (1983), 1791-1794 a nesie lac promotor v účinnej forme a okrem toho obsahuje príslušné reštrikčné miesta na sekvenciu β-galaktozidázy. Príslušný rekombinantný plazmid sa skonštruuje tak, ako je znázornené na obr. 4. Predovšetkým sa DNA plazmidu pUR288 rozštiepi pôsobením enzýmu BamHl, potom sa spracováva pôsobením T4-DNA-polymcrázy, a potom sa znovu štiepi enzýmom Sali. Potom sa postupne izoluje fragment s veľkosťou 805 bp z plazmidu pULB9291 štiepením restriktázou Kpnl, pôsobením T4-DNA-polymerázy a nakoniec štiepením restriktázou Sali. Oba fragmenty sa naviažu v molámom pomere pôsobením T4-DNA-ligázy a získaný plazmid sa použije na transformáciu hostiteľských buniek kmeňa JM101 E. coli, ktorý je voľne dostupným kmeňom ATCC č. 33 876. Získané transformanty sa overia reštrikčnou analýzou na dôkaz správnej orientácie sekvencie pre humánny proapo A-I vzhľadom na gén na β-galaktozidázu a na prítomnosť BamHl reštrikčného miesta, ktoré sa rekonštruuje spojením oboch uvedených sekvencii. To znamená, že sekvencia, ktorá je kódom pre humánny proapo A-I je zaradená pred sekvenciu na β-galaktozidázu v správnom čítacom rámci. Jeden z transformantov, obsahujúci plazmid pULB9296 spĺňal všetky kritéria a bol potom použitý na štúdium expresie.

4. Konštrukcia kvasinkového expresného plazmidu pULB9299, ktorý obsahuje sekvenciu DNA, ktorá je kódom humánneho proapo A.I (obr. 5).

Pri tejto konštrukcii sa sekvencia cDNA, ktorá je kódom pre humánny proapo A-I klonuje medzi signálom promótora a terminačným kodónom v kvasinkovom expresnom plazmide. Na tieto pokusy bol vybraný kvasinkový expresný vektor pRIT 10774. Konštrukcia kvasinkového expresného vektora pRIT10774 je opísaná v európskej patentovej prihláške č. 151 102. Tento vektor bol skonštruovaný na jednej strane z plazmidu pRIT 10749, uloženého v zbierke ATCC pod číslom 39133 podľa Budapeštianskej dohody a na druhej strane z vektora Yepl3 pre E. coli Sacharomyces cerevisiae, ktorý bol opísaný v publikácii J.R. Broach a ďalší, Gene, 8 (1979), 121-133, a ktorý je dostupný v zbierke ATCC pod číslom 37 115. Vektor pRIT 10774 je schopný replikácie v E. coli aj v kvasinkách a nesie promotor a terminátor transkripcie omitínkarbamoyl transferázy (ARG3), ktorý je oddelený jedným BamHl reštrikčným miestom, vhodným na včlenenie cudzorodej DNA spolu s príslušným iniciačným kodónom ATG pre počiatok translácie. Okrem toho obsahuje vektor 2 μ sekvencie kvasiniek, metabolické označenie na selekcie v kvasinkách a značenie AmpA na selekciu po transformácii E. coli týmto vektorom. Nie je to však jediný vektor, ktorý by bolo možné použiť na umožnenie expresie humánneho proapo A-I v kvasinkách. V podstate je možné použiť akýkoľvek iný kvasinkový vektor, ktorý obsahuje regulačné signály a jeho použitie potom povedie k získaniu kvalitatívne podobných výsledkov. Konštrukcia, ktorá je znázornená na obr. 5 sa uskutočňuje nasledovným spôsobom: DNA plazmidu pRIT10744 sa linearizuje pôsobením restrikázy BamHl a potom sa na ňu pôsobí T4-DNA-polymerázou.

Ďalej bol z plazmidu pULB9291 pôsobením restriktáz Asp 718 a Sali izolovaný fragment s 810 bp a tento fragment bol potom podrobený pôsobeniu T4-DNA-polymerázy. Tento fragment je kódom pre humánny proapo A-I a súčasne obsahuje aj iniciačný kodón ATG pre počiatok translácie. Oba fragmenty získané uvedeným spôsobom sa vzájomne naviažu v ekvimolárnom pomere pôsobením T4-DNA-ligázy a získaná zmes sa použije na transformáciu príslušných buniek E. coli kmeňa MM 294. Transformanty sa sledujú pomocou reštrikčnej analýzy, aby bolo možné overiť správnu orientáciu sekvencie DNA pre humánny proapo A-I vzhľadom na sekvenciu promótora ARG3. Jeden z transformantov obsahoval rekombinantný plazmid pULB9299, ktorý spĺňal všetky požiadavky. Tento plazmid pULB9299 bol schopný amplifikácie v E. coli a potom bol použitý na transformáciu sféroplastov kvasinky Saccharomyces cerevisiae, kmeň 10S44c (pep4-3, leu2-3, leu2-112) podľa uvedenej publikácie T. Cabezona a ďalší.

