KR100288389B1 - 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스 gp64의 프로모터와 다각체 프로모터의 융합 프로모터로 구성된 새로운 발현 시스템에 의한 재조합 단백질의 대량 생산방법 - Google Patents

오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스 gp64의 프로모터와 다각체 프로모터의 융합 프로모터로 구성된 새로운 발현 시스템에 의한 재조합 단백질의 대량 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스(Autographa Californicanuclear polyhedrosis virus, 이하 'AcNPV'로 약칭함) 의 폴리히드린(polyhedrin) 프로모터와 외피 당단백질인 gp64의 프로모터가 융합된 새로운 융합 프로모터, gp64 의 시그날 서열 및 외래 유전자 서열을 포함하는 베큘로바이러스 (baculovirus) 발현 벡터 그리고 이를 이용하여 곤충 세포에서 외래 단백질을 대량으로 발현, 제조하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 AcNPV의 다각체 프로모터인 폴리히드린 프로모터와 gp64의 초기 및 후기 프로모터와 융합시킨 융합 프로모터의 조절하에 gp64의 시그날 서열이 융합된 외래 단백질을 발현할 수 있는 베큘로바이러스 발현 벡터를 작제하고 이를 야생형 베큘로바이러스와 동형 재조합(homologous recombination)하여 얻은 재조합 베큘로바이러스를 곤충 세포에 감염시켜 외래 단백질을 활성형의 형태로 대량으로 발현, 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 베큘로바이러스 발현 벡터를 이용하면 유용한 외래 단백질을 인체에 활성이 있는 형태로 세포 배양액에서 용이하게 분리, 정제할 수 있으며, 또한 그 발현량이 현저히 증가되고 재조합 바이러스의 감염 초기에서부터 후기까지 지속적으로 발현이 높은 수준으로 유지되어 대량으로 제조가능하다.

Description

오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스 ｇｐ64의 프로모터와 다각체 프로모터의 융합 프로모터로 구성된 새로운 발현 시스템에 의한 재조합 단백질의 대량 생산방법
본 발명은 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스(AcNPV)의 폴리히드린 프로모터와 외피 당단백질인 gp64의 프로모터가 융합된 새로운 융합 프로모터, gp64의 시그날 서열 및 외래 유전자 서열을 포함하는 베큘로바이러스 발현 벡터 그리고 이를 이용하여 곤충 세포에서 외래 단백질을 대량으로 발현, 제조하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 AcNPV의 다각체 프로모터인 폴리히드린 프로모터와 gp64의 초기 및 후기 프로모터와 융합시킨 융합 프로모터의 조절하에 gp64의 시그날 서열이 융합된 외래 단백질을 발현할 수 있는 베큘로바이러스 발현 벡터를 작제하고 이를 야생형 베큘로바이러스와 동형 재조합하여 얻은 재조합 베큘로바이러스를 곤충 세포에 감염시켜 외래 단백질을 활성형의 형태로 대량으로 발현, 제조하는 방법에 관한 것이다.
베큘로바이러스(baculovirus)는 곤충 세포에만 한정적으로 감염을 일으키는 바이러스로서 약 80-200kbp 크기의 이중가닥 DNA가 막대형의 뉴클레오캡시드 외피에 둘러싸여 있으며, 일찍부터 생물학적 살충제를 연구하기 위하여 많이 사용되어 왔다. 최근에 들어서는 베큘로바이러스가 각종 유용한 단백질을 곤충 세포에서 대량으로 생산할 수 있는 발현 벡터로 이용되어 각광을 받고 있는 실정이다.
베큘로바이러스 속은 바이러스의 형태에 따라 다시 세 개의 아그룹으로 분류될 수 있다. 구체적으로 아그룹 A 바이러스인 핵다각체 병 바이러스(nuclear polyhedrosis virus, 이하 'NPV'로 약칭함)는 한 개의 뉴클레오캡시드가 외피에 포함되거나(SNPV), 여러 개의 뉴클레오캡시드가 하나의 외피에 둘러싸인 형태(MNPV)를 가지며 이 바이러스들은 다시 폴리히드라라는 폴리히드린 단백질의 복합체에 봉입되어 있다. 아그룹 B 바이러스는 그래눌로시스바이러스(granulosis virus, GV)인데 외피당 하나의 뉴클레오캡시드로 구성되고 그래눌린(granulin) 단백질의 복합체에 봉입되어 있다. 아그룹 C 바이러스는 하나의 뉴클레오캡시드로 구성되고 단백질 복합체에 둘러싸여 있지 않은 특징을 가진다.
이들 바이러스 중에 현재 알팔파 루퍼(alfalfa looper)로 불리우는 나방 모충인 오토그라파 캘리포니카(Autographa Californica)에서 분리한 NPV 인 AcNPV 또는 봄비스 모리(Bombix mori)에서 분리한 NPV인 BmNPV가 유용한 단백질을 대량으로 생산하는 발현 벡터 또는 발현 시스템으로 많이 이용되어 왔다.
베큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충세포에서 외래 단백질을 발현시키는 경우 여러 가지 이점이 있는데, 그중 하나는 곤충 세포를 이용한 베큘로바이러스 발현 시스템은 대장균의 발현 시스템과 유사한 정도로 단백질을 대량 생산할 수 있고, 그리고 대장균이나 효모와는 달리 당의 부가(glycosylation)와 같은 번역후 수식(post-translational modification)이 효과적으로 이루어져 천연형의 단백질과 유사한 생물학적으로 활성이 있는 외래 단백질을 대량으로 얻을 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.
또한 치료용 단백질을 생산하는 경우에는, 대장균의 발현 시스템을 이용하면 대장균의 세포벽에서 유래하는 발열성 물질인 파이로젠(pyrogen) 등이 혼입되어 부작용이 유발될 수 있고, 번역후 수식이 전혀 이루어지지 않으므로 천연형 단백질과 유사한 당단백질 형태로서의 외래 단백질을 생산할 수 없다. 또한 동물세포의 발현 시스템을 이용하여 생산된 단백질은 그 구조는 천연형 단백질과 유사하나 발현된 단백질의 양이 대장균 또는 곤충 세포에 비하여 매우 적다는 단점이 있다.
