JP2515399B2

JP2515399B2 - ヒト神経成長因子

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Publication number: JP2515399B2
Application number: JP1196431A
Authority: JP
Inventors: ダブリュ．チャンハーディ; ダブリュ．バーネツトジム; エイ．ベッカープレストン; バースズティン ― ペッテグリューヘラ; ティー．ヌグイエンビン; ウオードキャロル
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1988-11-22
Filing date: 1989-07-28
Publication date: 1996-07-10
Anticipated expiration: 2011-07-10
Also published as: JPH09235299A; DK366789A; DK366789D0; JPH07247300A; ATE167701T1; AU3900989A; DE68928718D1; JP2732556B2; EP0370171B1; NZ230096A; CA1341131C; IE980253A1; AU629840B2; IE892425L; EP0370171A2; JPH02291270A; US5272063A; DK175764B1; ZA895661B; EP0859056A2

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、バクロウイルス（baculovirus）発現系を
使用することによるヒト神経成長因子（hNGF）の発現の
ための組替えDNA分子の構築に関する。hNGFの製造は、
スポドプテラ・フルジペルダ（S.frugiperda）宿主細胞
内において該蛋白質の発現のためのバクロウイルス系を
用いて成功した。該組替えhNGFは、アルツハイマー病
（Alzheimer's Disease）の治療において有用である。

発明の背景哺乳類NGF（マウスNGF）の１次構造は、Angeletiおよ
びBradshawらのProc.Natl.Acad.Sci.USA68:2417（197
1）により最初に明らかにされた。その前駆体、プレ−
プロ−NGFの１次構造は、マウスNGF cDNAのヌクレオチ
ド配列から推定されている（ScottらのNature 302:538
（1983）;UllrichらのNature 303:821（1983））。

高度に相同的なヒトNGF（hNGF）遺伝子もまた同定さ
れている（UllrichのSymp.on Quan.Biol.,Cold Spring
Harbor 48:435（1983））。そのマウスNGFに対する相
同性は、アミノ酸およびヌクレオチド配列の段階の各々
において、90％および87％である。hNGFの希少さ故に、
その生物学的活性については、ほとんど知られていな
い。

バクロウイルス発現ベクターは、インビボまたはイン
ビトロのいずれかにおける昆虫細胞内での種々の外来遺
伝子の発現に用いられてきた（米国特許第4,745,051
号、1988年５月17日発行参照）、これらの発現ベクター
は、高度に効率的であり、かつ一時的に制御されるオー
トグラフア・カリフオルニカ（Autographa californic
a）核ポリヘドロシス・ウイルス（AcNPV）ポリヘドリン
プロモータにより、該プロモータの下流側に挿入された
興味ある遺伝子を伴つて協力を受けている。対応する遺
伝子産物は、該組換えバクロウイルスに感染されたスポ
ドプテラ・フルジペルダから得られる。

hNGFのβ−サブユニツトの単離およびE.coli中におけ
る異種蛋白質としての発現は、ヨーロツパ特許出願第0,
121,338号に記載されている。組換え技術の使用によ
り、ヒトβ−NGFは、他の哺乳類蛋白質を本質的に含む
ことなく発現された。改造されたアミノ末端を有する２
種の遺伝子を用いて融合蛋白質の発現をもたらすE.coli
中でのhNGFの発現は、IwaiらのChem.Pharm.Bull.34:472
4（1986）により記載されている。

ウイルス感染昆虫細胞中におけるポリペプチド製造の
ための組換え技術の使用は、ヨーロツパ特許出願第0,22
8,036号に記載されている。バクロウイルス発現系を用
いた蛋白質、Ｂ型肝炎表面抗原の製造方法は、公知であ
る。遺伝子的に異なり、その一つが関連する異種遺伝子
を含む、少なくとも２種類のバクロウイルス類に由来す
るヌクレオカプシド類の混合物を含有する混合多面包接
体（PIB）の使用は、特許協力条約出願WO 88/02030に
記載されている。記載された共感染技術を用いて、異種
蛋白質が発現される。

これらの大きい哺乳類蛋白質の発現が可能であるにも
かかわらず、本発明まではバクロウイルス発現系を用い
たhNGF等の小さい分子の発現の成功についての情報は、
ほとんど無い。この特定の発現系が、生物学的活性を示
す為の蛋白質前駆体の翻訳後蛋白質分解を必要とする小
さい蛋白質の産生に適しているか否かについても疑問で
あつた。

我々は、hNGFがバクロウイルス昆虫細胞発現系を用い
て収率良く成功裏に発現されるであろうことを予期せず
に見出した。

本発明は、hNGFを生物学的に活性な形態で発現し得る
バクロウイルス系において用いられる発現ベクターの構
築を記述する。本発明に従つた組換えDNA技術によるhNG
Fの充分な量の産生は、アルツハイマー病（AD）におけ
るNGFの潜在的な有用性を確認することを可能ならしめ
る。

本発明の要約本発明の一実施態様は、昆虫細胞類内で機能し得る制
御因子に対して適切な方向をもつて結合されたヒト神経
成長因子（hNGF）またはその誘導体の遺伝子を有するバ
クロウイルス転移ベクターである。好ましくは、hNGFを
コードする該遺伝子は、先行配列とバクロウイルス遺伝
子のプロモータとが組込まれたキメラ遺伝子である。

より詳細には、本発明は昆虫細胞内で機能する制御因
子に対して適切な方向をもって結合された、マウス神経
成長因子（NGF）のプレプロ部分のDNAコード配列および
成熟ヒトβNGFのDNAコード配列、またはヒトNGFのプレ
プロ部分のDNAコード配列および成熟ヒトβNGFのDNAコ
ード配列からなる、ヒトβNGF（hNGF）またはその誘導
体の遺伝子を有するバクロウイルス（baculovirus）転
移ベクターに関する。さらに、この転移ベクターは翻訳
開始が−187位または−121位メチオニンで起ることを特
徴とする。

本発明の他の実施態様において、昆虫細胞内での生物
学的に活性なhNGFおよびその誘導体の製造方法が記述さ
れている。該方法は、hNGFの該遺伝子をバクロウイルス
転移ベクター中に挿入し、キメラ遺伝子を形成すること
からなる。該キメラ遺伝子は、次いでバクロウイルス内
に組込まれ、次いで該組換えバクロウイルスにより昆虫
細胞の感染がなされる。該感染昆虫細胞は、好ましくは
低または無血清培地中にて育生され、そして該使用培養
培地から生物学的に活性なhNGFが採取される。

図面の概略的記載第１図:hNGFの成熟ベータサブユニツトのアミノ酸配列第２図:pAc373mhNGFプラスミドの構築第３図:pAcYMhNGFプラスミドの構築第４図：ウイルス感染細胞の上澄から精製されたhNGFの
銀染色およびウエスタンブロツト分析第５図:pAcY2MhNGF組換えバクロウイルス感染細胞由来
の培養液により処理されたPC₁₂細胞第６図：軸索突起の成長により示される攻撃の比率第７図：バクロウイルス産生hNGFに帰因する生物学的活
性第８図:hNGFの投与を受けたラツトにおける記憶の低下
および思考力の減退発明の詳細な記述本発明は、バクロウイルス発現系を用いて組換えhNGF
およびその誘導体を製造する手法を記述する。hNG前駆
体の配列をコードするDNAをバクロウイルス発現ベクタ
ー中に組込むことにより、生物学的に活性なhGNF分子が
発現される。

hNGFの“誘導体”は、hNGFと実質的に同じ活性を有す
る分子を生ずるような様式、例えばアミノ酸の付加、削
除または置換によつてhNGFとは異なる分子を包含するこ
とを意味する。

生物学的に活性なhNGFは、バクロウイルスDNAのポリ
ヘドリンプロモータと先行配列とに連結されたプレープ
ローhNGF遺伝子からなるキメラ遺伝子を構築することに
より、バクロウイルス発現系において発現され得る。バ
クロウイルスDNAのプロモータおよび先行配列を有する
プラスミドの例は、pAcYM1（Bishop,D.H.のJ.of Gen.Vi
ol,68:1233（1987））、pAC101（米国特許第4,745,501
号）、pAC373（Smith,G.E.のProc.Natl.Acad.Sci.USA,8
2:8404（1985））、およびpEV51（Rice,W.C.のJ.Virol.
61:1712（1987））を含む。本発明の好適な実施例にお
いては、該hNGF遺伝子は、プラスミドpAcYM1に挿入され
る。

hNGFの該コード配列は、例えば、既知のDNA配列を利
用した遺伝子の合成または当業者に知られている標準的
なクローニング技術の使用により、数種の供給源から入
手可能である。hNGFコード配列を有するcDNAクローン
は、既知のhNGF配列に基づいて特異的に設計されたオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーシヨンプローブを使用
することにより同定され得る。

hNGFコード配列を得た後、該配列は、pAcYM1等のバク
ロウイルスクローニングベクター中に挿入される。該ク
ローニングベクターは、該コード配列の効率的な転写、
翻訳および複写に要する適切な制御機能を与えるように
構築される。

本発明の一面において、hNGFをS.フルジペルダ細胞中
で産生する組換えDNA分子は、バクロウイルス転移ベク
ター中に挿入されたhNGF前駆体のDNAコード配列を有し
ている。転移ベクターは、興味ある外来遺伝子が、ポリ
ヘドリンプロモータの下流に挿入され得るプラスミドを
意味している。更に、該転移ベクターは、天然型バクロ
ウイルスゲノムと相同的な組換えが可能となるのに充分
な量のポリヘドリン遺伝子配列を含み、かくして結果と
してのウイルスは、興味ある外来遺伝子を、該ウイルス
ポリヘドリンプロモータの制御下に含有する。

該バクロウイルスプロモータの使用によつて、該成熟
hNGF前駆体が発現され、次いで成熟hNGFへ加工される。
次いで、該成熟hNGFは、該組換えウイルスに感染した細
胞から分泌される。

本発明の好ましい実施において、前記相同的組換えに
おいて使用されるバクロウイルスは、AcNPVと命名され
たアウトグラフアカリフオルニカ（Autographa calif
ornica）である。他のバクロウイルス系は、例としてボ
ンビクスモリ（Bombyx mori）およびヘリオテイス
ゼア（Heliothis zea）から単離された昆虫ウイルス等
を含み、より一般的にはヨーロツパ特許公開第0228036
号に示されたものを含む。使用される特定のバクロウイ
ルス系は、行なわれる遺伝子操作の種類により決定され
る。

