JP2941859B2 - Ｈａ蛋白の製造法 - Google Patents
Ｈａ蛋白の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はインフルエンザウイルスのヘマグルチニン
（HA）蛋白の製造法に関するものである。
（HA）蛋白の製造法に関するものである。
（目的） 従来の技術および発明が解決しようとする問題点 カイコ核多角体病ウイルス（以下BmNPVと略示する）
を利用するペプチド類の生産方法はすでに知られている
（例えば、Nature315592（1985）、特開昭61−9297、特
開昭62−208276）。また、インフルエンザウイルスのワ
クチンは従来より鶏卵にウイルスを感染させて生産して
いるが生産効率は良いと言えず、コンポーネントワクチ
ン製造にはウイルス粒子から表面抗原蛋白の一つである
ヘマグルチニン（HA）を単離しなければならないが、困
難な技術と高いコストが大きな障害となっている。その
ためにHA蛋白を遺伝子組換え技術を利用して大腸菌で生
産する試みもされているが、生産物の抗原性に問題があ
り未だ充分な成果を挙げていない。このために、昆虫培
養採用を利用した発現系も検討されている。即ちSpodop
tera frugiperda培養細胞にHA遺伝子を持つ組換えウイ
ルスAcNPVを感染させ、HA遺伝子を発現させている。し
かし発現量は少ない（Kurodaら:EMBO J.5（６）1359−1
365（1986）;Posseeら:Virus Res.5（６）43−59（198
6））。
を利用するペプチド類の生産方法はすでに知られている
（例えば、Nature315592（1985）、特開昭61−9297、特
開昭62−208276）。また、インフルエンザウイルスのワ
クチンは従来より鶏卵にウイルスを感染させて生産して
いるが生産効率は良いと言えず、コンポーネントワクチ
ン製造にはウイルス粒子から表面抗原蛋白の一つである
ヘマグルチニン（HA）を単離しなければならないが、困
難な技術と高いコストが大きな障害となっている。その
ためにHA蛋白を遺伝子組換え技術を利用して大腸菌で生
産する試みもされているが、生産物の抗原性に問題があ
り未だ充分な成果を挙げていない。このために、昆虫培
養採用を利用した発現系も検討されている。即ちSpodop
tera frugiperda培養細胞にHA遺伝子を持つ組換えウイ
ルスAcNPVを感染させ、HA遺伝子を発現させている。し
かし発現量は少ない（Kurodaら:EMBO J.5（６）1359−1
365（1986）;Posseeら:Virus Res.5（６）43−59（198
6））。
本発明者はカイコ個体を使用してHA遺伝子を高発現す
ることに成功し、生産されたHA蛋白が抗体産生誘起能力
を示しワクチンとしての使用可能性があることを確かめ
本発明を完成した。
ることに成功し、生産されたHA蛋白が抗体産生誘起能力
を示しワクチンとしての使用可能性があることを確かめ
本発明を完成した。
（発明の構成） 本発明は、カイコ核多角体病ウイルスDNA（BmNPV DN
A）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、インフルエンザウ
イルスのHA遺伝子を有する組換カイコ核多角体病ウイル
スをカイコ培養細胞またはカイコ虫体中で増殖させてHA
蛋白を製造する方法に関する。
A）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、インフルエンザウ
イルスのHA遺伝子を有する組換カイコ核多角体病ウイル
スをカイコ培養細胞またはカイコ虫体中で増殖させてHA
蛋白を製造する方法に関する。
BmNPVは養蚕業者に広く知られているが、代表的な株
としてT3株があり、この株のウイルスDNA（BmNPV DNA）
は米国のATCCにATCC No.40188として寄託されている。
としてT3株があり、この株のウイルスDNA（BmNPV DNA）
