JPH06506826A

JPH06506826A - タンパク性の脂質含有粒子

Info

Publication number: JPH06506826A
Application number: JP4507715A
Authority: JP
Inventors: アダムス，　サリー　エリザベス; バーンズ，　ニゲル　ロバート; フレンチ，　テモテ　ジョン; ガーリング，　アンドリュー　ジョン　ハバート; キングスマン，　アラン　ジョン; キングスマン，　スーザン　メアリー
Original assignee: ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッド
Priority date: 1991-04-10
Filing date: 1992-04-10
Publication date: 1994-08-04
Also published as: WO1992018621A1; NO933613D0; FI934427A; EP0508809A1; CA2107879A1; NZ242326A; AU1538692A; IE921111A1; NO933613L; ZA922659B; FI934427A0; GB9107631D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク性の脂質含有粒子この発明は、タンパク性の脂質含有粒子に関する。タンパク性の粒子は、以前にワクチンの製造において提案されている。

動物の免疫系への抗原の正確な提示は、有効なサブユニットワクチン又は免疫原における主要な要件となっている。高分子量複合体又は粒子への抗原決定基の集合は、有効な免疫応答を増強するのに重要であると思われる。

この発明以前に、いくつかの自己集合抗原提示システム（ｓｅｔｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）が開発されてきた。これらには、肝炎殻抗原〔ビースリー（Ｂｅｅｓ　ｌｙ）ら、　１９９０゜バイオテクノロジー　８　、６４４−６４９　）　、タバコモザイクウィルスコートタンパク〔ヘインズ（Ｈａｙｎｅｓ）ら、　１９８６．バイオテクノロジー　４．６３７）、ポリオウィルス〔パーク（Ｂｕｒｋｅ）ら、　１９８８、ネイチャー　３３２．８ｌ−８２）及びイーストレトロトランスポゾン　ティーワイエル　ビーエ元（ｙｅａｓｔ　ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　Ｔｙｌｐｉ）　（国際公開第８８０３５６３号及び同第８８０３５６２号）における抗原の融合に基づいたシステムがある。これらの全システムは、多量体融合タンパク複合体を形成する。しかしながら、それらの全ては単一のタンパクを含有し、それが細胞内で粒子に集合する。従って、これらの粒子構造は何れも脂質二重層で被覆されていない。結果として、これらのシステムには、このような二重層に基づく特異的な性質を付与することによって粒子に対する免疫応答を修正する機会がない。

脂質膜成分を含有する公知の自己集合粒子抗原提示システムは、ＢＷ肝炎表面抗原に基づいている〔ヴアレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）ら、　１９８５．バイオ／テクノロジー　３．３２３）。

しかしながら、これらの粒子の肝要な部分である膜は、製造工程の副産物として形成される。従って、製造工程中に、特異的な膜結合タンパクをこれらの粒子の脂質成分中に挿入するのを制御するのは困難である。

２つの関連したウィルスが同じ細胞に感染するとき、表現型混合の工程がおこるかもしれない。この工程は、後代ピリオンか、１つのウィルスのゲノムを含有し、どちらかの又は両方のウィルスの構造タンパクを含有しないときに起こる。このような表現型混合は、水庖性口内炎ウィルス（ＶＳ’／）といくつかのレトロウィルスの間で観察されており、それによってエンベロープタンパクの相互交換が起こる。換言すれば、混合性ウィルス株において、レトロウィルスの膜糖タンパクを持つｖＳｖ粒子及び■Ｓ■の糖タンパクを持つレトロウィルスタンパクの両方を検出することができる〔ワイスｆｆｅｉｓｓ、　）　ＲＮＡ“腫瘍ウィルス”（ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）　、コールドスプリングハーバ− 研究所（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　１９８４．２０９−２６０頁参照〕。

表現型混合はレトロウィルス間でも観察されており、ぞの１つは複製欠損であるかもしれない〔ヴアイス　同書〕。このような表現梨の混合したピリオンは、異種膜タンパクを持つ多価粒子担体として考えることができ、それらにはいくつがの欠点がある。：（１）このような製剤は、治療上の使用を不適切にする感染性レトロウィルスを予め含有する。；（２）活性ウィルスの不活性化が、タンパクの生物学的活性及びエピトープの抗原性を破壊するであろう。：（３）表現型の混合したピリオンの産生における感染性レトロピリオンに対する要件は、異種タンパクがウィルスのレセプターとして作用しなければならず、それによって、このような粒子に導入されつるタンパクの範囲が制限されることを意味する。；（４）このような粒子の製造における産生工程は、非常に高価で、かつ制御するのが困難であろう。

バッファーらＣＨａｆｆａｒ　ｅｔ　ａｌ）　Ｃジェイ、ヴイロール、（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、６４（６）　２６５３−２６５９　（１９９０））は、アフリカ緑ザルの腎細胞におけるワクシニア発現系で産生されたウィルスＲＮＡを含有する）ｆｌｖｇａｇ−ｅｎｖ粒子を報告した。予想どおり、ｅｎｖタンパクはｇａｇタンパクと相同であったので、産生された粒子に２つのタンパクが結合した。

ヴゾロールＣＶｚｏｒｏｒ）ら〔エイズ　リサーチ　アンド　ヒユーマン　レトロウィルス（ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　）（ｕｎｍａｎ　ＲｅｔｒｏｖｉｒｕＳｅＳ）、７（］）　２９−３６（Ｆ９９１）　）は、ＨＩＶ　ｅｎｖタンパクが相同ｇａｇタンパクと共に存在するワクシニア発現系を用いて、同様に粒子を産生じた。

ヤング（Ｙｏｕｎｇ）らは、サイエンス２５０１４２２　（ｔ９９ｏ）＋：Ｊおいて、鳥類白血病ウィルスピリオン（ＡＬＶ）中への異種及びキメラタンパクの導入を記載した。特に、複製能を有するＡＬＶピリオン中に導入するために、感受性細胞における組換えＤＮＡ技術によって発現されたＡＬＶ又はＭＬＶ膜貫通型ＥＮＶタンパク（ＭＬＶ　ｔｒａｎｓａ＋ｅｍｂｒａｎｅ　ＥＮＶ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の膜貫通梨及び細胞質ドメインに融合されたＣＤ４の細胞外ドメインから構成された、タンパクＣＤ４及びキメラが示された。このシステムは、原則としてあらゆる膜結合タンパクをＡＬＶ粒子中に導入することができるという利点を育するが、それは生の感染性レトロウィルスの使用によるものでもあり、加えて、異種膜タンパクを有する化レトロウィルスが用いられるならば組換えが可能であり、それによって新規な細胞向性を有する新規なレトロウィルスを産生ずることができる。結果として、まだシステムは、上述した他の欠点を有する。

従って、上述した困難、特に複製能を存するレトロウィルスを使用することの必要性にあうことなく、とりわけワクチンの調製に有用であろうタンパク性の脂質含有粒子をｌｌ製するのには問題がある。この発明は、この問題に対する解決に関する。

タンパク性の脂質含有粒子を出芽タンパクから調製することができることを見出した。このようなタンパクは、感染性ウィルス核酸の存在なしで宿主細胞における組換えＤＮＡ技術によってｌｌ製することができ、かつそれらが宿主細胞から出芽するので、少なくとも部分的に脂質によって被覆されるようになることができる。

この発明の第１の観点によれば、多数の自己集合タジノくり成分から形成された出芽集合体からなり、その集合体が少なくとも部分的に脂質二重層及び自己集合タンパク成分に関して異種の１もしくはそれ以上の膜結合タンパク成分で被覆されてなるタンパク性の脂質含有粒子（但し、自己集合タンパク成分がウィルス起源のものであるならば、粒子は感染性ウィルス核酸を育さない）が提供される。

この発明による粒子は合成品である。従って、この発明は、例えば天然のウィルスや天然の表現型の混合したウィルスにまでは広がらない。この発明による粒子は、表現型が混合していてもしていなくても感染性ウィルスの全成分を含有しなことで、そのような天然のウィルスと区別されるであろう。例えば、通常、感染性レトロウィルス核酸は脱落しているであろう。従って、この発明は、複製能を有するレトロウィルスの使用を避ける。

この明細書における“タンパク″の意味は、−次発現産物の意味、及び適当な場合には、翻訳後修飾された（例えばグリコジル化）タンパクの意味がある。

この発明は、抗原提示システムを産生ずる際の問題を解決する。しかしながら、これ以上のものを与える。この発明による粒子は、後に論じられるような用途及び適用の広範囲の変化を有する。

この発明の重要な具体例においては、自己集合タンパク成分は、単に自己集合タンパク分子であろう。以下の記載は、主としてこの具体例について言及するが、加えて、続いて萌らかにされるような他の具体例に適用されるものと理解されるべきである。

この発明による粒子の第一の成分は、多数の自己集合タンノ（り分子から形成された出芽集合体である。タンパク分子は粒子に集合することができ、それからその粒子は、それらが集合され、及び通常は合成された細胞からの出芽に基づいて脂質膜を得る能力を有する。原則として、タンパク分子は何れの源（ＳＯＵｒｃｅ）から由来してもよいが、タンパク分子としてはウィルス起源のもの（又は少なくともウィルス起源のタンノ（りに関連したもの）であるのが好ましい。全てではないにしても多くのウィルスが、粒子に集合することができるタンノ（り分子を含有する。

しかしながら、自己集合タンパクとしては、レトロウィルスのＧＡＧタンパクであるのが好ましい。例えば、ヒト免疫不全ウィルス（Ｈｍの出芽コア分子が適当であろう。出芽集合体は、この発明の粒子のコア（ｃｏｒｅ）を形成するので、 “コア′集合体又は“コア“として言及することができる。しかしながら、それは、必ずしもウィルスコアタンパクと同じもの又はウィルスコアタンパク由来のものとさえも解釈されるべきではない。

好ましいＧＡＧタンパクには、レトロウィルスであるＨ［Ｖ−１。

ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＴＬＶ−Ｉ［［（即ち、ＴＩＪ：／／＜球つイルスヲ含ム）、Ｓｌｖ、Ｂ］■、ＥＩＡＶ、　Ｃ４ＡＶ、マウス白血病ウィルス、モロニーマウス白血病ウィルス及びネコ白血病ウィルスのものがある。最も好ましいタンパクは、レトロウィルスであるヒト免疫不全ウィルス（Ｈｍ　（ゲイセン（Ｇｈｅｙｓｅｎ）ら二１９８９、セル５９．１０３−１Ｉ２）、サル免疫不全ウィルス（Ｓ１ｖ）〔デルチャンプル（Ｄｅｌｃｈａｍｂｒｅ）ら、１９８９．　ＥＭＢＯＪ、８．２６５３−２６６０　）及びウシ免疫不全様ウィルス（Ｂｍ　（ラスムラセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）ら、１９９０　ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７８４３５−４５１　）からのＧＡＧタンパクを含むウィルスコアタンパクである。

レトロウィルスのＧＡＧタンパクに対する免疫応答は、レトロウィルスによって誘発される疾患の発症及び進行において重要な役割を育することが示されてきた。従って、この発明の粒子におけるＧＡＧタンパクもまた、この発明が有する用途の１つである抗原提示システムの重要な免疫原成分として作用するであろう。

自己集合タンパクは、ウィルスのもの又はウィルス由来のものでなくてもよい。

例えば、イーストレトロトランスポゾンのＴＶタンパク又は昆虫のコピア様因子のような何れか他の転位因子であってもよく、又はそれらから由来してもよい。

この発明において有用な自己集合タンパク分子は、天然の自己集合分子と同じものであろう。しかしながら、そうでなくてもよく、例えば、自律的に自己集合するタンパク分子の自己集合配列が、自己集合能力に寄与する必要のない（それらは寄与するかもしれない力り　１又はそれ以上の追加アミノ酸によって補足されてもよく、追加アミノ酸は、例えば抗原性に寄与してもよい。また、もしくは加えて、自律的に自己集合するタンパク分子の配列は、アミノ酸置換、欠失及び／又は付加によって、他の目的のために修飾されてもよい。この発明のいくらかの具体例では、タンパク（特にウィルス起源のものであるならば）の核酸結合能力は修正されてもよい。このような修正は、例えばウィルス核酸が粒子中にほとんど導入されないか又は全く導入されないことを保証するのを助けるために、タンパクの核酸結合活性を減少する作用を有するか又は除去する作用までも有するであろう。しかしながら同時に、核酸結合特性は、例えばタンパクが通常結合しない核酸のための輸送システムとして粒子が用いられるように、減少されるよりもむしろ単に修正されてもよい。このような核酸には、アンチセンスＲＮＡ、　リボザイムのような消化あるいは切断活性を有するＲＮＡ、及び標的細胞の部位で放出されうる生物学的に活性なペプチドをコードするＤＮＡ及びｍＲＮＡがある。従って、この発明は、遺伝子治療に用いることができる。

それらのなかで、修飾された又は天然のＧＡＧタンパクが、この発明で用いるのに好ましい。

自己集合タンパク分子が自己集合配列及び追加アミノ酸を含有するとき、それは、第一のアミノ酸配列及び第二のアミノ酸配列からなるものとしてみなされるであろう。第一のアミノ酸配列は、タンパク分子にその自己集合特性（及び通常、出芽するために集合する能力）を付与するもとであり、第二のアミノ配列は、ある望ましい生物学的活性を付与するであろう。第二のアミノ酸配列の生物学的活性の例には、病的因子に対する特異的免疫応答の誘発のための抗原性、酵素活性及び細胞障害活性がある。第二のアミノ酸配列は、ウィルス、細菌、菌類及び原性動物起源のタンパクを含む病的因子に由来した何れかのタンパクに対する抗原性を粒子に付与するであろう。第二のアミノ酸配列は、（例えばウィルスの）感染性疾患のような疾患の発症又は進行を減少するか又は防ぐ免疫応答の誘導において重要な役割を果たすことが論証されてきた配列に対して、実質的に相同であるのが理想的であろう。例えば、Ｈ［Ｖ−１ｇｐ１２０の第三可変ドメインは、ＨＩＶ−１の優性を中和する決定基であることが論証されてきた。従って、好ましい第二のアミノ酸配列は、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の第三可変ドメインに対して実質的に相同であろう。