Použitie kmeňa Ic 1679d (ATCC č. 20631 ) viedlo k získaniu kvalitatívne podobných výsledkov. Transformanty kvasiniek potom boli skúmané na schopnosť exprimovať humánny proapo A-I.

5. Konštrukcia bakteriálneho vektora obsahujúceho sekvenciu DNA pre humánny proapo A-I: pNIV1612 (obr. 6A, 6B, 6C).

Pri uskutočňovaní tejto konštrukcie sa sekvencia DNA, ktorá je kódom pre humánny proapo A-I zaradí v správnom čítacom rámci za sekvenciu signálneho peptidu bielkoviny OmpA z E. coli. Na toto sledovanie bol vybraný sekrečný vektor pIN-III-om/M-2, opísaný v publikácii J. Ghrayeb a ďalší, EMBO J. 3 (1984), 2437-2442. Tento vektor a týmto vektorom transformovaný kmeň E. coli JA221 sú po vyžiadaní dostupné v Department of Biochemistry of the State University of New York (Stony Brook).

Tento sekrečný vektor obsahuje veľmi účinný promotor Ipp (lipoproteín), fragment promotora-operátora lac, sekvenciu lacl represore lac a príslušné reštrikčné miesta, uložené bezprostredne za sekvenciou, ktorá je kódom pre signálny peptid génu ompA. Príslušný rekombinantný plazmid je možné skonštruovať spôsobom, ktorý je znázornený na obr. 6A, 6B a 6C. V prvom rade sa sekrečný vektor pIN-Ill-cw/M-2 linearizuje restriktázou EcoRI a potom sa podrobí pôsobeniu T4-DNA-polymerázy. Potom sa z plazmidu pULB9291 vyberie fragment s veľkosťou 805 bp tak, že sa postupne pôsobí restriktázami Kprtl a Sal, a potom sa na získanú zmes pôsobí T4-DNA-polymerázou. Uvedený fragment je kódom pre humánny proapo A-I a obsahuje iniciačný kodón ATG pre počiatok translácie. Oba takto získané fragmenty sa navzájom naviažu v ekvimolámom pomere pôsobením T4-DNA-ligázy a takto získaná zmes sa potom použije na transformáciu príslušných buniek kmeňa JA221 E. coli, pestovaných na živnom médiu M9, opísanom v publikácii J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1972, str. 431. Médium obsahuje 20 mg/I Tryptofánu, 20 mg/I leucínu, 2g/l laktózy a 50 mg/1 ampicilínu. Získané transformanty sa podrobia selekcii podľa rezistencii na ampicilín a potom sa triedia s použitím oligonukleotidu s obsahom 18 báz. Ide o syntetický oligonukleotid, ktorý bol použitý tiež pri syntéze pomocného reťazca, ako je znázornená na obr. 2.

Transformanty, ktoré boli získané selekciou, sa potom podrobia kontrole reštrikčnou analýzou ich sekvencie na overenie správnej orientácie sekvencie DNA pre humánny proapo A-I vzhľadom k sekvencii DNA, ktorá je kódom pre signálny peptid, obsiahnutý v sekrečnom vektore (v mieste spojenia oboch sekvencii je rekonštituované reštrikčné miesto pre EcoRI). Jeden z transformantov nesie rekombinantný plazmid, ktorý spĺňa všetky požiadavky. Riadenou mutagenézou sa potom odstráni prebytočná sekvencia, ktorá pochádza z konštrukcie pomocného reťazca a ktorá je v nasledujúcej nukleotidovej sekvencii podčiarknutá:

5'- GTA GCG GAG GCC GCTGAATTCATG AGA CAT TTC TGG - 3' Val Ala Gin Ala Ala Glu Phe Met Arg His Phe Trp aa^

Na tento cieľ sa skonštruuje nasledujúci oligonukleotid, obsahujúci 24 báz signálny peptid---------m---------------proapo A-I

5'-GTA GCG GAG GCC AGA CAT TTC TGG-3' Val Ala Gin Ala Arg His Phe Trp zbavený 12 prebytočných báz a táto sekvencia sa potom použije na odstránenie prebytočnej sekvencie, obsahujúcej 12 báz z pomocného reťazca.

Na uskutočnenie mutagenézy sa použije Amershamov systém. Tento systém je založený na postupe, ktorý bol uvedený v publikácii F. Eckstein a ďalší, Nucleic Acids Res.

13, (1985), 8765-8785. Tento postup poskytuje vysoké výťažky a jeho celková účinnosť je až 95 %.