は米国のATCCにATCC No.40188として寄託されている。
このウイルスDNAのEcoRI−EcoRI断片（約10.5kb）をp
BR322のEcoRI切断点に導入したプラスミドpBmE36を有す
る大腸菌（E.coli K12 JM83 DGB−0036）はFERM BP−81
3として微生物工業技術研究所に寄託されている。
BR322のEcoRI切断点に導入したプラスミドpBmE36を有す
る大腸菌（E.coli K12 JM83 DGB−0036）はFERM BP−81
3として微生物工業技術研究所に寄託されている。
本発明の組換用プラスミドは、文献（Nature 315 592
（1985））の記載に基いて製造することができる。すな
わち、pBmE36をHindIII処理して多角体蛋白構造遺伝子
を含有する約3.9kbの断片をとりこれを市販のプラスミ
ドpUC9（Pharmacia P−L Biochemical社）に組込み、Ec
oRIで切断後、Bal31で処理し、さらにHindIIIで切断す
る等の操作で多角体蛋白遺伝子の全部または一部を有す
る断片を製造しpUC9に組込む。これと別に、フランキン
グ領域を含むプラスミドを作製し、両者を組合せて原料
のプラスミド（例えばp98Bシリーズのプラスミド）を作
ることができる。これを、BamHIおよびPstIで切断してp
UC由来の骨格を含む5,3kbpのDNA断片を分離し、これと
文献（Agric.Biol.Chem.51 1573−1580（1987））記載
のプラスミドpBMO30をBamHIおよびPstIで切断した3.7kb
pのDNA断片を結合させプラスミド（例えばpBMO50）を作
製することができる。
（1985））の記載に基いて製造することができる。すな
わち、pBmE36をHindIII処理して多角体蛋白構造遺伝子
を含有する約3.9kbの断片をとりこれを市販のプラスミ
ドpUC9（Pharmacia P−L Biochemical社）に組込み、Ec
oRIで切断後、Bal31で処理し、さらにHindIIIで切断す
る等の操作で多角体蛋白遺伝子の全部または一部を有す
る断片を製造しpUC9に組込む。これと別に、フランキン
グ領域を含むプラスミドを作製し、両者を組合せて原料
のプラスミド（例えばp98Bシリーズのプラスミド）を作
ることができる。これを、BamHIおよびPstIで切断してp
UC由来の骨格を含む5,3kbpのDNA断片を分離し、これと
文献（Agric.Biol.Chem.51 1573−1580（1987））記載
のプラスミドpBMO30をBamHIおよびPstIで切断した3.7kb
pのDNA断片を結合させプラスミド（例えばpBMO50）を作
製することができる。
ここで得られるプラスミドにインフルエンザウイルス
のHA遺伝子を有するプラスミド（例えばpEH−HA1（E.co
li EH−HA1として工業技術院微生物工業技術研究所の受
託番号FERM BP−2585））からHA遺伝子を切出して組込
み、該フラグメントが正しい方向に挿入されたプラスミ
ドを選択し組換用プラスミドとする。
のHA遺伝子を有するプラスミド（例えばpEH−HA1（E.co
li EH−HA1として工業技術院微生物工業技術研究所の受
託番号FERM BP−2585））からHA遺伝子を切出して組込
み、該フラグメントが正しい方向に挿入されたプラスミ
ドを選択し組換用プラスミドとする。
これを用いて組換ウイルスを製造するには、例えばカ
イコ樹立細胞を組換用プラスミドとBmNPV DNAとでコト
ランスフェクトし、必要に応じてプラーク法（J.Seric.
Sci.Jpn.,53 547（1984））や希釈法（J.Invertebr.Pat
hol.,29 304（1977））等により組換ウイルスを単離す
る。
イコ樹立細胞を組換用プラスミドとBmNPV DNAとでコト
ランスフェクトし、必要に応じてプラーク法（J.Seric.