しかしなから、自己集合タンパク分子は、（あったとしたも）修飾されているか、又は少なくともその自己集合部分が、一般的に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％あるいは９５％までも天然のタンパクと相同性を有するであろう。

自己集合タンパクをコードする核酸は、例えば（約０．９モルの塩溶液中で約３５°Ｃ〜６５°Ｃのような）ストリンジェント条件下で、天然の自己集合タンパクをコードする核酸とハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｓｅ）　Ｌ／てもよい（又は遺伝暗号の縮退のためではなくそうなるであろう）。

この発明による粒子のコア集合体において用いられる自己集合タンパク分子は、通常、全て互いに同じものであろう。しかしながら、それらが粒子形成能力を失わないように互いに十分に適合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）である限りは、異なるタンパク分子を用いることができる。

この発明による粒子は、自己集合タンパクのコア集合体を少なくとも部分的に被覆する脂質二重層も含有する。一般的に、脂質二重層は、集合体が集められる、及び／又は自己集合タンパクの合成が行われた細胞の膜（通常原形質膜であり、おそらく小胞体、ゴルジ装置又は核層ではない）に由来するであろう。

その素質（ｎａｔｕｒｅ）は、特に臨界的（ｃｒｉｔｉｃａｌ）であるとは信じられず、同様に、この発明による粒子は、以下で論じられるように、広くいろいろな細胞において産生されることができる。しかしながら、一般的なこととして、天然の脂質二重層はリン脂質の群の二重層からなり、これは、この発明の粒子における脂質の素質に影響を及ぼす傾向にあるであろう。脂質の存在は、粒子に対して、それが自己集合タンパクのみから構成された場合よりも大きい、かつ／又は広い免疫原特性を十分に付与するであろう。

この発明による粒子においては、脂質が、実質上完全にコア集合体を被覆するのが好ましい。この好ましいものからのいくらかの逸脱が許容され、例えばタンパクが脂質エンベロープを通して突出するならば優利であろう。しかしながら、あるかもしれないそのような非連続性は、通常重要ではない。脂質の孤立したパッチでまだらになったコア集合体からなる粒子は、好ましくない。

上記で論じたように、自己集合タンパク分子は、種々の生物学的活性を仲介するために修飾されてもよい。しかしながら、この発明による粒子は、非常に大きな柔軟性のために、それらが、少なくとも部分的にコア集合体を被覆する脂質に第三の成分として膜結合成分を導入する点で、大きな利点を育している。

膜結合成分は、膜（例えば原形質膜）局在及び／又は保持シグナルからなる（換言すれば、構成されるか又は含有する）であろう。このようなシグナルは、一般的に、特性に関して及び粒子の脂質成分と親和性を有する目的で、（ヒト又は自然界のどちらかによって）選択されたアミノ酸の配列であろう。

膜結合成分は粒子形成成分と融合することができ、それは、これらの成分の両方ともが、この発明において最も広く、分離タンパクよりもむしろ成分として言及された１つの理由である。

しかしながら、この発明の好ましい具体例では、粒子形成成分及び膜結合成分は分離タンパクである。膜結合成分の以下の議論は、主にそれが分離分子である場合について言及するが、その議論は、別の場合に対して類似に適用すると理解されるべきである。

膜結合タンパクが自己集合タンパクに関して異種である場合には、この発明は、天然の自己集合タンパク及びその自律的に結合した天然の膜結合タンパクを含有する粒子以外の粒子に指向される。同じ源由来の自己集合タンパク及び膜結合タンパクを含有するが、そのタンパクの１もしくはそれ以上が天然の物質から修飾される粒子も、いくつかの具体例において、よりわずかではあるが好ましい。

好ましい膜結合タンパクは、粒子に追加の生物学的特性を付与する。これらの特性には、免疫能力（又は改良された、もしくは部分的に変えられた免疫能力）を膜タンパクに付与すること；部位特異的ターゲティング能力；フソゲン特性（Ｆｕｓｏｇｅｎ　ｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）　；結合もしくはパッケージング活性；酵素活性；細胞障害性；医薬活性；及び／又は核酸結合活性がある。

膜結合タンパクが、その免疫学的特性のために含まれるならば、それは、ウィルス、細菌、菌類及び原生動物を含む何れかの病原微生物のタンパクからの配列であるか又はその配列を含むであろう。好ましい膜結合タンパクには、インフルエンザウィルス赤血球凝集素タンパク及びＨ［Ｖ−１を含むレトロウィルスのｅｎｖ白来白シタンパクむ、ウィルスの（又はウィルスと相同の）それらがある。

他の好ましい具体例では、膜結合タンパクは、特定された細胞又は分子に結合する特性を粒子に付与するであろう。細胞は、免疫系のものであってもよく、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）を含んでもよい。この構造においては、より多くの割合の投与された物質が免疫系の細胞によってとり込まれるので、与えられた投薬量の抗原によって、液性及び細胞性の両方の増強された免疫応答が誘導されることが期待される。この理由のために含有されるときには、好ましいタンパクには、抗体分子と同様に、ＣＤ４；ＣＤ８、ＩＣＡＭ−１，ＩＣＪＡ−２，ＶＣＡＭ及びアジュバンティング／ターゲティング分子８Ｂ＋／８７　（そのリガンド又はＣＤ２Ｂ＞のような白血球−内皮及び／又は白血球−白血球相互作用に関連した分子；又は免疫系の細胞に対して特異性を有する抗体分子の活性フラグメントのような他の特異的結合分子がある。他の適当なタンパクは、Ｔ細胞リガンドであるＣＤ４に結合するＨＩＶ−１のｇｐ１６０のようなウィルス起源のものであろう。

他の細胞型も膜結合タンパクによって標的にされてもよい。

例えば、インフルエンザ赤血球凝集素は、表面上にシアル酸を持つ細胞に対して粒子を標的設定するであろう。腫瘍特異抗原に対するリガンドは、適当な腫瘍に対して粒子を標的設定するであろう。

細胞に対して標的設定されることに加えて、又はそのかわりに、膜結合タンパクは、抗体もしくはレセプターのような特異分子、又はレトロウィルスのようなウィルスに対してまでも標的設定されてもよい。

好ましいフソゲン分子（Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）には、Ｈ［Ｖ−ｉｇｐ４１、インフルエンザ赤血球凝集素、水庖性ロ内炎つィルスＧタンパク（ＶＳＶ−Ｇ）、センダイウィルス融合因子（Ｆ）及びセムリキ森林熱ウィルスの糖タンパクのいくつか又は全配列を含有するそれらのようなウィルス起源のものがある。フソゲン活性（Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を持たない粒子は、エンドサイト−シスによってとり込まれ、リゾソーム内に導入されるようになることが予想される。粒子にフソゲン特性を付与することによって、粒子形成タンパクは細胞質内に直接的に輸送されるであろう。

細胞質内への直接的な輸送が、粒子を構成するタンパクに対して誘導された免疫応答のスペクトルを部分的に変更すると予想される。粒子形成タンパクが酵素又は毒素の融合タンパクであるならば、細胞質内への輸送は、リソソームによる酵簀又は中毒活性の低下を防ぐであろう。同様に、生物学的に活性なＲＮＡの輸送によって、リゾチームを避けることが可能になるであろう。

ある具体例では、粒子は、粒子形成タンパクと膜結合タンパクが共同発現される細胞から出芽する間に、その本来の構造の中に膜結合タンパクを得る。他の具体例では、膜結合タンパクは、膜結合タンパクと粒子形成タンパクの間の相互作用を増強しうる、そのＣ末端配列でコード化するために修飾されることができる。

例えば、膜結合タンパクの膜及び／又は細胞質ドメインは、組換えＤＮＡ技術によって、粒子形成タンパクが由来するウィルスのエンベロープタンパクの膜及び／又は細胞質ドメインの配列に部分的に変更されるであろう。多くの場合、レトロウィルスのＧＡＧタンパクとその同種のエンベロープタンパクの間の特異的な相互作用があり、この相互作用は、キメラ膜タンパク（ｃｈｉｍｅｒｊｃ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の特性であろうと予想される。このような相互作用によって、膜結合タンパクは、粒子中により有効に導入されるであろう。例えば、粒子形成タンパクが）ＩＩＶ−１のＧＡＧタンパクであり、かつ膜結合タンパクが少なくともいくつかのＶＣＡＭの特性を有するならば、ＨｒＶ−１ｇｐ４１のＣ末端でＶＣＡＭのＣ末端を置換するのが有利であろう。

この発明において作用な膜結合タンパク成分は、天然のタンパクと同じであってもよく、又は天然のタンパクに関して修飾されてもよい。

しかしながら、膜結合タンパク成分は、あったとしても修飾されるか、又は少なくともその膜結合部分が、一般的に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％又は９５％までも天然のタンパクと相同性を有するであろう。膜結合タンパクをコードする核酸は、例えば（約０．９モルの塩溶液中で約３５℃〜６５゛Ｃのような）ストリンジェント条件下で、天然の膜結合タンパクをコードする核酸とハイブリッド形成してもよい（又は遺伝暗号の縮退のためではなくそうなるであろう）。

この発明のより広く表わされた範囲の具体例においては、粒子形成タンパク及び膜結合タンパクは、それらが互いに有効にパッケージングされるように選択されるか、又はそれらのどちら一方もしくは両方が、それらが互いに存効にパッケージングされるように修飾されるであろう。これは、より良好な免疫原性、上昇された結合活性及び／又は改良されたターゲティングがより有効なパッケージングから十分に生じるように、粒子が免疫目的のために意図されるとき、特に作用であろう。

膜結合タンパクは、酵素活性及び／又は細胞障害活性を粒子に付与してもよい。

これらの活性のどちらか一方もしくは両方は、何れか他の医薬活性のように、ヒトもしくは獣医の治療又は診断において作用であろう。分子ＢＢＩによって示されるようなＴＩＢ胞増殖活性は、別の例である。

この発明が、粒子中に膜結合タンパクの単一の集団を有するごとに限定されないことは、高く評価されるであろう。実際に、例えば部位特異的ターゲティング能カを付与するタンパク及び細胞毒性のあるタンパクを有することは、十分に有利であろう。

このような二重の集団を存する粒子は、「魔法の弾丸（ＩＩｌａｇｉｃ　ｂｕｌｌｅｔｓ）　Ｊのような例を与えるために有用であり、この手段によって、細胞障害活性は、腫瘍細胞又は感染をおこしている細胞に正確に輸送されることができる。別の例は、特別な群の細胞に対して作用を有するタンパクを、それらの細胞に有効に輸送することであり、上述のようなＴ細胞に対して増殖作用を有するＢＢＩは、リンパ球特異性を有するＶＣＡＭのようなタンノ（りの手段によって、改良された効率でＴ細胞に輸送されることができる。

天然の膜結合タンパクは、多くの場合自然に、ｌ又はそれ以上の上記の生物学的活性、又はさらに何れか他の生物学的活性を育するであろう。このようなタンノくりは、その理由のために、この発明の粒子に用いるために選択されてもよい。

しかじな力（ら、この発明は、それらの用途に限定されない。膜に結合する能力を有するタンパクは、追加の生物学的活性を有するよう（こ修飾されてもよく、すでに望ましい活性を有するタンノくりが、膜に結合するように修飾されてもよい。最も大きし１柔軟性のために、膜結合活性を有する第一のアミノ酸配列及び望ましし）生物学的活性を存する第二のアミノ酸配列からなるタンノ々クカ（調製されるであろう。第二のアミノ酸配列は、天然のタンノ（りの少なくとも一部と同一であってもよいが、そうでなくてもよし１゜相同もしくは類似の天然のタンパ八又は完全に人工の配列までも、活性が適当である限りは用いられてもよい。

この発明において有用な膜結合タンノ（りは、上記のｉ己集合タンパク分子の任意の第二のアミノ酸配列に関して、別にもしくはその上、上記の何れかの特性もしくは特徴を有するであろう。

この発明の粒子の成分に対するいくつかの異なる特徴がここで記載されてきたが、与えられた例は、余すところなく述べたものであるというよりもむしろ例証となるものであると理解されるべきである。この発明の利点の１つは、それが粒子の特性に関して提供する大きな柔軟性である。

上記で論じたこの発明の粒子の成分は、しばしばそれが好ましいけれども、必ずしも単一の成分であることを意図していない。この発明の意図した適用に依存して、望まれるような他の成分を与えることができる。

この発明の粒子は、複製能を持つレトロウィルスの存在を必要としない方法で、組換えＤＮＡ技術の手段によって調製することができる。

この発明の第二の観点によれば、（ａ）自己集合することができ、かつ生じた集合体が宿主細胞から出芽することができ、それによって少なくとも部分的な脂質のエンベロープを得ることができるタンパク分子及び（ｂ）膜結合タンパク配列を、宿主細胞において共同発現することからなるタンパク性の脂質含有粒子を調製する方法が提供される。

一般的に、膜結合タンパクは、コア集合体が宿主細胞からの出芽に基づいて脂質を得るとき、この発明の粒子に結合するようになる。粒子を包囲する脂質膜は、活性形態におけｇ膜結合タンパクを含有することが示されてきた。単なる２つの必須のタンパクを発現するための組換えＤＮＡ技術の使用は、これらの構造の合成におしνて、複製能を持つレトロウィルスを不必要にする。

発現は、一般的には動物起源のものである適当な宿主細胞で行われるであろう。

スボドブテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属、特にスボドブテラ　フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のそれのような昆虫細胞もあるかもしれないが、哺乳動物細胞は適当な宿主細胞を形成するであろう。発現系は、宿主細胞として適当であるように選択されるであろう。昆虫細胞としては、組換えノくキュロウイルスに関連したバキュロウィルス発現系が好ましい。

バキュロウィルス多角体プロモーター（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）は、好ましいプロモーターであるが、他のプロモーターが、必要なもの又は望ましいものとして用いられてもよい。脂質によって被覆された粒子への最大効率の膜結合タンパクの導入が起こることを保証するために、自己集合及び膜結合タンパクの発現は、異なる時間の制御下にあるであろう。