V prvom rade sa tá oblasť DNA, ktorá má byť podrobená mutagenéze, klonuje vo vektore M13. Na tento cieľ sa včlení fragment DNA medzi reštrikčné miesta Xbal-Ball rekombinantného plazmidu pIN-III-ow/iX-2, ktorý obsahuje gén pre proapo A-I do vektora M13mpl9, poštiepeného restriktázami Xbal a Hindll. Vektor M13mpl9 sa bežne dodáva a je ho možné získať na objednávku (Amersham, Buckinghamshire, Veľká Británia). Potom sa oligonukleotid s obsahom 24 báz, získaný mutagenézou hybridizuje s jednoreťazcovou matricou a predĺži sa použitím Klenowovho fragmentu DNA-polymeráza za prítomnosti T4-DNA-ligázy a vzniká heteroduplexný mutant.

Selektívne odstránenie nemutovanej sekvencie je možné uskutočniť včlenením trinukleotidu do mutovanej sekvencie v priebehu syntézy in vitro s následným štiepením reťazca, ktorý neobsahuje fosfotionát pôsobením reštrikčnej endonukleázy NCil. Tento reťazec obsahuje miesto na štiepenie endonukleázou III, ktorá rozštiepi nemutovaný reťazec. Mutovaný reťazec sa teda používa ako matrica na rekonštrukciu cirkulámej molekuly s dvoma reťazcami, čím dochádza k vzniku homoduplexnej mutovanej molekuly. Priebeh mutagenézy je možné overiť analýzou sekvencie medzi signálnym peptidom a začiatkom génu, ktorý je kódom pre proapo A-I. Rekombinantný plazmid pNIV1612 sa rekonštruuje tak, že sa naviaže fragment vektora pIN-III-omp4-2 poštiepený reštrikčnými enzýmami Xbal a HindlII s fragmentom poštiepením enzýmami Xba-Ball, ktorý bol zbavený 12 prebytočných báz a s fragmentom génu pre proapo A-I poštiepeným enzýmami Balí a HindlII.

Všetky tri fragmenty sa naviažu pôsobením T4-DNA-ligázy a získaná zmes sa použije na transformáciu príslušných buniek E. coli kmeňa JA221, ako už bolo uvedené. Získané transformanty sa podrobia selekcii na rezistenciu na ampicilín a potom sa triedia použitím oligonukleotidu, ktorý obsahuje 18 báz, ako už bolo uvedené. Jeden zo získaných transformantov obsahuje plazmid pNIV1612. Ide o rekombinantný plazmid, v ktorého konštrukcii je vložená sekvencia, ktorá je kódom pre signálny peptid ompA pred úplnou sekvenciou pre proapo A-I bez iniciačného kodónu ATG, ako je znázornené na obr. 6A, 6B a 6C. Pri takto získaných transformantoch E. coli sa sleduje ich schopnosť exprimovať humánny proapo A-I.

6. Konštrukcia vektora na prenos a včlenenie sekvencie cDNA pre humánny proapo A-I do bakulovirusu: pNIV1613, obr. 7.

Plazmid pNIV1613, ktorý obsahuje sekvenciu DNA, ktorá je kódom pre humánny proapo A-I je možné skonštruovať tak, že sa vloží reťazec z klonu pULB9291 pred polyhedrinový gén bakulovirusu, ako je znázornené na obr.7. Na tieto pokusy bol použitý bakulovírusový prenosný vektor pAcRPó, ktorý bol opísaný v publikácii Y. Matsuura a ďalší, J. Gen. Virol. 67, (1986), 1515-1529. Tento plazmid je možné získať z Department of Microbiology and Immunology univerzity v Otawe. Plazmid obsahuje promotor polyhedrinového génu až do nukleotidu -7 v jeho signálnej sekvencii na 5' konce. Chýba mu kodón ATG polyhedrinového génu a prvých 170 nukleotidov sekvencie, ktorá je polyhedrinovým gcnom. Príslušné štiepne miesto reštrikčného enzýmu BamHl je umiestnené pred nukleotidom -7. Konštrukcia, ktorá je znázornená na obr. 7 sa realizuje nasledujúcim spôsobom: DNA plazmidu pA cRP6 sa linearizuje pôsobením enzýmu BamHl. Potom sa vyberie fragment DNA s veľkosťou 810 bp z plazmidu pULB9291 pôsobením reštrikčných enzýmov Asp718 a Sali. Tento fragment je kódom pre humánny proapo A-I a obsahuje iniciačný kodón pre počiatok translácie. Oba fragmenty sa v ekvimolámom pomere zmiesia a podrobia pôsobeniu T4-DNA-polymcrázy, naviažu sa pôsobením T4-DNA-ligázy a potom sa použijú na transformáciu príslušných buniek E. coli kmeňa AR58. Transformanty, ktoré sa týmto spôsobom získajú, sa selektujú na rezistenciu na ampicilín a potom sa triedia použitím syntetického oligonukleotidu s obsahom 35 báz, značenom 32p_{; a}ko je znázornené na obr. 2, ktorý zodpovedá časti sekvencie DNA, ktorá je kódom pre humánny proapo A-I, po čom sa uskutoční kontrola analýzou sekvencie DNA použitím reštrikčných enzýmov na overenie správnej orientácie sekvencie DNA, ktorá je kódom pre humánny proapo A-I vzhľadom na promotor polyhedrinového génu. Jeden z takto získaných transformantov obsahuje rekombinantný plazmid pNIV1613, ktorý spĺňa tieto požiadavky. Tento plazmid sa potom použije na pokusy s expresiou.

