KR950001993B1 - B형 간염 표면항원의 제조방법 - Google Patents

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Description

B형 간염 표면항원의 제조방법

제1도는 AcMNPV, 균주 HR3의 ECORI-I 단면의 제한지도를 나타낸 도.

제2도는 바큘로바이러스(baculovirus) 삽입벡터의 작제를 나타낸 도.

제3도는 VGF 재조합 벡터의 작제를 나타낸 도.

제4도는 재조합 바큘로바이러스를 발현시키는 VGF의 제조, 분리 및 발현을 나타낸 도.

제5도는 소태자 혈청 존재 및 부재하의 배지에서 전염된 세포중의 VGF 생성을 시간 경과에 따라 나타낸 도.

본 발명은 적합한 곤충 숙주 세포에서, 선택된 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서 전반에 걸쳐 여러 가지 참고문헌은 괄호안에 숫자로 참조기호를 표시하였다. 이들 참고문헌에 대한 완전한 인용문은 특허청구범위 바로 앞의 명세서 끝부분에 기재하였다. 본 발명이 속하는 분야의 종래 기술 수준을 더욱 상세히 기술하고자, 이들 참고문헌의 내용은 그대로, 본 명세서에 참고로 결합된다.

바큘로바이러스(baculovirus)의 분자 생물학적의 연구 발전에 최초로 기여한 해충처리시 바큘로바이러스의 효율적 이용은 상업적으로 관심을 끌어왔다. 바큘로바이러스의 게놈조직 및 유전자 발현에 관한 정보는 바이러스-숙주계에 유전성 복제에 직접 적용되어 보다 나은 해충구제제를 제조할 수 있으며 이들 바이러스를 외래성 DNA의 발현을 위한 진핵성 클로닝 벡터로 사용할 수 있다. 또한, 바큘로바이러스는 무척추세포에서의 유전자 발현의 제어에 대한 연구에 유용한 수단인 것으로 입증되고 있다.

바큘로바이러스과는 단일 속, 바큘로바이러스 속으로 이루어지며, 바큘로바이러스 속은 바이러스의 형태(1)를 토대로 3개의 아그룹으로 구분된다. 아그룹 A바이러스, 핵상 다면성 바이러스종 바이러스(NPV)는 외피당 단일 뉴클레오캡시드(SNPV)를 갖거나 외피당 1 내지 수개의 뉴클레오캡시드(MNPV)를 갖는 비리온을 생성한다. NPV-감염세포의 핵에서 폐쇄체(OB)가 형성되고 외피형성된 여러개의 뉴클레오캡시드(비리온)가 각각의 OB에 함침된다. 아그룹 B바이러스, 과립중 바이러스(GV)는 외피당 단 하나의 뉴클레오캡시드와 OB당 단일 비리온을 함유한다. 아그룹 C는 폐쇄되지 않은 단일의 외피형성된 뉴클레오캡시드로 이루어진다. 아그룹 A, B 및 C에서의 바큘로바이러스는 약 100 내지 150개의 킬로염기쌍(kbp)의 환상 2본쇄 DNA를 갖는다.

아그룹 A와 B에 속하는 바큘로바이러스의 주요특징은 감염세포의 핵에 폐쇄 바이러스 입자형을 함유하는 결정성 폐쇄체에 있다. 폐쇄체의 주 단백질, 폴리헤드린은 분자량이 약 30,000인 폴리펩타이드로서, 폐쇄체의 단백질 질량의 대략 95%에 달한다. 바이러스의 제2형태, 외피형성된 단일 뉴클레오캡시드(세포의 비폐쇄 바이러스, ENOV)는 조직 배양에서 전체적으로 만연된다. 감염세포에서, ENOV 대부분은 바이러스 폐쇄 공정(86)전에 합성된다.

바큘로바이러스 명명은 바이러스의 형태학적 아그룹으로부터 유도되며, 또한 분리곤충으로부터 유도된다. 이러한 방법으로, 알팔파 루퍼 모충 오토그라파 캘리포니카(alfalfa looper caterpillar Autographa californica)로부터 분리된 MNPV는 AcMNPV로 명명된다. 선택된 바큘로바이러스들을 그들의 명칭과 함께 표 1에 기재하였다.

표 1에 인용된 것으로부터, AcMNPV 게놈변이체가 바큘로바이러스의 분자 생물학에 대한 연구를 위한 모델시스템으로 부각됨을 알 수 있다. 그것이 부각되는 이유는 AcMNPV가 다른 바큘로바이러스보다 더 중요하기 때문이 아니라, 오히려 그것이 시험관내 조작이 용이한 시스템이기 때문이다. 따라서, 본 명세서의 데이터중 대부분은 AcMNPV 게놈변이체의 분석으로부터 유도된 것이다.

[표 1]

버큘로바이러스

다른 바큘로바이러스의 분자적 특성 규명 및 물리적 지도 작성은 AcMNPV보다 늦어졌다. 마루니아크등(Maruniak et al.) (22)은 제한효소인 BamH I, Bg1Ⅲ, BstEⅡ, EcoR I, HindⅢ, kpn I 및 Pst I를 사용하여 SfMNPV 및 이의 게놈변이체의 DNA의 지도를 작성하였다. 변이체 DNA중 게놈의 삽입 및 삭제 위치는 SfMNPV 게놈상의 4지역에 한정된다. 이러한 자료는 크넬 및 섬머즈(Knell and Summers) (23)의 연구(여기서, 이들은 상이한 네가지 실험실로부터 수득한 SfMNPV DNA를 분석하였다) 및 로(Loh)와 그의 동료들(24)에 의해 유도된 HindIII 및 BamH I 지도와 일치한다. 마루니아크 등(22)에 의해 제시된, SfMNPV에 대한 물리적 지도는 AcMNPV 폴리헤드린 유전자와 동류인 서열을 함유하는 EcoR I 단편에 대해 배향되었다.