自己集合タンパク及び膜結合タンパクは、同じかもしくは異なるプロモーターの制御下で発現されるであろう。一般的に、各々は、発現するための共通のプロモーターの使用（例えば、任意に続いて、自己集合タンパク及び膜結合タンノくりに結合される単一の融合タンパクは、十分にこの発明によって予期される可能性の範囲内である）を除いて、例えば上記で論じたような各々のプロモーターの制御下で発現されるであろう。

最初に発現された自己集合タンパクは直ちに自己集合することができないので、自己集合が行われる前に、いくらかの修飾もしくは他の事象（特に第二の分子の発現）が必要とされることは、高く評価されるであろう。同様に、膜結合タンパクが実際に膜に結合するようになる前に、いくらかの修飾もしくは他の事象が必要とされるであろう。しかし、それは、この発明の作用にも「膜結合」という言葉の意味にも影響を及ぼさない。

上記の方法において有用なベクター及び宿主細胞は、それ自体この発明の一部を形成する。

この発明の第三の観点によれば、第−及び第二の暗号配列からなり、第一の暗号配列（ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）が、脂質によって被覆された粒子を形成するために、動物細胞から順番に出芽することができるタンパクの集合体に自己集合することができるタンパク成分をコード化し、かつ第二の暗号配列が、膜結合タンパク成分をコード化し、該暗号配列が、任意に各々、異種プロモーターに効果的に連結される動物細胞発現ベクターが提供される。

この発明の第四の観点によれば、（ａ）脂質によって被覆された粒子を形成するために、動物細胞から順番に出芽することができるタンパクの集合体に自己集合することができるタンノくり成分をコード化する暗号配列（該暗号配列は、異種プロモーターに効果的に連結される）を有する第一のベクター、及び（ｂ）腹合タンパク成分をコード化する暗号配列（該暗号配列は、異種プロモーターに効果的に連結される）を有する第二のベクターからなる動物細胞発現ベクターのセットが提供される。

この発明の第五の観点によれば、上記のような発現ベクター又は発現ベクターのセットからなる宿主細胞が提供される。

上記のように産生された粒子は、一般的には、実質的に純粋であろう。粒子の精製が、その化学的及び／又は物理的特性によってなされてもより。

この発明の粒子には多くの用途がある。いくつかの用途が、自己集合タンパク又は膜結合タンパク又は両方の特性に関連して上記された。実際に、この発明の粒子がなしつる用途は、それらの２つの役割のために選択されたタンパクの特性に依存して広範囲に至るであろう。多くの用途は、（ヒト又は動物のどちらかのための）治療又は診断であろう。従って、第六の観点において、この発明は、上記のような粒子と適当な担体からなる医薬又は診断用組成物を提供する。

１つの主な医薬用途は、ワクチンの＃ｌＩ製にあり、その特別な形態の医薬製剤は、この発明が達するものであり、一般的には無菌であろう。第一に、この発明のワクチンは、あらゆる感染症、しかしながら仲介された（例えばウィルス、細菌又は原生動物起源のもの）感染症の治療又は予防に用いられるであろう。

ワクチンは、粒子の成分が十分なアジュバント様作用を有することが認められているけれども、ｌ又はそれ以上の適当なアジュバント及び／又は他の賦形剤を含有してもよい。

この発明による粒子は、診断目的のためにも用いられるであろう。粒子は、検出可能に標識されてもよい。この発明によって提供される１つの柔軟性は、何れかの又は全ての成分が、放射性核種、スピンラベル又は何れか他の検出可能な標識の何れかで標識されてもよいことである。

先に指摘したように、この発明の粒子の他の有用性には、（ｍ胞障害性及び／又は酵素タンパクのような）タンパク、あるいは（リボザイム、アンチセンスＲＮ＾、ＲＮエース（ＲＮＡｓｅｓ）又はＤＮＡもしくはｍＲＮＡ配列のような）核酸のための輸送システム；細胞質輸送のためのフソゲンシステム（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ　５ｙｓｔｅ＋ｓ＋ｓ）；及び他のシステムがある。

この発明の全観点の好ましい特徴は、一般的に上記のようである。

この発明は、添付の図面を参照して、以下の実施例によって例証されるであろう。

図１は、プラスミドρ０ＧＳＩ５の構造の概略図である。

図２は、抗ｐ２４モノクロナール抗体を用いて展開されたウェスタンプロットである。印Ａ）はρ５５′ｌを発現する組換えバキュロウィルスでスボドブテラ　フルジベルダ細胞を感染した後の細胞ベレット（ｃｅｌｌ　ｐｅｌｌｅｔ）である。印Ｂ）は、ρ５５″ｓ１を発現する組換えバキュロウィルスで感染されたスボドブテラフルジベルダ細胞の培養上清である。

図３は、ｐ５５１ゝ１を発現する組換えバキュロウィルスで感染されたスボドブテラ　フルジペルダ細胞の薄切切片の電子顕微鏡写真である。

図４は、インフルエンザ赤血球凝集素を発現する組−えバキュロウィルスで感染されたスボドブテラ　フルジベルダ細胞のウェスタンプロットを示す（用いられた抗体は、ナショナルインスチチュート　オブ　バイオロジカル　スタンダードアンド　コントロール（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）から得られたＲ３５５　ａ　Ａ／ＰＲ／８ＨＡであった）。

図５は、インフルエンザ赤血球凝集素を発現する組換えバキュロウィルスで感染され、ウサギ抗ＨＡ及びＰＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギつｇＧ抗体で処理されたスボドブテラ　フルジペルダ細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。

図６は、インフルエンザ赤血球凝集素及び９５５“°１を発現する組換えバキュロウィルスで共同感染されたスボドブテラ　フルジペルダ細胞の培養上清の不連続ショ糖密度匂配から回収された粒子のウェスタンプロットを示す。ａ）は抗ｐ２４抗体を用いた結果を示す。ｂ）は抗赤血球凝集素抗体を用いた結果を示す。

図７は、ｐ５５”’及びインフルエンザＨＡを発現する組換えバキュロウィルスで共同感染されたスボドブテラ　フルジベルダ細胞の薄切切片の電子顕微鏡写真である。

図８は、ａ）ｐ５５’°１を発現する組換えバキュロウィルスで感染されたスボドブテラ　フルジベルダ細胞、ｂ）ｐ５５”’及び赤血球凝集素を発現する組換えバキュロウィルスで共同感染されたスボドブテラ　フルジペルダ細胞からの培養上清の不連続ショ糖密度匂配から回収された粒子を用いて行われた赤血球凝集反応分析（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）の写真を示す。

図９は、抗ｐ２４モノクロナール抗体を用いて展開された、ひな赤血球ゴースト（ｃｈｉｃｋ　ｒｅｄ　ｃｅｌｌ　ｇｈｏｓｔｓ）に吸着された９５５″６′粒子及びｐｓｓ’　＠’粒子／赤血球凝集素粒子のウェスタンプロットを示す。Ｕ）で記されたレーンは未吸着の物質に対応し、ｐ）で記されたレーンは赤血球ゴーストベレットに対応し、Ｓ）で記されたレーンは赤血球に粒子が吸着した後の上清に対応する。

図１０は、抗ρ２４モノクロナール抗体を用いて展開された、抗赤血球凝集素抗血清（Ｆ７／８０／αＡ／ＰＲ／８）の欠如下（レーン１）又は存在下（レーン２）におけるひな赤血球に吸着された９５５′１″赤血球凝集素ウィルス様粒子のウェスタンプロットを示す。

図１１は、ヒトｒｃＡＭ−１を発現する組換えバキュロウィルス（Ａｃ０ＧＳ７４０）で感染され、かつマウス抗ＩＣＡＭ−１モノクロナール抗体及びＦｒＴＣ標識ヤギ抗マウス［ｇＧ抗体で処理されたスボドブテラフルジベルダ昆虫細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。

図１２は、ヒトＶＣＡＭ及びＶＣＡＭ／　ｇρ４１キメラ分子を発現するために着手した操作の要約を示す。

図１３は、ヒトｖＣＡＭを発現する組換えバキュロウィルス（Ａｃ０ＧＳ７４０）で感染され、かつマウス抗ＶＣＡＭモノクロナール抗体及びＦＩＴＣ［識ヤギ抗マスウ■ｇＧ抗体で処理されたスボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。

図１４は、ヒトＶＣＡＭ及びＨ［Ｖ−１ｇａｇを共同発現する組換えバキュロウィルス（Ａｃ０ＧＳ７４０）で感染され、かつマウス抗ＶＣＡＭモノクロナール抗体及びＰＩＴＣ標識ヤ標識ヤギ抗マウス１休Ｇ抗理されたスボドブテラ　フルジベルダ昆虫細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。

図１５は、Ａｃ０ＧＳ７４０によって感染された昆虫細胞の細胞ライセードに関するウェスタンプロット分析を示す。プロットは、抗ｐ２４モノクロナール抗体（Ａ）、又はポリクロナール抗ヒトＶＣＡＭ抗血清（Ｂ）のどちらかを用いて展開された。旧Ｖ−１ｐ５５”’及びヒトＶＣＡＭの両方の共同発現が確認される。

図１６は、３７°Ｃ（上のパネル）又は４°Ｃ（下の）（ネル）の両方で粘着性のＡｃ０ＧＳ７４０によって感染された昆虫細胞に結合したＵ９３７細胞のロゼツトの写真を示す。

図１７は、ｐＨ５，５でインキュベートされたＡｃＶＳＶ−Ｇによって感染された昆虫細胞（上のパネル）における融合体（ｓｙｎｃｙｔｉａ）の展開を示す。

比較のために、ｐＨ５，５に保持されたＡｃＮＰＶによって感染された細胞（下のパネル）も含まれている。

図１８は、ＶＳＶ−Ｇタンパクを共同発現する細胞から単離されたｐ５５″１１粒子の５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンプロ・ノド分析を示す。

パネルＡはコーマッシー　ブリリアント　ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓ　１ｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）で染色されたタンノくクゲルを表わし、ｐ５５”ｇ及びＶＳＶ−Ｇタンパクが共に精製されていることを立証してし）る。これらのタンパクが確実なものであることは、抗ｐ２４モノクロナール抗体（パネルＢ）又は抗ｖＳ■抗血清〔ストラテ・ツクサイエンティフィック社（Ｓｔｒａｔｅｃｈ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＬＴＤ）　）　Ｃｔ＜ネルＣ）を用いて展開されたウェスタンプロット分析によって提供される。

図１９ｔ４、ｐ５５”’　／ＶＳＶ−Ｇ粒子を吸着し、ＶＳＶ−Ｇ　（７）　７　／ゲン活性を誘発するために低ｐＨメディウムに短時間暴露した後の昆虫細胞における融合の展開を示す（上のパネル）。ｐ５５”“粒子は、昆虫細胞において融合体形成を誘発しない（下の）くネル）。

図２０は、ｐＯＧｓ５５４の構造における配列の詳細を示す。

図２１は、ｐＯＧｓ５５４　、ｐＯＧｓ５５５　、ｐＯＧｓ５６２及びｐＯＧｓ５６３の構造の概略図である。

図２２は、ｐＯＧｓ５６２の構造における配列の詳細を示す。

図２３は、一般的な目的のバキュロウィルス発現ベクターｐＡｃＲＰ２３の概略図である。

図２４は、野生型バキュロウィルスＡｃＮＰＶ　、ＡｃＫｌｇａｇ　（完全長ＧＡＧ）又はＡｃ０ＧＳ５５６　（完全長ＧＡＧ／ＧＰＧＲループ）で感染された昆虫細胞からの抽出物のウェスタンプロットを示す。ａ）は抗ＧＡＧモノクロナール抗体を用いた結果を示し、ｂ）は抗ＧＰＧＲモノクロナール抗体を用いた結果を示す。

図２５は、ＡｃＫｌｇａｇ　（完全長ＧＡＧ）で感染された昆虫細胞の薄切切片の電子顕微鏡写真である。

図２６は、ＡｃＫｌｇａｇで感染された昆虫細胞から出芽する完全長ＧＡＧ粒子の電子顕微鏡写真である。

図２７は、ＡｃＫｌｇａｇで感染された昆虫細胞から出芽した後の完全長ＧＡＧ粒子の電子顕微鏡写真である。

図２８は、Ａｃ０ＧＳ５５６　（完全長ＧＡＧ／ＧＰＧＲループ）で感染された昆虫細胞の薄切切片の電子顕微鏡写真である。

図２９は、Ａｃ０ＧＳ５５６　（完全長ＧＡＧ／ＧＰＧＲループ）で感染された昆虫細胞の核において見られた半粒子構造の電子顕微鏡写真である。

図３０は、野生型バキュロウィルスＡｃＮＰＶ　、Ａｃ０ＧＳ５７２　（切形ＧＡＧ）又はＡｃ０ＧＳ５７４　（切形ＧＡＧ／ＧＰＧＲループ）で感染された昆虫細胞からの抽出物のウェスタンプロットを示す。ａ）は抗ＧＡＧモノクロナール抗体を用いた結果を示し、ｂ）は抗ＧＰＧＲモノクロナール抗体を用いた結果を示す。

