JPH06500232A

JPH06500232A - 自己集合性複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子

Info

Publication number: JPH06500232A
Application number: JP3514511A
Authority: JP
Inventors: ペイン，レンドン
Original assignee: サリオン・バイオロジクス・コーポレイシヨン
Priority date: 1990-08-15
Filing date: 1991-08-08
Publication date: 1994-01-13
Also published as: WO1992003537A1; DE69128898D1; EP0652967B1; US5858726A; EP0652967A1; ATE163047T1; US5420026A; CA2089497A1; DE69128898T2; EP0652967A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】自己集合性複製欠陥型ハイブリッドウィルス粒子北回！と１１− ワクチン接種は過去３０年間ウィルス性疾患の抑制に重要な役割を果たしてきた。ワクチン接種は、簡単な免疫の原理に基づいている。感染性病原体に接触した動物体内では免疫防御が増強され、この免疫防御は、同じ病原体によって発症する疾患に対して終生防御を与える。ワクチン接種の目的は、感染前の動物の免疫防御の増強を誘発することである。従来、ワクチン接種では、生きた弱毒ウィルスまたは不活化した全ウィルスを免疫原として使用している。

これらの方法では、自然感染で得られる免疫応答の全域を誘発する天然型（ｎａｔｉｖｅ）抗原が得られるか否かにその成否が左右される。

従来のワクチン方法論はかなりの成功をみたにも拘わらず、隠れた欠点も多数有している。不活化が不十分なワクチンは、該ワクチンによって予防するはずの病気を発症させることもあり得る０弱毒面は、突然変異して病毒性になったりまたは非免疫原性になったりすることもある。ヘルペスウィルスのような潜伏性のウィルスは特に問題である。

何故なら、弱毒面による潜伏性感染の際に長期間の陰性結果が存在するか否かが分かつていないからである。最後に、多くの型のウィルスを増殖させる有効な手段が存在しない。

組換えＤＮＡチクノロシイにおける最近の進歩は、完全形（ｉｎｔａｃｔ）感染性病原体でなく所定の抗原を免疫原として使用することに基づいた゛ワクチン開発の可能性を提供した。このようなものとして、化学的に合成された免疫反応性エピトープから成るペプチドワクチン、組換え異種（ｈｅｔｅｒｏ　ｌ　ｏｇｏｕｓ　）細胞中のウィルスタンパク質の発現によって産生されたサブユニットワクチン、及び、１種またはそれ以上の所定抗原を提供するための生きたウィルスベクターの使用、などがある。

ペプチドワクチン及びサブユニットワクチンの双方は、隠れた欠点を多数有している。最大の問題は、操作されたタンパク質のコンホーメーシタンが自然環境中の抗原のコンホーメーシタンにほぼ一致するか否かを確認するのが難しいことである。免疫応答を追加刺激するために、適当なアジュバント、ペプチドの場合にはキャリアータンパク質を使用する必要がある。更に、これらのワクチンは、主として体液性応答を誘発し、従って、有効な免疫を誘発することに成功しないこともあり得よう。サブユニットワクチンは、不活化した全ウィルスによって感染防御が得られる疾患に対してはしばしば無効である０例えば、イヌのパルボウイルスサブユニットから不活化した感染防御ウィルスを得ることはできるが、ウサギにウィルス中和性抗体を誘発することに成功しない（Ｓｍｉｔｈ　＆　Ｗａｌｌｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ、２９：２６３〜２６９　（１９８４）　）　。