그러나 곤충 세포를 이용하여 외래 단백질을 발현시키는 경우는, 발현되는 단백질의 양에 있어서 일반적으로 세포내 단백질은 200mg/l 이상으로 발현되고, 당단백질로서 분비되는 단백질은 평균 1mg/l로 발현된다고 보고되고 있다.
이러한 베큘로바이러스 발현 시스템의 장점에도 불구하고 당쇄화되어있고 분비되는 외부 단백질의 발현은 분비되지 않는 단백질에 비해 종종 발현양이 현저히 낮은 경우가 있다(Jarvis, D. L. and Summers, M. D.,Mol. Cell. Biol., 1989, 9, 214-223). 이러한 외부 단백질이 곤충 세포에서 낮은 수준으로 발현되는 이유는 주로 외부 유전자의 시그날 서열이 숙주세포에 의해서 비효율적으로 인식되거나, 바이러스의 감염에 따른 숙주 세포의 단백질 프로세싱(processing) 능력의 감소에 기인하는 것으로 여겨지고 있다.
인간 트롬보포이에틴(humane Thrombopoietin, 이하 'hTPO'라 약칭함)은 332개의 아미노산으로 구성된 당단백질 (glycoprotein)로서, 인간의 간 또는 신장 등의 조직에서 생성되고 분비되어 골수에 작용하여 골수 내의 조혈 세포인 혈소판의 수를 증가시키고 분화를 촉진시키는 조혈 단백질이다. 1958년 켈레만이 '트롬보포이에틴(TPO)'이라는 혈액내 활성 물질이 혈소판의 생성을 조절함을 제안한 이래 1994년에 이르러서야 hTPO가 존재함이 밝혀져 그의 구조와 작용에 대한 연구가 이루어졌다. hTPO는 골수세포내에 존재하는 혈소판 전구세포인 거핵구 콜로니 형성 전구세포들에 작용하여 혈소판 전구세포를 증식시켜 궁극적으로 혈소판의 수를 증대시키고 그의 분화를 촉진시키는 당단백질로서, 최근 의학 분야에서 관심이 모아지고 있는 유망한 단백질이다. 구체적으로 hTPO가 사용되어 치료될 수 있는 적응증은 혈소판의 수가 감소 (thrombocytopenia)되거나 그의 기능이 퇴화되어 유발되는 질환으로, 특히 항암제 또는 약물을 과량으로 투여하는 경우에 유발되는 혈소판 감소증 및 골수 이식을 한 환자를 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다. 현재까지 이러한 혈소판 감소증을 치료하는 방법으로 혈소판을 수혈하는 방법이 유일하게 사용되어 왔으나, 이는 출혈의 유발, 에이즈 바이러스 또는 간염 바이러스와 같은 혈액에서 유래한 감염원에 의한 감염 및 혈소판의 항원성 등과 같은 부작용이 있었다. 따라서 이러한 부작용들을 최소화할 수 있거나 원천적으로 제거할 수 있는 hTPO 단백질은 혈소판이 관여하는 각종 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
베큘로바이러스 발현 시스템의 문제점을 해결하여 상기와 같은 유용한 단백질을 대량 생산하기 위한 노력의 일환으로, 최근에는 외부 유전자의 시그날 서열을 조작함으로서 발현되는 단백질을 숙주세포의 세포외로 분비시켜 그 발현양을 증대시킨 예가 보고되고 있으며 일부 단백질의 경우에도 발현양을 성공적으로 증대시킨 경우가 보고된 바 있다. 즉 머피 등은 AcNPV의 gp64 외피 단백질의 시그날 서열을 HIV-I(humane influenza virus Ⅰ)의 gp120과 융합시켜 gp120이 약 20배나 높은 수준으로 발현 및 분비된 결과를 보고하였다(Murphy,et al., Protein Expr. Purif., 1993, 4, 349-357). 이 때 이용된 AcNPV의 gp64 단백질은 봉입형 바이러스(extracellular virus, 이하 'ECV'로 약칭함) 형태의 AcNPV의 페플로머(peplomer)를 구성하는 주요 외피 당단백질로서 숙주세포의 감염에 중요한 역할을 수행하며, 초기 프로모터와 후기 프로모터의 두 가지의 프로모터에 의해 발현을 조절받는다 (Jarvis, D. L. and Garcia, A.,Virology, 1994, 205, 300-313).
이에 본 발명자들은 유용한 외래 단백질을 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 보다 효과적으로 대량 생산하기 위하여 연구 노력한 결과, AcNPV의 다각체 프로모터와 gp64의 초기 및 후기 프로모터를 융합시킨 융합 프로모터의 조절하에 gp64의 시그날 서열이 융합된 hTPO 등 외래 단백질을 발현할 수 있는 베큘로바이러스 발현벡터를 작제하고 이를 야생형 베큘로바이러스와 동형 재조합(homologous recombination)하여 얻은 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시켜 당단백질 형태의 hTPO가 세포외로 분비되도록 발현시키면 hTPO의 발현량이 현저하게 증가되고 또한 감염후 2-3일 이후에도 계속 높은 수준을 유지하여 그 생산량이 극대화되며, hTPO 등의 외래 단백질을 인체에 활성이 있는 당단백질 형태로 세포 배양액에서 용이하게 분리, 정제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 유용한 외래 단백질, 그중 특히 당단백질 형태의 분비성 외래 단백질을 보다 효과적으로 대량 생산하기 위한 베큘로바이러스 발현 시스템을 구축하는 것을 그 목적으로 한다.