AcMNPV와 SfMNPV 및 이의 각 제놈변이체 외에, 물리적 지도는 또한 CfMNPV(25), HzSNPV(26) 및 OpMNPV(27)에서 유도된다. 이러한 분석은 바큘로바이러스의 유전자 특성 규명에 대한 중요한 발단이며, 이는 결국 바큘로바이러스 생물학에 적용되는 일반 법칙을 명확하게 해줄 것이다.

물리적 지도작성 연구의 한가지 직접적인 잇점은 여러 가지 클로닝 벡터(5,11,28)에 제한 단편 라이버러리를 확립했다는 것이다. 이러한 시약은 AcMNPV 분자 생물학의 연구를 용이하게 해 줄 것이다.

예를 들면, 이는 시험관내에서 변이유발에 의해 제조된 돌연변이체의 특성 규명중 마커 레스큐(marker rescue)와 같은 기능적 지도작성 기술의 발전을 위한 및 전사 해도 지도 작성을 위한, 게놈 부위로부터의 많은 순수한 DNA를 제공한다.

AcMNPV 및 대부분의 다른 바큘로바이러스의 게놈은 약 100개 정도의 단백질을 코드화시킬 수 있다. 약 40개의 바이러스-유도 단백질이 감염세포에서 탐지되었으며(88), 100개 이상의 바이러스성 구조 단백질은 2-차원 겔 전기영동에 의해 분리되었다(43,44).

바이러스도 폴리펩타이드 출현시기에 따라 4가지 시기적 부류, 즉 최초기(2H), 초기(2-6h), 말기(8-12h) 및 최후기(12h 이상)로 나눌 수 있다(45 내지 50). 초기 폴리펩타이드는 감염 약 6시간후에 시작되는 DNA 복제 이전에 유도된다(35).

바이러스 DNA 복제 개시후에 합성되는 말기 단백질은 주로 비리온의 구조 단백질인 반면에, 최후기의 폴리펩타이드는 바이러스 폐쇄 공정(예를 들면 폴리헤드린)과 관련이 있다. 약간의 초기 단백질은 DNA 복제시 합성되지 않는 반면에 대부분의 다른 초기 단백질은 감염 사이클의 마지막까지 계속 합성된다. 각 시기적 단계는 선행단계로부터의 단백질의 적절한 발현을 필요로 하는 것 같다(49,51). 이와 같은 시기적 조절외에도, 바이러스 유도 단백질이 감염세포에서 동물량으로 합성되지 않기 때문에 조절은 발현 수준에서 되고 있음이 명백하다.

세포외의 폐쇄되지 않은 바이러스 또는 폐쇄 바이러스와 연관된 내인성 RNA 폴리머라제 활성은 보고되어 있지 않다. NPV DNA는 감염성이기 때문에, 숙주 RNA 폴리머라제가 적어도 감염초기에 바이러스 RNA의 전사에 관여함이 틀림없다. 많은 동물 핵 DNA 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 SV 40은 대분의 바이러스성 mRNA를 전사시키고 정상 세포 mRNA 합성에 관여하는 숙주 RNA 폴리머라제 Ⅱ를 사용한다.

단지 한가지 보고서에서만 NPV 감염된 세포 중에서 숙주 RNA 폴리머라제 활성의 역할을 시험하였다(56). 에스. 프루기페르다(S. Frugiperda) 세포가 AcMNPV 감염되어 있는 동안, 대부분의 AcMNPV-특이 mRNA의 합성은 RNA 폴리머라제 Ⅱ의 강력한 억제제인 알파-아마니틴(alpha-amanitin)에 대한 내성이 있다. 따라서, AcMNPV mRNA의 합성은 RNA 폴리머라제 Ⅱ보다는 RNA 폴리머라제의 활성에 기인하여 나타난다. 서열화된 바큘로바이러스 프로모터의 불규칙한 모양을 고려하는 경우, 후-전사에 관련되는 바큘로바이러스-특이 RNA 폴리머라제가 존재하는 것 같다(87).

감염된 세포로부터 정제한 폴리(A)⁺로부터 시험관 내에서 합성된 다수의 독특한 단백질을 합성했다. 폴리헤드린으로서 알려진 30K달톤 폴리펩티드의 식별은 전동영동 및 면역침전(45,50,54)으로, 그리고 펩타이드 지도화(40)로 행한다. 생체내 합성된 폴리헤드린과 시험관내에서 합성된 폴리헤드린이 겔에서 함께 이동함이 관찰되므로 이 단백질이 전사후에 크게 변형되지 않음을 확인할 수 있다(46,47). 또한, 주요한 뉴클레오캡시드 단백질 중 하나인 14K의 식별도 행해졌다(50). 이들 결과는 두 단백질이 바이러스 암호화되었다는 선행 재조합 연구로부터의 결론을 지지해 준다(39).

저분량의 메티오닌-결핍 염기성 단백질인 10K 단백질은 감염시 후기에 많은 양으로 생산되며, 감염된 세포에서 폴리헤드린과 동등하게 발현되는 것으로 보인다(40,41,55). 10K 단백질의 작용은 알려져 있지 않다. 대부분의 10K 단백질은 비구조적이며 감염된 세포에서 폴리헤드린과 동시에 생산되기 때문에, 폐쇄공정에 관련되어 있을지도 모른다. 10K 단백질이 바이러스 입자의 부수적인 구조 성분이라고 암시하는 몇가지 증거가 있다(28).