図３１は、Ａｃ０ＧＳ５７２　（切形ＧＡＧ）で感染された昆虫細胞の薄切切片の電子顕微鏡写真である。

図３２は、Ａｃ０ＧＳ５７２で感染された昆虫細胞から出芽する切形ＧＡＧ粒子の電子顕微鏡写真である。

図３３は、　Ａｃ０ＧＳ５５６で感染された昆虫細胞から出芽した後の切形ＧＡＧ粒子の電子顕微鏡写真である。

図３４は、Ａｃ０ＧＳ５７４　（切形にＡＧ／ＧＰＧＲループ）で感染された昆虫細胞の薄切切片の電子顕微鏡写真である。

図３５は、Ａｃ０ＧＳ５７４で感染された昆虫細胞の核におけるノ＼イブリッドＧＡＧ：ＧＰＧＲループ粒子の電子顕微鏡写真である。

図３６は、Ａｃ１１ＧＳ５７４で感染された昆虫細胞から出芽するノ１イフ′リッドＧＡＧ：ＧＰＧＲループ粒子の１１ＬそＲ微鏡写真である。

文婢−例−１−５使用しｔ、−大腸菌株は、ＨＷ８７（ａｒａＤ１３９、（ａｒａ−１ｅｕＭｅｌ　７６９７、（ｌａｅＩＰＯＺＹ’）ｄｅｌ１７４、ｇａｌｌ、、ｇａに、ｈｓｄＬ　ｒｐｓＬ、、ｓｒｌ　、、ｒｅｃＡ５６）であ１．ｔ、−６、二の菌株の使用は必須ではなく、当業者は、他の菌株が容易に代用されうることを高く評価するであろう。大腸菌メディア（ｍｅｄｉａ）は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）　（ミラー、１９７２、［エクスペリメンツ　イン　モレキュラー　ゲネテイクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　Ｊ　、Ｃ５）ｌ　ｐ４３３）　ｆこ従って調製された。大腸菌は、標準法〔マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２、「モレキュラー　クローニングーア　ラボラトリ−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ　、ＣＳＨｐ１９９）を用いて形質転換された。

標準手順が、制限消化及びプラスミド構造のために用いられた（マニアティスら、１９８２　前記）。供給者の指示に従って、制限酵素及びＴ４　ＤＮＡリガーゼが用いられた。

準備として、シナウド（Ｃｈｉｎａａｌｔ）及びカーボン（Ｃａｒｂｏｎ）　（シナウド及びカーホン、１９７９　ジン（Ｇｅｎｅ）　５．１１１　）によって記載されたように、かつホルムス（Ｈｏｌｍｅｓ）及びキグレイ（Ｑｕｉｇｌｅｙ）の方法〔ホルムス及びキグレイ、１９８１、アナル、バイオケム（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１４．１９３　）による迅速分析のために、プラスミドＤＮＡが大腸菌から単離された。

ＨＩＶ−１ｇａｇ構造は、ｐＯＧｓ２から由来した。プラスミドｐＯＧｓ２は、５ｓｔｌ−Ｂｃｌｌ制限フラグメントとしてプラスミドｐＳＰ６４　（プロ、メガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｃｐ））中に挿入された、ＨＹＶ−１（分離株ＢＨＩＯ）のヌクレオチド６７８−２４７０を含有する。

ｇａｇ遺伝子は、ヌクレオチド７９０−２３２８によってコード化される。適当なりａｍＨＥフラグメントに対してｇａｇ遺伝子を提供するために、ｐＯＧｓ２が、Ｂａ１３１エクソヌクレアーゼ及びＢａｍＨ［リンカ−を用いて以下のように修飾された。ｇａｇフラグメントの３′末端を修飾するために、プラスミドｐＯＧｓ２は、５ａｉｌで切断され、Ｂａ１３１エクソヌクレアーゼを用いて種々の時間消化され、過剰のＢａｍＨ［リンカ−（ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）の存在下で再結合された。生じたプラスミドの欠失した末端部（ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｅｎｄ　ｐｏｉｎｔｓ）は、ＤＮ＾配列決定法によって決定された。プラスミドｐＯＧｓ１１は、そのＢａｍＨｆ部位がｇａｇ終止コドンに関して＋４９の位置にある欠失派生物（ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）である。ｇａｇフラグメントの５゛末端を修飾するために、ｐＯＧｓ２は、ＥｃｏＲ［で切断され、Ｂａ１３１　エクソヌクレアーゼを用いて種々の時間消化され、過剰のＢａｍＨＩリンカ−（ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）の存在下で再結合された。欠失した末端部は、ＤＮＡ配列決定法によって決定された。プラスミドｐＯＧｓＩ２は、そのＲａｍ）１１部位がｇａｇ開始ＡＴＧコドンに関して−２２の位１にある欠失派生物である。Ｂａｍ旧部位が側面に位置したｇａｇ遺伝子を提供するために、ｐＯＧｓ１２におけるｇａｇ遺伝子の３゛末端が、修飾された配列を含むρ０ＧＳＩＩからのＢｇｌ　ＩＩ−Ｂｇｌ　［フラグメントで置換された。生じたプラスミドは、消化されたｐＯＧｓ１５であった（図１参照）。

完全なｇａｇ暗号配列が、ＢａｍＨ［カセットとしてｐＯＧｓ１５から摘出され、ｐＡｃＫｌｇａｇを誘導するためにバキュロウィルス発現ベクターｐＡｃＲＰ２３にクローニングされた。ベクターｐＡｃＲＰ２３は、／％イコビーナンバー細菌プラスミド（ｈｉｇｈ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｌａｓｍｉｄ）（ｐＵｃ８）に、オートグラファ　カリフオルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多面体ウィルスの多面体遺伝子を包囲する制限フラグメント（ＥｃｏＲ［−υをクローニングすることによって、イギリス、オックフオードのザ　インスチチュート　オブヴイロロジー　アンド　エンバイロメンタル　ミクロバイオロジー（Ｔｈｅ　１ｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｖｅｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏｇｙ）で作製された。外来遺伝子の挿入ために、多面体遺伝子の一部は、欠失され、独特の制限酵素部位（ＢａｍＨ）によって置換された〔バキュロウィルス発現ベクターの詳細として、マツウラら、１９８７、ジェイ、ジン、ゲイロール、　（Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ）６８．１２３３−１２５０参照）。このベクターにクローニングしたとき、ｇａｇ遺伝子は非常に強力な多面体プロモーターに制御された状態になる。

公的に入手可能であり、鱗翅類系［ＰＬＢ−３ｆ２１−ＡＨ（ヴアウン。

９ｓイ、エル、　（Ｖａｕｇｈｎｊ、Ｌ、）ら、１９７７、インビトロ　１３．２１３−２１７３のクローニングした派生物（ｃｌｏｎａｌ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）であるスボドブテラ　フルジベルダ　９　（ｓｆ９）で示された細胞系〔サマース、エム、ディー、（Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｍ、　Ｄ、　）及びスミス、ジー。

イー、　（ＳＩｌｌｉｔｈ、Ｇ、ε、）、１９８７、テキサス　アグリ力ルチュラルエクスベリメント　ステーション　ブレチン（Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、１５５５番〕が、全実験のために用いられた。これは、熱によって不活性化された１０％のウシ胎児血清〔アイシーエヌーフローラボラトリーズ（［ＣＮ−ＦＬＯＷＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、イギリス〕に加えて　５０［Ｕ／ｒ！ｄ！のペニシリン及び５０■／−のストレプトマイシン〔ギブコーピーアールエル（ＧｒＢＣＯ−ＢＲＬ）　、イギリス〕を合作するＴＣｌｏｏ　（ギブコーピーアールエル、イギリス）からなるメディウムでの懸濁培養で増殖した。

組換えバキュロウィルスは、相同性ＤＮＡ配列間でのインビトロ組換えの現象を用いることによって調製された。ウィルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡ（ｐＡｃＫｌｇａｇ）は、塩化カルシウム沈降法によってスボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞中に導入され、後代は、４８時間後に回収された（サマース、エム、ディー、及びスミス、ジー、イー、　、１９８７、テキサス　アグリカルチュラル　エクスペリメント　ステーション　ブレチン　１５５５番）。（ＡｃＫ１−ＧＡＧで示された）組換えバキュロウィルスは、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）及びフォルフナ−（Ｐａｕ　１ｋｎｅｔ）の手順に従って、その多面体ネガティブの遺伝表現型に基づいて選択された〔ブラウン、エム、　（Ｂｒｏｗｎ、Ｍ、）及びフオルクナー、ビー、　（Ｆａｕｌｋｎｅｒ、Ｐ、）　、１９７７、ジェイ、ジン、ゲイロール１．３６．３６１−３６４　）　。

プラーク精製後、Ｈ＋Ｖ−１ｇａｇの発現をコード化する組換えノくキュロウイルスの高力価ウィルス株が調製され、その力価がプラーク分析で決定された（力価は、５ＸｌＯ’プラ一ク形成単位／ｄを超えていた）。

スポドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞がＡｃＫ１ｇａｇ組換えノくキュロウイルスで感染されたとき、ｐ５５１・１ポリペプチドは、感染された細胞において発現され、抗ｐ２４モノクロナール抗体を用いるウェスタンブロッティングにより検出することができた（図１参照）。ｐ５５′“′は培養上清に蓄積するので、ｐ５５”′が原形質膜に輸送され、そこで細胞から放出されることが明白である（図２）。ＡｃＫ１−ＧＡＧ感染細胞の電子顕微鏡写真は、ｐ５５１０の放出が細胞膜から出芽する粒子の形成のためであることを示すＣ図３及びゲイセンら、１９８９、セル５９．１０３−１１２　）。

遺伝子を発現する組換えバキュロウィルスは、前にポジー（Ｐａｓｓｅｅ）によって用いられたものであった〔ポジー、１９８６、ヴイールス　リサーチ（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　５．４３−５９　）　、また、このライ　ルス（ＡｃＰＲｌＢ、　ＨＡで示される）の高力価ウィルス株が調製された。ナショナル　インスチチュート　オブ　バイオロジカル　スタンダード　アンド　コントロールによって提供された抗赤血球凝集素血清を用いるウェスタンブロッティングにより、組換えバキュロウィルスＡｃＲＰ１８．　ＨＡで感染されたスボドブテラ　フルジベルダ細胞における赤血球凝集素の発現が確認された（図４）、１：５０の希釈での抗）ＩＡ（ｅｘ−ＮＩＢＳＣ）及びＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギつｇＧ　（シグマ、プール（Ｐｏｏｌｅ）　、イギリス〕を用いるＡｃＰＲｌＢ、　８Ａで感染されたスボドブテラ　フルジペルダ細胞の蛍光抗体法は、原形質膜に位置されるＨＡと一致した染色パターンを与えた（図５）。これは、ＡｃＰＲｌＢ、　ＨＡによって感染された細胞で産生された組換えＨＡが、自然感染におけるようにプロセッシングされ、輸送されることを立証する。

出芽ｐ５５”’粒子がその表面上に赤血球凝集素を得るためには、同じ細胞においてｐ５５１°′及び赤血球凝集素を発現することが必要である。これは、以下のようにして達せられた。スベドブテラ　フルジベルダ昆虫細胞を、ログ増Ｍ（ｌｏｇ　ｇｒｏｗｔｈ）に保持し、使用前に約１．５Ｘ　１０’／−の細胞密度まで増殖した。

感染前に、細胞を８分間２０°ｃ　９００ｒｐｍでスピンダウンし、培養上清を廃棄した。細胞膜たり各々のウィルスにおいて２　ｐｆｕの感染多重度が達せられるように、ＡｃＫ１−ＧＡＧ及びＡｃＰＲｌＢ、ＨＡ両方の混合物で細胞を感染した。これは、両方の外来遺伝子の必然的な発現を有する全細胞において、共同感染が確立されたことを保証した。

また、次いで、ｐ５５“″のみを発現するために、細胞当たり２プラ一ク形成単位（ｐｆｕ）の感染多重度で、細胞をＡｃＫ１−ＧＡＧで感染した。室温で１時間後、感染された細胞を前のように沈澱し、ウィルス接種原を除去した。細胞を１．５　ＸＩＯ”細胞／ｌｎＩの密度まで新しいメディウムで再懸濁し、２７° Ｃで６６時間懸濁培養しながらインキュベートした。

培養液を無菌の５０ｍ１遠心管の中に移し、細胞を沈澱するために、１０分間４ °Ｃ３Ｋｒｐｍで回転した。澄明にされた上溝を、ショ糖ステップグラジェント〔Ｔ開（１０ｍＭ）リス塩酸塩ｐＨ７，４，１ｍ１ｉｌＥＤＴＡ、　１５０ｍＭ塩化ナトリウム）中の３０％ショ糖が上層にあるＴＥＮ中の６０％シヨ糖〕に付し、２時間１０’ｃ９６０００ｇで遠心分離した。これらの遠心力下で、単量体インフルエンザ赤血球凝集素は、３０％ショ糖を通して沈降しない。対照的に、粒子と結合した赤血球凝集素は非常に増大された明白な沈降係数を有し、従って、３０％ショ糖を通して沈降するであろう。粒子を３０％／６０％シヨ糖界面から回収し、数個のグラジェントから物質をプールした後、さらに同様のショ糖ステップグラジェントで濃縮した。回収後、ショ糖を除去するために、サンプルを４°ＣでＴＥＮを用いて終夜透析した。３０％／６０％シヨ糖界面から回収された粒子のウェスタンブロッティングは、赤血球凝集素及びｐ５５１０″の両方の存在を示した（図６）。これによって、ｐ５５″１“及びインフルエンザ赤血球凝集素の粒子の素質が確認される。

共同感染された細胞の薄切切片の電子顕微鏡写真は、ＡｃＫｌ−ＧＡＧのみで感染された細胞から産生されたものと形態学的に区別がつかない出芽粒子の存在を示す（図７）。

実施例３上記実施例２における３０％／６０％界面から回収された粒子を含有する赤血球凝集素の活性が、標準赤血球凝集反応分析を用いて測定された。１日令のひな赤血球〔アルセパ−中に１０％として与えられる、セロチック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）　、イギリス〕を、５分間４°Ｃ２５０ｇで遠心分離により沈澱し、リン酸塩で緩衝化された生理食塩液ＣＰＢＳ）で３回洗浄し、その濃度をＰＢＳ中に１．０％（Ｖ／Ｖ）となるように調節した。手積製された粒子の連続した２層の希釈液を、マイクロタイタブレートを通してＰＢＳで調製し、等量の１％赤血球を加えた。５０％終末点を室温で６０分後に評価し、ＨＡ力価を終末点／ｒｎｌの逆数として計算した。図８からみることができるように、単独で発現され、上記のように精製されたときのｐ５５１°１は、赤血球凝集活性を持たず、一方それがＨＡと共同発現されたとき、その赤血球凝集力価は、１／１２８である。