도 1은 외래 단백질로 인간 트롬보포이에틴(human Thrombopoietin, 이하 'hTPO'라고 약칭함) cDNA를 포함하는 베큘로바이러스(baculovirus) 발현 벡터 pBT332, pGP404 및 pPGP404의 개략적 구조를 나타낸 것이고,
도 2는 자신의 시그날 서열을 포함하는 hTPO cDNA를 포함하는 베큘로바이러스 발현 벡터 pBT332의 작제과정을 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명의 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스(Autographa Californicanuclear polyhedrosis virus, 이하 'AcNPV'로 약칭함)의 외피 당단백질인 gp64의 시그날 서열을 가지는 hTPO cDNA를 포함하는 베큘로바이러스 발현 벡터 pGP404의 작제과정을 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명의 폴리히드린 프로모터와 gp64 프로모터가 융합된 융합 프로모터 및 gp64 시그날 서열을 가지는 hTPO cDNA를 포함하는 베큘로바이러스 발현 벡터 pPGP404의 작제과정을 나타낸 것이고,
도 5는 베큘로바이러스 발현 벡터 pGP404를 제한효소로 절단하여 gp64 시그날 서열과 hTPO cDNA가 벡터내에 바르게 삽입되고 제한효소 인식 부위가 존재함을 아가로오즈 겔 전기영동으로 나타낸 것이고,
레인 1 : 마커 ; 레인 2 :BamHI 절단;
레인 3 :BglI 절단; 레인 4 :Eco47Ⅲ 절단;
레인 5 :HincⅡ 절단;
도 6은 베큘로바이러스 발현 벡터 pPGP404를 제한효소로 절단하여 gp64 프로모터와 시그날 서열, 그리고 hTPO cDNA가 바르게 삽입되고 제한효소 인식 부위가 존재함을 아가로오즈 겔 전기영동으로 나타낸 것이다.
레인 1 : 마커 ; 레인 2 :BamHI 절단;
레인 3 :BglI 절단; 레인 4 :HincⅡ 절단;
레인 5 :SacI 절단;
도 7은 본 발명의 재조합 베큘로바이러스 AcGP404 및 AcPGP404 내에 gp64 프로모터와 시그날 서열, 그리고 hTPO cDNA가 존재함을 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 'PCR'로 약칭함)을 수행하여 아가로오즈 겔 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이고,
레인 1 : 마커 ; 레인 2 : 발현 벡터 pGP404 ;
레인 3 : 발현 벡터 pPGP404 ;
레인 4 - 레인 5 : 재조합 베큘로바이러스 AcGP404 ;
레인 6 - 레인 7 : 재조합 베큘로바이러스 AcPGP404 ;
도 8은 곤충세포주인 트리코플루시아 니 5(Trichoplusia ni5, 이하 'TN5'라 약칭함) 세포에 재조합 베큘로바이러스 Ac332, AcGP404, AcPGP404를 감염시켜 시간의 경과에 따라 발현되어 분비되는 hTPO를 효소면역측정방법(enzyme-linked immunosorbant assay, 이하 'ELISA'로 약함)으로 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 TN5 세포에 재조합 베큘로바이러스 Ac322, AcGP404, AcPGP404를 감염시켜 시간의 경과에 따라 발현되어 분비되는 hTPO를 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
레인 1 : 마커 ;
레인 2 - 레인 4 : Ac332 감염후 24, 48, 72시간 경과시의 배양 상등액 ;
레인 5 - 레인 7 : AcGP404 감염후 24, 48, 72시간 경과시의 배양 상등액 ;
레인 8 - 레인 10 : AcPGP404 감염후 24, 48, 72시간 경과시의 배양 상등액
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리히드린 프로모터와 AcNPV의 gp64 외피 당단백질의 프로모터가 융합된 새로운 융합 프로모터를 포함하는 베큘로바이러스 발현 벡터 및 이에 더하여 gp64 외피 당단백질의 시그날 서열을 포함하는 베큘로바이러스 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 발현 벡터를 pPGP404로 명명하고 이 플라스미드를 대장균에 형질전환하여 그 형질전환체(E. coliTOP10F'/pPGP404)를 1998년 4월 25일에 국제기탁기관인 한국종균협회에 기탁하였다(수탁번호 : KFCC-11031).
또한 본 발명은 상기 베큘로바이러스 발현 벡터를 야생형 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스와 곤충 세포에 공형질 감염시켜 얻은 재조합 베큘로바이러스를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 베큘로바이러스를 곤충 세포에 감염시켜 외래 단백질을 대량으로 생산하는 제조방법을 제공한다. 이 때 곤충 세포로는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 또는 스포돕테라 푸르기페다(Spodoptera frugiperda) 세포주를 이용하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 AcNPV의 폴리히드린 프로모터와 gp64 외피 당단백질의 프로모터가 융합된 새로운 융합 프로모터를 포함하는 베큘로바이러스 발현 벡터를 제공한다.
구체적으로, 상기 AcNPV의 폴리히드린 프로모터는 서열 9의 염기 서열을 포함한다.
AcNPV의 다각체 폴리히드린 프로모터는 베큘로바이러스 발현 시스템에서 목적 단백질의 발현양을 증가시키는 것으로 공지된 프로모터이며, gp64 외피 당단백질의 프로모터는 초기 프로모터와 후기 프로모터의 두가지 프로모터의 작용으로 발현을 조절하여 바이러스 감염후 단백질이 지속적으로 발현되도록 한다. 본 발명에서는 상기의 AcNPV의 다각체 프로모터와 gp64 외피 당단백질의 프로모터를 융합한 새로운 융합 프로모터를 이용한다.
또한 본 발명은 상기 융합 프로모터에 더하여 gp64 외피 당단백질의 시그날 서열을 포함하는 베큘로바이러스 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로 gp64 프로모터와 gp64의 시그날 서열은 서열 10의 염기 서열을 포함한다.
이 때 융합 프로모터 다음에는 외래 단백질 유전자를 삽입하여 목적 단백질을 효율적으로 대량 제조할 수 있다.
본 발명에서는 외래 단백질로는 hTPO를 삽입하여 이를 발현, 제조한다. 그러나 사용될 수 있는 외래 단백질의 종류는 이에 한정되지 않고 유용한 외래 단백질이면 어떠한 것도 가능하며, hTPO, 인간 에리트로포이에틴, 인터루킨-3, 과립구콜로니자극인자를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 gp64의 초기 프로모터와 후기 프로모터, gp64의 시그날 서열을 포함하는 hTPO cDNA를 클로닝하기 위하여, 우선 이동벡터 pBlue404(대한민국 특허출원 제 97-7512호)와 pGP64(김희진, 서강대학교 석사학위논문, 1995)를 이용하여 PCR을 수행한다. 구체적으로 pBlue404로부터 성숙 hTPO의 아미노 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 인식 부위를 가지는 서열 3의 올리고 뉴클레오타이드와 hTPO의 카복시 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 인식 부위를 가지는 서열 2의 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 사용하여 약 1021bp의 hTPO cDNA를 분리한다. 또한 gp64의 시그날 서열의 카복시 말단 부위의 염기 서열과 제한효소 인식 부위를 가지는 서열 5의 올리고 뉴클레오타이드와 gp64 초기 프로모터의 아미노 말단 부위의 염기 서열과 제한효소 인식 부위를 가지는 서열 6의 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 사용하여 약 364bp의 gp64의 초기 프로모터와 후기 프로모터, 시그날 서열을 모두 포함하는 유전자를 분리한다.