재조합 바큘로바이러스를 작제하기 위한 몇가지 시도가 있었다 : 1) 선택된 폴리펩타이드를 제조하는 수단으로서의 고성능 진핵 발현 벡터, 2) 바큘로바이러스 유전자 기능 및 조직의 연구 및 바큘로비루스 및/또는 일반적인 무척추 동물에서의 유전자 발현 억제 연구.

바큘로바이러스 벡터 계에 대한 가장 관심이 집중된 시도는 많은 양의 외래성 유전자 생성물을 발현시키기 위한 것이다. 폴리헤드린(Pn) 유전자는 바이러스-감염된 진핵 세포중의 어떤 다른 유전자보다도 더욱 풍부하게 발현된다. NPV 감염된 유충에서 발견된 단백질 질량의 15% 이상이 폴리헤드린인 것으로 나타나며(78), 겔 전기영동시킨 결과 감염된 조직배양 세포중 총 단백질 질량의 25%인 것으로 밝혀졌다(41). 따라서, 이들 측정치는 쳔연 폴리헤드린 프로모터로부터 외래성 유전자의 발현시에 예상될 수 있는 이론적 한도치이다. 이 수준은 폴리헤드린 프로모터내에서 서열을 유전적 조작함으로써 초월될 수 있다.

강한 폴리헤드린 프로모터 서열외에, 몇몇 다른 특징 때문에 바큘로바이러스 게놈은 외래 DAN의 클로닝 및 발현을 위해 매력적인 것이 된다. 이들 특징은, 예를 들면, 다음과 같다 : 1) 바큘로바이러스 포유동물세포(79) 또는 일반적인 척추동물 세포(96,97)중에서 복제되지 않기 때문에 건강에 해가 되는 것은 아니다; 2)바큘로바이러스는 특정한 무척추 동물에 대하여 제한된 숙주범위를 나타낸다; 3)바큘로바이러스게놈은 몇몇 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 대해 지도화되어 있고 이의 전사활성에 대해 특징 규명이 되어 있다; 4)바큘로바이러스 유전자 생성물은 글리코실화 또는 포스포릴화에 의해 변형된다(88). 일련의 유전자 또는 많은 수의 유전자를 삽입시킬 수 있음을 암시하는 것으로서, 바큘로바이러스 캡시드는 적어도 두 개의 게놈을 포장할 수 있다.

바큘로바이러스 재조합체의 형성에 포함된 일반적인 방법은 1)바큘로바이러스 게놈의 비-필수 영역으로부터 DNA에 의해 측접된, 외래성 단백질을 코드화한 서열에 결환된 Pn 유전자 전사 조절 서열을 함유하는 재조합 플라스미드의 사용; 2)플라스미드 및 바이러스 DNA를, 동질 재조합에 의해 키메라(chimera)유전자가 바이러스 게놈의 동일한 비필수 영역으로 삽입되는 세포에 도입시키기 위한 형질감염의 방법의 사용; 및 3)재조합 바이러스의 분리 및 플라크(plaque) 정체를 포함한다.

외래성 유전자를 바큘로바이러스 감염된 세포에서 발현시키기 위한 목적으로 삽입시킨 두 문헌에서(81,82), 외래성 DNA를 AcMNPV의 폴리헤드린 유전자 영역에 삽입시켜, 발현이 Pn 유전자 프로모터의 조절하에 나타나며 재조합체의 표현형이 OB^-가 되게 한다. 스미드 등(Smith et al.)은 (81)인체 B-인터페론 유전자를 Pn 유전자의 전사 개시부위에 대해 여러 위치에 삽입시켰다. Pn 유전자내의 어떤 프레임-내 또는 프레임-외 삽입물과 반대로, Pn 유전자의 코돈을 개시하는 ATG로부터 3뉴클레오타이드 상부에 삽입시킨 경우에, 유전자는 가장 효과적으로 발현되었다. 이 연구는, 유전자가 충분히 발현되고, 단백질은 글리코실화되고 감염된 세포로부터 분리됨을 기술하였다. 인터페론은 VSV 플라크 감소 검정(83)에 의해 측정된 바와 같은 생물학적 활성을 갖는다. 분비 메카니즘 및 글리코실화 형태의 상세한 설명은 결정되어야 할 사항으로 남아있다.

밀러(Miller) 및 그 동료들은 (82) X-gal의 존재하에 푸른 플라크를 생성시키는 폴리헤드린-융합 단백질로서 E.coli β-갈락토시다제를 발현시켰다. 갈락토시다제 융합 생성물의 특이활성은 조세포 용해질에 대해 지금까지 보고된 것중 가장 높았다.

곤충 또는 곤충 조직 배양세포에서 외래성 유전자를 발현시키는 재조합체 바큘로바이러스는 다음과 같은 여러 가지 목적용 단백질을 생성시키기 위해 작제할 수 있다 :

1)서브-단위 백신으로서 사용하거나 임상적 진단에 사용하기 위한 항원을 생성시키기 위해, 2)치료적 적용을 위한 효소를 생성시키기 위해, 3)무척추 동물에 대해 독성을 갖는 단백질을 생성시키기 위해, 4)농업 또는 식품 적용에 사용하기 위한 효소를 생성시키기 위해, 5)두 체인을 정확하게 조합시키는 동일한 세포에서 각각의 서브-단위 폴리펩타이드의 발현에 의해 활성 항체 또는 다른 다중 서브 단위 단백질을 생성시키기 위해.