該hNGF遺伝子は、メチオニン開始コドンのひとつが利
用可能となるようにバクロウイルス転移ベクター中に挿
入される。該hNGF遺伝子は、記述（UllrichらのCold Sp
ring Harbor Symposia on Quant.Biol.XLVIII、p435（1
983））によると、翻訳開始コドンとして使用されてい
ると思われるメチオニンを−121および−119位置に有し
ている（１位は、成熟hNGFのＮ−末端セリン残基を示し
ている。第１図参照）。対照的には、最も良く研究され
てきた神経成長因子であるマウスNGFの顎下腺cDNAは、
−121位と−119位とに加えて−187位にメチオニンを有
している。ヒトまたはマウスにおいて、どのコドンが翻
訳開始コドンとして機能しているかは明確でない。

該マウスcDNAに対応するmRNAを用いた研究は、小麦胚
抽出物を用いたインビトロでの翻訳では、−187位のメ
チオニンにおいて翻訳が開始されることを示している
（Edwardsらの、J.Biol.Chem.263:6810（1988））。こ
の観察と一致して、顎下腺においては−187位メチオニ
ンにて翻訳開始が起こり得ることを示すNGF前駆体が、
マウス顎下腺から単離されている（SabooriおよびYoung
の、Biochemistry25:5565（1986））。しかしながら、
マウスにおいて、少なくとも３種類の異なつたNGF mRN
Aが産せられることも示されている（SelbyらのMol.and
Cellular Biol.７:3057（1987））。この多様性は、別
のスプライシングおよび／または別のプロモータに由来
する独立した開始によるものとして説明される。他のマ
ウスNGF mRNA類が−187位メチオニンを欠除しているこ
とから、−121位または−119位のメチオニンにおいても
翻訳が開始され得ることが推論されている（Selbyらの
前出文献）。

該マウスNGF遺伝子とは対照的に、ヒトNGF遺伝子構造
は、そこまでは特徴付けられてはいない。従つて、同様
にどのメチオニンコドンが翻訳開始の為に使用されてい
るかについては明らかではない。我々は、ここで（例３
に示されるように）翻訳開始が、バクロウイルス発現系
においては−121位メチオニン［２−MET位と命名され
る］にて最も効率的に起こり、その一方−119位メチオ
ニン［１−MET位と命名される］での開始は、全く非効
率的であることが示された。

本発明のバクロウイルス発現系を用いた生物学的に活
性なhNGFの正しい発現および分泌は、プローNGF配列の
存在を必要とすることもまた観察された。プロー配列を
除去する試み、すなわち（プレー）シグナル配列の成熟
hNGF配列に対する直接的なスプライシングは、hNGFの分
泌を生じなかつた。

本発明の好適な実施においては、hNGF遺伝子が転移ベ
クター中に挿入され、キメラ遺伝子が形成される。興味
ある外来遺伝子を含む転移ベクターと天然型バクロウイ
ルスゲノムDNAとによる細胞の共−感染によつて、ビリ
オンDNAおよび該転移ベクターの間の相同的組換えは、
バクロウイルスポリヘドリン遺伝子中に挿入されたキメ
ラNGF遺伝子を含む組換えゲノムを生ずる。組換えゲノ
ムを含むウイルス類は、プラーク精製によりクローン化
され、発現ベクターとして使用される。該発現ベクター
に感染された昆虫細胞類は、低または無血清培地中で育
生され、hNGFが該使用された培養培地から採取される。

更に特定的には、該hNGF遺伝子が組込まれた転移ベク
ターは、該hNGF遺伝子を有するプラスミドの修飾により
構築される。該プラスミドは、hNGFコード配列の上流お
よび下流の両方に都合のよい制限部位が組込まれるよう
に修飾される。この修飾は、合成アダプタの使用により
達成される。例えば、所望の制限部位を有する２種類の
アダプタが合成される。第１のアダプタ：５′GGGGATCCAAATATGTCCATGTTGTTCTACACTCT3′および
５′GATCAGAGTGTAGAACAACATGGACATATTTGGATCCCC3′は、
２つの可能な開始コドンのうちの第１のもの［２−MET
位、−121位、第１図参照］のすぐ上流にBamHI切断部位
を有している。一方、第２のアダプタ：５′GGGGATCCAAATATGTTGTTCTACACTCT3′および５′GATC
AGAGTGTAGAACAACATATTTGGATCCCC3′は、第２のメチオニ
ンコドン［１−MET位、−119位、第１図参照］の次に制
限部位を置いている。更に、例えば５′pCAGATCTG等の
合成リンカーが、好適な制限部位を導入するためにhNGF
遺伝子の下流に挿入される。

他の実施例において、該hNGF遺伝子を有するプラスミ
ドは、バクロウイルスポリヘドリン遺伝子プロモータの
直ぐ下流に挿入されてもよく、これによつて転写開始の
ためにバクロウイルスポリヘドリンプロモータが使用さ
れる。

メチオニン開始コドンを与える上記方法に加え、NGF
遺伝子のプレープロ部分が、マウス顎下腺cDNAのもので
あり、一方成熟NGFをコードするNGFの部分がヒトNGF遺
伝子配列（第１図）であるようなハイブリツドまたはキ
メラ遺伝子を構築することも可能である。このようなハ
イブリツドまたはキメラ遺伝子は、該マウスプレープロ
NGF部分に存在する−187位メチオニンにおける翻訳開始
を可能的に許容し、一方成熟hNGFの発現をもたらす。こ
のようなキメラ遺伝子は、正確に折り重ねられたか、あ
るいは翻訳後に加工されたことが示された。該バクロウ
イルス発現系を使用して、このようなキメラ遺伝子は、
生物学的に活性なhNGFを生じた。

上記した合成アダプタを用い、得られた転移ベクター
は、該hNGF遺伝子が利用可能な２つのメチオニン（me
t）開始コドンの１つに隣接して位置するように構築さ
れる。該hNGFの修飾配列は、例えばpAcYM1等の適当なバ
クロウイルス転移ベクターに対し、該hNGF遺伝子が適切
な方向となるように連結される。得られるプラスミド
は、バクロウイルスプロモータを、可能なNGFメチオニ
ン開始コドンのひとつに近隣して含んでいる。

このように構築された組換えバクロウイルス転移ベク
ターは、例えば制限酵素切断部位についてのスクリーニ
ングまたはこの分野で公知のDNA配列化技術によつて選
択される。

実施例中に記載された特定のベクターに加え、これら
特定のベクターの誘導体もまた特定的に包含されてい
る。誘導体類は、発現可能な形態の該hNGF遺伝子の本質
的な役割に対して明らかな影響を与えることのない、酵
素制限部位等における修飾を含んでいる。

一旦該hNGF転移プラスミドが選択された後は、該キメ
ラhNGF遺伝子を含むプラスミドは、適当な昆虫宿主細胞
中に該バクロウイルス性DNAと共に共−トランスフエク
トされ得る。このような宿主細胞は、例えばS.フルジペ
ルダ（好ましくは細胞株Sf9、ATCC No.CRL1711）、A.
カリフオルニカ、ヘリオテイスゼアラルバ等であり得
る。トランスフエクシヨンは、標準的な技術により実施
される。このような技術は、例えば、ウイルス性トラン
スフエクシヨン、DEAE−デクストラン誘導ピノサイトシ
ス、リン酸カルシウム沈殿、および最近においては、リ
ポフエクシヨン（リポ感染）を含む。本発明の好適な実
施においては、トランスフエクシヨンは、FelgnerのPro
c.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413（1987）に記載されてい
るように、リポフエクシヨン技術を用いて実施される。

トランスフエクシヨンに続いて、該細胞は、培地中で
育生される。好ましくは３日または４日の後に、該使用
された上澄が採取され、宿主細胞の融合性の単層上にプ
ラーク形成される。組換えウイルスを示す閉塞性負のプ
ラークが摘み採られ、更にプラーク精製される。

発現のために好適な昆虫宿主細胞、好ましくはSf9細
胞は、次いで、組換えウイルスにより好適には0.01から
10プラーク形成単位／細胞をもつて感染され、引き続き
好ましくは低または無血清培地で育生される。培養液
は、好適には３から７日後に採取され、標準的な同定試
験、例えばELISAおよびウエスタンブロツト分析等の免
疫試験、またはPC₁₂細胞分化（Greene,L.A.のTrends Ne
urosci ７:91（1986））等の生物学的試験が行なわれ
る。

プレープローNGF前駆体の加水分解処理を増大させる
ため、上述した方法は、宿主細胞の他の組換えウイルス
類と共感染されることにより増強されてもよい。例え
ば、S.フルジペルダにおけるプレープローhNGFの加水分
解処理は、該S.フルジペルダ細胞のhNGFのベータサブユ
ニツトおよびmNGFのガンマサブユニツトの遺伝子を含む
組換えウイルス類による共−感染によつて増強され得
る。hNGFのベータサブユニツトと酵母KEX2遺伝子を含む
組換えウイルス類またはhNGFのベータサブユニツトとヒ
トカリクレインプロテアーゼの遺伝子を含む組換えウイ
ルス類による共−感染もまた有用である。

本発明の該hNGFは、使用された培養培地から更に精製
され得る。標準的な蛋白質精製技術、例えば、イオン交
換クロマトグラフイー、逆相クロマトグラフイー、アフ
イニテイクロマトグラフイー、大きさ排除クロマトグラ
フイー、等電点フオーカシング等が採用され得る。

臨床的な使用のためには、hNGFは医薬品グレードのhN
GFを得るために更に精製される。医薬品剤型は、hNGFの
１投与単位が、アルツハイマー病（AD）および他の神経
性疾患の治療に有効であるように、有効量のhNGFを適当
な製薬学的担体中に含んでなるであろう。

痴呆の最も一般的な型態であるADの病理学は、多くの
神経系が関与し複雑である。AD脳において最も一致した
神経病理学的な知見は、中枢コリン作働性ニユーロンの
顕著な減損である（Hymanらの、Science 225:1168−11
70（1984）;Pearsonらの、Brain Research 289:395（1
983）;Whitehouseらの、Science 215:1234（198
2））。この減損は、痴呆の程度に関連しており（Perry
らの、British Med.Journal ２:1457（1978））、軸索
突起プラークの数に定量的な相関がある。コリン作働性
ニユーロン欠損は、海馬回および皮質に向けて軸索突起
を延ばる基底前脳核（中央隔膜および神経核基底）の上
昇経路を形成するニユーロンに限定されて生ずる。これ
らの２つの領域は、認識機能において特に重要である
（Mannらの、J.Neural.Neurosurg.Psychiatry 49:310
（1986））。これらのニユーロンの減損は、皮質および
海馬回の両者において顕著な脳委縮を生じ、ADに特徴的
な記憶欠損に対して主要な寄与をするものと考えられて
いる。