7. Produkcia humánneho proapo A-I transformovanými mikroorganizmami.

ml kultúry kmeňa AR58 alebo JM101 E. coli, transformovanej plazmidom pULB9296 sa pestuje na bohatom živnom médiu, doplnenom 50 gg/ml ampicilínu (živný bujón LB, podrobnosti sú uvedené v zmienenej publikácii T. Maniatisa a ďalší). Bunky sa pestujú až do optickej hustoty 0,6 pri 630 nm. V prípade plazmidu pULB9291 sa indukcia promotorom Pl lambda uskutoční tým, že sa kultúra najprv pestuje pri teplote v rozmedzí 30 až 42°C tak, aby došlo k inaktivácii represora promotora Pl lambda, tak ako je uvedené v publikácii M. Rosenberg et al, Methods Enyzmol. 101, (1983), 123-138. Indukcia sa uskutočňuje celkovo 20 minút.

V prípade plazmidu pULB9296 sa uskutočňuje indukcia lac promotora tým spôsobom, že sa ku kultúre, inkubovanej pri teplote 37°C pridá chemický induktor IPTG (izopropyl-P-D-tiogalaktozid) až do dosiahnutia konečnej koncentrácie 1 mM (podľa uvedenej publikácie R. Lorenzettiho a ďalší). Indukcia sa v tomto prípade uskutočňuje 60 minút.

ml kultúry kvasinkových buniek kmeňa 10S44c, transformovanej plazmidom pULB9299 sa pestuje pri teplote 30°C v prostredí na pestovanie kvasiniek (Difco) s obsahom dusíkatých báz a 1 % glukózy tak dlho, až je dosiahnutá optická hustota 0,3 pri 630 nm. V tomto prípade nie je potrebné použiť žiadnu indukciu, pretože v tomto zvláštnom prípade je expresia konštitutívna.

Potom sa odoberú vzorky takto získaného materiálu s objemom 1 ml a tieto vzorky sa odstredia 5 minút pri 15 000 g. Potom sa získaná peleta rozruší pôsobením vriaceho dodecylsíranu sodného (DSS). Potom sa peleta znovu rozsuspenduje v 50 μΐ pufra, ktorý obsahuje DSS (50 mM Tris-HCl s pH 6,8, 2 % DSS, 6 M močovina, 5 % 2-merkaptoetanol a 10 % glycerol) a potom sa zmes zahrieva na teplotu varu 100 °C celkovo 3 minúty. Potom sa extrakty odstredia pri 15 000 g celkovo 10 minút. Tým sú vzorky pripravené na uskutočňovanie elektroforetickej analýzy na polyakrylamidovom géli s koncentráciou 15 % alebo 7,5 % v prítomnosti DSS v denaturačných podmienkach (uvedená publikácia Laemmliho a ďalší).

Po uskutočnení elektroforézy sa polyadrylamidové gély premyjú 40 ml destilovanej vody a potom 40 ml pufra s fosforečnanom sodným s koncentráciou 50mM a s pH 7,5. Potom sa bielkoviny elektrickým spôsobom prenesú z gélu na listy nitrocelulózy v priebehu dvoch hodín pri napätí 60 V a prúde 1,5 A v tom istom fosfátovom pufri (uvedená publikácia T. Cabezona a ďalší). Listy nitrocelulózy sa potom nasýtia 1 % albumínom v 50 mM pufri s fosforečnanom sodným s pH 7,5 a potom sa inkubujú pri izbovej teplote cez noc s králičím sérom s obsahom protilátok proti humánnemu apo A-I s riedením 1/500 (a v prítomnosti monoklonálnych protilátok proti myšej β-galaktozidáze v prípade plazmidu pULB9296), a to v rovnakom pufri, ktorý bol zbavený albumínu.