관심있는 한 유전자는 B형 간염 바이러스의 표면항원(HBsAg)을 코드화하는 유전자이다. B형 간염 바이러스(HBV)는 세계 2억의 사람들이 만성적으로 고통받고 있는 것으로 평가되는 질병의 원인균체이다(7). HBV는 어떤 조직 배양계에서는 증식하지 않으며, 통상적인 실험용 동물을 감염시키지 않으므로, 이 항원의 공급원은 감염된 개체의 혈청으로 제한된다(참조 B). HBsAg는 주요 외피 단백질 및 감염성 비리온을 중화시키는 항원 둘다를 나타내며 그 자체는 백신으로서 질병에 대해 효과적인 것으로 입증되었다.

HBsAg-유전자는 다양한 결과를 나타내는 많은 종류의 다른 발현 벡터에서 발현되어 왔다. 원핵 발현계는 심지어 강력한 박테리아 프로모터(9,10)를 사용하여 시스템에서 조차 저농도의 HBsAg-관련 면역물질을 생성시킨다. 효모(11,12), SV 40을 기초로 한 플라스미드(13,14), 헤르페스 심플렉스 바이러스(15) 및 백신 바이러스(16)과 같은 진핵계는 배양물 ℓ당 약 1㎎ 내지 20㎎ 범위의 양의 HBsAg를 생성시킨다. 재조합체 바큘로바이러스는 배양물ℓ당 1g 정도의 양의 HBsAg를 생성시킬 수 있다(하기 참조).

올바르게 겹쳐지면 백신화를 위한 바이러스 에피토우르(epitope)를 보다 양호하게 제공할 수 있으므로 백신화된 개체에 보다 강한 면역성을 부여하고 백신화된 집단을 보다 완전히 보호한다.

서브-단위 백신 생산에 유용한 기타 유전자에는 EBV, AIDS 레트로 바이러스, 인플루인자 및 RSV등과 같은 바이러스로부터 유도된 유전자가 포함된다. 이러한 바이러스로부터 유도된 유전자는 보호 면역이 일어 날 수 있도록 숙주 면역 시스템중 항원으로 작용하는 단백질을 코드화한다.

본 발명은 바이러스 프로모터를 포함하는 제1DNA단편을 곤충 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스로부터 분리시키고, 선택된 폴리펩타이드를 코드화하는 서열을 함유하는 제2DNA단편을 적합한 공급원으로부터 분리시키고, 상기 제1DNA단편과 제2DNA단편을 합하여 벡터 DNA를 포함하는 제3DNA단편의 연속 본쇄(여기에서, 상기 제2DNA단편은 상기 제1DNA단편의 상기 프로모터에 인접하여 프레임내에 있으며 전사 종결 시그널을 함유한다)를 형성시키고, 상기 제3DNA단편과 바큘로바이러스 게놈 DNA 사이에 재조합을 수행하여 재조합 벡터를 형성시키고, 이렇게 하여 생성된 상기 재조합 벡터를, 상기 재조합 벡터 단편이 상기 곤충 숙주 세포내에 이입되도록 하는 조건하에서 상기 곤충 숙주 세포와 접촉시켜, 감염된 곤충 숙주 세포를 형성시키고, 이러한 방식으로 감염된 숙주 세포를 성장시킨 다음 상기 숙주 세포 또는 배양액으로부터 선택된 폴리펩타이드를 분리시킴을 특징으로 하여 적합 곤충 숙주 세포에서 선택된 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 선택된 폴리펩타이드를 코드화하는 서열을 함유하는 제2단편이 제1DNA단편의 프로모터에 인접하는 프레임내에 있으며 전사 종결 시그널을 함유하는, 벡터 DNA를 포함하는 제1DNA단편으로 이루어지는 재조합 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 감염된 곤충 세포로부터 합성되어 회수될 수 있는 폴리펩타이드 분자에 관한 것으로서, 이러한 폴리펩타이드는 변형된 세포로부터 능동적 또는 수동적으로 분비되며, 따라서 회수될 수 있다.

또한 본 발명은 바이러스 프로모터의 프레임 내에서 폴리펩타이드를 코드화하며 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA를 함유하는, 선택된 폴리펩타이드를 합성하고, 능동적 또는 수동적으로 분비하는 감염된 곤충 세포에 관한 것으로서, 바이러스 프로모터의 조절하에 폴리펩타이드가 합성될수 있도록 DNA를 곤충 숙주 세포에 이입시켜 감염된 곤충 세포를 생산하게 되며, 폴리펩타이드는 세포 또는 배양액으로부터 회수할 수 있다.

또한, 본 발명은 곤충 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바큘로바이러스로부터 폴리헤드린 프로모터를 포함하는 제1DNA단편을 분리하고, B형 감염 바이러스 표면항원을 코드화하는 서열을 함유하는 제2DNA단편을 적절한 공급원으로부터 분리해낸 다음, 제1DNA단편과 제2DNA단편을 합하여 제2DNA단편이 제1DNA단편의 프로모터에 인접하여 프레임내에 있고 전사 종결 시그널을 함유하는 벡터 DNA를 포함하는 제3DNA단편의 연속 본쇄를 형성하고, 제3단편과 바큘로바이러스 게놈 DNA를 재조합시킴으로써 재조합 벡터를 형성한 다음, 이와 같이 형성된 재조합 벡터를 이러한 재조합 벡터 단편이 곤충 숙주 세포에 이입되어 감염된 숙주 세포를 생산하는 조건하에 곤충 숙주 세포와 접촉시키고, 감염된 세포를 적절한 조건하에 배양한 다음, 세포 또는 배양액으로부터 B형 간염 바이러스 표면항원을 분리함으로써 적절한 곤충 숙주 세포중 B형 간염 바이러스 표면항원을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 바큘로바이러스 벡터 DNA를 함유하고 폴리헤드린 프로모터에 인접하고 이에 의해 조절되는 B형 간염 바이러스 표면항원을 코드화하고 전사 종결 시그널을 함유하는, DNA단편을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 B형 간염 바이러스 표면항원의 전사가 백터내의 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 있도록 상기 표면항원을 코드화하는 서열을 포함하는 재조합 벡터로 곤충 세로를 감염시켜 제조된, B형 간염 바이러스 표면항원을 합성하는 변형 곤충 숙주 세포에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 B형 간염 바이러스 표면항원을 폴리헤드린 프로모터의 프레임내에서 코드화하고 전사 종결 시그널을 함유하여, 언급된 표면항원이 폴리헤드린 프로모터의 조절하에서 합성되도록 한 DNA를 함유하는, B형 간염 바이러스 표면항원을 합성하고 이를 능동적 또는 수동적으로 분리하는 감염 곤충세포에 관한 것이다.