これらの神経化学的欠損に基づき、種々のADの治療方
法が行なわれ、最近において最も有力なものは、アセチ
ルコリンエステラーゼ阻害剤である経口フイソスチグミ
ン（physostigmine）である。フイソスチグミンの経皮
投与は、ある種のAD患者において認識機能の改善を示し
た（Mohsらの、Am.J.Psychiatry 142:28（1985）、Dav
isらの、New England J.Med.308:721（1983）;Christie
らの、Br.J.Psychiatry 138:46（1981））が、その臨
床的使用は、その半減期の短かさ故に限定されている。
向神経性因子である神経成長因子の、特にコリン作働性
ニユーロン退化の防止および神経再生成の増強（Hefti
の、Ann.Neurol.13:109（1983））の両者のための使用
は、最近AD治療の新たな手がかりとして示唆されてい
る。HeftiのAnn.Neurol.20:275（1986）も参照。

NGFの役割は、第１には、脊椎末梢交感および神経稜
−誘導知覚神経の特異的な機能の発達および維持を制御
することに帰する（Lev−MontalciniおよびAngeletiのp
hysiol.Rev.48:534（1986））。より最近においては、N
GFは、基底前脳における上昇コリン作働性ニユーロンの
栄養作用を有することも確立された。

NGF、そのRNA転写物およびレセプター類は、これらの
前脳コリン作働性ニユーロンにより刺激を受ける海馬回
および皮質領域に高水準で存在している（Korchingら
の、EMBO J.４:1389（1985）;Riopelleらの、Proc.Soc.
Neurosci 11:1056（1985）;Raivichらの、Neurosci.2
0:23（1986）,Sheltonらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
83:2714（1986））。コリン作働性ニユーロン上のNGFレ
セプターの刺激は、線条および基底前脳核におけるコリ
ンアセチルトランスフエラーゼ（ChAT）活性の増大を生
じる（MobleyらのMol.Brain Res.387:53（1986）;Scien
ce 229:284（1985））。

NGFが基底前脳神経に対して栄養作用を有することに
ついての最も得心のゆく証拠は、多分：（ａ）ラツトに
おける中隔海馬回経路に対する損傷に続き、内因性NGF
の劇的な増大があること（Gasserらの、Brain Res.376:
351（1986））および、（ｂ）NGFは、縁の切断に続く隔
膜コリン作働性ニユーロンの生存を促し、かつ認識損傷
をなくすこと（Gageらの、J.Comp.Neurol.269:147（198
6）;HeftiのJ.Neurosci.６:2155（1986）;Williamsら
の、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9231（1986））であ
る。これらの観察に基づくと、ADにおいて観察されるコ
リン作働性ニユーロンの減失は、これらのニユーロンを
維持するために充分な量のNGFを合成することについて
の脳標的組織の失敗の結果であろう可能性がある。選択
的には、それは、コリン作働性ニユーロンのNGFに対す
る応答における異常性、すなわちレセプターの異常性を
反映するであろう。ADの病理学において異常なNGF応答
が関与していないとしても、NGFは、コリン作働性ニユ
ーロンの悪化を遅れさせ、または防止し、および／また
は残るニユーロンのChAT活性の増大において、なお有用
である。

AD治療に対して有効な医薬組成物は、特異的な最終的
用途に依存する種々の経路のいずれかによつて投与され
る。最も好ましい経路は、用途および関与する患者に依
存するであろう。

正確な投与量および投与回数は、治療される患者の要
求および苦悩の程度に依存するであろう。効果的な医薬
組成物を得るための蛋白質の製剤化方法は、当業者に知
られている。

好ましくは、該組成物は殺菌溶液であろう。好ましく
は、それはカニユーレにより脳内に腔内的な連続注入に
より投与されるであろう。該カニユーレは、好ましくは
小型ポンプに連結され得る。このような小型ポンプは、
皮下に挿入され得て、かつ薬剤の多量の貯蔵（数週間ま
たは数ケ月間に充分な）を保持し得る、治療は、好まし
くは数週または数ケ月の長期間に亘る。好ましい投与量
の割合は、脳内に１日あたり0.1から100μg hNGFの範囲
が予想され、より好ましくは2.5−５μg/日である。考
えられるところでは、該組成物は別法として脊髄中に投
与され得る。この投与経路によると、より多量の投与量
が必要であろう。

本発明は、hNGFの高収率を与える点において特に優れ
ており、かくしてその性質の適切な評価を可能としてい
る。収率は、好ましくは培養液について５μg/mlの程
度、好適には10μg/mlである。

以下の例は、記述的なものであつて、本発明を制限す
るものではない。別途特定されない限り、遺伝子操作に
おいて用いたすべての酵素は、商業的な供給者より得ら
れたもので、実質的に製造者の指示に基づいて使用され
た。クローン化処理は、特に記さない限り、Maniatisら
の、Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laborator
y,1982により記述されているようにして実質的に行なわ
れた。

例１ヒトベータ神経成長因子遺伝子の単離ヒト白血球ゲノムライブラリー（クローニングベクタ
ー：ラムダEMBL−３を用いて構築されている）は、Clon
tech Laboratories Inc.（パロアルト（Palo Alto）、
カリフオルニア州）から購入した。約1.5×10⁶p.f.u.の
組換えフアージが、E.coli LE392細胞［Silhavy,T.J.
のExperiments with Gene Fusion,Cold Spring Harbor
Laboratory,xi−xii頁（1984）］を0.01倍の感染をもつ
て感染させるために用いられた。37℃にて20分間の吸収
の後に、感染細胞は、0.7％の軟質寒天で希釈され、12
の新鮮なルリアブロス（Luria Broth（LB））プレート
（150mm）上に塗布された。37℃にて６時間の後、該プ
レートは培養器から取出され、一夜冷蔵された。次い
で、該フアージローンは、２片のニトロセルロースフイ
ルター（BA85/20 0.45mm、Schleicher and Schuell）
により順次覆われた。次いで該ニトロセルロースフイル
ターは、アルカリ変性され（0.5M NaOH、1.5M NaClに
より15分間）、中性化され（0.5MトリスHCl、PH8.0およ
び1.5M NaClにて15分間）、洗浄され（６×SSC（塩、
クエン酸ナトリウム）にて15分間）、そして80℃にて２
分間焼成した。ハイブリダイゼーシヨンに先立ち、該フ
イルターは、プレーハイブリダイゼーシヨン溶液（６×
SSC、0.1％SDS、５×デンハルト溶液、1mM EDTA、100m
μ/mlサケ精子DNA、100mμ/ml酵母tRNAおよび0.05％Na
ピロリン酸塩）により65℃にて16時間処理された。³²P
標識（ニツク−トランスレーシヨンによる、比活性３×
10⁸cpm/μｇ）マウスベーターNGF cDNA（W.Rutter博士
からの寄贈、Nature 302:538（1983））が、次いで該ニ
トロセルロースフイルターに添加され、そしてハイブリ
ダイゼーシヨン（６×SSC、0.1％SDS、２％脱脂乳、1mM
EDTA、0.05％Naピロリン酸塩、100μg/ml硫酸デクス
トラン）が65℃にて16時間行なわれた。次いで、該フイ
ルターは、２×SSC、0.1％SDSにて２回、0.6×SSC、0.1
％SDSにて１回（それぞれ10分間）洗浄された。該フイ
ルターは、空気乾燥され、そして−70℃にてＸ−線フイ
ルムに曝された。

正のハイブリダイゼーシヨン信号を与えたフアージプ
ラークを摘採り、サブクローニングおよびハイブリダイ
ゼーシヨンの２種の付加的なラウンドに供した。ハイブ
リダイゼーシヨンの第３のラウンドの間に、ヒトNGF遺
伝子（５′GAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCA3′）に対し
て相補的な末端標識合成オリゴヌクレオチド（28量体）
もハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いられた。
正のフアージから調製されたDNA類は、制限酵素消化お
よびニツク−トランスレーシヨンによるマウスベーター
NGF cDNAまたは前述した合成オリゴヌクレオチドのい
ずれかをプローブとして使用するサザンブロツト分析に
より特徴付けがなされた。予想された大きさ（Bgl II、
EcoR IおよびHind II断片について、それぞれ1.8、5.7
および4.4kb）のハイブリツド化断片を生ずるフアージ
が選択された。プレープロヒトベーターNGFサブユニツ
トの全コード配列を含む1.8kb Bgl II断片は、該フア
ージDNAから切取られ、pUC8（Bethesda Research Labor
atories、ガイテルスブルグ、メレーランド、米国）プ
ラスミドベクター中に転移された（互換性のBamH I部位
を介して）。結果としてのプラスミドは、phNGF＃５と
命名した。

例２ pAC373mhNGFの調製 pAC373mhNGFの構築は、多段階工程であつた（第２
図）。概略的には、該構築は、キメラNGF遺伝子のベク
ターpUC8中への最初の組立てに関し、ここで該NGFキメ
ラの５′末端は、マウス顎下腺NGF cDNAからなり、該
キメラの３′末端は、ヒトNGFの成熟配列をコードする
ヒトゲノムDNAの断片からなる。

ポリヘドロン遺伝子プロモータの直下流に特異的なBa
mH I部位を有し、ポリヘドリン構造遺伝子内部に特異的
なKpm I部位を有するバクロウイルストランスフエクシ
ヨンプラスミドpAC373（Smith,G.E.のProc.Natl.Acad.S
ci.USA.82:8404（1985））は、アダプタをBamH Iおよび
Kpn I制限部位に連結することにより、該NGFキメラを受
け入れるために修飾され、該アダプタは、特異的なSma
IおよびPst I制限部位を含んでいた。次いで、該キメラ
マウス／ヒトNGF遺伝子は、該pUC8ベクターからSma Iか
らPst Iまでの断片として切取られ、そして該Sma Iおよ
びPst I制限部位を介して修飾pAC373ベクター中に挿入
された。

pmNGFと称されるプラスミドは、カリフオルニア州943
05、スタンフオード、スタンフオード大学薬学部、神経
生物学科のEric Shooter博士から得た。プラスミドpmNG
Fは、ScottらのNature 302:538（1983）に記載された
マウスNGF前駆体（プレプロマウス NGF）をコードする
マウス顎下腺cDNAのSma IからPst Iまでの961塩基対断
片からなり、ベクターpGEM1（Promega、ミドルトン、ウ
イスコンシン、米国）中に、Sma IおよびPst I制限部位
を介してサブクローン化されている。