Listy nitrocelulózy sa potom päťkrát premyjú 40 ml toho istého fosfátového pufra a potom sa inkubujú v 40 ml fosfátového pufra, ktorý obsahuje 10 gg/ml kozej protilátky proti protilátke králika (alebo proti protilátke myši), a označí sa peroxidázou. Po štyroch hodinách inkubácie pri izbovej teplote sa listy nitrocelulózy znovu päťkrát premyjú 40 ml fosfátového pufra a potom sa vyvíjajú pridaním 50 ml chromogénneho substrátu (10 mg diaminobenzidínu, 100 μΐ peroxidu močoviny s koncentráciou 10 % a lOOmMTris HclspH 7,6).

V prípade plazmidu pULB9291 a pULB9299 je možné nájsť jediný produkt, ktorý reaguje s protilátkami proti humánnemu apo A-I. Tento produkt má molekulovú hmotnosť, ktorá zodpovedá molekulovej hmotnosti vzorky prirodzeného humánneho apoA-I. V prípade plazmidu pULB9296 je možné dokázať zložený polypepetid, ktorého veľkosť zodpovedá predpokladanej veľkosti polypeptidu β-galaktozidázy a humánneho proapo A-I (144 kjednotiek), tento zložený polypeptid reaguje zo sérom s obsahom protilátok proti humánnemu apo A-I a zo sérom s obsahom protilátok proti β-galaktozidáze. Rozmery uvedených látok boli stanovené predbežne pomocou kalibračných kriviek, založených na migrácii rôznych vzoriek s odlišnými molekulovými hmotnosťami, pričom sa použijú tie isté gély, ktoré sa použili na spracovanie molekulárnych extraktov.

V ďalšom pokuse bolo pestované 20 ml kultúry kmeňa E. coli JA221, transformovanej plazmidom pNIV1612 v bohatom prostredí, doplnenom 50 gg/ml ampicilínu (živný bujón LB, uvedená publikácia T. Maniatisa a ďalší) až do dosiahnutia optickej hustoty 0,6 pri 630 nm. Indukcia lac promótora bola uskutočňovaná tak, že ku kultúre, inkubovanej pri teplote 37°C, bol pridaný chemický induktor IPTG (izopropyl-P-D-tiogalaktozid) až do konečnej koncentrácie 2 mM. Indukcia bola uskutočňovaná 60 minút. Potom boli odoberané vzorky týchto kultúr s objemom 1 ml a tieto vzorky boli scentrifugované pri 15 000 g celkovo 5 minút. Získaná peleta bola podrobená osmotickému šoku, aby bolo možné oddeliť periplazmatickú frakciu, postup bol uvedený v publikácii D. Koshland a D. Botstein, Celí 20, (1980), 749-760. Uvoľnená frakcia sa znovu rozsuspenduje v uvedenom pufri s obsahom DSS, ale bez močoviny, zmes sa uvedie do teploty varu, potom sa scentrifuguje a podrobí sa elektorforéze na polyakrylamidovom géli s koncentráciou 12,5 % v prítomnosti DSS, a po elektroforetickom prenose sa uskutočňuje detekcia imunologickým spôsobom. Frakciu proapo A-I, syntetizovaného týmto spôsobom, je možné dokázať v bunkách, ale nie v periplazme. Tento jav je pravdepodobne spôsobený tým, že nedochádza k sekrécii proapo A-I. Je tiež možné, že nebola zvolená optimálna účinnosť osmotického šoku. Hlavnú frakciu proapo A-I je možné voľne dokázať v prostredí po osmotickom šoku, čo znamená, že došlo k sekrécii tejto bielkoviny bunkami.

8. Produkcia humánneho proapo A-I hmyzími bunkami, infikovanými bakulovírusom.

Rekombinantný plazmid pNIV1613 bol použitý spolu s kmeňom, ktorý je rezervoárom bakulovírusu na spoločnú infekciu buniek Spodoptera frugiperda v tkanivovej kultúre. Triedením vírusových rekombinantov, zbavených polyhedrínu boli získané rekombinantné plaky. Rekombinantný vírus, získaný čistením z jedného plaku, sa potom použije na infekciu hmyzích buniek. Tento postup je v odbore dobre známy a bol podrobne opísaný v publikácii M. D. Summers a G.E. Smith, Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celí Culture Procedures, Texas University College Station, (1987). Rekombinantný vírus bol skúmaný z hľadiska jeho schopnosti produkovať proapo A-I, imunologický po elektroforetickom prenose elektorforézouna 12,5 % polyakrylamidovom géli v prítomnosti DSS, po rozrušení buniek pôsobením pufra RIPA (0,05 M pufra Tris-HCI s pH 7,2 s obsahom 0,15 M NaCI, 1 % Tritonu x 100, 0,1 % DSS, 0,1 % desoxycholátu sodného a 1 mM fenylmetylsulfonylfluoridu (FPNS) s následným pôsobením vriaceho DSS. Bolo možné dokázať jediný produkt, ktorý reagoval s protilátkami proti humánnemu apo A-I. Tento produkt mal molekulovú hmotnosť, ktorá zodpovedala molekulovej hmotnosti štandardnej vzorky prirodzeného humánneho apo A-I. Bielkovina, ku ktorej expresii došlo, tvorila hlavnú zložku celkových bielkovín. Koncentrácia proapo A-I v 1 litri kultúry, merané jednoduchou radiálnou imunodiíúziou, spôsobom podľa publikácie G. Mancini a ďalší, Immunochem. 2, (1965), 235-254, bola približne 100 mg.