제1도 : AcMnPV. 균주 HR3의 EcoRⅠ-Ⅰ 단편의 제한지도

제한부위 및 단편크기는 코크란등(cochran et al)(89) 및 코크란(90)으로부터 유도한다. 화살표가 있는 수평선은, 번역 개시 및 종결 코돈(91,92)에 각각 상응하는 ATG로부터 TAA코돈까지의 폴리헤드린 유전자의 위치 및 극성을 나타낸다.

제2도 : 바큘로바이러스 삽입 벡터의 작제

폴리헤드린 유전자 및 이의 조절 성분을 함유하는 pAcEcoⅠ로부터의 서열을 뉴클레아제 ExOⅢ 및 SI으로 처리하여 KpnⅠ 위치로부터 처리한다. BamHⅠ링커를 제거된 말단에 가하고, DNA를 BamH Ⅰ로 amHⅠ분해시키고 희석 조건하에 결찰하여, 말단 BamHⅠ 부위를 상기 처리 말단에 결찰시킨다. SalⅠ/BamHⅠ 단편을 생성 클론으로부터 분리시키고, 적당한 제거부를 함유하는 것으로 생각되는 것을 pUC 클론의 프로모터-함유 SalⅠ/BamHⅠ 단편 대신 삽입한다. pAcPn으로 명명된 생성 재조합체는 전사개시 부위 유일한 BamHⅠ 부위를 갖는 폴리헤드린 프로모터 영역을 함유한다. 본 BamHⅠ 부위는, 삽입 벡터 pAcPn^-10에서 천연형태 ATG 코돈의 위치로부터 약 10개의 뉴클레오티드 상부에 위치한다.

제3도 : VGF 재조합 벡터의 작제

pK19의 BamHⅠ 단편을 pAcPn^-10 삽입 벡터의 BamHⅠ 위치에 삽입한다. VGF 유전자의 바른 배향은 AccⅠ 부위의 소재에 의해 측정된다. 폴리헤드린 유전자에 관하여 바른 배향으로 VGF를 사용한 재조합 벡터는 pMCⅠ186으로 명명한다.

제4도 : 재조합 바큘로바이러스를 발현시키는 VGF의 제조, 분리 및 발현

천연형태 SeMNPV-25로부터 분리된 DNA와 VGF 재조합 벡터 pMC186을 인산칼슘으로 침전시키고 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포내로 공동-형질 감염시킨다. 동질 재조합시킨 후 OB^-재조합 바이러스를 선택한다. VGF 서열의 존재는 프로브로서 pK19를 사용하여 DNA를 혼성화시켜 측정한다. VGF 재조합체는 3회 플라크 정제시키고, 원 바이러스는 성장시켜 VGF 생성용 Sf 및 Tni 세포 뱅양물의 많은 부피를 감염시키는데 사용된다.

제5도 : 소태자 혈청 존재 및 부재하의 배지에서 감염된 세포중의 VGF 생성의 시간경로

Sf 세포의 복제배양물을 AcVGF 재조합 바이러스의 10PFU로 감염시키고 10% FCS의 존재(필드 바＜filled bar＞) 및 부재 (다이아몬드 바＜diamond bar＞중에서 배양한다. 감염후 지정된 시간에, 배양배지를 수득하고 선행기술된 방사수용체 분석을 사용하여 VGF활성도를 분석평가한다. VGF 활성도는 EGF 당량의 ng/ml로서 나타낸다.

[본 발명의 상세한 설명]

[물질 및 방법]

A. 세포 및 바이러스 : 디. 누드선(Dr. D. Knudson; 예일대학)에 의해 수득된 SeMNPV-25, AcMNPV의 게놈 변종을 성장시키고 TC 100(KC 생물학) 및 10% FCS를 사용하여 Sf21-AF 세포중에 적정시킨다.

B. 바이러스 DNA의 정제 : 천연형의 플라크 정제된 분리물 및 재조합 NPV를 Sf 세포중에서 성장시킨다. 세포외 비폐쇄 바이러스를 분리시키고, 바이러스성 DNA를 선행 기술된 바대로 정제시긴다.

C. 삽입 벡터의 구성 : 삭제열은 엑소뉴클레아제 Ⅲ 분해에 후속하여 타마노이 및 스틸만(Tamanoi and Stillman)에 의해 기술된 바의 뉴클레아제 SI 분해(93) 및 코트란 등(cochran et al.)(86)에 의해 변형된 바에 의해 pAcEco I(89)로 작제된다.