상기에서 분리한 gp64의 프로모터와 시그날 서열을 포함하는 유전자 조각을 제한효소BglI과BglⅡ로 절단시키고, hTPO cDNA를 제한효소BglI과EcoRI으로 절단시킨 다음 폴리히드린 프로모터를 포함하는 공지의 이동벡터인 pBlueBac4(Invitrogen사, Cat. No. V1995-20)에 삽입하여 재조합 베큘로바이러스 발현 벡터를 작제한다.
본 발명의 베큘로바이러스 발현 벡터를 pPGP404로 명명하고 이를 대장균 TOP10F' 균주에 형질전환하여 그 형질전환체(E. coliTOP10F'/pPGP404)를 1998년 4월 25일에 국제기탁기관인 한국종균협회에 기탁하였다(수탁번호 : KFCC-11031).
본 발명에서 사용한 hTPO cDNA는 이미 공지된 염기 서열 (Sauvage,et al., Nature, 1994, 369, 533-538)에서 단백질로 발현되지 않는 5'-말단 및 3'-말단의 인트론 부분을 완전히 제거시킴으로서 단백질이 전사되어 번역되는 과정의 효율을 저해할 수 있는 유전자의 2차 구조가 형성되는 것을 배제하도록 설계된 것이다(서열 11 및 서열 12 참조).
또한 본 발명에서는 pBlue404로부터 hTPO 시그날 서열의 아미노 말단의 염기 서열과 제한효소 인식 부위를 가지는 서열 1의 올리고 뉴클레오타이드와 서열 2의 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 사용하여 시그날 서열을 포함하는 hTPO cDNA를 분리하고 이를 pBlueBac4에 삽입하여 재조합 베큘로바이러스 발현 벡터 pBT332를 작제한다.
또한 본 발명에서는 pGP64로부터 시그날 서열의 아미노 말단 부위와 제한효소 인식 부위, 그리고 카복시 말단 부위의 염기 서열과 제한효소 인식 부위를 가지는 서열 4와 서열 5의 올리고 뉴클레오타이드 시발체를 사용하여 gp64 시그날 서열을 분리하고, 상기에서 분리된 hTPO cDNA와 함께 pBlueBac4에 삽입하여 재조합 베큘로바이러스 발현 벡터 pGP404를 작제하였다.
본 발명에서는 이동벡터 pGP404와 pPGP404의 제한효소 지도 및 염기 서열 등을 분석하여 공지된 서열과 완전히 동일한 염기 서열을 가지는 hTPO cDNA를 포함하는 것을 확인하였다.
또한 본 발명은 본 발명의 베큘로바이러스 발현 벡터를 야생형 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스(AcNPV) DNA와 곤충세포에 공형질 감염시켜 얻은 재조합 베큘로바이러스를 제공한다.
본 발명에서는 베큘로바이러스 발현 벡터 pPGP404를 야생형 AcNPV DNA와 공형질 감염시켜 ECV를 분리한 다음 이로부터 공지된 방법(O'Reilly,et al.,Baculovirus expression vector, A laboratory manual, 1989, W. H. Freeman company)으로 재조합 베큘로바이러스 DNA를 정제하여 재조합 베큘로바이러스를 제조하고 이를 AcPGP404라 명명하였다. 구체적으로 제한효소Bsu36I으로 삼중 절단하여 준비된 단일 DNA인 Bac-N-Blue DNA(Invitrogen사, Cat. No. K855-01)를 pPGP404와 함께Sf9 세포주에 감염시키고 7일 내지 10일이 경과한 다음 배양 상등액을 취하면, 이 때 베큘로바이러스 이동벡터 pPGP404와 AcNPV의 DNA 사이에 동형 재조합이 일어나 hTPO cDNA를 포함하는 본 발명의 재조합 베큘로바이러스가 제조된다.
재조합 베큘로바이러스가 감염된 곤충 세포는 세포 및 세포핵의 크기가 정상세포보다 커지고 핵내에 바이러스 봉입체가 보이지 않는(occlusion negative, occ-) 플라크가 현미경상에서 관찰되고, pBlueBac4내 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 효소가 발현되면 고정시킨 한천 배지에 X-gal 시약을 첨가하였을때, 푸른 원형의 플라크를 얻을 수 있어 재조합 바이러스의 형성을 확인할 수 있다.
본 발명에서는 재조합 베큘로바이러스 플라크를 취하여 다시 상기Sf9 세포에 감염시키고 7일 후에 배양 상등액에서 ECV를 수거한 후 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 염화나트륨 용액으로 침전시켜 바이러스 DNA를 분리한 다음 이동벡터 pBlueBac4내의 다중클로닝 부위(multicloning site, 이하 'MCS'라 약칭함)의 5'-말단 상류(upstream) 부위와 3'-말단의 하류(downstream) 부위의 염기 서열에 해당하는 서열 7 및 서열 8의 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 이용해서 PCR을 수행하여 hTPO cDNA가 삽입된 재조합 베큘로바이러스가 제조되었슴을 확인하였다.
또한 본 발명에서는 베큘로바이러스 이동 벡터 pBT332, pGP404를 각각 AcNPV DNA와 곤충세포에 공형질 감염시켜 얻은 재조합 베큘로바이러스 Ac332 및 AcGP404를 제조한다.
본 발명은 본 발명의 재조합 베큘로바이러스를 곤충 세포에 감염시켜 외래 단백질을 대량으로 생산하는 제조방법을 제공한다.
이 때 곤충세포로는 스포돕프테라 푸르기페다 9(Spodoptera frugiperda 9) 또는 트리코플루시아 니 5(Trichoplusia ni 5) 세포주를 이용한다.
구체적으로 본 발명에서는 재조합 베큘로바이러스 AcPGP404를 곤충세포주에 감염시켜 1×107pfu/ml 이상의 타이터(titer)를 가지는 고농도 베큘로바이러스 원액(high titer stock, 이하 'HTS'로 약칭함)을 제조한 다음 숙주세포에 상기 고농도 바이러스 원액을 감염시켜 hTPO 등의 외래 단백질을 발현시킨다.