これによって、粒子と結合した赤血球凝集素が活性であることが確認される。

実施例４実施例２におけるｐ５５１°１粒子と赤血球凝集素間の物理的結合が、ひな赤血球ゴーストへの赤血球凝集素によって仲介されたｐ５５””の吸着により立証された。ひな赤血球ゴーストは、低張ショック（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ　５ｈｏｃｋ）　ｌこより調製された〔スト−フェンビール（Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌ）及びラザリド（Ｌａｚａｒｉｄｅｓ）　、１９８６、ＰＮＡＳ、　８３．３１８−３２２　）。アルセパ−中に供給された細胞を上記のようにＰＢＳで３回洗浄し、最終遠心分離後、細胞ペレ・ストを、ｔｏｏ容量の冷却された（４°Ｃ）細胞溶解用緩衝液（ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ）（５ｍＭｌ−リス塩酸塩ｐＨ７，６，５ｍＭ塩化マグネシウム、１［１１Ｍ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。４°Ｃで３分インキコ、ベートした後、ゴーストを５分間４°Ｃ３００ｇで沈降し、さらに１００容量の細胞溶解用緩衝液で洗浄した。最終的に、ゴーストを、０．１％ＢＳＡを含有するＴＥＮ中に５％の濃度になるように再懸濁した。次も）で、１００μｌの部分標本を記載したように遠心分離し、上清を廃棄してサンプルと混合されうるゴーストペレットを残し７た。２μｌの５％ＢＳＡをエツペンドルフチューブ中の１００μｌのサンプル（ｐ５５・・ｌウィルス様粒子又はインフルエンザ赤血球凝集素を提示するｐ５５１°１ウィルス様粒子）に加え、工・ソペンドルフ遠心機で２分間（６０００ｇ）回転した。この１００μｌの澄明にされたサンプルを、沈澱したゴーストの部分標本に加え、２０℃で１時間インキュベートシた。次いで、混合物を５分間２０℃３００ｇで回転し、１ｔ＊ｆ（１００μ Ｎ）を除去し、１００μｌの２Ｘ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）と混合した。ペレットをＴＥＮ＋０．１％ＢＳＡ、次いでＴＥＮのみで洗浄し、最終的に、２００μｌの５ＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液に溶解した。

サンプルを１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜上にプロットした。ｇａｇタンパクの存在が、標準ウェスタンプロット分析においてＨＩＶ−１ｐ２４（デュポン、アメリカ）に対するモノクロナール抗体を用いて検出された。図９からみることができるように、粒子がＨＡを共同発現する細胞から精製されるならば、ｐ５５”’の存在はペレットにおいて検出されるだけである。これによって、ｐ５５ｔａ″を出芽することによって形成された粒子が、ｐ５５””粒子を包囲する脂質二重層において、活性形態におけるＨＡを提示していることが立証される。

ひな赤血球ゴーストに対するインフルエンザ赤血球凝集素を共同発現する細胞から精製されたｐ５５”’ウィルス様粒子の出芽か、赤血球凝集素によって仲介されたことを確認するために、赤血球凝集反応を阻害する抗血清であるＦ７／８０／αＡ／ＰＲ／８　（ナソヨナル　インキュベート　オブ　バイオロジカル　スタンダード　アンド　コントロール（イギリス）によって提供された〕の存在下で、実験を繰り返した。この抗体は赤血球ゴーストへの結合を全く妨ぎ（図１０参照）、従って、相互作用は９５５′“１粒子のエンベロープに導入された赤血球凝集素のためであることが、証明された。

実施例５ベクターｐＣＤＭｇ中に供給されたヒト［ＣＡＭ−１遺伝子は、ビービー　プロダクツ社（Ｂｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｌｔｄ）　、アビンドン（Ａｂｉｎｇｄ。

ｎ）、イギリスから得られた。これは、昆虫細胞における発現を最適化するために、実施例１で記載した標準手順を用いて操作された。これらの操作は以下に詳述される。

［ＣＡＭ−１遺伝子は、Ｅａｒ［及びＸｂａ　［で消化された後のｐＣＤＭ８から単離され、フレナラ修復（Ｋｌｅｎａｗ　ｒａｐａｊｒ）後、ｐＯＧ５７１６を誘導するために、バキュロウィルス変異誘発ベクターｐＡｃＣＬ２９．１〔リビングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）及びジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）　、　１９８９、ヌクレイツク　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　１７：２３６６　）のＳａ＋ａｆ部位に結合された。これは、ｒｃＡＭ−１遺伝子の下流のベクターポリリンカーのＢａｍＨＩ制限部位を認識した。

部位に指向した（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）変異誘発のためのクンケル法（Ｋｕｎｋｅｌ　ｍｅｔｈｏｄ）　（クンケル、１９８５、ブロク、ナトル、アカド。

サイ、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ）　、アメリカ、８２　：　４８８−４９２３が、ｐＯＧｓ７１８を誘導するために、ＩＣＡＭ−１の翻訳開始コドンの隣接した上流にＢａｍＨＩ制限部位を導入するために用いられた。現在Ｂａｍｆ（ｒカセットとして存在するＩＣＡＭ−１遺伝子を、ｐＯＧｓ７２２を誘導するために、バキュロウィルス発現ベクターｐＡｃＹＭｌ　（マツウラら、１９８７、ジエイ、ジン、ゲイロール、６８：ｌ２３３−１２５）にクローニングした。

ヒトＩＣＡＭ−１を発現する組換えバキュロウィルスを、相同性ＤＮＡ配列間のインビトロ組換えの現象を利用してｌｌＷした。

ウィルスＤＮＡ（ＡｃＲＰ２３．ＬａｃＺ　、インスチチュート　才ブ　ゲイロロジー　アンド　エンバイロメンタル　ミクロバイオロジー、オックスフォード、イギリスから得られた）及びプラスミドＤＮＡ　（ｐＯＧｓ７２２）が、リボフエクチン試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ　ｒｅａｇｅｎｔ）（ＢＲＬ、イギリス）によってスボドブテラ　フルジベルダ昆虫細胞中に導入された。次いで、ブラウン及びフォルフナ−プラーク分析によって単離された後代ピリオンが、マルチウェルプレートに接着したスボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞を感染するために用いられた。これらの細胞は、ヒトｒｃＡＭ−１に対して生じた２つのモノクロナール抗体（１１Ｃ８１及び１４Ｃ１１、ＢＢプロダクツ社、アビンドン、イギリスから得られた）及びＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ　（シグマ、プール、イギリス）の混合物を用いる生細胞蛍光抗体法によって、表面【Ｃ＾トＩ発現をもとにスクリーニングされた。この方法で選択された組換えバキュロウィルス（Ａｃ０ＧＳ７２２で示される）は精製されたプラークであり、ヒト（ＣＡＭ− １の発現をコード化する組換えバキュロウィルスの高力価ウィルス株が調製された。５ＸｌＯ’プラ一ク形成単位（ｐｆｕ）／ｒｎｌを超えるウィルス力価が産生された（プラーク分析によって決定された）。

スボドプテラ　フルジベルダ昆虫細胞をＡｃ０ＧＳ７２２で感染したとき、抗ヒトＩＣＡＭ−１モノクロナール抗体及びＦＩＴＣＩ！Ｉ識ヤギ抗マウスＩｇＧを用いる生細胞蛍光抗体法において、強い表面染色が観察された（図１１参照）。

これは、Ａｃ０ＧＳ７２２によって感染された細胞において産生された組換えヒトｒｃＡＭ−１が、［ＣＡＭ−１ポジテイブヒト細胞におけるように、プロセッシングされ、細胞表面に輸送されることを立証する。

実施例２〜４において例証されたように、Ａｃ０ＧＳ７２２及びＡｃＫ１−ＧＡＧでの共同感染によるスボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞におけるヒトｒｃＡＭ−１及びｐ５５”’の同時発現は、それらが細胞から出芽するどきｐ５５１° ″ウィルス様粒子の脂質エンベロープ中にヒトＩＣＡＭ−１が導入される結果であろう。結果として、これらの粒子は、ＬＦＡ−１を持つ細胞に対する向性（ｔｒｏｐｉｓａ＋）を有するであろう。このような細胞には、抗原提示細胞がある。

実施例６ベクターｐＣＤＭ８に供給されたヒトＶＣＡＭ遺伝子を、ビーピープロダクツ社、アビンドン、イギリスから得た。これは、昆虫細胞における発現を最適化するために、実施例１で記載した標準手順を用いて操作された。これらの操作は図１２に要約され、以下に詳述される。ＶＣＡＭ遺伝子は、Ｘｈｏｌ及びＰｖｕ　Ｉ　［で消化された後のｐＣＤＭ８から摘出された。次いで、それはＲａｍｅｒで消化さ１　れたベクターρυＣ１８にクローニングされ、フレナラ修復され、次いでＳａｌ［で消化された。これは、構造ｐＯＧｓ７２３を誘導し、各々ＶＣＡＭ遺伝子の上流及び下流のポリリンカーＰｓｔｒ及びＢａｍＨＩ制限部位を認識した。次いで、ＶＣＡＭ遺伝子をＰｓｔ［−ＢａｍＨＩフラグメントとして放出し、ｐＯＧｓ７３１を誘導するために、ＰＳｔｌ及び＋　ＢａｍＨｒで消化されたバキュロウィルス変異誘発ベクターｐＡｃｃＬ２９．８（リビングストン及びジコーンズ、１９８９、ヌクレイツク　アシッド　リサーチ　１７　：　２３６６）にクローニングした。ｐＯＧｓ７３４を得るために、ＶＣＡＭの翻訳開始コドンの隣接した上流にＢａｍＨ［制限部位を導入するために、部位に指向した異変誘発が用いられた。現在ＢａｍＨ１カセツトとして存在するＶＣＡＭ遺伝子を、ｐＯＧ３７３８を誘導するために、バキュロウィルス発現ベクターｐＡｃＹＭ１（マツウラら、１９８７、ジエイ、ジン、ゲイロール、　６８　：　１２３３ −１２５０）にクローニングした。

ヒトＶＣＡＭを発現する組換えバキュロウィルスを、相同性ＤＮＡ配列間のインビトロ組換えの現象を利用してｌｉ製した。ウィルスＤＮＡ（ＡｃＲＰ２３．　ＬａｃＺ）及びプラスミドＤＮＡ（ｐＯＧｓ７３８）が、リボフェクチン試薬（ＢＲＬ、イギリス）によってスボドブテラ　フルジベルダ昆虫細胞中に導入された。次いで、ブラウン及びフすルクナー　プラーク分析によって単離された後代ピリオンが、マルチウェルプレートに接着した昆虫細胞を感染するために用いられた。これらの細胞は、ヒトＶＣＡＭに対して生じた２つのモノクロナール抗体（ビーピープロダクツ社　アビンドン、イギリス）及びＦ［ＴＣ標識ヤギ抗マウス［ｇＧ　（シグマ、プール、イギリス）の混合物を用いる生細胞蛍光抗体法によって、表面ＶＣＡＭ発現をもとにスクリーニングされた。この方法で選択された組換えバキュロウィルス（Ａｃ０ＧＳ７２２で示される）は精製されたプラークであり、ヒトＶＣＡＭの発現をコード化する組換えバキュロウィルスの高力価ウィルス株が調製された。５Ｘ１０”プラーク形成単位（ｐｆｕ）　／ｒｎｌを超えるウィルス力価が産生された（プラーク分析によって決定された）。

スボドブテラ　フルジベルダ昆虫細胞をＡｃ０ＧＳ７３８で感染したとき、抗ヒトＶＣＡＭモノクロナール抗体及びＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス［ｇＧを用いる生細胞蛍光抗体法において、強い表面染色が観察された（図１３参照）。これは、Ａｃ０ＧＳ７３８によって感染された細胞において産生された組換えヒトＶＣＡＭが、ＶＣＡＭポジティブヒト細胞におけるように、プロセッシングされ、細胞表面に輸送されることを立証する。

従って、実施例２〜４において例証されたように、ＡｃＯＧ５７３８及びＡｃＫ１−ＧＡＧでの共同感染によるスボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞におけるヒトＶＣＡＭ及びｐ５５１・ｌの同時発現は、それらが細胞から出芽するどきｐ５５“１ウィルス様粒子の脂質エンベロープ中に生物学的に活性なヒトＶＣＡＭが導入される結果である記載したように、昆虫細胞における２つの外来遺伝子の共同発現は、スボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞を、２つの組換えバキュロウィルスによって、各々高多重感染度で共同感染することによりうまく達せられることができる。しかしながら、バキュロウィルス感染のランダムな素質は、一部分の細胞が、高多重感染度にもかかわらずｌ又はそれより少いウィルスで感染されることを意味する。従って、より有効なアプローチは、各々それ自体のプロモーターの制御下で、２つの外来遺伝子を含有する２Ｎ！組換え（ｄｕａｌ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）バキュロウィルスを作製することである。従って、この二重組換えを存する昆虫細胞の感染は、感染されるすべての細胞における両方の外来遺伝子の同時発現を結果として生じるであろう。

１（ｒＶ〜Ｉｐ５５”’及びヒトＶＣＡＭを共同発現するための二重組換えバキュロウィルスの構造は、以下に記載され、また、図２に要約される。

完全なＨ［Ｖ−１ｇａｇをコードする配列は、Ｂａｍ旧カ上カセツトてｐＯｓＧ１５から摘出され、ｐＯＧｓ７３７を誘導するために、二重バキュロウィルス発現ベクターｐＡｃＵＷ５１のＢａｌ［Ｉ制限部位にりローニングされた。ベクターｐＡｃＵＷ５１　（ｐＡｃＬＩＷ３から得られるウニイヤ−（Ｗｅｙｅｒ）ら、１９９１、ジエイ、ジン、ヴ４　ロール、　７２：　２９６７−２９７２）は、イギリス、オックスフォード、インスチチュート　才ブ　ゲイロロジー　アンド　エンバイロメンタルミクロバイオロジーで作製され、多面体及びｐｌｏプロモーターを含有し、その両方ともは、バキュロウィルス感染サイクルにおいて非常に遅れて活性化される。ベクターにおけるこれらのプロモーターの各々の下流は、外来遺伝子の挿入のための独特の制限部位（各々Ｂａｍ）ＩＩ及びＢａ１ｌ）である。ＶＣＡｌｌ遺伝子は、ＢａｍＨ［７ラグメントとしテｐＯＧｓ７３４から摘出され、ＰＯＧＳ７４０を誘導するために、ｐＯＧｓ７３７のＢａｍＨＩ制限部位にクローニングされた。従って、このプラスミドは、Ｈ［Ｖ−１ｇａｇ及びヒトＶＣＡＭ遺伝子の両方を含有し、これらの２つのタンパクを同時に共同発現する二重組換えバキュロウィルスが作製されるのを可能にする。