AcMNPV-HR3 DNA의 Eco-RI 단편은 pUC 벡터내에 클론시킨다. pAcEco I의 샘플 50㎍은 그의 유일한 kpn I 부위에 선형화시키고 6.6mM Tris-HC1(pH 7.4)-6.6mM MgCl₂-6.6mM 2-머캅토에탄올 및 -50mM NaC1중의 엑소뉴클레아제 Ⅲ 100U로 분해시킨다. 18℃에서 5분동안 배양시킨후에, 동량의 2×농 S1 완충액 및 뉴클레아제 S1 600U를 가하고 DNA를 18℃에서 3시간 동안 배양시킨다. 이러한 조건하에서 700bp까지를 각 KpnⅠ 말단으로부터 제거한다. DNA 폴리머라제 Ⅰ의 klenow 단편으로 처리하여 모든 말단을 평평하게 한 후, BamHⅠ 링커를 DNA에 결찰시켜 말단을 무디게 한다. 플라스미드는 과량의 BamH I 로 분해시킨 후에 희석 조건하에 결찰시켜 재환형화시킨다.

개개의 선택된 돌연변이체의 삭제 말단부는 폴리아크릴아미드 겔상에서 Sal I-BamH I 단편의 전기영동성 이동으로부터 유추한다.

다른 플라스미드는 pAcEco Ⅰ로부터 유도된 Sal I 단편을 XhoⅠ 및 EcoRⅠ 부위 사이에서 삭제된 다중클로닝부위를 갖는 pUC19 플라스미드의 SalⅠ 부위에 삽입시켜 작제한다.

SalⅠ/BamHⅠ 단편은 pAcEcoⅠ 삭제 돌연변이체로부터 분리시키고 1000bp 범위의 것은 pUC 클론의, 프로모터 함유 SalⅠ/BamHⅠ 단편 대신에 삽입한다.

pAcPn 계열로 명명되는 생성된 재조합체는 전사 개시부위 하부의 유일한 BamHⅠ부위를 갖는 폴리헤드린프로모터 영역을 함유한다. pAcPn^-10로 명명되는 재조합체에서 BamHⅠ 부위는 천연형 ATG 코돈의 위치로부터 약 10 뉴클레오티드 상부에 위치한다.

D. VGF를 발현시키는 바큘로바이러스 재조합체의 작제 : 종두 바이러스 19K 초기 유전자 영역으로부터 540bp DdeⅠ단편을 분리하고 pUC18내로 삽입하기 전에 BamHⅠ 링커를 가한다. 생성된 플라스미드를 pK19로 명명한다. DdeⅠ 단편은 EGF 및 TGF와 상동관계인 19K 단백질을 코드화하는 전체 VV 유전자를 함유한다. pK19의 BamH I 단편을 pK19로부터 분리하고 바큘로바이러스 삽입 벡터 pAcPn^-10의 BamH I 부위로 클론시킨다. 19K삽입물을 함유하는 재조합 플라스미드는 이들의 적절한 배향을 확인하기 위해 제한 엔도뉴클레아제 분해시켜 분석한다.

키메라성 VGF 유전자를 상동 재조합에 의해 SeMNPV-25 게놈내에 삽입한다. 간단히 재조합 플라스미드 20㎍ 및 SeMNPV-25DNA 1㎍을 헵스-완충 염수(NaC1,0.14M;KC1,5mM;Na₂PHO₄·2H₂O,1mM:덱스트로스,0.1%;헵스(Hepes),20mM;pH 7.05) 1m1중에서 잘 혼합한다. 2.5M 염화칼슘 50μ1 부피를 서서히 가하고 잘 혼합한다. 혼합물을 실온에서 15분동안 방치시키면, 이 동안 미세한 백색 침전이 형성된다. 이 혼합물은 25㎠ 플라스크내의 반-융합성 Sf 세포에 가한다. 이를 실온에서 30분 동안 천천히 진동시키고 미리 가온한 TC-100 5ml를 세포에 가한다. 감염시킨지 72시간 후에 감염된 세포 상등액을 수득하고, 10^-5범위로 희석한 다음, Sf 세포에 플라크한다. 재조합 바이러스를 감염시킨지 약 4일후, 감염된 세포는 확인할 수 있는 세포병적인 결과를 갖지만 핵은 폐쇄되지 않은 플라크로서 현미경으로 확인 할 수 있다. 여러 플라크를 취하고 2개의 플라크를 순수한 재조합 바이러스를 수득하기 위해 정제한다. 프로브로서 pK19를 사용한 DNA : DNA 하이브리드화를 재조합체를 확인하는데 사용한다.

삽입 벡터의 작제 : 모카스키등 [Mocarski et al.(95)]은 단편이 바이러스로부터 상동성 서열로 측접에 있을 때 특정 DNA단편을 바이러스의 게놈내로 삽입하는데 대한 상동성 재조합의 이용을 증명했다. 여러 단체가 상동성 재조합에 의한 키메라성 유전자를 삽입한 후 벡터 게놈의 전사적 조절 영역으로부터 외래 유전자의 발현을 기술했다. 바큘로바이러스 감염세포에서 외래 유전자의 발현에 대해 이러한 예를 적용하기로 한다. 첫번째 과제는 지정된 바큘로바이러스 프로모터로부터 하부에 독특한 클로닝 부위를 함유한 일반화된 클로닝 벡터를 작제하는 것이고, 이런 클로닝 부위 모두는 상동성 재조합에 의해 직접 삽입하기 위해 바이러스 게놈에 대한 상동성 서열로 측접될 것이다.

삽입 벡터는 제1도 그리고 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 작제한다. EcoR I-I 단편을 힘유하는 폴리헤드린 유전자에서의 삭제부를 Kpn I 부위에 도입시키고 BamH I 링커를 삭제 말단점에 가한다. pAcPn^-10으로 표시되는 폴리헤드린 유전자의 삭제된 ATG 개시 코돈으로부터 상부 10염기쌍 위치를 유일한 BamH I 를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리한다.