이 때 감염수는 세포 1개당 5-10개의 바이러스의 수의 비율로 감염시키는 것이 바람직하고, hTPO는Sf9 세포주에서 보다 TN5 세포주에서 약 2∼5배 이상 발현되므로(대한민국 특허출원 제 97-7512호) hTPO를 대량으로 생산하는데에는 TN5 세포주를 이용하는 것이 바람직하다.
단백질의 발현 여부 및 발현량은 ELISA 및 웨스턴 블럿 방법으로 확인한다. 그 결과 gp64의 시그날 서열을 가지고 폴리히드린 프로모터와 gp64 프로모터의 융합 프로모터를 가지는 본 발명의 재조합 베큘로바이러스 AcPGP404를 이용하는 경우가 hTPO의 시그날 서열을 가지고 폴리히드린 프로모터에 의해 조절받는 Ac332를 이용하는 경우보다 단백질의 발현양이 약 3배 이상 증대됨을 확인하였다.
본 발명의 방법으로 제조되는 hTPO는 세포 배양액으로 분비되고 활성을 유지하는 당단백질 형태로 생산되며, 그 발현양에 있어서도 최고 배양액 1리터당 약 6mg 이상을 나타내었다. 또한 본 발명의 융합 프로모터 및 gp64 시그날 서열에 의해 발현된 hTPO는 hTPO 자신의 시그날 서열에 의해 발현된 hTPO와 동일한 역가를 가짐을 거핵구세포 콜로니 측정법에 의해 확인하였다.
이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
〈실시예 1〉 폴리히드린 프로모터의 조절하에 시그날 서열을 포함하는 hTPO가 발현되도록 고안된 이동벡터 pBT332의 제조
시그날 서열이 포함된 hTPO cDNA를 얻기 위해서, 이동벡터 pBlue404 약 50ng을 주형으로 사용하고, hTPO 시그날 서열의 아미노 말단 서열을 가지는 서열 1의 올리고 뉴클레오타이드와 hTPO cDNA의 카복시 말단 전사해독틀(open reading frame, ORF) 부위와 종결 코돈을 포함하는 염기 서열을 가지는 서열 2의 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 하여 PCR을 수행하였다.
구체적으로 각각의 시발체를 μl당 40 pmol이 되도록 녹인 다음, 그것을 4μl씩 사용하고,Pfu(Pyrococcus furiosus) 폴리머레이즈(2.5u/μl, Stratagene사, Cat. No. 600153) 1μl를 부가하여 최종 100μl 부피로 PCR 반응을 진행시켰다. PCR 반응은 94℃, 90초의 1차 변성후, 94℃, 40초의 변성; 55℃, 1분의 시발체 접합; 72℃, 2분의 효소 신장 반응 과정을 35회 반복한 다음 최종 효소 반응을 72℃, 5분으로 수행하여 종료하였다. 얻어진 PCR 산물은 1% 아가로오즈 겔 전기영동을 수행하여 hTPO cDNA 서열을 포함하는 크기에 해당하는 1077bp의 DNA 밴드를 면도칼로 잘라내어 퀴엑스 Ⅱ(QIAEX Ⅱ) 키트(Qiagen사, Cat. No. 20021)를 이용하여 용출하고, 이를 최종적으로 50μl가 되도록 삼차 증류수에 녹였다.
상기 방법으로 증폭된 유전자를 클로닝하기 위하여 제한효소BglII 및EcoRI을 이용하여 37℃에서 5시간 동안 반응시킴으로써 완전히 절단하였다. 또한 베큘로바이러스 이동벡터 pBlueBac4는 제한효소BglII 및EcoRI으로 상기의 조건으로 절단하고, 제한효소로 절단된 두 DNA 단편을 1% 아가로오즈 겔 전기영동하여 1070bp, 4776bp 크기의 밴드만을 분리한 다음, 각각을 30μl의 삼차 증류수에 녹였다.
hTPO cDNA의 PCR 산물과 폴리히드린 프로모터를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터 pBlueBac4를 연결시키기 위하여 이들을 3 : 1의 몰 비율로 혼합하고 T4 DNA 라이게이즈(NEB사, Cat. No. 202S)를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이 반응액으로 대장균 TOP10F'(Invitrogen사, Cat. No. C3030-03) 균주를 하나한 등의 방법(Hanahan,et al., DNA cloning, Vol 1: A practical approach, IRL Press, 1985, 109-135)으로 형질전환시켜 대장균 형질전환체를 획득하였다.
상기 과정으로 제조된 hTPO cDNA를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터를 pBT332라고 명명하고(도 4참조), 얻어진 형질전환체 클론을 TB 배지 50ml로 37℃에서 18시간 배양한 후, 위자드 미디프렙(Wizard Midiprep) 키트(Promega사, Cat. No. A7640)를 이용하여 이동벡터 pBT332를 대량 추출하였다. 이를 제한효소HincⅡ로 절단시킨 다음, 1% 아가로오즈 겔 전기영동을 수행하여 시그날 서열을 포함하는 hTPO cDNA가 바르게 삽입되었슴을 확인하였다.
〈실시예 2〉 폴리히드린 프로모터의 조절하에 gp64 시그날 서열을 가지는 hTPO가 발현되도록 고안된 이동벡터 pGP404의 제조
hTPO cDNA 중 시그날 서열이 결손된 cDNA를 얻기 위해서, 이동벡터 pBlue404 약 50ng을 주형으로 사용하고, 시그날 서열을 제외한 hTPO cDNA의 아미노 말단 서열을 포함하는 염기 서열을 가지는 서열 3의 올리고 뉴클레오타이드와 서열 2의 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 이용하여 상기 실시예 1에서와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은 1% 아가로오즈 겔 전기영동을 수행하여 hTPO cDNA 서열을 포함하는 크기에 해당하는 1021bp의 DNA 밴드를 면도칼로 잘라내어 퀴엑스 Ⅱ 키트를 이용하여 용출하고, 이를 최종적으로 50μl가 되도록 삼차 증류수에 녹였다.