ＨＩＶ−１ｇａｇ及びヒトＶＣＡＭの両方を発現する二重組換えバキュロウィルスは、相同性ＤＮＡ配列間のインビトロ組換えの常法により調製された。ウィルスＤＮＡ（ＡｃＲＰ２３．　ＬａｃＺ）及びプラスミドＤＮＡＣｐＯＧＳ７４０）が、リポフエクチン試薬（Ｂｌ？Ｌ、イギリス）によってスボドプテラ　フルジペルダ昆虫細胞中に導入された。次いで、ブラウン及びフォルフナ−プラーク分析によって単離された後代ピリオンが、マルチウェルプレートに接着したスボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞を感染するために用いられた。これらの細胞は、ヒトＶＣＡＭに対して生じた２つのモノクロナール抗体（ビーピープロダクツ社、アビンドン、イギリス）及びＦ［ＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ　（シグマ、プール、イギリス）を用いる生細胞蛍光抗体法によって、表面ＶＣＡＭ発現をもとにスクリーニングされた。この方法で選択された組換えバキュロウィルス（Ａｃ０ＧＳ７４０で示される）は精製されたプラークであり、ヒトＶＣＡＭ及びｐ５５１°１の共同発現をコード化する組換えバキュロウィルスの高力価ウィルス株が調製された。５Ｘ１０７ブラ一ク形成単位（ｐｆｕ）　／ｍｌを超えるウィルス力価が産生された（プラーク分析によって決定された）。

スボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞をＡｃ０ＧＳ７４０て感染したとき、抗ヒトＶＣＡＭモノクロナール抗体及びＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス［ｇＧを用いる生細胞蛍光抗体法において、強い表面染色が観察された（図１４参照）。これは、Ａｃ０ＧＳ７４０によって感染された細胞において産生された組換えヒトＶＣＡＭが、ＶＣＡＭポジティブヒト細胞におけるように、プロセッシングされ、細胞表面に輸送されることを立証する。Ａｃ０ＧＳ７４０で感染されたスポドブテラフルジベルダ昆虫細胞の細胞ライセードが、抗ｐ２４モノクロナール抗体（デュポン、アメリカ）及びポリクロナール抗ヒトＶＣＡＭ抗体（ビーピープロダクツ社）の両方を用いるウェスタンブロッティングによって試験された。図１５に示されるように、ｐ５５”’及びヒトＶＣＡＭの両方がこの細胞ライセード中に存在し、それによって、Ａｃ０ＧＳ７４０によって感染された細胞におけるこれらのタンパクの共同発現が確認される。

ＶＣＡＭのリガンドはＶＬＡ−４である。バキュロウィルスによって発現されたヒトＶＣＡＭが生物学的に活性であることを確認するために、ＶＣＡＭを発現する昆虫細胞とヒトＶＬＡ−４ポジティブ細胞間の粘着分析（ａｄｈｅｓｆｏｎ　ａｓｓａｙｓ）を行った。用いた細胞系Ｕ９３７は、単核細胞系のものであり、当初は、細網肉腫におかされている患者から得られた〔サンドストロン（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ）及びエルシン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）　、１９７６、インド、ジェイ、キャンサー（ｒｎｔ、Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ）　、１７．５６５−５７７　）　、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｔ’ペニシリン／ストレプトマイシン及び熱で不活性化された５％のウシ胎児血清が加えられたＲＰＭ［１６４０メデイウム中で増殖したＵ９３７細胞を収穫し、粘着分析用緩衝液［５０Ｕ／−のペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭヘペス（ＨＥＰ巳Ｓ’）　ｐＨ７，２，０，５％ＢＳＡを含存するＲＰＭＩ　１６４０メデイウム〕で洗浄し、ｌＸｌＯ７細胞／Ｔｎｌの細胞密度に再懸濁した。Ａｃ０ＧＳ７４０又は野性型ＡｃＮＰＶで感染されたスボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞の単層を粘着分析用緩衝液で洗浄し、５００ μｌのＵ９３７細胞懸濁液を加えた。次いで、Ｕ９３７細胞の規則的な再分布を有する混合物を、３７°Ｃで９０分間インキュベートした。次いで、過剰のＵ９３７細胞を除去し、０．５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳで固定する前に、昆虫細胞を粘着分析用緩衝液で２回及びＰＢＳで１回洗浄した。分析は、０．５％アジドの存在下で、予め冷却された細胞で、４°Ｃで行われた。

図６は、Ａｃ０ＧＳ７４０によって感染された細胞が、３７°Ｃ及び４℃の両方における粘着分析において、Ｕ９３７細胞を結合することを示す。スボドブテラ　フルジペルダ細胞が野性型ＡｃＮＰＶウイルスで感染されたとき、そのような結合は観察されなかった。

蛍光抗体法とともにこの結果は、生物学的に活性なＶＣＡＭが合成され、かつ同時にｇａｇを発現する昆虫細胞でプロセッシングされることを示す。

従って、Ａｃ０ＧＳ７４０で感染されたスボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞は、その脂質エンベロープ中に導入された生物学的に活性なヒトＶＣＡＭを有するｐ５５””ウィルス様粒子を分泌するであろう。さらに、このような粒子は、ＶＬＡ−４を持つ細胞に結合するであろう。このような細胞には、ある抗原提示細胞がある。

実施例８ウィルスによってコード化された糖タンパクが発芽粒子によって集められる機構は、十分に理解されていない。同種のキャプシドタンパクを存する糖タンパクの膜貫通型及び／又は細胞質ドメインの間の特異的相互作用が、有効な導入のために重要であろう。このことを考慮して、発芽ｐ５５”’粒子中へのＶＣＡＭの導入を改良するために、ＶＣＡＭの膜貫通型及び細胞質ドメインは、Ｈ［Ｖ−１ｇｐ４１からの対応するドメインで置換された。このようなＶＣＡＭ−ｇＰ４１キメラを作製するための操作は、図１２に要約され、以下に記載される。

ＨＩＶ−１ｇｐ４１を包囲するＫｐｎ　［フラグメントをベクターｐＨＸＢ２ｇｐ　ｔ３′から単離し、ｐＯＧｓ７３３を誘導するために、ｐＡｃｃＬ２９．１のＫｐｎ　［部位にクローニングした。これは、ｇｐ４１遺伝子の下流のベクターポリリンカーのＰｓｔ［部位を認識した。ｐＯＧｓ７３６を得るために、部位に指向した変異誘発によって、ｇｐ４１の膜貫通型ドメイン配列の隣接した上流にＰｓｔ１部位が導入された。次いで、このプラスミドのＰｓｔ［を消化することにより、ｇｐ４１の膜貫通型及び細胞質ドメインをコード化する配列が単離された。

部位に指向した変異誘発が、ｐＯＧｓ７３５を誘導するために、ｐＯＧＳ７３１のＶＣＡＭ遺伝子に２つの新しい制限部位を導入するために用いられた。これらは、ＶＣＡＭの翻訳開始コドンの隣接した上流のＢａｍＨ１部位及びＶＣＡＭの膜貫通盟ドメイン配列の隣接した上流のＰｓｔｒ部位から構成された。ＶＣＡＭ遺伝子を、Ｂａｍ旧フラグメントとしてｐＯＧｓ７３５から摘出し、ｐＯＧｓ７３９を誘導するために、ｐＡｃｃＬ２９．１のＢａｍＨ１部位にクローニングした。これは、ＶＣＡＭ遺伝子の隣接した下流のベクターポリリンカーのＰｓｔ１部位を認識した。従って、ｐＯＧｓ７３９のＰｓｔｌを消化することにより、ＶＣＡＭの膜貫通型及び細胞質ドメインをコード化する配列は放出され、次いでそれは、ＰｓｔＥフラグメントとしてｐＯＧｓ７３６から得られた対応するｇｐ４１配列で置換された。これは、プラスミドｐＯＧｓ７４２を誘導した。ＤＮＡ配列決定により、このキメラのＶＣＡＭ及びｇｐ４１成分が層になっており、従って、単一のポリペプチドとして翻訳されるであろうということが確認された。ＶＣＡＭ−ｇｐ４１ハイブリッド遺伝子をＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＯＧｓ７４２から摘出し、ｐＯＧｓ７４３を誘導するために、ｐＯＧｓ７３７のＢａｍＨ［部位にクローニングした。従って、このプラスミドは、ＨｆＶ−１ｇａｇ及びＶＣＡＭ−ｇｐ４１の両方のハイブリッド遺伝子を含存し、これら２つのタンパクを同時に共同発現する二重組換えバキュロウィルスが作製されるのを可能にする。ＶＣＡＭ−ｇｐ４１ハイブリッドは、野性型■Ｃ鳩分子のそれよりも大きい効率でｇａｇに基づいた粒子中に導入されることが予想される。これは、このような粒子のＶＬＡ−４を持つ細胞に対する結合活性を上昇するであろう。

実施例９水痘性口内炎ウィルス〔インディアナ　セロタイプ（［ｎｄｉａｎａｓｅｒｏｔｙｐｅ））のエンベロープ糖タンパク（Ｇタンパク）を発現する組換えバキュロウィルスは、予めバイレー（Ｂａｉ　１ｅｙ）によって用いられたものであった〔バイレー、エムジエイ（Ｂａｉｌｅｙ、ＭＪ）ら、１９８９．　ゲイロロジ− １６９，３２３−３３１）。また、このウィルス（ＡｃＶＳＶ−Ｓで示される）の高力価ウィルス株が調製された。

ＶＳＶ−Ｇは、低ｐＨにより活性化されるフソゲンタンパク（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）である〔フロルキーワイツ、アール（Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚ、　Ｒ）及びローズ、ジエイ（Ｒｏｓｅ、　Ｊ）、１９８４、サイエンス　２２５．７２１−７２３　）。ＡｓＶＳＶ−Ｇによって感染された昆虫細胞における生物学的に活性なり５ｖ−ｃタンパクの細胞表面発現は、ｐＨ５，５でこのような細胞をインキュベートすることにより変化された。図１７に示されるように、長い多有核の融合体（ｍｕｌｔｉ−ｎｕｃｌｅａｔｅｄ　５ｙｎ（ｙｔｉａ）が、ＶＳＶ−Ｇによって仲介された細胞−細胞融合の結果として成形される。

出芽ｐ５５”″粒子がその表面上にＶＳｖ−Ｇタンパクを得るために、同じ細胞において両方のタンパクが同時に発現されるように、昆虫細胞をＡＣＫＩ−ＧＡＧ及びＡｃＶＳＶ−Ｇで共同感染した。これは、以下のようにして達せられた。

スボドブテラ　フルジペルダ昆虫細胞をログ増殖に保持し、使用前に約１．５　ＸＩＯ’／ｒｎｌの細胞密度まで増殖した。感染前に、細胞を、８分間２０’ＣＣ９００ｒｐでスピンダウンし、培養上清を廃棄した。絃胞当たり各々のウィルスにおいて２　ｐｆｕ（プラーク形成単位）の多重感染度が達せられ−るように、ＡｃＫ１−ＧＡＧ及びＡｃＶＳｖ−Ｇの両方の混合物で細胞を感染した。これによって、両方の外来遺伝子の必然的発現をともなう大多数の細胞において、共同感染が確立されたことが保証された。

また、次いで、ｐ５５”’のみを発現するために、細胞当たり２ｐｆυの多重感染度で、細胞をＡｃＫ１−ＧＡＧのみで感染した。室温で１時間後、感染された細胞を前のように沈澱し、ウィルス接種原を除去した。細胞を１．５　ＸＩＯ＠細胞／ｍｌの密度まで新しいメディウムで再懸濁し、２７′Ｃで６６時間懸濁培養しながらインキュベートした。

培養液を無菌の５０−遠心管の中に移し、細胞を沈澱するために、１０分間４° Ｃ３Ｋｒｐｍで回転した。５％ＰＥＧ６０００を添加して３時間４°Ｃで混合することにより、澄明にされた培養上清からｐ５５ｆ“粒子を沈澱した。沈澱物を、１０分間４℃９　Ｋｒｐｍで遠心分離することにより回収し、最初の培養容量の１／１０のＴＥＮで再懸濁した。凝集した物質を沈澱するために、４°Ｃ３ＫｒｐＩｌｌで５分間回転した後、再懸濁されたＰＥＧ沈澱物を、線形ショ糖グラジェント（夏１ｎｅａｒ　５ｕｅｒｏｓｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）（１０〜５０％５０％シミ／ＴＥＮ（１０ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１５０ｍＭ塩化ナトリウム）〕に付し、２０分間ｌＯ℃１９７０００ｇで遠心分離した。これらの遠心力下で、単量体ＶＳＶ−Ｇタンパクは、グラジェントを通して存意には沈降しない。対照的に、粒子と結合したＶＳＶ−Ｇタンパクは、非常に増大された明白な沈降係数を育し、従って、グラジエン１へを通して沈降するであろう。遠心分離後、グラジェントを分別し、ｐ５５”’粒子を回収した。図１８は、この物質が５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたとき、ｐ５５”’ 及びｖｓｖ−ｃタンパクの両方が存在することを示し、それは、それらが共に精製されたことを立証する。これらのタンパクが確実なものであることの確認は、抗ｐ２４モノクロナール抗体及び抗■Ｓｖ抗体を用いるウェスタンプロットにより提供された（図１８参照）。