적절한 배향으로 이 부위에 도입된 외래 서열은 폴리헤드린 프로모터로부터 발현될 것이고, 전사물이 그 자신의 ATG 및 TAA 해독의 개시 및 종료 코돈 각각을 함유한다면, 전사물은 진정한 폴리펩티드로 해독될 것이다.

삽입 벡터 pAcPn^-10은 제1세대 벡터를 나타낸다. 후속 벡터는 다음 특성을 포함할 것이다：a) BamH I 부위외의 삽입부위 : b) 외래 유전자가 프레임에 결찰될 수 있도록 사용된 바큘로바이러스 유전자의 ATG 코돈 및 프로모터 함유하는 단편에 대한 독특한 제한부위; c) AcMNPV의 반복 영역과 같은 추가의 조절서열; d) 외래 유전자 생성물의 능동 분비를 위한 시그널 서열; e) 기타의 바큘로바이러스 프로모터 서열; 및 f) 바큘로바이러스 감염 세포내에서 활성인 것으로 나타난 합성 올리고머.

[ VGF를 발현시키는 바큘로바이러스 재조합체의 작제]

VGF의 완전한 코드화 영역을 함유하는 pK19로부터 540염기쌍 단편을 BamH I 단편으로서 pK19로부터분리하고 pAcPn-10의 BamH I 부위에 삽입시킨다. 유전자의 배향은 419위치에 존재하는 Acc I 부위를 사용함으로써 확인하고 정확한 배향을 가진 플라스미드를 pMC160으로 명명한다. 이는 제2도에 명시되어 있다.

제3도에 도시된 바와 같이, 재조합 바이러스는 인산칼슘-침전 천연형의 SeMNPV-25 DNA 및 pMC160로 공동-형질감염 Sf 세포에 의해 제조된다.

세포를 수득하고 OB^-플러그를 플라그 분석판으로부터 분리한다. 그다음 플라그내의 바이러스를 VGF DNA의 존재하에 프로브로서 pK19를 사용한 도트-블롯 하이브리드화(dot-blot hybridication)에 의해 스크린시킨다. 24개의 플라그중의 6개의 VGF DNA가 있는 것으로 나타난다. 이것들을 20회 이상 플라그시켜서 OB^-및 VGF^-DNA⁺임을 다시 확인한다. 재조합 바이러스의 과다량은 Sf 세포중에서 제조된다.

재조합 바이러스의 예측된 구조를 확인하기 위해 DNA를 재조합에서부터 유도된 NOV로부터 정제시키고 천연형의 감염된 세포 및 그의 제한 단편 형태를 비교한다.

[ VGF 재조합 바큘로바이러스의 발현]

VGF 유전자의 발현을 분석하기 위해서, Sf 세포의 단층을 재조합 바이러스 세포당 약 10PFU로 감염시키고 세포의 샘플 및 세포배양배지를 감염후에 여러차례 수득한다. VGF 발현의 정량 치는 표 2에 상세히 기술되어 있다.

[표 2]

곤충 세포내에서의 VGF 생성

1×10⁶T.ni. 및 S.F. 세포의 복제 배양물을 천연형 SeMNPV-25 또는 AcVGF 재조합 바이러스로 감염시킨다. 감염의 다중도는 10PFU이다. 세포를 감염후 72시간째에 비감염 세포와 함께 수득한다. 세포 용해질 및 세포 배양 상등액 모두를 EGF 당량으로서 표현되는 VGF 활성에 대해 분석한다.

샘플에 함유된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한 다음 마우스의¹²⁵I-EGF의 스위스(swiss) 3T3 세포로의 결합을 억제하는 능력에 대해 분석한다.

폴리아크릴아미드겔은 때때로 12hpi를 능가하는 재조합체로 감염된 샘플중의 약 18K에서 부가적인 유전자 생성물이 존재함을 나타낸다. 이 18K 유전자 생성물은 세포 빛 세포 배양 배지 모두에 존재한다.

그런 다음 세포 배양 배지를 EGF 활성에 대해 분석한다. 재조합 바이니러스로 감염된 샘플은 12시간 경과시 3T3 세포상의 수용체에 대해 마우스¹²⁵I-EGF와 경쟁하는 물질을 증가된 양 함유된 것으로 나타난다.

불안전한 배지에 추가의 FBS를 첨가하지 않고 VGF 유전자를 발현시키기 위해 시험에서, Sf 세포의 복제 배앙물을 재조합 바이러스로 감염시키고 추가의 FBS의 존재하 또는 부재하에 배지내에 계속둔다. 감염후 96시간까지 여러차례, 세포 배양 배지를 수득하고 경쟁 분석으로 분석하였다. 제6도는 FBS 비함유샘플에서의 발현이 일정하게 되는 경우에 거의 동등량의 활성이 각 샘플에 72hpi까지 함유되는 반면, FBS함유 샘플에서의 발현은 그렇지 못함을 나타낸다. 이 실험은 VGF 재조합 생성물 그 안에서 생성될 수 있으며 다른 단백질이 없는 배지로부터 정제될 수 있음을 나타낸다.

FBS 비함유의 재조합체 감염 세포 배지 50ml를¹²⁵I-EGF 경쟁물질의 정제에 사용한다. 18K 폴리팹타이드 1mg 이상을 HPLC에 의해 정제한다. 이 폴리펩타이드는 감염세포에서 확인되는 추가 18K 폴리펩타이드와 SDS-폴리아크릴아미드겔 상에서 함께 이동되는 것으로 밝혀졌다.