21개의 아미노산을 코딩하는 gp64 시그날 서열을 함유하는 유전자는 gp64 유전자가 클로닝되어 있는 이동벡터 pGP64(김희진, 서강대학교석사학위논문, 1995)를 주형으로 하여, 서열 4의 올리고 뉴클레오타이드와 서열 5의 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 79bp 크기의 PCR 산물은 마찬가지로 퀴엑스 Ⅱ 키트를 이용하여 아가로오즈 겔로부터 용출하여 50μl의 삼차 증류수에 녹였다.
상기 과정으로 증폭된 유전자를 클로닝하기 위하여, hTPO cDNA는 제한효소BglI 및EcoRI을 이용하여 37℃에서 5시간 동안 반응시키고, gp64 시그날 서열 유전자는 제한효소BglII 및BglI으로 37℃에서 5시간 동안 반응시킴으로써 완전히 절단한 다음 제한효소로 절단된 두 DNA 단편을 1% 아가로오즈 겔 전기영동하여 1005bp, 63bp 크기의 밴드만을 분리하여 각각을 30μl의 삼차증류수에 녹였다. hTPO cDNA의 PCR 산물과 gp64 시그날 서열의 PCR 산물을 실시예 1에서 준비한 제한효소BglII 및EcoRI으로 절단된 폴리히드린 프로모터를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터 pBlueBac4에 연결시킨 후, 대장균 TOP10F'에 형질전환시켜 대장균 형질전환체를 획득하였다.
상기 과정으로 제조된 베큘로바이러스 이동벡터를 pGP404라고 명명하고(도 5참조), 얻어진 형질전환체로부터 이동벡터 pGP404를 대량 추출하였다. 이를 제한효소BamHI,BglI,Eco47Ⅲ 및HincⅡ를 이용하여 절단시킨 다음, 1% 아가로오즈 겔 전기영동을 수행하여 gp64 시그날 서열과 hTPO cDNA가 바르게 삽입되었슴을 확인하였다(도 7참조).
또한, 최종적으로 생거 등의 다이디옥시 뉴클레오타이드 서열 결정 방법(Sanger,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 5463-5467)을 수행하여 본 발명에서 클로닝한 gp64 시그날 서열과 hTPO cDNA가 공지의 서열과 완전히 동일한 염기 서열을 가지는 것을 확인하였다.
〈실시예 3〉 gp64 초기 및 후기 프로모터와 폴리히드린 프로모터가 융합된 두 종의 프로모터 조절하에 gp64 시그날 서열을 가진 hTPO가 발현되도록 고안된 이동벡터 pPGP404의 제조
gp64 시그날 서열과 그것의 상류(upstream) 부위에 존재하는 초기 프로모터의 보존(consensus) 서열인 CAGT 서열과 후기 프로모터의 보존(consensus) 서열인 TAAG 서열을 함유하는 유전자(서열목록 참조)를 이동벡터 pGP64로부터 서열 5의 올리고 뉴클레오타이드와 서열 4의 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 얻었다.
얻어진 371bp의 PCR 산물은 1% 아가로오스 겔 전기영동후 퀴엑스 Ⅱ 키트로 해당 크기의 유전자 절편을 분리한 다음 제한효소BglⅡ 및BglI으로 절단하여 최종 355bp의 유전자 절편을 얻었다.
이렇게 얻은 355bp의 유전자 조각을 상기 실시예 2에서 분리한 1005bp의 hTPO cDNA 유전자 조각과 함께 제한효소BglⅡ 및EcoRI으로 선형화된 4776bp의 베큘로바이러스 이동벡터 pBlueBac4에 클로닝한 다음 대장균 TOP10F' 균주에 형질전환시켜 형질전환된 클론을 얻어 이를 pPGP404라고 명명하였다(도 6참조). 상기실시예 1에서와 같이 위자드 미디프렙 키트로 상기 벡터를 대량 추출한 다음 제한효소BamHI,BglI,HincⅡ 및SacI으로 절단하여, gp64 초기 프로모터와 후기 프로모터 및 시그날 서열 그리고 hTPO cDNA가 바르게 삽입되었슴을 확인하였다(도 8참조).
또한, 최종적으로 생거 등의 다이디옥시 뉴클레오타이드 서열 결정 방법을 수행하여 본 발명에서 클로닝한 gp64 프로모터 및 시그날 서열과 hTPO cDNA가 공지의 서열과 완전히 동일한 염기 서열을 가지는 것을 확인하였다.
〈실시예 4〉 이동벡터 pBT332, pGP404 및 pPGP404를 이용한 재조합 베큘로바이러스 Ac332, AcGP404 및 AcPGP404의 제조
hTPO cDNA를 포함하는 재조합 베큘로바이러스를 제조하기 위하여,Sf9 세포를 60mm 디쉬에 2×106세포수로 계대하여 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 이 때 배지로는 그레이스 곤충세포 배양배지(Gibco-BRL사, Cat. No. 10902088)를 사용하였다. 다음 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3에서 제조한 본 발명의 베큘로바이러스 이동벡터 pBT332, pGP404 및 pPGP404 약 4μg에 각각 제한효소Bsu36I으로 절단된 야생형 베큘로바이러스 Bac-N-Blue DNA 1μg을 첨가하여 공형질 감염시킨 다음 세포가 완전히 파쇄될 때까지 27℃에서 7일 이상 배양하였다.
이로부터 배양 상등액을 얻어, 그것을 10-2, 10-3, 10-4배로 희석한 다음 공지의 방법대로 플라크 검정법(O'Relly,et al, Baculovirus expression vectors, A laboratory manual, 1989, W. H. Freeman company)을 수행하여, 상기 세포주의 핵내에 핵다각체가 형성되지 않으면서 X-gal 시약을 첨가했을때 푸른색을 띠는 재조합 베큘로바이러스 플라크를 분리하였다. 이렇게 분리된 재조합 베큘로바이러스를 각각 Ac332, AcGP404 및 AcPGP404라 명명하고, 이들을 60mm 디쉬에 2×106세포수의 농도로 정체 배양된Sf9 세포에 감염시켜 7일간 배양하여 재조합 베큘로바이러스의 P-1 스톡(stock)을 얻고, 이 P-1 스톡으로 동일한 과정을 다시 한번 수행하여 P-2 스톡을 얻었다.