ｐ５５”’粒子に導入されたｖｓｖ−ｃタンパクのフソゲン活性の評価のために、別の簡単な精製手順が材料を単離するのに採用された。これは、ＡｃＫ１−ＧＡＧ及びＡｃＶＳＶ−Ｇ（又は、対照としてＡｃＫ！−ＧＡＧのみ）で昆虫細胞を共同感染すること、及び記載したように収穫すること、次いで澄明にされた培養上清をシタ糖ステップグラジェント（ＴＥＮ中の３０％ショ糖が上層にあるＴＥＮ中の６０％ショ糖）に付すこと、及び２時間４°Ｃ９６０００ｇで遠心分離することから構成された。粒子を３０％７６０％界面から回収し、数個のグラジェントから物質をプールした後、さらに同様のショ糖ステップグラジェントで濃縮した。回収後、ショ糖を除去するために、サンプルを４°Ｃで１０ｍＭヘペスｐＨ７，４，１５０ｍＭ塩化ナトリウムを用いて終夜透析した。

ｐ５５”’粒子のエンベロープ中に導入されたＶＳＶ−Ｇタンパクのフソゲン活性が、スボドプテラ　フルジベルダ昆虫細胞にそれらを吸着した後、これらの粒子の融合体形成を誘発する能力によって最初に評価された。３５ＩＩｌ１１の組織培養プッシュに各々ｌ。

５Ｘ１０＠の昆虫細胞を供給し、プッシュに細胞を接着した後、４°Ｃまで冷却した。培養上清を除去し、２５０μｌのｐ５５ｆ■ウィルス様粒子又はＶＳＶ− Ｇを提示するｐ５５”“ウィルス様粒子（これらも４℃まで冷却した）の添加前に、細胞を１４５０１Ｍ塩化ナトリウム、）ＯｍＭへベスｐＨ７，４で２回洗浄した。４℃で１時間の吸着後、粒子を除去し、２−の組織培養メディウムｐ）（ｓ、　５を用いて２８°Ｃで１時間置換した。この低ｐＨメディウムは、ＶＳＶ −Ｇのフソゲン活性を誘発する。次いで、メディウムを除去し、２−の標準ｐＨ（６，２）の組織培養メディウムで置換し、２８℃で２時間インキュベートした。図１９は、ｖｓｖ−ｃタンパクを共同発現する細胞から精製されたｐ５５１° １粒子が吸着された細胞において、多数の融合体が展開されたことを示す。２５５１０粒子のみに暴露された後の細胞間においては、融合体は形成されなかった。

これは、出芽粒子に導入されたＶＳＶ−Ｇタンパクが、低ｐＨで暴露された後フソゲンとして（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）活性であり、この活性は精製手順後まで持続されることを立証する。

さらに、出芽粒子に導入されたｖｓｖ−ｃタンパクが生物学的に機能しうるものであることを確認するために、ｖｓｖ−ｃを提示するｐ５５”’粒子の溶血活性が決定された。ＶＳＶは、Ｇタンパク〔シレゲル、アール、　（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ、　Ｒ）及びウェイト、エム、　（Ｗａｄｅ、　Ｍ）　１９８４、ジエイ、パイオル、ケム、　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、）　２５９．４６９１− ４６９４）によって仲介される酸性ｐＨ依存性溶血活性を有することが立証されている〔バイリー、シー（Ｂａｉｔ）’、　Ｃ）ら、１９８１、ジェイ、セル　パイオル、　（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）　９１．１１１ａ〕。溶血活性は、以下の分析によって測定された。ヒツジ赤血球（アルセパ−中に１０％として与えられた；セロチック、イギリス）を、５分間４°Ｃ２５０ｇで遠心分離により沈澱し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を２つの部分標本に分割し、ｐＨ５，０又はｐＨ７，４の溶血性緩衝液（ｈｅａｍｏｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒＸｌｏｍＭ　ＭＥＳ、　１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄した。最終遠心分離後、細胞を、同じｐＨの溶血性緩衝液中に１０％（Ｖ／Ｖ）濃度となるように再懸濁した。１００μ！の上記の手順によって単離した粒子（約２０μｇｐ５５”“を含有する）を、５００μｌのｐＨ５，０又は７．０のどちらかの１０％ヒツジ赤血球とともに、３７°Ｃで２０分間インキュベートした。対照として、各々のｐＨでの赤血球の自発性溶血を評価するために、１００μｆの１０ｍＭヘペスｐＨ７，４，１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含めた。

次いで、細胞を記載したように遠心分離によって沈澱し、上清におけるヘモグロビン濃度の評価として、５４１ｎｍ吸光度を用いた。図１に示されるように、ｐ５５”″粒子のみでは優位な溶血活性を持たない。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇタンパクを共同発現する昆虫細胞から精製されたものは、高いｐＨ依存性の活性を有した。

図１は、ＶＳＶ−Ｇが溶血を仲介した後の５４１ｎｍの吸光度における上昇によって表わされた、ヒツジ赤血球からのヘモグロビンの放出を示す。ｐ５５”’粒子ではなくρ５５″’−／ＶＳＶ−Ｇ粒子における顕著な酸性ｐＨ依存性溶血活性が立証される。値は、１００μ！サンプル（約２０μｇ　ｐ５５“１つ当たりの０Ｄｓ４＋単位として表わされ、自発性溶血を除くために、示されたｐＨにおける対照サンプルのＯＤを減じることによって調節される。

先に記載した実施例において、自己集合タンパクは、ＨｔＶ−ＩＧＡＧの自律的に生じる配列と同じものである。しかしながら、記載した発明において、そうであることは必要なことではない。

自己集合分子は、切形であってもよく、かっ／又は１もしくはそれ以上の追加のアミノ酸によって補足されてもよい。この異種配列は、追加の生物学的活性を有してもよい。このような異種配列は、当該分野で公知又は未だ解明されていない何れかのアミノ酸配列であることができる。生物学的活性は、単一タイプの活性（例えば、免疫原性、レセプター結合活性、治療活性あるいはターゲティング活性）であってもよく、あるりはそれは、合併した２又はそれ以上の異なる生物学的活性を有してもよい。異種アミノ酸配列は、感染図子の抗原であってもよい。

以下の実施例において、用いた異種配列は、ＨＩＶ−１のエンベローブ糖タンパクｇｐ１２０のアミノ酸３００と３３０の同で発見された、第三可変ドメイン又はＧＰＧＲループ配列である。ＧＰＧＲループは、ジスルフィド結合によって連結した２つの欠失システィン残基（ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ）によって定義され、ＨＩＶ−１における主要な中和エピトープ（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ｅｐｉｔｏｐｅ）である〔プトネイ（Ｐｕｔｎｅｙ）ら、１９８６、サイエンス２３４．１３９２；ルシエ（Ｒｕｓｃｈｅ）ら、１９８８、ブロク、ナトル、アカド、サイ、８５．３１９８；パルカー（Ｐａｌｋｅｒ）ら、１９８８、ブロク、ナトル、アヵド、サイ、８５．１９３２　、グドスミト（Ｇｏｕｄｓｍｊ　ｔ）ら、１９８８、エイズ　２゜１５７〕。

この実施例は、図面中のある図を参照して、ＨＩＶ−１工ンベロープ糖タンパクｇｐ１２０からのＧＰＧＲループを含有するハイブリットＨＩＶ−Ｉ　ＧＡＧ粒子の構造を記載する。

組換えＤＮＡ操作は、実施例１に記載したようである。

シアノエチルホスホルアミダイト（ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）を用いる自動ホスホルアミダイト化学によって、オリゴヌクレオチドを合成した〔ビューケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）及びカルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）　、１９８１、テトラヘドロン　レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）　２４．２４５）　、ブ０７キングをはずしくｄｅ−ｂｌ。

ｅｋｉｎｇ）、制御されたボアグラス支持体から除去した後、オリゴマーを変性ポリアクリルアミドゲルで精製し、さらにエタノール沈殿によってｍ製し、最終的に、それらの濃度を評価する前に水に溶解した。次いで、結合（Ｉｉｇａｔｉｏｎ）段階のために要求されるように、５′リン酸を有するそれらを提供するために、キナーゼ処理した。次いで、関連プラスミドベクター中に結合する前に、相補的オリゴマーをアニーリングした。合成オリゴマーの配列は、ジデオキシ配列決定法により確認された。用いた試験計画書は、本質的には、記載してきたようであり〔ビギン（Ｂｉｇｇｉｎ）ら、１９８３、プロ先ナトル、アカド、サイ、　８０．３９６３〕、記載したようにプラスミドＤＮＡに関する配列決定をするために修飾された〔ゴー（Ｇｕｏ）及びウニ（Ｎｕ　）、１９８３、ヌクル。

アシツブ。レス、（ＮｕｃＪ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、）　１１．５５２１）。

ＨＩＶ−ｇａｇ構造は、実施例１に記載したようにｐｏｃｓ　２から由来した。

全てのＨＩＶ−１ｇａｇ及びＧＰＧＲループ配列を含有する融合遺伝子を、８ｇ１１１１１位でＨＩＶ−１分離株ＨＸＢ２　（フィッシ＋　−（Ｆｊｓｈｅｒ）ら、１９８６、サイエンス２３３．６５５〕からのＧＰＧＲループ配列をコード化する合成オリゴマーを挿入することによって作製し、合成オリゴｖ　−５ＥＡＧＡＧ１０３及び５ＥＡＧＡＧ１０４テ結合した（図２０）、コノ挿入は、ｇａｇ遺伝遺伝軸中いて、原Ｂｇｌ［ｒ部位に関してＢｇｌｒ１部位１を再構築する。生じたプラスミドはｐＯＧｓ５５４で示された。

ＨＸＢ２　ＧＰＧＲループ配列をコード化する合成オリゴマーを、新８ｇＮ１部位で切断されたＰＯＧＳ５５４中に挿入した。これは、ＢａｍＨＩカセットとしてｇａｇ（完全長）：ＧＰＧＲループ融合遺伝子を含有するプラスミドｐＯＧｓ５５５を誘導した（１１２１）。

Ｃ末端７５残基が除去されたｇａｇ遺伝子を産生ずるために、合成オリゴｖ　− ８ＥＡＧＡＧ１０Ｓ及び５ＥＡＧＡＧ１０９を、１３ｇ１ｒ［テ切断すしたｐＯＧｓ５５４中に挿入した。この挿入は、終止フドン、及びＢａ１ｌ■部位の下流のＢａｍＨ［部位を誘導することになる。生じたプラスミドは、ｐＯＧｓ５６２で示され、ＢａｍＨ１カセツトとしてｇａｇ（切形）：ＧＰＧＲループ融合遺伝子を含有する（図２１及び２２）。

切形）ＩＩ’／−１ｇａｇ遺伝子及びＧＰＧＲループ配列を含有する融合遺伝子を、プラスミドｐＯＧｓ５６２におけるＢｇｌｒｒ部位で、ｆＨＶ−１分離株ＨＸＢ２　（フッシャーら、１９８６　前記）からのＧＰＧＲループ配列をコード化する合成オリゴマーを挿入することによって作製した。

生じたプラスミドはｐＯＧｓ５６３で示され、ＢａＩＩＩＨＩカセットとしてｇａｇ（切形）：ＧＰＧＲループ融合遺伝子を含有する（図２１）。

４つのｇａｇカセット（完全長ｇａｇ；完全長ｇａｇ／ＧＰＧＲループ；切形ｇａｇ　；切形ｇａｇ／ＧＰＧＲループ）の各々を、ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＯＧｓ１５、ｐＯＧｓ５５５、ｐＯＧｓ５６２及びｐＯＧｓ５６３から摘出し、各々ｐＡｃＫ１ｇａｇ、　ｐＯＧｓ５５６、ｐＯＧｓ５７２及びＰＯＧＳ５７４を誘導するために、バキュロウィルス発現ベクターｐＡｃＲＰ２３　（Ｑｉ１２３）にクローニングした。プラスミドｐＡｃＲＰ２３は、オートグラフアカリフｔルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）Ｉ多面体ウィルス（ＡｃＮＰＶ）からの強力な多面体プロモーター及びＡｃＰＮＶ配列によって欠失した外来遺伝子の挿入のための独特なりａｍＨ［部位を含有する。また、プラスミドｐＡｃＲＰ２３は、大腸菌におけるプラスミドの修復及び選択のための配列を含有する（マツウラら、１９８７、ジエイ、ジン、ゲイロール、６８．１２３３）　、このベクターのＢａｍＨ夏部位にクローニングしたとき、ｇａｇ遺伝子派生物は、多面体プロモーターに制御された状態になる（図２３）。

鱗翅類系ＩＰＬＢ−５ｆ２１−Ａε（ヴアウンら、１９７７、インビトロ１３．２１３）のクローニング派生物（ｃｌｏｎａｌ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）であるスポドブテラ　フルジベルダ　９（Ｓｒ１）で示された細胞系（サマース及びスミス、１９８７、テキサス　アグリカルチュラル　エクスベリメント　ステーション　プレチン、１５５５番）が、全実験のために用いられた。細胞を、熱によって不活性化された１０％のウシ胎児血清（アイシーエヌーフロー　ラボラトリーズ、イギリス）に加えて５０１υ／−のペニシリン及び５０ｍｇ／−のストレプトマイシン〔ギブゴーピーアールエル、イギリス〕を含有するＴＣｌｏｏ（ギブゴーピーアールエル、イギリス）からなるメディウムでの懸濁培養で増殖した。

組換えバキュロウィルスは、相同性ＤＮＡ配列間でのインビトロ組換えの現象を利用することによって調製された。ウィルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡ（ｐＡｃＫＩｇａｇ、　ｐＯＧｓ５５６、ｐＯＧｓ５７２又はｐＯＧｓ５７４）は、塩化カルシウム沈降法によってＳＦ９昆虫細胞中に導入され、後代は、４８時間後に回収された（サマース及びスミス、前記）。組換えバキュロウィルスは、ブラウン及びフォルフナ−プラーク分析で、その多面性ネガティブの遺伝表現型に基づいて選択された（ブラウン及びフォルフナ−，１９７７、ジエイ、ジン、ゲイロール３．３６．３６１）。プラーク精製後、組換えバキュロウィルスの高力価ウィルス株がｌｌ製され、その力価は、プラーク分析で決定された。力価は、５Ｘ１０７ブラ一ク形成単位（ｐｆｕ）／−を越えていた。組換えバキュロウィスルは、ＡｃＫｌｇａｇ（完全長ｇａｇ）、Ａｃ０Ｇ３５５６　（完全長ｇａｇ／ＧＰＧＲループ）、Ａｃ０ＧＳ５７２　（切形ｇａｇ）及びＡｃ０ＧＳ５７４　（切形ｇａｇ／ＧＰＧＲループ）で示された。