9. Cytoplazmatická produkcia humánneho proapo A-I v E. coli. Použitie minimálneho, definovaného prostredia.

Plazmid pULB9292 bol použitý na cytoplazmatickú produkciu humánneho proapo A-I mikroorganizmom E. coli v prostredí, označenom ako minimálne, ktorého zloženie bude uvedené. Plazmid pULB9292 je možné skonštruovať tak, že sa vymení fragment poštiepený enzýmami EcoRl a Ncol plazmidu pULB9291, ktorý je kódom pre Pl lambda promotor, za fragment, získaný z plazmidu pOTS tiež poštiepeným pomocou enzýmov EcoRI a Ncol podľa publikácie M. Rosenbert a ďalší, Methods Enzymol., 101, (1983), 123-138. Fragment plazmidu pOTS, získaný poštiepením pomocou enzýmov EcoRI a Ncol a opísaný v publikácii G. Devare a ďalší, Celí, 36, (1984), 43-49 obsahuje tiež promotor Pl lambda figa, ktorý je účinný a regulovateľný. Potom sa pestuje na ďalej definovanom minimálnom prostredí 20 ml kultúry kmeňa AR58 mikroorganizmu E. coli, transformovaného plazmidom pULB9292. Minimálne prostredie obsahuje na 1 liter nasledujúce množstvo jednotlivých zložiek: 3 g Na2HPC>4.2H2O, 3 g KH2PO4, 0,5 g’ NaCI, 1 g NH4CI, 1,37 mM MgSO₄.7H2O, 29,5 μΜ FeCl₃.6H2O, 236 μΜ MnSO4-H2O, 10 g glukózy, 1 mg vitamínu B], 50 mg ampicilínu, živné prostredie LB 1/20 (objemový pomer). Bunky sa pestujú v uvedenom minimálnom živnom prostredí tak dlho, až optická hustota dosiahne hodnoty 0,5 pri 630 nm. Indukcia Pl lambda promótora sa uskutočňuje tak, že sa na začiatku kultúra pestuje za teplotného rozmedzia 30 °C až 42 °C, čím dôjde k inaktivácii represora promotora Pl lambda, ako bolo opísané v uvedenej publikácii M. Rosenbergera a ďalší. Indukcia sa uskutočňuje celkovo 60 minút. Potom sa odoberú vzorky získanej kul túry s objemom 1 ml a tieto vzorky sa nechajú prejsť Frencovým lisom, alebo sa scentrifugujú celkovo 5 minút pri 15 000 g. Získaný celkový bunkový extrakt alebo získaná peleta sa potom spracovávajú pôsobením vriaceho DSS, tak ako bolo opísané v odseku 7. Po uskutočnení elektroforézy a po clektroforetickom prenose je možné dokázať jediný produkt, ktorý reaguje s protilátkami proti humánnemu apo A-I. Tento produkt má molekulovú hmotnosť, ktorá je v súlade s molekulovou hmotnosťou štandardnej vzorky prirodzeného humánneho apo A-I. Podiel proapolipoproteínu A-I, ktorý sa po expresii dostal do definovaného minimálneho živného prostredia je 13,5 % celkových bielkovín, stanovený obsah proapo A-I je približne 270 mg na liter kultúry.