10マイクログラムのpmNGFを、制限エンドヌクレアー
ゼEcoR I（Bethesda Research Leboratories）を用い、
供給者の勧める条件を用いて消化した。EcoR I切断DNA
を、次いでPst I（Bethesda Research Laboratories）
を用いて供給者の勧めに従つて切断した。該消化DNA断
片を、0.7％アガロースゲル上での電気泳動により分離
し、約1,000塩基対断片を該ゲルからDretzenらのAnal.B
iochem.112:295（1981）によるDEAEニトロセルロース法
で回収した。回収された約0.5マイクログラムのEcoR I
からPst Iまでの断片を、制限エンドヌクレアーゼXho I
I（New England Biolabs,ウオルサム、マサチユーサ
ツ、米国）により供給者の勧める条件を用いて更に消化
した。該消化DNAを、フエノール抽出し、エタノール沈
殿させ、乾燥させそして無菌の蒸留水中にマイクロリツ
トル中50ナノグラムの濃度で懸濁させた。

２分の１マイクログラムのプラスミドpUC8を、BamH I
（Bethesda Research Laboratories）により供給者の勧
める条件を用いて消化した。該BamH I切断DNAを、更に
制限エンドヌクレアーゼEcoR Iにより切断した。該切断
DNAを、フエノール抽出し、そしてエタノール沈殿させ
た。該Xho II切断されたpmNGFのEcoR IからPst Iまでの
切断を、BamH IおよびEcoR I切断pUC8と、125ナノグラ
ムのEcoR IおよびBamH I切断pUC8、約125ナノグラムのX
ho II切断されたpmNGFのEcoR IからPst Iまでの断片、
1.25マイクロモルのトリス−HCl、pH7.8、0.25マイクロ
モルのMgCl₂、0.50マイクロモルの還元ジチオスレイト
ール、2.5ナノモルのATP、および１単位のT4DNAリガー
ゼ（Bethesda Research Laboratories）を含有する25マ
イクロリツトルの反応混合物中で連結した。該反応混合
物は、15℃にて16時間熟成された。

該連結混合物を、適切なE.coli TG1宿主細胞（Taylo
r,J.W.のNucl.Acids Res. 13:8749（1985））中に形質
転換させ、そしてmlあたり50マイクログラムのアンピシ
リン、mlあたり50マイクログラムの５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルベーターＤ−ガラクトピラノシ
ド、およびmlあたり0.05マイクロモルのイソプロピルベ
ーターＤ−チオガラクトピラノシドを含むＬ寒天平板
（10gmのトリプトン、5gmの酵母抽出物、10gmのNaCl、1
5gmのバクト−アガー（bacto−agar）をリツトルあたり
含む）上に塗布した。37℃にて一夜育生した後、12の無
色のコロニーを無作為に摘採り、各々をmlあたり50マイ
クログラムのアンピシリンを含む1.5mlのＬブロス中に
接種した。卓上シエイカー上で37℃にて５時間育生した
後、微少溶菌DNAを各培養物からBirnboimおよびDolyのN
ucleic Acids Research ７:1513（1979）の方法により
調製した。EcoR IおよびBamH Iによる切断の後、これら
の微少溶菌プラスミドDNA調製物のうちの４つが、約580
塩基対の予想された断片（該Xho II生成DNA末端は、こ
の場合、BamH I生成DNA末端に連結されたときにBamH I
部位を再生成するような配列を有する）を生じた。これ
らのプラスミドの一つをpmNGF＃２と命名し、更に構築
に使用した。

hNGFの成熟部分をコードするヒトゲノムDNAのXho II
断片を、pmNGF＃２のBamH I部位に導入するために、該
ベクターpmNGF＃２をBamH Iにより切断し、自己連結の
防止のためにアルカリホスフアターゼにより処理した。
１マイクログラムのpmNGF＃２を制限エンドヌクレアー
ゼBamH Iにより消化した。該切断DNAをフエノール抽出
し、そしてエタノール沈殿させた。次いで、該乾燥DNA
ペレツトを、10マイクロリツトルの殺菌蒸留水中に再懸
濁した。該BamH I切断pmNGF＃２を、次いで１マイクロ
グラムのBamH I切断pmNGF＃２、0.315マイクロモルのホ
ウ酸ナトリウム、pH10.4および１単位のウシ腸管アルカ
リホスフアターゼ（Sigma Chemicals）を含む21マイク
ロリツトルの反応混合物中で、アルカリホスフアターゼ
を用い、37℃にて１時間の熟成によつて処理した。１時
間の後にEDTA、pH8.0を最終濃度５ミリモルまで加え、
該混合物を68℃で15分間熟成した。次いで、該混合物を
フエノール抽出し、エタノール沈殿させ、乾燥させ、そ
して殺菌蒸留水中に再懸濁した。

10マイクログラムのphNGF＃５（例１に記載されてい
る）を制限エンドヌクレアーゼXho II（New England−B
iobabs）を用い、供給者の勧める条件に従つて消化し
た。次いで、該Xho II切断phNGF＃5DNAをPvu II（Bethe
sda Research Laboratories）を用い、供給者の勧めに
従つて消化を行なつた。該プラスミドのpUC8ベクター部
分に由来する該Xho II断片は、Xho II断片から誘導され
た所望の1,004塩基対のhNGFゲノムDNAとほぼ同様な大き
さであつた。該pUC8誘導断片は、Pvu II部位を含んでお
り、従つて、Pvu II部位を含んでいないhNGFゲノムDNA
誘導断片に比較して大きさにおいて減少された。該消化
DNA断片を0.7％アガロースゲル上での電気泳動により分
離し、約1,000塩基対の断片を、該ゲルからDretzenらに
よるAnal.Biochem. 112:295（1981）のDEAEニトロセル
ロース法により回収した。

該回収された1,000塩基対Xho II hNGFゲノムDNA断片
を、BamH Iおよびアルカリホスフアターゼ処理pmNGF＃
２に対し、120ナノグラムのBamH I切断アルカリホスフ
アターゼ処理pmNGF＃２、250ナノグラムの1,000の塩基
対Xho II hNGFゲノムDNA、１マイクロモルのトリス−HC
l、pH7.8、0.20マイクロモルのMgCl₂、0.40マイクロモ
ルの還元ジチオスレイトール、２ナノモルのATP、およ
び１単位のT4 DNAリガーゼを含む20マイクロリツトル
の反応混合物中で連結した。該反応混合物を15℃にて16
時間熟成した。

該20マイクロリツトルの連結混合物を、適切なE.coli
TG1宿主細胞中に形質転換し、mlあたり50マイクログ
ラムのアンピシリンを含むＬ寒天平板上に塗布した。37
℃にて一夜育生した後、170の無作為に選択した単離コ
ロニーを別々に直径82mmのニトロセルロースフイルタ
（BA85型、Schleicher and Schuell）上に線条に付け
た。

GrunsteinおよびHognessのコロニーハイブリダイゼー
シヨン法をManiatis（312−315頁）に記載されているよ
うに、NGFの成熟型部分をコードするヒトゲノムDNAと相
同な28量体合成オリゴヌクレオチド５′GAGGTGAACATTAA
CAACAGTGTATTCA3′を、³²P5′末端標識の後にプローブ
として用いて行なつた。170の試験コロニーのうち44が2
8量体プローブとハイブリツド化した。明確にハイブリ
ツド化したコロニーのうち24を別々にmlあたり50マイク
ログラムのアンピシリンを含むＬブロス1.5ml中に接種
した。卓上シエーカー上で37℃にて５時間の育生の後、
微少溶菌DNAを各培養物からBirnboimおよびDolyの方法
（前出文献）により調製した。EcoR Iによる切断の後、
微少溶菌プラスミド調製物は、約700塩基対の予想され
た断片を生成した。これらのプラスミドをpmhNGF＃５、
pmhNGF＃９およびpmhNGF＃21と命名した。

プラスミドpmhNGF＃９のDNA配列分析は、それがマウ
スcDNAとヒトゲノムDNAとの所望の結合を有しているこ
とを示した。10マイクログラムのプラスミドpmhNGF＃9D
NAを、制限エンドヌクレアーゼSma I（Bethesda Resear
ch Laboratories）を用い、供給者の勧める条件により
切断した。エタノール沈殿および減圧下での乾燥後、該
Sma I切断DNAを更に制限エンドヌクレアーゼPst I（Bet
hesda Research Laboratories）を用い、供給者の勧め
る条件により切断した。約1,580塩基対断片が0.7％アガ
ロースゲルでの電気泳動により分離され、該DNAをDretz
enらのAnal.Biochem. 112:295（1981）のDEAE−ニトロ
セルロース法により回収した。

バクロウイルスクローニングベクタープラスミドpAC3
73を含むポリヘドリンプロモータを1,580塩基対Sma Iか
らPst Iマウス／ヒトキメラNGF DNAを受容するため
に、pAC373の特異的なBamH IおよびKpn I部位の間にSma
IおよびPstI部位を含むアダプタを挿入することにより
修飾した。該合成35量体オリゴヌクレオチド５′GATCCG
AGCTCCCGGGAGATCTAGACTGCAGGTAC3′（Sma I、Pst Iおよ
び他の制限酵素部位を含む）を蒸留水中にマイクロリツ
トルあたり100ピコモルの濃度で再懸濁した。200ピコモ
ルの該35量体を、該35量体に加えて1.4マイクロモルの
トリス−HCl、pH7.6、0.2マクイロモルのMgCl₂、0.1マ
イクロモルのジチオスレイトール、１ナノモルのATP、
および7.5単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Pharmac
ia）を含む20マイクロリツトルの反応混合物中で37℃に
て１時間熟成することによつてリン酸化した。該酵素を
65℃にて10分間加熱することにより不活性化した。相補
的27量体オリゴヌクレオチド５′CTGCAGTCTAGATCTCCCGG
GAGCTGG3′を同様な方法で処理した。

各リン酸化反応混合物（リン酸化オリゴヌクレオチド
を各々50ピコモル含む）の５ミリリツトル分別物を合
せ、自己−相補的オリゴヌクレオチドを、70℃にて４分
間熟成することにより互いにアニール化させ、次いで37
℃にて30分間、最終的には23℃にて60分間熟成した。

３マイクログラムのプラスミドpAC373を制限エンドヌ
クレアーゼKpn I（Bethesda Research Laboratories）
により切断した。該Kpn I切断pAC373を更に制限エンド
ヌクレアーゼBamH Iにより切断した。該Kpn IおよびBam
H I切断DNAをフエノール抽出し、エタノール沈殿させ、
減圧乾燥し、そして殺菌蒸留水中にマイクロリツトルあ
たり120ナノグラムの濃度で再懸濁させた。該切断pAC37
3ベクターDNAを、次いでアニール化オリゴヌクレオチド
に対して120ナノグラムのKpnおよびBamH I切断pAC373DN
A、1.0ピコモルのアニール化オリゴヌクレオチド、１マ
イクロモルのトリス−HCl、pH7.8、0.2マイクロモルのM
gCl₂、0.4マイクロモルの還元ジチオスレイトール、２
ナノモルのATP、および１単位のT4 DNAリガーゼを含有
する20マイクロリツトルの反応混合物中で連結した。該
連結混合物を15℃にて16時間熟成した。