完全長ＧＡＧ及び完全長ＧＡＧ／ＧＰＧＲループタンパクの発現か、ウェスタンプロット分析によって試験された。ＳＦ９細胞の合流単層を、組換えウィルスＡｃＫ１ｇａｇ、組換えウィルスＡｃ０ＧＳ５５６又は野性形ＡｃＮＰＶを用いて、細胞当たり５ｐｆｕの多重感染度で感染した。細胞を、４８時間ポスト感染で収穫し、１０００ｇで遠心分離することによって沈殿した。リン酸塩で緩衝化された生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄した後、細胞を溶解し、タンパクを、レムリ（Ｌａｅａｏｎｌｉ）によって記載されたように、５ＰＳ−ＰＡＧＥによりて分離した（レムリ、１９７０、ネイチャー　２２７．６８）。分離したタンパクを、タービン（Ｔｏｗｂ　ｉ口）によって記載されたように、ニトロセルロースに移しくタービンら、１９７９、ブロク、ナトル、アカド。

サイ、７６．４３５０）　、抗ＧＡＧ又はＧＰＧＲモノクロナール抗体（ＭＡｂ。

デュポン−イギリス）のどちらかを用いて探索した。ＡｃＫｌｇａｇで感染した細胞は、抗ＧＰＧＲモノクロナール抗体と反応せず、抗ＧＡＧモノクロナール抗体と反応した約５５ｋＤのタンパクを含有した。対照として、Ａｃ０ＧＳ５５６で感染した細胞は、抗ＧＡＧ及び抗ＧＰＧＲモノクロナール抗体の両方と反応した約５９ｋＤのタンパクを含有し、これによって、融合タンパクとして完全長ＧＡＧ／ＧＰＧＲループ融合遺伝子の発現が確認される（図２４）。

ＡｃＫｌｇａｇ（完全長ＧＡＧ）で感染した細胞の薄切切片を電子Ｈ機銃を用いて試験したとき、ウィルス様粒子が原形質膜から出芽するのをみることができた（図２５及び２６）。図２７によって、出芽した粒子は、ゲイソン（ゲイソンら、１９８９、セル５９．１０３）によって先に観察されたような幼若なＨ［Ｖピリオンと類似の形態を有したけれども、いくつかの不規則を示したことが立証される。対照として、Ａｃ０ＧＳ５５６　（完全長ＧＡＧ／ＧＰＧＲループ）で感染した細胞の電子顕微鏡写真は、ハイブリッドタンパクが大きく凝集した物質として核において蓄積したことを示した（図２８）。

ある例においては、部分的に球状構造が明白であり、それは、優勢的には不規則であるが、場合としてウィルス様粒子の外観を有した（図２９）。この結果により、ハイブリッドＧＡＧ粒子を誘導することは可能であるが、規則的な安定な構造の形成のためには、粒子形成配列の修飾が必要であることが示唆された。

また、切形ＧＡＧ及び切形ＧＡＧ／ＧＰＧＲループタンパクの発現が、ウェスタンプロット分析によって試験された。ＳＦ９細胞の合流単層を、組換えウィルスＡｃ０ＧＳ５７２、組換えウィルスＡｃ０ＧＳ５７４又は野性型ＡｃＮＰＶを用いて、細胞当たり５ｐｆｕの多重感染度で感染した。細胞を収穫し、溶解し、タンパクを上記のように分離した。予想されたように、Ａｃ０ＧＳ５７２で感染した細胞は、抗ＧＰＧＲモノクロナール抗体と反応せず、抗ＧＡＧモノクロナール抗体と反応した約４７ｋＤのタンパクを含有した。Ａｃ０ＧＳ５７４で感染した細胞は、抗ＧＡＧ及び抗ＧＰＧＲモノクロナール抗体の両方と反応した約５４ｋＤのタンパクを含有し、これによって、融合タンパクとして切形ＧＡＧ／ＧＰＧＲループ融合遺伝子の発現が確認される（図３０）。

Ａｃ０ＧＳ５７２で感染した細胞の電子顕微鏡分析によって、原形質膜から出芽するウィルス様粒子の存在が立証された（図３１及び３２）　、　ＡｃＫｌｇａｇ（完全長ＧＡＧ）で感染した細胞から出芽するウィルス様粒子と対照して、切形ＧＡＧ粒子は、より規則的であるように見られた（図３３）。さらにより顕著であるのは、Ａｃ０ＧＳ５７４（切形ＧＡＧ／ＧＰＧＲループ；図３４及び３５）で感染した細胞の、主に核における、規則的な粒子の外観であった。加えて、いくつかのハイブリッドの切形ＧＡＧ　：　ＧＰＧＲループ粒子が細胞表面から出芽するのを見ることができた（図３６）。これらのデータは、ｇａｇ融合遺伝子からのハイブリッドＧＡＧ粒子の形成が、ｇａｇ遺伝子の修飾に依存することを立証する。さらに、そのデータは、ＨＩＶ−Ｉ　ＧＡＧタンパクの第一の４３７アミノ酸が、ウィルス様粒子を形成するのに十分な情報を含有することを立証する。

実施例２〜９において例示したように、同一細胞における切形ＧＡＧ又は切形ＧＡＧ／ＧＰＧＲループタンパク、及び天然の又は修飾された配列である異種の膜結合タンパクの発現は、膜結合タンパクが膜から出芽する粒子中に導入されることに起因するであろう。それを生じることで、出芽した粒子は、膜結合タンパクの全てではないにしてもいくつかの特性を得るであろう。これらの特性には、抗原性、ターゲティング及び薬理学的活性がある。２つのタンパクの発現は、１又はそれ以上のベクター及び動物起源の何れかの細胞型のものからであってもよい。

図１ＨＩＶ−Ｊ　ＧＡＧカセットの構造ａ）　ｂ）図３図６図９ＧＡＧ　ＧＡＧ＋ＨＡｕ　ｐｓ　ｕ　ｐｓ図１０図ＩＪ。

図１３盟図１４図１６図１７図１９図２０ｐＯＧｓ５５４の構造ｇｌ　ＩＩ −゛口“ＡＧＧＧＡＡ　ＧＡＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣ−−ＡＡＴＣＣＣＴｒＣＴＡＧ　ＡＣＣＧＧＡＡＧＧ−５ＥＡＧＡＧ１０３　５’　ＧＡＴＣＡＧＡ　ＴＣＴ　ＧＧＣＣＣ３′５ＥＡＧＡＧ１０４３’ＴＣ下ＡＧＡ　ＣＣＧＧＧＣＴＡＧ　５ｐＯＧｓ５５４における新Ｂｇ１１１部位の配列図２３ｐＡｃＲＰ２３の概略図叩図２７図２８図２９図３０図３１図３２図３３図３４図３５図３６国際調査報告　。１７１．。。ｌ／１１ｎ＆ｃ１ＭＴ／Ｃ只　Ｑ１１００６５１フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１５／１６　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５６９　Ｈ９０１５−２ＪＬ　９０１５−２Ｊ（７２）発明者　バーンズ、　ニゲル　ロパート英国、オックスフォード　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウォトリントンロード（番地なし）　ブリティッシュバイオ−テクノロジー　リミテッド内（７２）発明者　フレンチ、　テモテ　ジョン英国、オックスフォード　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウオトリントンロード（番地なし）　ブリティッシュバイオ−テクノロジー　リミテッド内Ｉ（７２）発明者　ガーリング、　アンドリュー　ジョン　ハバート英国、オックスフォード　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウォトリントンロード（番地なし）　ブリティッシュバイオ−テクノロジー　リミテッド内（７２）発明者　キンゲスマン、　アラン　ジョン英国、オックスフォード　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウォトリントンロード（番地なし）　ブリティッシュバイオ−テクノロジー　リミテッド内フロントページの続き（７２）発明者　キンゲスマン、　スーザン　メアリー英国、オックスフォード　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウオトリントンロード（番地なし）　ブリティッシュバイオ−テクノロジー　リミテッド内

Claims

【特許請求の範囲】

１．多数の自己集合タンパク成分から形成された出芽集合体からなり、その集合体が少なくとも部分的に脂質二重層及び自己集合タンパク成分に関して異種の１もしくはそれ以上の膜結合成分で被覆されてなるタンパク性の脂質含有粒子（但し、自己集合タンパク成分がウイルス起源のものであるならは、粒子は感染性ウイルス核酸を有さない）。
２．自己集合タンパク成分が、ウイルス起源のもの又はウイルス起源のタンパクに関連したものである請求項１に記載の粒子。
３．自己集合タンパクが、レトロウイルスのＧＡＧタンパクである請求項２に記載の粒子。
４．レトロウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｔリンパ球ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）又はウシ免疫不全様ウイルス（ＢＩＶ）である請求項３に記載の粒子。
５．自己集合タンパク成分が、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）の出芽コア分子である請求項４に記載の粒子。
６．自己集合タンパクの核酸結合能力が、それが由来する天然のタンパクに比べて修正されている請求項１〜５のいずれか１つに記載の粒子。
７．自己集合タンパク成分が、第一のアミノ酸配列及び第二のアミノ酸配列からなり、第一のアミノ酸配列がタンパク分子にその自己集合特性を付与し、第二のアミノ酸配列が望ましい生物学的活性を付与する請求項１〜６のいずれか１つに記載の粒子。
８．第二のアミノ酸配列の生物学的活性が、抗原性、酸素活性及び／又は細胞障害活性及び／又は核酸結合活性である請求項７に記載の粒子。
９．第二のアミノ酸配列が、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の第三可変ドメインに対して実質的に相同性である請求項８に記載の粒子。
１０．第二のアミノ酸配列が、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡ又はメッセンジャ−ＲＮＡに結合することができる請求項８に記載の粒子。
１１．自己集合タンパク成分又はその自己集合部分が、天然のタンパクと少なくとも７０％の相同性を有する請求項１〜１０のいずれか１つに記載の粒子。
１２．脂質二重層が、集合体が集められた、かつ／又は自己集合成分の合成が行われた細胞から由来する請求項１〜１１のいずれか１つに記載の粒子。
１３．脂質が、実質上完全にコア集合体を被覆する請求項１〜１２のいずれか１つに記載の粒子。
１４．膜結合タンパク成分が、粒子に追加の生物学的活性を付与する請求項１〜１３のいずれか１つに記載の粒子。
１５．膜結合成分が、原形質膜局在及び／又は保持シグナルからなる請求項１４に記載の粒子。
１６．膜結合成分が、免疫能力、部位特異的ターゲティング能力、フソゲン特性、結合あるいはパッケージング活性、酵素活性、細胞障害及び／又は医薬活性を付与する請求項１４又は１５に記載の粒子。
１７．膜結合成分が、ウイルスタンパクからの配列であるか又は該配列を含有する請求項１４又は１５に記載の粒子。
１８．ウイルスタンパクが、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク又はレトロウイルスのｅｎｖ由来タンパクである請求項１７に記載の粒子。
１９．膜結合成分が、粒子に免疫系の細胞に結合する特性を付与する請求項１４又は１５に記載の粒子。
２０．膜結合成分が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２又はＶＣＡＭ又はＢＢＩの活性を有する請求項１９に記載の粒子。
２１．膜結合成分が、ＨＩＶ−１ｇｐ４１、ＶＳＶ−Ｃ、インフルエンザ赤血球凝集素、センダイウイルス融合因子（Ｆ）、又はセムリキ森林熱ウイルスの糖タンパクのフソゲン特性を有する請求項１４又は１５に記載の粒子。
２２．膜結合成分が、Ｔ細胞増殖活性を有する請求項１４又は１５に記載の粒子。
２３．宿主細胞において、自己集合することができ、かつ生じた集合体が宿主細胞から出芽することができ、それによって少なくとも部分的な脂質のエンベロープを得ることができるタンパク成分を発現することからなるタンパク性の脂質含有粒子を調製する方法。
２４．膜結合タンパク成分が、自己集合タンパクと同じ宿主細胞において共同発現される請求項２３に記載の方法。
２５．発現が、哺乳動物又は昆虫細胞において行われる請求項２３又は２４に記載の方法。
２６．発現が、昆虫細胞において、バキュロウイルス発現系の手段によって行われる請求項２５に記載の方法。
２７．第一及び第二の暗号配列からなり、第一の暗号配列が、脂質によって被覆された粒子を形成するために、動物細胞から順番に出芽することができるタンパクの集合体に自己集合することができるタンパク成分をコード化し、かつ第二の暗号配列が、膜結合タンパク成分をコード化し、該暗号配列が、任意に各々、異種プロモーターに効果的に連結される動物細胞発現ベクター。
２８．（ａ）脂質によって被覆された粒子を形成するために、動物細胞から順番に出芽することができるタンパクの集合体に自己集合することができるタンパク成分をコード化する暗号配列（該暗号配列は、異種プロモーターに効果的に連結される）を有する第一のベクター、及び（ｂ）膜結合タンパク成分をコード化する暗号配列（該暗号配列は、異種プロモーターに効果的に連結される）を有する第二のベクターからなる動物油脂発現ベクターのセット。
２９．請求項２７に記載の発現ベクター又は請求項２８に記載の発現ベクターのセットからなる宿主細胞。
３０．請求項１〜２２のいずれか１つに記載の粒子及び適切な担体からなる医薬又は診断用組成物。
３１．ワクチンであり、かつ無菌である請求項３０に記載の医薬組成物。
３２．請求項１〜２２のいずれか１つに記載の検出可能に標識化された粒子。