Sci.Jpn.,53 547（1984））や希釈法（J.Invertebr.Pat
hol.,29 304（1977））等により組換ウイルスを単離す
る。
カイコ樹立細胞としては、Bm細胞（ATCC No.CRL−891
0）やBM−Ｎ細胞（ATCC No.CRL−8851）、Bm36細胞等が
知られている。
0）やBM−Ｎ細胞（ATCC No.CRL−8851）、Bm36細胞等が
知られている。
BM−Ｎ細胞を用いたときはコトランスフェクト後に細
胞を凍結・融解処理で破壊して組換ウイルスを取得する
のが適しており、Bm36を用いたときは培養液の上清を用
いて組換ウイルスを取得することができる。
胞を凍結・融解処理で破壊して組換ウイルスを取得する
のが適しており、Bm36を用いたときは培養液の上清を用
いて組換ウイルスを取得することができる。
目的物質をカイコを用いて生産するには、培養細胞中
で増殖したウイルス（組換ウイルスと非組換ウイルスの
混合物または組換ウイルスを単離したもの）をカイコに
経皮的にまたは体腔内に注射して感染させる、または、
人工飼料やクワ葉にウイルスを混ぜて与えて感染させ
る。そして、人工飼料あるいはクワ葉で適当日数飼育し
て目的の蚕白を蓄積させ、体液を採取して遠心分離等で
沈殿を集める。他の方法では、あるいはカイコを摺りつ
ぶしてSDS水溶液、尿素水溶液、もしくはアルカリ性水
溶液で抽出して常法処理によって得ることができる。ま
た、すりつぶしたカイコをリン酸バッファーに懸濁させ
超音波処理したのち血球に結合させて取得することもで
きる。
で増殖したウイルス（組換ウイルスと非組換ウイルスの
混合物または組換ウイルスを単離したもの）をカイコに
経皮的にまたは体腔内に注射して感染させる、または、
人工飼料やクワ葉にウイルスを混ぜて与えて感染させ
る。そして、人工飼料あるいはクワ葉で適当日数飼育し
て目的の蚕白を蓄積させ、体液を採取して遠心分離等で
沈殿を集める。他の方法では、あるいはカイコを摺りつ
ぶしてSDS水溶液、尿素水溶液、もしくはアルカリ性水
溶液で抽出して常法処理によって得ることができる。ま
た、すりつぶしたカイコをリン酸バッファーに懸濁させ
超音波処理したのち血球に結合させて取得することもで
きる。
DNA断片の合成、切断、スクリーニング、単離等は一
般的遺伝子操作技術を応用して行うことができる。
般的遺伝子操作技術を応用して行うことができる。
次に実施例を挙げて説明するが、これらは例示にすぎ
ず、限定的意味はない。
ず、限定的意味はない。
実施例1:プラスミドpBMO50の作製 プラスミドpBmE36より導いたプラスミドp89B310（Nat
ure 315 592−594（1985）参照）を、BamHIおよびPstI
で切断し、アガロースゲル電気泳動でpUC由来の骨格を
含む5.3kbpのDNA断片を分離した。これに、文献記載（A
gric.Biol.Chem. 51 1573（1987））のプラスミドpBMO3
0をBamHIおよびPastIで切断しアガロースゲル電気泳動
で分離したポリリンカーを含む3.7kbpのDNA断片を、T4
リガーゼを用いて結合させpBMO59を作製した。
ure 315 592−594（1985）参照）を、BamHIおよびPstI
で切断し、アガロースゲル電気泳動でpUC由来の骨格を
含む5.3kbpのDNA断片を分離した。これに、文献記載（A
gric.Biol.Chem. 51 1573（1987））のプラスミドpBMO3
0をBamHIおよびPastIで切断しアガロースゲル電気泳動
で分離したポリリンカーを含む3.7kbpのDNA断片を、T4
リガーゼを用いて結合させpBMO59を作製した。
実施例2:組換ウイルスの作製 １）インフルエンザウイルスA/sw/Ehime/1/80（H1N2）
株のHA遺伝子を持つプラスミドpEH−HA1（FERM BP−258
5）をBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行いHA
遺伝子を含む1.8kbpのDNAフラグメントを単離した。こ
のフラグメントを、BglIIで切断したpBMO50とT4リガー
ゼを用いて結合させ、ポリヘドリン遺伝子のプロモータ
ーとの関係でHA遺伝子が発現し得る方向にフラグメント
の挿入されたプラスミドpBM−HA1−３を得た。
株のHA遺伝子を持つプラスミドpEH−HA1（FERM BP−258
5）をBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行いHA
遺伝子を含む1.8kbpのDNAフラグメントを単離した。こ
のフラグメントを、BglIIで切断したpBMO50とT4リガー
ゼを用いて結合させ、ポリヘドリン遺伝子のプロモータ
ーとの関係でHA遺伝子が発現し得る方向にフラグメント
の挿入されたプラスミドpBM−HA1−３を得た。
２）pBM−HA1−3DNAおよび野生型カイコ核多角体病ウイ