次いで、20マイクロリツトルの連結混合物を、適切な
E.coli HB 101宿主細胞（Maniatis,T.らのMolecular
Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Lab
oratory:ニユーヨーク）中に形質転換し、mlあたり50マ
イクログラムのアンピシリンを含むLB寒天平板上に塗布
した。

37℃にて一夜育生後、12コロニーを任意に選択し、そ
れぞれをmlあたり50マイクログラムのアンピシリンを含
む1.5mlのＬブロスに接種した。卓上シエーカー上で37
℃にて５時間育生後、各培養物からBirnboimおよびDoly
の方法（前出文献）により微少溶菌DNAを調製した。

Pst IおよびXho I（pAC373中の特異的制限部位）によ
る切断後、予想された約2,000塩基対の大きさのDNA断片
が、微少溶菌プラスミドDNA調製物の一つを除くすべて
から得られた。Pst I制限部位を獲得したすべてのプラ
スミドは、Xho IおよびSma Iによる切断から決定される
ようにSma I制限部位もまた獲得していることが分かつ
た。pAc373 SSBXP−８と命名されたこれらのプラスミ
ドの一つを最終的なプラスミド構築のために使用した。

１マイクログラムのプラスミドpAC373 SSBXP−８を
制限エンドヌクレアーゼSma Iにより供給者が勧める条
件を用いて消化した。エタノール沈殿の後、該乾燥Sma
I切断DNAペレツトを殺菌蒸留水中に再懸濁し、更にPst
I（Bethesda Research Laboratories）により供給者の
勧めに従つて切断した。該Sma IおよびPst I切断pAC373
SSBXP−８ DNAをフエノール抽出し、エタノール沈殿
させ、そして乾燥DNAペレツトをマイクロリツトルあた
り100ナノグラムの濃度として殺菌蒸留水中に再懸濁し
た。次いで、該切断pAC373 SSBXP−８ベクターを、先
に単離したマウス／ヒトNGFキメラを含むpmhNGF＃９の
約1,580塩基対のSma IからPst I断片に、100ナノグラム
のSma IおよびPst I切断pAC373 SSBXP−８、250ナノグ
ラムの約1,580塩基対のpmhNGF＃９のSma IからPst I断
片、1.0マイクロモルのトリス−HCl、pH7.8、0.20マイ
クロモルのMgCl₂、0.40マイクロモルの還元ジチオスレ
イトール、2.0ナノモルのATP、および１単位のT4 DNA
リガーゼを含む20マイクロリツトルの反応混合物中で連
結した。該反応混合物を15℃にて16時間熟成した。

該連結混合物を適切なE.coli HB 101宿主細胞中に
形質転換し、mlあたり50マイクログラムのアンピシリン
を含むＬ寒天平板上に塗布した。37℃にて一夜育生後、
12コロニーを任意に摘採り、各々をmlあたり50マイクロ
グラムのアンピシリンを含む1.5mlのＬブロス中に接種
した。卓上シエーカー上での37℃における５時間の育生
後、各培養物から微少溶菌DNAをBirnboimおよびDolyの
方法（前出文献）により調製した。EcoR Iによる切断
後、これらの微少溶菌プラスミドDNA調製物のうちの２
つが予想された3,400塩基対断片を生じた。

pAC373mhNGFと命名したこれらのプラスミドの一つ
を、バクロウイルスゲノムDNAと共に、下記例４に記載
の方法によりスポドプテラフルジペルダSf9細胞の共
−トランスフエクシヨンのために使用した。得られた組
換えウイルスを、Sf9昆虫細胞の感染に使用し、次いで
下記例５に記載の方法によりhNGFを発現した。

例３ pAcYMhNGFプラスミドの調製 pAcYMhNGFプラスミドの構築は、多段階工程であつた
（第３図）。第１に、プラスミドphNGF＃５（例１に記
載）を、ベータ−NGFコード配列の上流および下流の両
方に都合の良い制限酵素部位を組込むために修飾した。
上流側のBamH I切断部位を与えるため、２つのオリゴヌ
クレオチドアダプタを合成した。第１のアダプタ：５′GGGGATCCAAATATGTCCATGTTGTTCTACACTCT3′および５′GATCAGAGTGTAGAACAACATGGACATATTTGGATCCCC3′は、
２つの可能な開始コドンの第１のもの［２−MET位、−1
21］から直ぐ上流側にBamH I切断部位を有している。一
方、第２のアダプタ:5′GGGGATCCAAATATGTTGTTCTACACTC
T3′および５′GATCAGAGTGTAGAACAACATATTTGGATCCCC3′
は、第２のメチオニンコドン［１−MET位、−119］の次
に制限部位が位置している。

該35量体オリゴヌクレオチド５′GGGGATCCAAATATGTCC
ATGTTGTTCTACACTCT3′を、マイクロリツトルあたり100
ピコモルの濃度で蒸留水中に再懸濁した。100ピコモル
の35量体を、1.4マイクロモルのトリス−HCl、pH7.6、
0.2マイクロモルのMgCl₂、0.1マイクロモルのジチオス
レイトール、１ナノモルのATPおよび7.5単位のT4ポリヌ
クレオチドキナーゼ（Pharmacia）を含む20マイクロリ
ツトルの反応混合物中で、37℃にて１時間熟成すること
によりリン酸化した。次いで、65℃にて10分間加熱する
ことにより該酵素を不活性化した。39量体オリゴヌクレ
オチド５′GATCAGAGTGTAGAACAACATGGACATATTTGGATCCCC
3′を同様な方法で処理した。

各リン酸化反応混合物の５マイクロリツトルの分別物
（各リン酸化オリゴヌクレオチド25ピコモルを含む）を
合し、自己相補的オリゴヌクレオチドを70℃にて４分間
の熟成、次いで37℃にて30分間、最終的に23℃にて60分
間の熟成により相互にアニール化させた。

phNGF＃５のプラスミドDNAは、dam^-E.coli宿主GM48
（dam3^-、dcm6、gal、ara,lac、thr、leu、thi、tonA、
tsx）および制限エンドヌクレアーゼBcl I（Boehringer
−Mannheim）により供給者の勧めに従つて切断された５
マイクログラムの該DNAから調製した。エタノール沈殿
後、該Bcl I切断DNAペレツトを減圧下に乾燥した。該乾
燥DNAペレツトを、殺菌水中に再懸濁し、そしてエンド
ヌクレアーゼSma Iにより切断した。該Sma IおよびBcl
I切断phNGF＃5DNAをフエノール抽出し、エタノール沈殿
させ、減圧下に乾燥させ、そして殺菌蒸留水中に再懸濁
した。次いで、該切断phNGF＃５ベクターDNAを、100ナ
ノグラム（0.038ピコモル）のBcl IおよびSma I切断phN
GF＃5DNA、2.5ピコモルのアニール化オリゴヌクレオチ
ド、１マイクロモルのトリス−HCl、pH7.8、0.2マイク
ロモルのMgCl₂、0.4マクイロモルの還元ジチオスレイト
ール、２ナノモルのATP、および１単位のT4 DNAリガー
ゼを含む20マイクロリツロルの反応混合物中でアニール
化オリゴヌクレオチドに連結した。該連結混合物を15℃
にて16時間熟成した。

次いで、該20マイクロリツトルの連結混合物を、適切
なE.coli GM48宿主細胞中に形質転換し、mlあたり50マ
イクログラムのアンピシリンを含むLB寒天平板上に塗布
した。37℃にて一夜育生後、12コロニーを任意に摘採
り、それぞれをmlあたり50マイクログラムのアンピシリ
ンを含む1.5mlのＬブロス中に接種した。卓上シエーカ
ー上で37℃にて５時間育生後、各培養物から微少溶菌DN
AをBirnboimおよびDolyの方法（前出文献）により調製
した。BamH IおよびSal Iにより切断した後、これらの
微少溶菌DNAは、予想された1500塩基対断片を生成し
た。phNGF2Mと命名された、これらのプラスミドのひと
つを、Sangerの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 74:54
63（1977））によるDNA配列決定に付し、所望の配列を
有していることが分かつた。

プラスミドphNGF1Mを、合成オリゴヌクレオチド５′G
GGGATCCAAATATGTTGTTCTACACTCT3′および５′GATCAGAGT
GTAGAACAACATATTTGGATCCCC3′を用いて同様な方法で構
築した。BamH IおよびSal Iによる切断の後、クローンp
hNGF1mの微少溶菌プラスミド調製物は、予想された1500
塩基対の断片を生じた。

pAcYM1（前出文献）中へのクローニングのためのBamH
I適合性下流制限部位を得るために、Bgl IIリンカーを
hNGF DNAの下流の２つのApa I部位の間に導入した。該
８量体オリゴヌクレオチド５′CAGATCTG3′を、188ピコ
モルの該８量体、1.4マイクロモルのトリス−HCl、pH7.
6、0.2マイクロモルのMgCl₂、0.1マイクロモルの還元ジ
チオスレイトール、１ナノモルのATP、および7.5単位の
T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Pharmacia）を含む20マ
イクロリツトルの反応混合物中で、37℃にて１時間熟成
することによりリン酸化した。該酵素を65℃にて10分間
加熱することにより不活性化した。1.6マイクログラム
のプラスミドのphNGF2Mを制限エンドヌクレアーゼApa I
（New England Biolabs）により、供給者の勧める条件
に従つて消化した。フエノール抽出、エタノール沈殿お
よび乾燥の後、該Apa I切断DNAをマイクロリツトルあた
り200ナノグラムの濃度で殺菌蒸留水中に再懸濁した。A
pa I切断DNAの３′突出部を、次にE.coli DNAポリメラ
ーゼＩのクレナウ断片および４種類のdNTPのすべてを用
いて熟成することにより、除去（平滑−末端化）した。
1.4マイクログラムのApa I切断 phNGF2Mを、該Apa I切
断DNA、1.25マイクロモルのNaCl、0.25マイクロモルの
トリス−HCl、pH7.5、0.25マイクロモルのMgCl₂、それ
ぞれ５ナノモルのdATP、dGTP、dTTP、およびdCTP、なら
びに１単位のE.coli DNAポリメラーゼＩのクレナウ断
片（Bethesda Research Laboratories）からなる25マイ
クロリツトルの反応混合物中で23℃にて10分間熟成し
た。