〈실시예 5〉 PCR에 의한 재조합 베큘로바이러스 DNA 내에 존재하는 hTPO cDNA의 확인
재조합 베큘로바이러스내에 폴리히드린 프로모터에 인접하여 gp64 프로모터 및 시그날 서열, hTPO cDNA가 나란히 연결되어 삽입되어 있음을 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다.
우선, 상기 재조합 베큘로바이러스에서 DNA를 추출하기 위하여 상기 P-1 스톡 500μl를 5000rpm으로 3분 동안 원심분리하고 그의 상등액을 얻어 여기에 동량의 20% 폴리에틸렌글리콜 8000/1M NaCl 용액을 부가하여 완전히 섞은 다음 30분 동안 상온에 방치하였다. 그리고나서 상온에서 14000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 침전액을 얻고 100μl 삼차 증류수에 녹여 완전히 균질화시켰다. 여기에 프로테아제 K 100μg을 넣고 50℃에서 1시간 동안 반응시키고 다시 동량의 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜(25:24:1) 용액을 부가하여 잘 섞은 다음, 5분 동안 10000rpm으로 원심분리하여 상등액을 취하였다. 여기에 1/4 부피의 10M 암모니움아세테이트 용액을 가한 다음, 2.5배 부피의 100% 에탄올을 부가하여 -70℃에서 15분 동안 방치하였다. 이를 14000rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 침전물을 70% 에탄올로 1회 세척하고 10μl의 삼차 증류수에 녹였다.
상기 과정으로 추출된 재조합 바이러스 DNA 2μl를 주형으로 사용하고, 베큘로바이러스 이동벡터 pBlueBac4내 다중클로닝 부위(multicloning site, 이하 'MCS'로 약칭함)의 5'-말단의 상류 부위와 3'-말단의 하류 부위의 염기 서열에 해당하는 서열 6 및 서열 7의 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 사용해서 프리믹스-탑(PreMix-Top, 바이오니아사, Cat. No. K2014)로 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 94℃, 90초의 1차 변성후, 94℃, 40초의 변성; 53℃, 1분의 시발체 접합; 72℃, 2분의 효소 신장반응 과정을 35회 반복하여 진행시킨 다음, 최종 효소 반응을 72℃, 5분으로 수행하여 종료하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로오즈 겔 전기영동으로 AcGP404와 AcPGP404 각각에 해당하는 1233bp, 1525bp의 DNA 밴드를 확인하였다 (도 9참조).
〈실시예 6〉 고농도의 재조합 베큘로바이러스 원액의 제조 및 이를 이용한 hTPO의 발현
곤충세포에서 hTPO를 발현시키기 위하여, 우선 60mm 디쉬에서 얻은 P-2 스톡 베큘로바이러스액 1ml을Sf9 세포가 1×107세포수로 배양된 T-75 플라스크에 접종하여 27℃에서 7일 동안 배양하여 고농도의 재조합 베큘로바이러스 원액을 제조하였다.
고농도 베큘로바이러스 원액의 타이터를 결정하기 위하여, 각 재조합 베큘로바이러스의 고농도 바이러스 원액을 10-5, 10-6, 10-7배로 희석한 다음 공지의 플라크 검정법을 수행하여 7일에서 10일 이후에 나타나는 플라크의 수를 계산하였다. 그 결과 각 고농도 바이러스 원액의 타이터는 Ac332는 1×108pfu/ml, AcGP404는 4×107pfu/ml, AcPGP404는 2×108pfu/ml로 결정되었다.
상기에서 제조된 각 고농도 바이러스 원액을 TN5 세포에 감염하여 hTPO의 발현을 유도하였다. 6-well 플레이트에 TN5 세포를 1×105세포수로 계대한 후, 각각의 재조합 바이러스를 10 MOI(Multiplicity of infection)로 감염시켰다. 감염후 24, 48, 72시간에 배양 상등액을 취하여, 항원 코팅 ELISA법으로 hTPO의 발현양을 측정하였다(도 10참조).
발현된 hTPO의 정량은 R＆D사의 시약급 hTPO(Cat. No. 288-TPB-025)를 표준품으로 사용하였고, 1차 항체로는 염소 항-hTPO(goat anti-hTPO) 폴리클로날 항체 (R＆D사, Cat. No. AB288NA)를 1 : 1000의 비율로 희석하여 사용하였으며, 2차 항체로는 알칼라인 포스파테이즈-융합 항-염소 IgG(alkaline phosphatase-conjugated anti-goat IgG, Sigma사, Cat. No. A4187)를 1 : 10000의 비율로 희석하여 사용하였고, 발색기질로는 pNPP 용액(Sigma사, Cat. No. N7653)을 사용하였다.
또한 상기 배양 상등액 10μl를 취하여 상기의 1차 항체와 2차 항체, 그리고 발색기질로는 BCIP/NBT(Sigma사, Cat. No. B5655)를 이용하여 공지의 방법대로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블럿을 수행한 결과, hTPO에 특이적인 진한 발색 밴드를 확인하였으며, 이를도 11에 나타내었다.
hTPO 시그날 서열하에 발현된 hTPO는 웨스턴 블럿 분석 결과 감염후 24 시간째에는 발현이 거의 확인되지 않다가 감염후 48시간 경에 발현이 확인되었으나, hTPO cDNA내에 hTPO 시그날 서열 대신 gp64 시그날 서열이 대체된 것(pGP404, pPGP404를 이용한 경우)은 감염후 24시간째에 hTPO에 해당하는 단백질 밴드가 뚜렷이 나타나 발현된 hTPO가 배지로 신속하게 분비되는 것이 확인되었으며, 감염후 48시간 경에는 더욱 많은 발현을 나타내었다. 발현양도 hTPO 시그날 서열하에 발현된 hTPO 보다 많게 나타났다.
또한, 폴리히드린 프로모터 서열 아래에 gp64 초기 및 후기 프로모터 서열이 나란히 융합된 2종의 프로모터하에서 hTPO cDNA의 발현은 현저한 발현양의 증가가 나타나 감염후 48시간째에는 ELISA로 정량한 결과 폴리히드린 단일 프로모터에 의해 발현된 것에 비해 약 3배 이상의 높은 발현양을 나타내었다.