10. Izolácia, čistenie a charakterizácia humánneho proapo A-I, produkovaného transformovanými mikroorganizmami.

10.1 Izolácia a čistenie

Surové extrakty takto získaného surového rekombinantného proapo A-I sa centrifugujú celkovo 15 minút pri 4000 g a peleta sa odloží. Supematant sa potom centrifuguje dve hodiny pri 100 000 g. Získaná peleta sa znovu rozsuspenduje v čo najmenšom objeme pufra (TEN 100), so zložením 20 mM Tris-HCI s pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1,75 μg/ml FPMS a 100 pg/ml mertiolátu sodného (sodná soľ kyseliny etylmerkuritiosalicylovej), a potom sa oddelene upraví objem suspenzie a supematantu na pôvodný objem extraktu pridaním toho istého pufra. Potom sa bielkovina vyzráža z oboch suspenzií pridaním zvyšujúcej sa koncentrácie izopropylalkoholu. Potom sa stanovia, použitím radiálnej imunodifúzie, opísanej v uvedenej publikácii G. Manciniho a ďalší, ďalšie frakcie bielkovín, vyzrážaných z každej suspenzie, ktorá obsahuje hlavný podiel imunologickej reaktivity, zodpovedajúcej humánnemu apo A-I, pričom sa použije bežne dodávaná autentická vzorka ľudského apo A-I. Každá takto získaná frakcia sa výhodne čistí na chromatografii na živicovej kolóne Sephacryl S200, ako elučné činidlo sa opäť použije uvedený pufor. Odoberajú sa frakcie s objemom 0,9 ml a potom sa v každej z týchto frakcií stanoví celkové množstvo bielkoviny, ktorá ma imunologickú reaktivitu, ktorá zodpovedá imunologickej reaktivite humánneho apo A-I. Molekulová hmotnosť bielkoviny vo frakciách, získaných vymývaním chromatografickej kolóny sa stanoví kalibráciou kolóny pomocou zlúčenín so známou molekulovou hmotnosťou, ako sú napríklad aldoláza, sérový albumín hovädzieho dobytka, vaječný albumín, chymotrypsinogén a Cytochróm C, kalibrácia sa uskutočňuje v rovnakých podmienkach. Čistota humánneho proapo A-I na 1 mg celkovej bielkoviny v hlavných frakciách, ktoré obsahujú rekombinantný humánny proapo A-I, vyjadrené v mg bielkoviny s rovnakou imunologickou reaktivitou, akú má bežne dodávaná vzorka autentického humánneho apo A-I, bola stanovená ako 95 %.

10.2. Charakterizácia

10.2.1 Fyzikálne vlastnosti rekombinantného proapo A-I

V prípade, že sa podrobí rekombinantný proapo A-I, čistený a izolovaný zo supematantu a z pelety po centrifugácii pri 100 000 g izoelektrickej fokusácii spôsobom opísaným v publikácii N. Catsimpoolas, Anál. Biochem 26 (1969), 54-62 pri postupne sa zvyšujúcom pH v rozmedzí 4 až 6, získa sa jednotný pás, ktorého izoelektrický bod leží pri pH 4,95. Apo A-I z ľudskej plazmy je o niečo kyslejší a jeho izoelektrický bod leží pri pH 4,75. Celkový rozdiel medzi hodnotou izoelektrického bodu rekombinantného proapo A-I a proapo A-I izolovaného z ľudskej plazmy predstavuje len 0,2 jednotky pH, čo je v dobrej zhode s rozdielom, ktorý je známy pre hodnoty izoelektrických bodov plazmatického apo A-I a plazmatického proapo A-I, ktorý bol stanovený ako 0,17 jednotky pH podľa publikácie G.L. Millis a ďalší, Lab. Tech. Biochem. Mol. Biol. 14, (1984), 244-245.

Pokiaľ ide o molekulovú hmotnosť, pozostáva ako rekombinantný proapo A-I z pelety, tak proapo A-I zo supernatantu z jediného polypeptidového reťazca, ktorý má v oboch prípadoch rovnakú molekulovú hmotnosť 29,9 ±1,4 kjednotiek. Apo A-I z ľudskej plazmy má o niečo menšiu molekulu, jeho molekulová hmotnosť sa rovná 29,3 ±1,3 kjednotiek.

10.2.2 Určenie peptidovej sekvencie rekombinantného proapo A-I použitím BNPS-skatolu

Štiepenie chemickým spôsobom bolo uskutočnené použitím 3-bróm-3-metyl-2-/(2nitrofenyl)tio/-3H-indolu, t. j. DNPS-skatolu spôsobom, opísaným v publikácii A. -fontana, Methods Enzymol 25 (1972, 419-423. 5 až 10 pg vzorky čistenej bielkoviny sa rozpustí v 100 μΐ roztoku fenolu s koncentráciou 15 % objemových vo vodnom roztoku kyseliny octovej s koncentráciou 50 % objemových. Potom sa pridá 50 μΐ roztoku s obsahom 4,8 mg BNPS-skatolu na 1 ml ľadovej kyseliny octovej a zmes sa inkubuje 72 hodín pri teplote 25 °C. Potom sa pridá 50 μΐ 2-merkaptoetanolu a zmes sa znova inkubuje 5 hodín pri teplote 37 °C. Vzorky sa odparia, znova sa rozpustia v 100 μΐ vody a roztok sa extrahuje trikrát 200 μΐ etylacetátu. Organická fáza sa odloží, vodné fázy sa lyofilizujú a analyzujú elektroforézou na polyakrylamidovom géli s obsahom DSS.