熟成後、0.5マイクロモルのEDTA、pH8.0を添加し、得
られた混合物をフエノール抽出し、エタノール沈殿さ
せ、乾燥させ、そしてマイクロリツトルあたり100ナノ
グラムのDNA濃度で再懸濁した。該Apa I切断平滑末端化
phNGF2MベクターDNAを、次いで、100ナノグラムのApa I
切断平滑末端化 phNGF2M、28ピコモルのリン酸化８量
体リンカー、１マイクロモルのトリス−HCl、pH7.8、0.
2マイクロモルのMgCl₂、0.4マイクロモルの還元ジチオ
スレイトール、２ナノモルのATP、および１単位のT4 D
NAリガーゼ（Bethesda Research Laboratories）を含む
20マイクロリツトルの反応混合物中で、該８量体Bgl II
リンカーと連結させた。

該連結混合物を23℃にて16時間熟成した。次いで、該
DNAリガーゼを65℃にて10分間熟成することによつて不
活性化した。該連結DNAを、引続き制限エンドヌクレア
ーゼBgl II（Bethesda Research Laboratories）により
供給者の勧める条件で切断した。フエノール抽出、エタ
ノール沈殿および乾燥の後、該DNAをマイクロリツトル
あたり10ナノグラムの濃度で殺菌蒸留水中に再懸濁し、
そして該DNAを100ナノグラムのDNA、１マイクロモルの
トリス−HCl、pH7.8、0.2マイクロモルのMgCl₂、0.4マ
イクロモルの還元ジチオスレイトール、２ナノモルのAT
P、および１単位のT4 DNAリガーゼを含む反応混合物中
で再連結した。該連結混合物を、23℃にて16時間熟成し
た。次いで、20マイクロリツトルの該連結混合物を適切
なE.coli HB101宿主細胞中に形質転換し、そしてmlあ
たり50マイクログラムのアンピシリンを含むLB寒天平板
上に塗布した。

37℃にて一夜育生後、６コロニーを任意に摘採り、そ
れぞれをmlあたり50マイクログラムのアンピシリンを含
む1.5mlのＬブロス中に接種した。卓上シエーカー上で3
7℃にて５時間育生後、各培養物から微少溶菌DNAをBirn
boimおよびDolyの方法（前出文献）により調製した。Ba
mH IおよびBgl IIにより切断の後、phNGF 2Mの連結に
由来する微少溶菌プラスミドDNA調製物のうち２つは、
予想された約780塩基対の断片を生じた。

プラスミドphNGF1mを、同様な方法で構築し、780塩基
対のBamH IからBgl II断片を精製した。

約２マイクログラムのプラスミドphNGF2M DNAを、制
限エンドヌクレアーゼBamH IおよびBgl IIにより切断し
た。該消化DNA断片を0.7％アガロースゲル上での電気泳
動により分離し、約780塩基対断片を、DretzenらのDEAE
ニトロセルロース法、Anal.Biochem. 112:295によつて
ゲルから回収した。該回収DNAを、マイクロリツトルあ
たり30ナノグラムの濃度で殺菌蒸留水中に再懸濁した。

バクロウイルス転移プラスミドpAcYM1（Matsuura,Y.
のJ.of Gem.Virol. 68:1233（1987））を含む９マイク
ログラムのポリヘドリンプロモータを、制限エンドヌク
レアーゼBamH Iを用い、供給者の勧める条件を使用して
切断した。フエノール抽出、エタノール沈殿および乾燥
の後、該BamH I切断pAcYM1を殺菌蒸留水中に再懸濁し、
９マイクログラムのBamH I切断pAcYM1、0.315マイクロ
モルのホウ酸ナトリウム、pH10.4、および１単位のウシ
腸アルカリホスフアターゼ（Sigma）を含む21マイクロ
リツトルの反応混合物中で、37℃にて１時間、アルカリ
ホスフアターゼ処理をした。１時間後に、EDTA、pH8.0
を５ミリモルの最終濃度まで加え、該混合物を68℃にて
15分間熟成した。次いで、該混合物をフエノール抽出
し、エタノール沈殿させ、乾燥し、そして殺菌蒸留水中
に再懸濁した。

次いで、先に精製したphNGF2Mの約780塩基対BamH Iか
らBgl II断片を、100ナノグラムのBamH I切断リン酸化p
AcYM1、225ナノグラムのphNGF2mのBamH IからBgl IIま
で（780塩基対断片）、１マイクロモルのトリス−HCl、
pH7.8、0.2マイクロモルのMgCl₂、0.4マイクロモルの還
元ジチオスレイトール、２ナノモルのATP、１単位のT4
DNAリガーゼを含む20マイクロリツトルの反混合物中
で、BamH I切断アルカリホスフアターゼ処理pAcYM1と連
結した。該連結混合物を15℃にて16時間熟成した。

次いで、20マイクロリツトルの該連結混合物を適切な
E.coli HB101宿主細胞中に形質転換し、mlあたり50マ
イクログラムのアンピシリンを含むLB寒天平板上に塗布
した。37℃にで一夜育生後、12コロニーを任意に摘採
り、それぞれをmlあたり50マイクロモルのアンピシリン
を含む1.5mlのＬブロス中に接種した。卓上シエーカー
で37℃にて５時間育生後、それぞれの培養物からBirnbo
imおよびDolyの方法（前出文献）により、微少溶菌DNA
を調製した。制限エンドヌクレアーゼPst1およびXho I
による切断後、これらの微少溶金プラスミドDNA調製物
のうちの２つは、予想された数および大きさの制限断片
を生じた。pAcYM2MhNGFと命名したこれらのプラスミド
のひとつを、バクロウイルスゲノムDNAと共にスポドプ
テラフルジペルダ Sf9細胞の共−トランスフエクシ
ヨンに使用した。

プラスミドpAcY1MhNGFは、phNGF1MのBamH IからBgl I
Iまでの断片とpAcYM1とを用いて同様な方法で構築し
た。

例４ hNGF組換えバクロウイルスの調製 pAcY1MhNGFまたはpAcY2MhNGFを、バクロウイルス（Ac
NPV）性DNAを共にスポドプテラフルジペルダ細胞（Sf
9）中に、Felgner（前出文献）により記載されたリポフ
エクシヨン法を用いて共−トランスフエクトした。

pAcYM1誘導hNGFプラスミドの種々の量（１から10マイ
クログラム）および１マイクログラムのAcNPV DNA（1.
5ml）を、同量の“DOTMA"リピド溶液（Life Science Te
chonlogy,MD）（66μg/mlをHEPES−緩衝溶液中に含む）
と混合した。次いでリポソームにカプセル化されたDNA
をＴ−25フラスコ中のSf9細胞に加え、1.5時間熟成し、
次いで3mlの新鮮な培地を加えた。４時間後に元の培地
を廃棄し、新鮮な培地をつぎ足した。27℃にて３または
４日間熟成後、上澄溶液を採取し、Sf9細胞の融合性単
層において測定した。閉塞体を示さない（光顕微鏡的に
測定した）プラークを摘採り、ポリヘドリン−負の組換
えウイルスを得るためにSf9細胞上で２回、再プラーク
化を行なつた。高力価ウイルス（10⁷から10⁸p.f.u./m
l）株を調製した。

例５組換えウイルス感染細胞上澄中のヒトベータNGFの免疫
測定 35mmの組織培養皿中の昆虫細胞［アメリカンタイプカ
ルチヤーコレクシヨン（ATCC）、ロツクヴイル、MDか
ら入手した（アキアワヨトウ卵巣（Fall Armyworm Ovar
y）スポドプテラフルジペルダ（Sf9）ATCC＃CRL171
1）］を、組換えウイルスから誘導されたpAcY1MhNGFま
たはpAcY2MhNGFのいずれかで別々に100p.f.u./細胞の倍
々によつて感染させた。１時間の後、感染ウイルスを除
去し、2mlの新鮮Grace培地（JR Scientific、Woodland,
CA）（胎仔性ウシ血清を含まない）を添加した。72時間
後、培養上澄を回収し、10倍に濃縮した。該濃縮試料
を、抗−マウスNGF抗体を使用して、ELISAまたはウエス
タンブロツト分析のいずれかに供した。ウエスタンブロ
ツト（第４図）およびELISAの両方の結果は、pAcY1MhNG
Fが検出可能な量のhNGFを産生しない一方、pAcY2MhNGF
誘導組換えウイルスは、約１マイクログラム/mlのhNGF
を培地中に分泌することを示した。

例６無血清培地中でのhNGFの産生無血清培地（XL−400）は、JR Scientific Inc.Woodl
and CAから購入した。27℃のXL−400培地中に繁殖したS
f9細胞を、100mlシエーカーフラスコ中で懸濁状態で育
生した。細胞密度を新鮮培地で希釈しつつ３×10⁵から
１×10⁶細胞/mlに保持した。対数相において倍増する時
間は、約24時間であつた。細胞密度５×10⁵から2.4×10
⁶細胞/mlのSf9細胞を、組換えウイルスにより、感染の
種々の倍率（MOI）（0.01から10p.f.u./細胞まで）をも
つて感染させた。

培養上澄を、感染後３、５おより６日において採取し
た。0.22μｍ膜フイルタ系（Corning glassware,Cornin
g,NY）を通してロ過した後、ロ液中に存在するhNGFの量
をELISA法により測定した。XL−400培地においては、組
換えhNGFは、Sf9細胞が密度2.4×10⁶細胞/mlかつMOI0.0
1において感染された場合に、感染後３日目に最適に産
生された（約６μg/ml）。

例７ ELISAによる分析 Immulon−２平底96穴プレート（Dynatech Labs Inc.
カタログ番号011−010−3450）を、抗−マウス−ベータ
（2.5S）NGF（Boehringer Mannheim、カタログ番号1008
218）により、１μg/mおよび0.15ml/穴の濃度で、少な
くとも２時間被覆した。（NGFは、コーテイング緩衝液
（Na₂CO₃/NaHCO₃、50mM;Naアジド0.1％w/v;pH9.6）によ
り希釈した。）次いで、該プレートを洗浄緩衝液（50mM
トリス−HCl、pH7.0;200mM NaCl、10mM CaCl₂、0.1％
（w/v）トライトンＸ−100、0.05％（w/v）Na−アジ
ド）により洗浄した。次に、該プレートをBSA（洗浄緩
衝液中に１％BSA、Sigma、RIA級、カタログ番号Ａ−788
8）により室温下で少なくとも30分間ブロツクし、再び
洗浄緩衝液により洗浄した。