백신 바이러스로 감염된 세포로부터 정제한 VGF를 글리코실화하여 겉보기 분자량 23,000(94)의 것으로한다. 여기 나타낸 결과는 바큘로바이러스계로 발현된 VGF가 충분히 글리코실화라지 않으며, 약 18K의 분자량을 가지고 있으되 활성을 보유함을 보이고 있다. 따라서 진정한 VGF 생성물의 추가된 크기의 그 활성에 필수적이 아닌 것으로 보인다.

본 발명에 따라, 여러 가지 형태의 의학적 상업적으로 중요한 폴리펩타이드 및 단백질을 제조할 수 있다. 본 명세서에 기재하고 있는 바와 같이, 본 발명의 방법은 B형 간염 표면 항원을 제조하는데 적용할 수 있다. 종두 바이러스 성장인자, 표피 성장인자 및 형질전환 성장인자와 같은 바이러스 성장인자, 그리고 AIDS 레트로바이러스 외피 및 코어 항원과 같은 폴리펩타이드, 말라리아 스포로조이트 항원, 에프슈타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 막 표면 항원, 호흡계 합포체성 바이러스 항원 및 파라인플루엔자 항원등을 제조할 수 있다.

또한 단백질 감미료, 뉴로펩타이드 및 성장 조절인자와 같은 수용체 결합 또는 수용체 자극 단백질을 본등을 제조할 수 있다.

또한 단백질 감미료, 뉴로펩타이드 및 성장 조절인자와 같은 수용체 결합 또는 수용체 자극 단백질을 본 발명의 방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 방법은 선택된 폴리펩타이드를 변형시켜 유리한 생물학적 활성이 증가된 동족체를 생성시킨다. 또 본 발명은 백신 적용을 위한 특수항원 폴리펩타이드를 생성시키는데 이용된다. 항원성 폴리펩타이드는 아미노산 서열이 주 항원성 폴리펩타이드의 아미노 또는 카복시-말단 영역에 다른 폴리펩타이드 일부 또는 전부를 코드화하도록 처리된다. 따라서 이들 아미노 또는 카복시-말단 부분이 백신에 있어 보조 또는 면역보강의 기능을 발휘한다.

한편 본 발명의 방법에 따라, 종 서브단위 및 경 서브단위를 코드화한 플라스미드를 동시감염시키거나, 서열상에 증쇄 및 경쇄 모두를 코드화한 플라스미드를 감염시켜 특수 면역 글로불린 분자의 증쇄 및 경쇄 서브단위를 동일 곤충 세포내에서 제조할 수 있다. 유사한 방법으로 인슐린 같은 다른 복수 서브단위 분자를 제조할 수 있다.

본 발명 관련분야의 기술인은 본원 명세서의 기재내용을 참고로 하여 여러 가지로 수정, 변경 또는 응용할 수 있을 것이며 이들은 본 발명의 취지와 범위에 합치될 수 있다.

Claims (11)

1. 폴리헤드린 프로모터를 포함하는 제1DNA단편을 곤충 숙주세포를 감염시킬 수 있는 바큘로바이러스로부터 분리시키고; B형 간염 바이러스 표면 항원을 코드화하는 서열을 함유하는 제2DNA단편을 적절한 공급원으로부터 분리시키고; 상기 제1DNA단편과 제2DNA단편을 합하여 제2DNA단편이 제1DNA단편의 프로모터에 인접하여 프레임내에 있고 전사 종결 시그널을 함유하는, 벡터 DNA를 포함하는 제3DNA단편의 연속 분쇄를 형성시키고; 상기 제3단편과 바클로바이러스 게놈 DNA 사이에 재조합을 수행하여 재조합 벡터를 형성하고; 이렇게 하여 생성된 상기 재조합 벡터를 상기 재조합 벡터 단편이 곤충숙주 세포에 이입되도록 하는 조건하에서 곤충 숙주세포와 접촉시켜 감염 숙주 세포를 생성시키고; 상기 감염된 세포를 적절한 조건하에 배양한 다음, 세포 또는 배양액으로부터 B형 간염 바이러스 표면 항원을 분리시킴을 포함하며, 단 상기 바클로바이러스가 봄빅스 모리(Bombx mori)가 아님을 특징으로 하는, 적합한 곤충 숙주세포내에서 B형 간염 바이러스 표면 항원을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 곤충 숙주 세포가 나비목 유충(catepillar) 세포인 방법.
3. 제1항에 있어서, 나비목 유충이 트리코플루시아니(Trichoplusia ni)인 방법.
4. 제1항에 있어서, 곤충 숙주 세포가 스포도프테라 플루기페르다(Spodoptera frugiperda)인 방법.
5. 제1항에 있어서, 곤충 숙주 세포가 헬리오디스 제아(Helilothis zea) 세포인 방법.
6. 제1항에 있어서, 곤충 숙주 세포가 만두카 섹스타(Manduca sexta) 세포인 방법.
7. 제1항에 있어서, 바클로바이러스가 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica)로부터 분리된 방법.
8. 제1항에 있어서, 바클로바이러스가 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)로 부터 분리된 방법.
9. 제1항에 있어서, 바클로바이러스가 라키플루오시아 오우(Rachiplusia ou)로 부터 분리된 방법.
10. 제1항에 있어서, 바클로바이러스가 갈레리아 멜로넬라(Galleria melonella)로부터 분리된 방법.
11. 제1항에 있어서, B형 간염 바이러스 표면 항원이 능동적 또는 수동적으로 감염세포로부터 분리됨으로써 배양 매질로부터 회수될 수 있는 방법.

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