ルス（BmNPV）T3株のDNA（ATCC No.40188）をBm36細胞
にリン酸カルシウム法でコトランスフェクトし、翌日培
地を交換し、１週間培養後BM−Ｎ細胞を用いてクローニ
ングを行った。即ち、培養上清を10-5、10-6および10-7
に希釈し、等量の細胞液（約1.5×106cell/ml）を加え
て、96穴マルチプレートに分注（200μl/well）した。
１週間培養後、顕微鏡観察によって、ウイルス感染によ
り細胞変性を起こしているが多角体形成の起こっていな
いウエルを検索してHA遺伝子を保持する組換ウイルスvB
mBM−HA1−B4を得た。（参考文献J.gen.Virol.68,2599
−2606（1987））。
ルス（BmNPV）T3株のDNA（ATCC No.40188）をBm36細胞
にリン酸カルシウム法でコトランスフェクトし、翌日培
地を交換し、１週間培養後BM−Ｎ細胞を用いてクローニ
ングを行った。即ち、培養上清を10-5、10-6および10-7
に希釈し、等量の細胞液（約1.5×106cell/ml）を加え
て、96穴マルチプレートに分注（200μl/well）した。
１週間培養後、顕微鏡観察によって、ウイルス感染によ
り細胞変性を起こしているが多角体形成の起こっていな
いウエルを検索してHA遺伝子を保持する組換ウイルスvB
mBM−HA1−B4を得た。（参考文献J.gen.Virol.68,2599
−2606（1987））。
３）pBM−HA1−3 DNAおよびBmNPV T3株DNAをBM−Ｎ細胞
にリン酸カルシウム法でコトランスフェクトして翌日培
地を交換し、１週間培養後1,000RPMで10分の遠心操作に
より細胞を回収し、それにPBSを加えて同様の遠心操作
による細胞の洗浄を三回繰返したのち、細胞に300μｌ
のPBSを加えて凍結・溶解を三回繰返した。7,000RPMで
５分の遠心操作を行い、上清を用いて２）と同様の方法
でクローニングを行った。但し、希釈倍率は、10-2、10
-3および10-4であった。その結果、２）と同様のHA遺伝
子を保持する組換ウイルスvBmBM−HA1−G4を得た。
にリン酸カルシウム法でコトランスフェクトして翌日培
地を交換し、１週間培養後1,000RPMで10分の遠心操作に
より細胞を回収し、それにPBSを加えて同様の遠心操作
による細胞の洗浄を三回繰返したのち、細胞に300μｌ
のPBSを加えて凍結・溶解を三回繰返した。7,000RPMで
５分の遠心操作を行い、上清を用いて２）と同様の方法
でクローニングを行った。但し、希釈倍率は、10-2、10
-3および10-4であった。その結果、２）と同様のHA遺伝
子を保持する組換ウイルスvBmBM−HA1−G4を得た。
実施例3:カイコ培養細胞でのHA遺伝子発現 １）組換ウイルス液の作製 培養フラスコ（75cm2、10％FCS添加TC−10培地15ml）
で生育させたカイコ培養細胞（BM−Ｎ細胞;7×105個/m
l）に組換えウイルスを感染させた。28℃で10日間培養
を行った後、培養液を回収して2,000rpmで10分間遠心分
離を行い、その上清液を組換えウイルス液とした。
で生育させたカイコ培養細胞（BM−Ｎ細胞;7×105個/m
l）に組換えウイルスを感染させた。28℃で10日間培養
を行った後、培養液を回収して2,000rpmで10分間遠心分
離を行い、その上清液を組換えウイルス液とした。
２）カイコ培養細胞でのHAの生産 培養フラスコ（75cm2、10％FCS添加TC−10培地15ml）
中のカイコ培養細胞（BM−Ｎ細胞;7×105個/ml）から培
地を除去後、上記組換えウイルス液（1.5ml）を加え
た。30分間室温で静置し、未吸着ウイルスを除去してか
ら新鮮な培地を加えて28℃で４日間培養を行った。培養
終了後細胞を2,000rpmで10分間遠心分離を行って集め、
0.5mlのPBSに懸濁し、30秒間超音波処理をした。その結
果、この液中のHA価は8,192であることが明らかとな
り、ワクチン用タンパクがこれまで報告されているもの
よりも100倍近くも産生されるていることが示された。
なおHA価の測定は下記の通りに行った。
中のカイコ培養細胞（BM−Ｎ細胞;7×105個/ml）から培
地を除去後、上記組換えウイルス液（1.5ml）を加え
た。30分間室温で静置し、未吸着ウイルスを除去してか
ら新鮮な培地を加えて28℃で４日間培養を行った。培養
終了後細胞を2,000rpmで10分間遠心分離を行って集め、
0.5mlのPBSに懸濁し、30秒間超音波処理をした。その結
果、この液中のHA価は8,192であることが明らかとな
り、ワクチン用タンパクがこれまで報告されているもの
よりも100倍近くも産生されるていることが示された。
なおHA価の測定は下記の通りに行った。
３）HA価の測定方法 Ｕ底96穴プレートで、PBSを用いて試料原液の２倍階
段希釈を実施し（各ウェル50μｌを入れる）、これに0.