標準曲線は、各々の商業的な検定に包含される：蒸留
水中に100μg/mlの濃度をもつて再構成され、５μ／
チユーブの分別物として−60℃で保存された2.5Sマウス
NGF（Sigma、製品番号N6009）を、解凍し、495μの試
料緩衝液（20μg/mlのアプロチニンが添加されたブロツ
ク用緩衝液、United States Biochemical Co.カタログ
番号11388）により希釈した。この標準（最終NGF濃度１
μg/ml）は、４℃において少なくとも10日間安定であ
る。

該mNGF標準を、試料緩衝液により倍々に一連に希釈
し、ELISAプレート（0.1ml/穴；一対で）上に加えた。
培養液についても、試料緩衝液中に一連に稀釈（1/2か
ら1/64,000）し、プレート上に加えた（この場合も0.1m
l/穴）。４℃において一夜熟成の後、該穴を反復洗浄し
た。NGF（2.5S）−ベーターgal共役物（Boehringer Man
nheim,カタログ番号1008234、ブロツク用緩衝液中に0.0
125単位/ml）を、各穴に加えた。37℃にて４時間熟成
後、該プレートを再度洗浄した。0.2mlの新たに調製し
た基質溶液（基質緩衝液中に2mg/mlのクロロフエノール
レツド−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド:100mMのhepe
s、pH7.0;150mMのNaCl、2mMのMgCl₂;0.1％（w/v）Naア
ジド、１％（w/v）のアルブミン）を各穴に加え、更に3
7℃にて２時間熟成した。次いで、ELISAプレートをTite
rtek Multiskanマイクロタイタープレート読取装置によ
り、570nmのMultiskan干渉フイルターを用いて読んだ。

例８バクロウイルス産生hNGFの生物活性組換えpAcY1MhNGFまたはpAcY2MhNGFウイルスにより産
生される物質の生物活性を、インビトロにおいてPC₁₂フ
エオクロモサイトマ細胞株（pheochromocytoma cell li
ne）（Greene,L.A.の、Trends Neurosci.７:91（198
6））上で試験した。P₁₂細胞を、５％の限定的に添加さ
れた仔ウシ血清および５％のウマ血清が添加されたダル
ベツコの修飾イーグル培地（DMEM）中で育生し、穴（16
mm）あたり約50,000細胞の密度で播種した。細胞を、組
換えバクロウイルス感染細胞、またはマウスNGF（Sigm
a）由来のいずれかの培養液の一回の添加により処理し
た。細胞を、添加後14日まで観察した。

pAcY2MhNGF組換えバクロウイルス感染細胞由来の培養
液（25μ/ml培地）により処理されたPC₁₂細胞は、急
速な分化を起こした（第５図）。神経軸索の出芽に示さ
れる攻撃の比は、mlの培地あたり25および100ngにおけ
るマウスNGF（25−36時間）より実質的により速い（12
時間以内）（第６図）。PC₁₂細胞の速い分化を誘導する
能力は、バクロウイルス産生hNGFの本来の性質であるよ
うに見える。他方、分化の持続時間は、濃度依存性であ
る。感染Sf9細胞液の濃縮調製物により処理されたPC₁₂
細胞は、実験の継続期間中（14日間）分化が続いた。一
方、バクロウイルス産生hNGFのより希釈された調製物
（0.1×）により処理されたPC₁₂細胞は、５日後にそれ
らの分化の表現型が逆転した。

興味深いことに、pAcY1MhNGF組換えウイルス感染細胞
上澄により処理されたPC₁₂細胞は、分化の徴候を示さな
かつた。この観察は、ウエスタンブロツトおよびELISA
の負の結果と一致する（例５）。

バクロウイルス産生hNGFによる生物学的活性は、抗−
マウスNGF抗体により中和され得る（第７図）。

例９ PC₁₂細胞のNGF−誘導分化の中和 PC₁₂細胞を、次の変更を伴つて例８に記載されたよう
に塗布した:NGFを培養培地に添加するのに先立つて、抗
−マウスNGF抗血清（Collaborative Research Inc.、生
血清の1:500および1:1000希釈）を該PC₁₂細胞に添加し
た。次いでマウスNGF（Sigma）または組換えヒトNGFをP
C₁₂細胞培養物に加え、それらの細胞分化に対する効果
を14日間の期間観察した。

ヒト（25μの培養液）およびマウス（100ng）のNGF
の両者によるPC₁₂細胞のNGF誘導分化は、抗NGF抗血清の
生血清1:500および1:1000希釈により中和された。

例10 ヒト神経芽SH−SY5Y細胞におけるhNGFの生物学的活性 SH−SY5Y細胞［Biedlerらの、Cancer Res.33:2643（1
973）、同文献38:3751（1978）］の培養物を、75cm²Cor
ning T−75フラスコ中において、ダルベツコ修飾イーグ
ル培地（DMEM）および10％の胎孔性ウシ血清（JR Scien
tific）が添加されたハム（Ham）のＦ−12（JR Scienti
fic,Woodland,CA）の1:1混合物中で37℃にて維持した。
細胞を、フラスコあたり4mlのDMEM中の0.02％EDTAを加
え、次いで激しく振とうすることにより、移送および採
取のために分離した。細胞を、1:5の分配比で通過させ
た。いずれの場合にも培養物中に抗菌剤を使用しなかつ
た。負の対照上澄、100ng/mlの濃度のNGF（2.5SマウスN
GF、Sigma）またはヒトNGF（25μ/ml）に対する細胞
の曝露の後、該細胞を分化の徴候について24時間毎に観
察した。培養継続のために培地を２日毎に交換し、かつ
NGFを充足した。アフイジコリン（Aphidicolin）を、処
理の第２週に10μg/mlで培地に加えた。

SH−SY5Yヒト神経芽細胞株に対するヒトNGF（25μ/
ml）の添加は、急速な分化（細胞からの軸索突起の伸
長）を誘導したが、負の対照培養液上澄のSH−SY5Y細胞
への投与（25μ/ml）の後には何らの効果も観察され
なかつた。24時間の早期に始まつたNGFによる分化の急
速な攻撃は、同じ細胞系に対するマウスNGF（Sigma）の
添加の後に観察されたより遅い攻撃（５日）（Jensen,D
ev.Biol. 120:56（1987））とは対照的であつた。

アフイジコリンは、分化細胞に対しては何らの効果も
持たないが、アルフアDNAポリメラーゼの可逆的な阻害
剤であり、従つて有糸分裂する細胞を殺すであろう。NG
Fによる分化が誘導されなかつた僅かな有糸分裂的に活
性な細胞は、静止すなわち分化細胞に生成するため、第
２週における細胞のアフイジコリンによる処理が必要で
ある。

例11 同じバクロウイルスにおいてhNGF遺伝子および処理酵素
をコードする他の遺伝子を含む組換えウイルス類による
感染 hNGF遺伝子およびNGFのガンマサブユニツトまたは酵
母KEX2エンドペプチダーゼ等の処理酵素をコードする他
の遺伝子を高水準で共発現するように特異的に加工され
た転移ベクターの発展は、成熟NGFの多量産生への別の
到達手段である。これは、ベータNGF遺伝子をポリヘド
リンプロモータの下流に挿入し、かつガンマNGFまたはK
EX2遺伝子をポリヘドリンプロモータの第２の複写物、
他のバクロウイルスプロモータ、例えばp10後方プロモ
ータ、または設計された合成プロモータ等の制御下に挿
入することにより達成され得る。次いで、組換えウイル
スを、例４に記載されているように創生し、例５に記載
されているようにSf9細胞の感染に使用される。

例12 記憶障害試験におけるnNGF 一般論この試験においては、損傷は、AD患者に見られる記憶
および認識能力の傷害の見地からコリン作用性機能不全
の模倣を試みる。hNGF治療は、傷害の程度を著しく減少
した。

方法雄のCharles River Wisterラツト（280−300g）を、
音、温度および湿度が制御され、12時間の明／暗サイク
ルが維持された住居に個別に収容した。最初の10日間
は、研究動物は、飼に自由に近づけた。11日以後は、動
物の給飼をすべての動物がそれらの元の体重の80％とな
るまで減少させた。この体重は、訓練中を通して維持さ
れた。

装置−Ｙ迷路を動物の前訓練のために用い、各ゴール
アームは、高さ13cm×幅13cm×長さ47cmであつた。これ
らのアームは、進入路（高さ13cm×幅13cm×長さ40cm）
からギロチン様とびらにより分離されていた。

訓練方法−訓練および試験方法は、基本的にはRamlre
zおよびSteinの方法（Behav.Brain Res.13:53−61（198
2）に従つた。概略的には、動物を異なる実験グループ
（ｎ＝５−９）に無作為に配分し、３日間の前訓練にお
いて実験者およびＹ迷路に馴ませた。次いで、動物は、
５日間無作為変更訓練にあてられた。ラツトを進入路の
基部に置いた後、該動物は、放たれ、アームの一方に進
入することが許された。一旦ゴールアームに入ると、該
動物は飼の報酬（45mgのNoyesフードペレツト）を得
た。ペレツトを食べた後、該動物は進入路に戻され、放
たれて、次の無作為に選ばれ、再び該ラツトが飼の報酬
を得るゴールアームに進入することが許された。該動物
は、合計10回の左／右無作為変更の一連を経験させられ
た。この強制的な訓練期に続き、動物を、迷路中で自由
に変更するように、すべてがある基準水準:3日間連続し
ての80％の正しい変更挙動に達するまで訓練した。

外科−ラツトをキシラジン（Haver）／ケトアミン（P
arke−Davis）200:20mg/kgi.m.により麻酔し、立体配置
フレーム（Kopf Instruments）に置いた。頭蓋骨を露出
し、浄化し、各々のMeynertの中核基底（NBM）の上部に
２つの穴を穿つた（座標は、PaxinoおよびWatson（The
Rat Brain in Stereotaxic Coordinate,第２版、Academ
ic Press,New York）に従つてブレグマから測定し、額
角／後端−0.4mm、横方向±2.6mmであつた）。該穴の下
の脳膜を貫通させ、イボテン酸（5mg/ml）で満たしてお
いたハミルトンシリンダの先端を脳膜に対して−6.5mm
および−7.5mm内方に下げた。1.0μのイボテン酸を、
NBM中に１分間にわたつて注入した。