〈실시예 7〉 거핵구세포 콜로니 측정법에 의한 hTPO의 역가평가
8주에서 11주령된 C57BL/6 마우스(Charles River사, 일본)는 경추를 탈골하여 죽인 후 곧바로 대퇴골 2개를 무균적으로 분리하여 70% 알코올로 깨끗이 세척한 다음 대퇴골의 양쪽을 수술용 가위로 절단하여 10% 열처리시킨 우태아 혈청(Fetal bovine serum, 이하 'FBS'로 약칭함)을 함유한 DMEM 배지(Gibco-BRL사, Cat. No. 11995302) 2.5ml에 넣고 23G 크기의 침이 장착된 주사기로 골수세포를 완전하게 뿜어내어 채취하였다. 채취된 세포 부유액은 40μm 필터(Falcon사, Cat. No. 2340)로 여과한 다음 1200rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상기 배지로 골수세포를 재현탁한 후, 이것을 거핵구세포 콜로니 측정법에 사용하였다.
거핵구세포 콜로니 측정법은 우선 준비된 신선한 골수세포를 35mm 디쉬에 넣은 다음 5% CO2배양기에 넣고 37℃에서 1-2시간 배양하여 부착된 세포들을 제거하였다. 그 후 골수세포를 1% BSA, 10% FBS, 0.1ng/ml 마우스 인터루킨-3(IL-3), 50ng/ml hTPO, 그리고 0.3% 아가를 포함하는 DMEM 배지에 각 디쉬당 5×104세포의 농도로 계대한 후, 37℃에서 7일간 배양하였다. 아가 디스크는 배양 디쉬를 45°로 기울여 25×27mm 슬라이드 글라스위에 올려놓은 후 상온에서 건조 탈수시켰다. 그 다음 슬라이드 글라스를 5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 10분간 고정시킨 후 증류수로 세척하였다. 공기 건조후 거핵구 세포에 특이적인 효소인 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholineesterase, AchE)를 상온에서 18시간 동안 잭슨의 방법(Jackson, C. W.,Blood, 1973, 42, 412-421)에 따라 염색하였으며, 그 후 헤마톡실린(haematoxyline)으로 10분간 염색하였다. 3개 이상의 거핵구세포로 구성된 것을 콜로니로 하여 도립 현미경하에서 콜로니 수를 측정하였다.
그 결과 gp64 시그날 서열과 융합 프로모터에 의해 발현, 분비된 hTPO가 hTPO 시그날 서열과 폴리히드린 프로모터에 의해 발현, 분비된 hTPO와 동일한 거핵구세포 콜로니 형성능을 가지는 것으로 나타났다.
상기에서 살펴본 바와 같이, AcNPV의 폴리히드린 프로모터와 외피 당단백질인 gp64의 프로모터의 융합 프로모터와 gp64의 시그날 서열을 목적 외래 단백질 유전자의 상류에 도입한 본 발명의 베큘로바이러스 발현 시스템은 외래 단백질을 발현하는데 있어서, 폴리히드린 프로모터와 gp64 프로모터가 융합된 새로운 융합 프로모터의 조절을 받아 그 발현량이 현저히 증가되고, 결합되어 해독되는 gp64의 시그날 서열의 작용으로 세포외로 신속하게 분비될 수 있으며, 곤충세포를 숙주세포로 이용하여 천연의 단백질 활성이 유지되는 성숙된 형태, 즉 프로세싱되고 번역후 수식된 형태로 발현, 분비된다.
따라서, 본 발명의 제조방법에 의하면 유용한 외래 단백질을 재조합 바이러스의 감염 초기에서부터 후기까지 지속적으로 생산하여 대량 생산이 용이하며, 생산된 천연형의 단백질과 유사한 생물학적으로 활성이 있는 단백질을 세포 배양액에서 쉽게 분리, 정제할 수 있다. 구체적으로 hTPO를 제조하는 경우 배양액 1리터당 6mg 이상의 hTPO를 세포 배양액에서 얻을 수 있다.
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서열의 종류 : 유전자 (프로모터)
〔 서열목록 〕
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서열의 형 : 핵산
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형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 유전자 (프로모터 및 시그날서열)
〔 서열목록 〕
서열번호 : 11
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서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 유전자
〔 서열목록 〕
서열번호 : 12
서열의 길이 : 353
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질

Claims (10)

  1. 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스 (Autographa Californica nuclear polyhedrosis virus) 유래의 서열번호 9로 특정되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리히드린 프로모터와 서열번호 10의 1 번 염기로부터 292 번 염기까지의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 gp64 외피 당단백질의 프로모터가 융합된 새로운 융합 프로모터를 포함하는 베큘로바이러스 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합 프로모터의 하류에 서열번호 10의 293 번 염기로부터 255 번 염기까지의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 gp64 외피 당단백질의 시그날 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 베큘로바이러스 발현 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합 프로모터 또는 시그날 서열의 하류에 외래 단백질 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 베큘로바이러스 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 외래 단백질은 인간 트롬보포이에틴, 인간 에리트로포이에틴, 인터루킨-3, 과립구콜로니자극인자에서 선택되어지는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 베큘로바이러스 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 외래 단백질이 인간 트롬보포이에틴인 베큘로바이러스 발현 벡터 pPGP404.
  6. 베큘로바이러스 발현 벡터 pPGP404를 대장균 TOP10F' 균주에 형질전환시킨 대장균 형질전환체 TOP10F'/pPGP404(수탁번호:KFCC-11031).
  7. 제3항의 베큘로바이러스 발현 벡터를 야생형 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스 DNA와 공형질 감염시켜 얻은 재조합 베큘로바이러스.
  8. 베큘로바이러스 발현 벡터 pPGP404를 야생형 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스 DNA와 곤충 세포에 공형질 감염시켜 얻은 재조합 베큘로바이러스 AcPGP404.
  9. 제7항의 재조합 베큘로바이러스를 곤충 세포에 감염시켜 외래 단백질을 대량으로 생산하는 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 곤충세포는 스포돕프테라 푸르기페다(Spodoptera frugiperda) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
KR1019980017926A 1998-05-19 1998-05-19 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스 gp64의 프로모터와 다각체 프로모터의 융합 프로모터로 구성된 새로운 발현 시스템에 의한 재조합 단백질의 대량 생산방법 KR100288389B1 (ko)

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