5％ニワトリ赤血球浮遊液を50μｌ加えて良く振盪す
る。室温で１時間反応させた後に赤血球の凝集を観察す
る。凝集の観察された最大希釈倍数をその試料原液のHA
価とする。
段希釈を実施し（各ウェル50μｌを入れる）、これに0.
5％ニワトリ赤血球浮遊液を50μｌ加えて良く振盪す
る。室温で１時間反応させた後に赤血球の凝集を観察す
る。凝集の観察された最大希釈倍数をその試料原液のHA
価とする。
実施例4:カイコ虫体でのHAの発現 ５令のカイコ幼虫に組換ウイルス液50μｌを皮下に注
射することにより感染させた。４日後にカイコ１頭当り
15mlのPBSを加え、ホモジナイザーで粉砕して2,000rpm
で10分間遠心分離を行った。その上清液のHA価を実施例
３の方法で測定したところ8,192であった。
射することにより感染させた。４日後にカイコ１頭当り
15mlのPBSを加え、ホモジナイザーで粉砕して2,000rpm
で10分間遠心分離を行った。その上清液のHA価を実施例
３の方法で測定したところ8,192であった。
実施例5:組換ウイルス感染カイコ虫体よりのHA蛋白の精
製 ５令のカイコ幼虫40頭に組換ウイルス液各50μｌを皮
下に注射することにより感染させた。４日後に虫体を集
め600mlのPBSを加えホモジナイザーで粉砕した。１秒間
隔で30分間超音波処理した後2,000rpmで10分間遠心分離
した。この上清液を４℃に冷却した後0.1％グルタール
アルデヒドで固定したニワトリ赤血球の20％浮遊液240m
lを加えて４℃で10分間HA蛋白を吸着させた。2,000rpm
で10分間遠心分離し、沈殿を800mlの冷PBSで洗浄する操
作を３回繰り返した。PBSを遠心分離で除いた後2M NaCl
溶液240mlを加えてHA蛋白を遊離させた。2,000rpmで10
分間遠心分離し上清を集め、沈殿は再度2M NaCl溶液に
よるHA蛋白の遊離を行い遠心分離後上清をとり両液を合
わせた。PEG6000を最終濃度20％になるように加え、４
℃で一夜静置した後13,000rpmで３時間遠心分離しHA蛋
白を沈殿として集めた。
製 ５令のカイコ幼虫40頭に組換ウイルス液各50μｌを皮
下に注射することにより感染させた。４日後に虫体を集
め600mlのPBSを加えホモジナイザーで粉砕した。１秒間
隔で30分間超音波処理した後2,000rpmで10分間遠心分離
した。この上清液を４℃に冷却した後0.1％グルタール
アルデヒドで固定したニワトリ赤血球の20％浮遊液240m
lを加えて４℃で10分間HA蛋白を吸着させた。2,000rpm
で10分間遠心分離し、沈殿を800mlの冷PBSで洗浄する操
作を３回繰り返した。PBSを遠心分離で除いた後2M NaCl
溶液240mlを加えてHA蛋白を遊離させた。2,000rpmで10
分間遠心分離し上清を集め、沈殿は再度2M NaCl溶液に
よるHA蛋白の遊離を行い遠心分離後上清をとり両液を合
わせた。PEG6000を最終濃度20％になるように加え、４
℃で一夜静置した後13,000rpmで３時間遠心分離しHA蛋
白を沈殿として集めた。
実施例6:カイコより精製したHA抗原蛋白のHI試験 A/NJ/8/76（H1N1）のHAに対する５種のモノクロナル
抗体およびA/sw/Iowa/15/30（H1N1）、A/NJ/8/76（H1N
1）、A/Philippines/2/82（H3N2）、B/Yamagata/16/88
ウイルスおよび実施例５で得たHA蛋白に対するウサギ免
疫血清を使用して、実施例５で得たHA蛋白のHI試験を後
に述べる方法で行った。その結果を表１に示す。
抗体およびA/sw/Iowa/15/30（H1N1）、A/NJ/8/76（H1N
1）、A/Philippines/2/82（H3N2）、B/Yamagata/16/88
ウイルスおよび実施例５で得たHA蛋白に対するウサギ免
疫血清を使用して、実施例５で得たHA蛋白のHI試験を後
に述べる方法で行った。その結果を表１に示す。
これによると、カイコで生産したHA蛋白はA/sw・Ehim
e/1/80（H1N2）ウイルスと同じパターンを示した。
e/1/80（H1N2）ウイルスと同じパターンを示した。
HI試験の方法 Ｕ底96穴プレートで標準抗インフルエンザウイルス抗
体液の２倍階段希釈系列をPBSを用いて作製する（各ウ
ェル25μｌを入れる）。これに抗原（HA価16/ml）25μ
ｌを加える。37℃で30分間反応後、0.5％ニワトリ赤血
球浮遊液50μｌを加え振盪し室温で１時間静置する。赤
血球の凝集を観察し、凝集を完全に抑える抗体の最高希
釈度の逆数をもってHI抗体価とする。
体液の２倍階段希釈系列をPBSを用いて作製する（各ウ
ェル25μｌを入れる）。これに抗原（HA価16/ml）25μ
ｌを加える。37℃で30分間反応後、0.5％ニワトリ赤血