V prípade chemického štiepenia pôsobením BNPSskatolu sú rozmery a počet fragmentov apo A-l viac menej vopred dané, pretože v použitých experimentálnych podmienkach nastáva pôsobením BNPS-skatolu selektívne štiepenie za tryptofánovým zvyškom. Pri predpokladanej 100 % účinnosti štiepenia v každom štiepnom mieste, je najväčším fragmentom, ktorého prítomnosť je možné očakávať, C-terminálny fragment s veľkosťou 15,4 kjednotiek. Molekulová hmotnosť ostatných fragmentov sa pohybuje v rozmedzí 0,5 až 5,3 kjednotiek, tieto fragmenty sú teda príliš malé na detekciu. V prípade neúplného štiepenia môže byť fragment s veľkosťou 15,5 kjednotiek predĺžený v smere k N-terminálnemu koncu, tvoria sa fragmenty s veľkosťou 20,7 kjednotiek, 23,1 kjednotiek a 27,6 kjednotiek.

Tento jav je možné pozorovať tak v prípade humánneho apo A-I z krvnej plazmy, ako v rôzne čistených vzorkách rekombinantného proapo A-I.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sekvencia rekombinantnej DNA obsahujúca reťazec, ktorý je kódom pre humánny proapolipoproteín A-I, v ktorom bola jedna časť prirodzeného kódového reťazca nahradená fragmentom DNA, ktorý je kódom pre tie isté aminokyseliny, ale na základe inej nukleotidovej sekvencie, čím dochádza ku zníženiu alebo vylúčeniu tvorby štruktúr s dvojitým reťazcom.
2. 2. Sekvencia rekombinantnej DNA podľa nároku 1, v ktorej je prirodzená sekvencia kódov pre aminokyselín -6 až +14 proapolipoproteínu A-I nahradená nasledujúcou sekvenciou (len jeden reťazec):

   5’- ATG AGA CAT TTC TGG CAG CAG GAC GAA CCT CCA CAA TCT CCT TGG GAT AGA GTT AAG GACTTG-3', pričom táto sekvencia navyše obsahuje iniciačný kodón ATG a modifikované kodóny pre aminokyseliny v polohách -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 a+14, pričom ostatné aminokyseliny sú kódované rovnakými nukleotidmi ako prirodzená sekvencia humánneho proapolipoproteínu A-I.
3. 3. Replikovateľný klonovací vektor obsahujúci sekvenciu rekombinantnej DNA podľa nárokov 1 a 2.
4. 4. Expresný vektor obsahujúci sekvenciu rekombinantnej DNA podľa nárokov 1 a 2, operatívnym spôsobom viazaný na regulačnú sekvenciu DNA a včlenený medzi signály pre iniciáciu a termináciu translácie.
5. 5. Expresný vektor podľa nároku 4, ktorého regulačná sekvencia DNA obsahuje časť promótora Pl z λ fága.
6. 6. Rekombinantné plazmidy pULB9291 alebo pULB9292 zodpovedajúce expresnému vektoru podľa nároku 5.
7. 7. Expresný vektor podľa nároku 4, ktorého sekvencia DNA pre humánny proapolipoproteín A-I je vložená pred sekvenciou DNA pre β-galaktozidázu a regulačná sekvencia DNA obsahuje oblasť lac promótora.
8. 8. Rekombinantný plazmid pULB9296 zodpovedajúci expresnému vektoru podľa nároku 7.
9. 9. Expresný vektor podľa nároku 4, ktorého regulačná sekvencia obsahuje oblasti promótora a terminátora transkripcie z kvasinkového génu ARG3.
10. 10. Rekombinantný plazmid pULB9299 zodpovedajúci expresnému vektoru podľa nároku 9.
11. 11. Expresný vektor podľa nároku 4, ktorého sekvencia DNA pre humánny proapolipoproteín A-I neobsahuje kodón ATG a je vložená pred sekvenciou pre signálny peptid bielkoviny OmpA z E. coli a regulačná sekvencia DNA obsahuje oblasti promótora Ipp a promóto-operátora lac.
12. 12. Rekombinantný plazmid pNIV1612 zodpovedajúci expresnému vektoru podľa nároku 11.
13. 13. Expresný vektor podľa nároku 4, ktorého regulačná sekvencia DNA obsahuje oblasť promótora polyhedrinového génu z bakulovírusu.
14. 14. Rekombinantný plazmid pNIV1613 zodpovedajúci expresnému vektoru podľa nároku 13.
15. 15. Bunková kultúra mikroorganizmu transformovaná expresným vektorom podľa nároku 4 až 14.
16. 16. Spôsob výroby humánneho proapolipoproteínu A-I, vyznačujúci sa tým, že sa pestuje za príslušných podmienok bunková kultúra alebo mikroorganizmus transformovaný vektorom podľa nároku 15 a takto produkovaný humánny proapolipoproteín sa izoluje.