更に、第３の穴を側部脳室上部の頭蓋に穿ち（額角／
後端−0.8mm、横方向1.4mm）、ステンレス鋼カニユーレ
を脳膜から4mm脳室中に植え付けた。該カニユーレは、2
3gのステンレス鋼針から組立てられ、ポリエチレンチユ
ーブを介してあらかじめ満たされた殺菌Alzet（Alza、P
alo Alto、カリフオルニア、米国）モデルの2ml小型浸
透型ポンプ（流速2.4μ／時）に連結された。該ポン
プは、肩甲骨間に皮下的に設置した。次いで、傷を縫合
し、該動物の回復を待つた。小型ポンプは、異なる治療
グループに応じて：ａ） hNGFが、0.1μg/mlのラツト血清を含む殺菌食塩
水中に最終濃度0.1、1.0または10.0μg/ml溶解される、
すなわち、ラツトは、４週間の治療期間に、0.2、2.0ま
たは20.0μｇのhNGFを受けるか；またはｂ） 0.1mg/mlのラツト血清を含む食塩水により満たさ
れた。

処理手続実験グループは、対照動物（ｎ＝６）、傷害のみ（ｎ
＝９）、0.1μg/mlのhNGFを有する傷害（ｎ＝９）、1.0
μg/mlのhNGFを有する傷害（ｎ＝９）、および10.0μg/
mlのhNGFを有する傷害（ｎ＝９）から成つている。該動
物は、空間的変更の仕事において訓練され、外科的に処
置され、次いで３週間の治療期間が与えられた。治療期
間の後に、該ラツトを、Ｙ−迷路中で再試験し、それら
の挙動的成績を、20日の期間にわたつて評価した。

統計的分析−Cochran−Mantel−Haenszelテストを、
治療の全体的な効果に加えて治療間の対的な差異に対し
て意味のある試験を得るために使用した。

結果実験グループにおける傷害後の死亡率は、40％で、最
終的グループの数は、対照（６）、傷害のみ（６）、0.
1μg/mlのhNGFを有する傷害（５）、1.0μg/mlのhNGFを
有する傷害（６）、10.0μg/mlのhNGFを有する傷害
（６）であつた。

空間的変更挙動におけるイボテン酸傷害およびhNGFの
効果を測定するために、３種類の行動基準を検討した：
（ｉ）傷害後、基準に至る日数、（ii）１日あたりの変
更誤りの平均数、および（iii）１日あたりの忍耐的誤
りの平均数。

第８図に示されるように、横軸方向にイボテン酸傷害
動物は、対照動物に比べて確立された水準まで到達する
ために著しく長くかかる（ｐ＜0.01）。この効果は、hN
GFの1.0および10.0μg/mlの投与により部分的に改善さ
れる。傷害のみの動物と、傷害を有するが、1.0μg/ml
hNGF（ｐ＜0.01）および10.0μg/ml hNGF（ｐ＜0.01）
により治療された動物との間には、顕著な差異があつ
た。傷害のみのラツトと、傷害を有し、0.1μg/mlのhNG
Fを投与されたものとの間には顕著な差はなかつた。

横軸方向の傷害は、また、ラツトに対照ラツトと比べ
た場合、顕著な日変更の誤り（ｐ＜0.01）を招き、かつ
対象動物に比べて顕著な忍耐的誤り（ｐ＜0.01）を招
く。

hNGF治療は、NBMに対する横軸方向のイボテン酸傷害
に続いて観察される損傷に限定された。傷害が治療され
た、および傷害が1.0μg/ml（ｐ＜0.01）ならびに10.0
μg/ml（ｐ＜0.01）の投与をもつてhNGFで治療された動
物の間には、変更の誤り（第８図）の平均数と、忍耐的
誤りの平均数とにおいて著しい差異があつた。傷害が治
療された、および傷害が0.1μg/ml hNGFで治療された動
物の間には、９日までは、変更および忍耐的誤りの平均
数において顕著な差はなかつたが、10日以後においては
これらのグループ間に著しい差異（ｐ＜0.01）があつ
た。

要約すると、ラツトにおけるMeynert中核基底の横軸
方向のイボテン酸傷害は、学習した空間的変更挙動を著
しく損なう。この損傷は、組換えhNGFにより著しく改善
され、rhNGFは、中枢コリン作働性機能傷害を改善する
ことが示唆される。

例13 例12に示される試験において、何らの毒性効果も観察
されなかつた。

上記の記載および例は、好ましい実施態様を含めて本
発明を全て開示している。分子遺伝学および関連する科
学における当業者には自明であるような、ここに記載し
た方法の変更は、記載された特許請求の範囲に包含され
るものと理解される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、hNGFの成熟ベータサブユニツトのアミノ酸配
列を示す図である。クローン化されたマウスプレープローNGFcDNAと、Ullri
ch,Symp.on Quant Biol.,Cold Spring Harbor48:435（1
983）により発行されたヒト配列との比較であり、ここ
でｍはマウス配列、ｈはヒト配列を示し、IVSは、ヒト
遺伝子中の介在配列の位置を示している。第２図は、pAc373mhNGFプラスミドの構築を示すフロー
チヤートである。第３図は、pAcYMhNGFプラスミドの構築を示すフローチ
ヤートである。第４図は、ウイルス感染細胞の上澄から精製されたhNGF
の銀染色およびウエスタンブロツト分析の結果を示す泳
動図である。第５図（１）、（２）、（３）および（４）は、pAcY2M
hNGF組換えバクロウイルス感染細胞由来の培養液により
処理された細胞の状態を示す、つまり生物の構造を示す
写真である。第６図は、軸索突起の成長により示される攻撃の比率を
示すグラフである。第７図は、バクロウイルス産生hNGFに帰因する生物学的
活性を示すグラフである。第８図は、ラツトにおける記憶の低下および思考力の減
退を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ヘラバースズティン ― ペッテグリューアメリカ合衆国カリフォルニア州パロアルト，ウイルキーコート4125 (72)発明者ビンティー．ヌグイエンアメリカ合衆国カリフォルニア州サンジョセ，ホワイトサンズドライブ 3191 (72)発明者キャロルウオードアメリカ合衆国カリフォルニア州ラホンダ，レッドウッドドライブ119 (56)参考文献特開昭60−84299（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｅ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ〔82〕，（1985）Ｐ．8404− 8408

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】昆虫細胞内で機能する制御因子に対して適
切な方向をもって結合された、マウス神経成長因子（NG
F）のプレプロ部分のDNAコード配列および成熟ヒトβNG
FのDNAコード配列、またはヒトNGFのプレプロ部分のDNA
コード配列および成熟ヒトβNGFのDNAコード配列からな
る、ヒトβNGF（hNGF）または１個または複数個のアミ
ノ酸の付加、挿入、欠失または置換体であり、かつhNGF
と実質的に同じ活性を有するその誘導体の遺伝子を有す
るバクロウイルス（baculovirus）転移ベクターであっ
て、翻訳開始が−187位または−121位メチオニンで起る
ことを特徴とするバクロウイルス転移ベクター。
【請求項２】マウスNGFのプレプロ部分のDNAコード配列
および成熟ヒトβNGFのDNAコード配列からなるhNGFまた
は１個または複数個のアミノ酸の付加、挿入、欠失また
は置換体であり、かつhNGFと実質的に同じ活性を有する
その誘導体の遺伝子を有する請求項第１項に記載の転移
ベクター。
【請求項３】hNGFをコードする遺伝子が、バクロウイル
ス遺伝子のmRNAリーダー配列およびプロモータが結合さ
れたキメラ遺伝子である請求項第１項に記載の転移ベク
ター。
【請求項４】−187位の開始コドンより上流側に挿入さ
れたBam HI制限部位を有する合成アダプタを用いて構築
される請求項第１項または第３項のいずれか一つに記載
の転移ベクター。
【請求項５】合成アダプタがコード配列： 35量体：５′GATCCGAGCTCCCGGGAGATCTAGACTGCAGGTAC3′ 27量体：５′CTGCAGTCTAGATCTCCCGGGAGCTGG3′ を有する請求項第４項に記載の転移ベクター。
【請求項６】下図に示されるpAC373mhNGFまたは１個ま
たは複数個のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換体
であり、かつhNGFと実質的に同じ活性を有するその誘導
体である請求項第４項に記載の転移ベクター。
【請求項７】BamHI制限部位がhNGF遺伝子の−121位の開
始コドンに隣接するように挿入された合成アダプタを用
いて構築される請求項第１項に記載の転移ベクター。
【請求項８】合成アダプタがコード配列： 35量体：５′GGGGATCCAAATATGTCCATGTTGTTCTACACTCT3′ 39量体：５′GATCAGAGTGTAGAACAACATGGACATATTTGGATCCCC3′ を有する請求項第７項に記載の転移ベクター。
【請求項９】下図に示されるpAcY2MhNGFまたは１個また
は複数個のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換体で
あり、かつhNGFと実質的に同じ活性を有するその誘導体
である請求項第７項に記載の転移ベクター。
【請求項１０】請求項第１項から第９項までのいずれか
一つに記載の転移ベクターにより感染された昆虫細胞。
【請求項１１】スポドプテラ・フルジペルダ（Spodopte
ra frugiperda（Sf9））である請求項第10項に記載の昆
虫細胞。
【請求項１２】ａ）hNGFの遺伝子をバクロウイルス転移
ベクター中に挿入して請求項第３項のキメラ遺伝子を形
成し；ｂ）該（ａ）のキメラ遺伝子をバクロウイルス中に結合
させ；ｃ）該組換えバクロウイルスにより昆虫細胞を感染さ
せ；ｄ）該（ｃ）の感染昆虫細胞を育生し；そしてｅ）使用した培養培地からhNGFまたは１個または複数個
のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換体であり、か
つhNGFと実質的に同じ活性を有するその誘導体を採取す
ることからなる、昆虫細胞内における生物学的に活性なhNGFまたは上記誘
導体の製造方法。
【請求項１３】昆虫細胞が、低または無血清培地中で育
生される請求項第12項に記載の方法。
【請求項１４】キメラ遺伝子が、発現ベクターであるバ
クロウイルス中にリポ感染法を用いて結合される請求項
第12項または第13項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】昆虫細胞が、hNGFのベータサブユニット
をコードする組換えウイルスにより感染される請求項第
12項、第13項または第14項のいずれか一つに記載の方
法。
【請求項１６】感染昆虫細胞が、生物学的に活性なベー
タhNGFを培養培地中に分泌する請求項第15項に記載の方
法。
【請求項１７】請求項第１項のヒトNGFまたは１個また
は複数個のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換体で
あり、かつhNGFと実質的に同じ活性を有するその誘導体
のDNAコード配列、および該hNGFコード配列のバクロウ
イルス発現ベクター中へのトランスフェクションに要す
る制御因子を有し、hNGFまたはその生物学的に活性な誘
導体の発現をもたらす昆虫細胞への感染が可能なhNGF発
現ベクター。