球浮遊液50μｌを加え振盪し室温で１時間静置する。赤
血球の凝集を観察し、凝集を完全に抑える抗体の最高希
釈度の逆数をもってHI抗体価とする。
実施例7:カイコより精製したHA抗原蛋白の免疫試験 実施例５で得たカイコで生産したHA蛋白の免疫原性試
験を二元免疫拡散によって行った。カイコで生産したHA
蛋白はA/NJ/8/76とA/Kumamoto/37/79（H1N1）ウイルス
のHAに対する各特異抗体との間で１本の強い免疫沈降線
を形成した。
験を二元免疫拡散によって行った。カイコで生産したHA
蛋白はA/NJ/8/76とA/Kumamoto/37/79（H1N1）ウイルス
のHAに対する各特異抗体との間で１本の強い免疫沈降線
を形成した。
実施例8:マウスを用いた免疫応答（免疫原性）試験 実施例５によりカイコで生産したHA蛋白および対照と
して発育鶏卵で増やしたインフルエンザウイルスA/sw/E
hime/1/80をエーテル処理して作製した（HA）ワクチン
を、一元放射免疫拡散法によって抗原量を同等に調整し
試料とした。各々の試料を、４週令のマウス（ddy）の
腹腔に0.5mlずつ投与し免疫を行った。免疫後１週毎に
血清中のHI抗体価を測定した。結果を表２に示す。
して発育鶏卵で増やしたインフルエンザウイルスA/sw/E
hime/1/80をエーテル処理して作製した（HA）ワクチン
を、一元放射免疫拡散法によって抗原量を同等に調整し
試料とした。各々の試料を、４週令のマウス（ddy）の
腹腔に0.5mlずつ投与し免疫を行った。免疫後１週毎に
血清中のHI抗体価を測定した。結果を表２に示す。
これによれば４週後に、カイコで生産したHA蛋白は鶏
卵由来のワクチンに比較して４倍のHI抗体価を示した。
卵由来のワクチンに比較して４倍のHI抗体価を示した。
また、免疫後３週目の血清中の抗体量を、MDCK細胞に
よるプラーク中和試験により調べた。即ち、抗血清をME
M−BAを用いて希釈系列を作製し試料とした。各々の試
料液0.4mlとA/sw/Ehime/1/80ウイルス液0.4ml（約200pf
u）を混合して37℃で30分間反応させ、その0.2mlを6cm
ディシュ中のMDCK細胞（１×106個/ml）に加え寒天培地
を重層した。35℃のCO2インキュベーターで３日間培養
後、中性赤を含む二次寒天培地を重層しその翌日形成さ
れたプラーク数を数えた。プラーク形成を阻止する希釈
倍数を表３に示す。この結果から求めた50％のプラーク
形成を阻止する希釈倍数は、カイコで生産したHAワクチ
ンおよび鶏卵で作ったHAワクチンで各々28,183.8および
19,952.6であった。
よるプラーク中和試験により調べた。即ち、抗血清をME
M−BAを用いて希釈系列を作製し試料とした。各々の試
料液0.4mlとA/sw/Ehime/1/80ウイルス液0.4ml（約200pf
u）を混合して37℃で30分間反応させ、その0.2mlを6cm
ディシュ中のMDCK細胞（１×106個/ml）に加え寒天培地
を重層した。35℃のCO2インキュベーターで３日間培養
後、中性赤を含む二次寒天培地を重層しその翌日形成さ
れたプラーク数を数えた。プラーク形成を阻止する希釈
倍数を表３に示す。この結果から求めた50％のプラーク
形成を阻止する希釈倍数は、カイコで生産したHAワクチ
ンおよび鶏卵で作ったHAワクチンで各々28,183.8および
19,952.6であった。
実施例9:カイコより精製したHA抗原蛋白の性状 実施例５で得たHA蛋白のイムノブロッティングを行っ
た。A/SW/Illinois/63（H1N1）ウイルスに対する兎の抗
血清及びHA蛋白のHA2部分に対する兎の抗血清を用いて
調べたところ、約70Kの蛋白が両抗血清によって検出さ
れた。即ち、実施例５で得たHA蛋白は、HA1とHA2の部分
がつながった分子量約70Kの蛋白であることが分った。
た。A/SW/Illinois/63（H1N1）ウイルスに対する兎の抗
血清及びHA蛋白のHA2部分に対する兎の抗血清を用いて
調べたところ、約70Kの蛋白が両抗血清によって検出さ
れた。即ち、実施例５で得たHA蛋白は、HA1とHA2の部分
がつながった分子量約70Kの蛋白であることが分った。
フロントページの続き (72)発明者 堀内 正 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第一製薬中央研究所内 (72)発明者 佐伯 欣之 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第一製薬中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭61−9297（ＪＰ，Ａ) ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ. ６，（1986），Ｐ．1359−1365
Claims (4)
- 【請求項１】カイコ核多角体病ウイルスDNA（BmNPV DN
A）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、インフルエンザウ
イルスのHA遺伝子を有する組換カイコ核多角体病ウイル
スをカイコ虫体中で増殖させることにより抗体産生誘起
能力を有するHA蛋白を製造することを特徴とするHA蛋白
の製造法。 - 【請求項２】前記組換カイコ核多角体病ウイルスが、カ
イコ核多角体病ウイルスDNAのプロモーター部分を含む
５′上流塩基配列に続いてインフルエンザウイルスのHA
遺伝子およびカイコ核多角体病ウイルスDNAのターミネ
ーター配列を含むまたは含まない３′下流塩基配列を有
するものである特許請求の範囲第１項のHA蛋白の製造
法。 - 【請求項３】前記インフルエンザウイルスのHA遺伝子
は、プラスミドpEH−HA1由来のものである特許請求の範
囲第１項のHA蛋白の製造法。 - 【請求項４】前記組換カイコ核多角体病ウイルスは、カ
イコ核多角体病ウイルスDNAのプロモーター部分を含む
５′上流塩基配列に続いてインフルエンザウイルスのHA
遺伝子およびカイコ核多角体病ウイルスDNAのターミネ
ーター配列を含むまたは含まない３′下流塩基配列を有
するプラスミドと、BmNPVとで、カイコ培養細胞または
カイコを混合感染させることにより得られたものである
特許請求の範囲第２項のHA蛋白の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1242280A JP2941859B2 (ja) | 1989-09-20 | 1989-09-20 | Ｈａ蛋白の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1242280A JP2941859B2 (ja) | 1989-09-20 | 1989-09-20 | Ｈａ蛋白の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03108480A JPH03108480A (ja) | 1991-05-08 |
| JP2941859B2 true JP2941859B2 (ja) | 1999-08-30 |
Family
ID=17086914
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1242280A Expired - Fee Related JP2941859B2 (ja) | 1989-09-20 | 1989-09-20 | Ｈａ蛋白の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2941859B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995007099A1 (fr) * | 1993-09-09 | 1995-03-16 | The Nisshin Oil Mills, Ltd. | Vaccin et procede pour sa production |
| CN101365480B (zh) | 2005-11-01 | 2014-11-05 | 诺华疫苗和诊断有限两合公司 | 经由β-丙内酯处理的残留细胞DNA水平降低的细胞衍生病毒疫苗 |
| US9555094B2 (en) | 2012-07-23 | 2017-01-31 | The Institute Of Biological Resources | Isolated nucleic acid for the production of a vaccine against virus |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS619297A (ja) * | 1984-10-29 | 1986-01-16 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製法 |
-
1989
- 1989-09-20 JP JP1242280A patent/JP2941859B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．６，（１９８６），Ｐ．１３５９−１３６５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03108480A (ja) | 1991-05-08 |
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