組換え体から産生された精製ポリペプチドを含むサブユニットワクチンの代替物として、ウィルス様構造として集合したウィルスキャプシドタンパク質から成る非感染性サブユニット様ワクチンを開発することが可能であろう、かかる非複製ウィルス様粒子は、不活化ワクチンの多くの免疫学的利点とサブユニットワクチンの安全性特徴とを併せて有しているであろう、数人の研究者が、外来ウィルスキャプシドタンパク質を発現し、これらのタンパク質をウィルス様粒子として自己集合させる真核細胞の開発に関して報告している０例えば、ウシ乳頭腫ウィルス／ＣＰＶ組換えアラスミドによって形質転換されたネズミの細胞内でイヌのバルボウイルス（ＣＰＶ）キャプシドタンパク質ＶＰＩ及びＶＰ２を同時発現させると、生化学的に且つ免疫学的に真正ＣＰｖピリオンに類似した自己集合性粒子が形成される（　Ｍａｚｚａｒａら、Ｍｏｄｅｒｎ　Ａ　ｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｖａｃｃｉｎｅ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｎ、Ｙ、、Ｒ，Ｍ、Ｃｈａｎｏｃｋ　＆　Ｒ，＾。

Ｌｅｒｎｅｒ編、４１９〜４２４頁（１９８６）　ＨＭａｚｚａｒａら、ＰＣＴ出顧−０８８／　０２０２Ｂ、公開日１９８８年３月２４日）、感受性のイヌにワクチン接種として使用したとき、これらの中空キャプシドはＣＰＶ抗原刺激に対する感染防御を与える免疫応答を誘発した。別の例では、バキュロウィルス発現系を使用して昆虫細胞中でＨＩＶまたはＳＩＶのＪＬＩＬ前駆体ポリペプチドを発現させると、未成熟のレトロウィルス様粒子が形成され、該粒子は、感染細胞の培養培地に分泌されることが判明した（Ｇｂｅｙｓｅｎら、Ｃｅ１ｌ−１５９：　１０３〜１１２（１９８９）　；　Ｄｅｌｃｈａｍｂｒｅら、ＥＭＢＯＪ、、８　：　２６５３〜２６６０　（１９８９）　）　、　＋１乳類細胞中で、コアポリペプチド及び逆転写酵素を含むＨＩＶ様粒子は、ＳＶ４０後期置換ベクターを用いるＨＩＶ　ＩＩＬ二ＩＬＰ遺伝子の過渡的発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）　＠に産生された（Ｓｍｉｔｈら、ＪＪｉｒｏｌ、、６４　：　２６５３〜２６５９　（１９９０）　）　。

また、少なくともＨＩＶ　ＬＬＬ遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスは、適当な宿主線取に感染するとレトロウィルス様粒子を産生させることが判明した（　Ｋａｒａｅ。

５ｔａｓ　ら　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ　＾、　８６　二　８９６４〜８９６７　（１９８９）；　５ｈｉｏｔａ　＆　５ｈｉｂｕｔａ、　［竺騰江、１７５　：　１３９〜１４８　（１９９０）　）、組換えワクシニア感染細胞中でｍポリペプチドとＨＩＶエンベロープ糖タンパク質とが同時発現し、エンベロープに埋包されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含むエンベロープ付きコア構造を有するＨＩＶ様粒子が形成された。感染細胞中でのｍ遺伝子とｅｎｖ遺伝子との同時発現を得るためには、一方がｅｎｖを発現し他方がＩＬＳ二二」−λ」−を発現する２つの異なる組損えワクシニアを細胞に同時感染させるか（Ｈａｆｆａｒら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６４：２６５３〜２６５９　（１９９０）　）　＋または、ｅｎｖと　ａ　−。■との双方を発現させる単一の組換え体を細胞に感染させる（Ｍａｚｚａｒａら、米国特許出願第０７７３６０　、０２７号及び第０７１５４０，１０９号）。

ウィルスエンベロープ糖タンパク質を含む粒子を産生ずる能力は、ワクチンの開発に重要な関係をもつ、エンベロープを有するウィルス（例えばヘルペスウィルス、レトロウィルス、トガウィルス、ラブドウィルス、パラミクソウィルス、オルトガクンウイルス及びコロナウィルスなど）の脂質外層膜に局在するウィルスエンベロー１糖タンパク質はしばしば、ウィルスの主要免疫原決定基である０例えばＨＩＶの場合、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０は。

ウィルス中和性抗体応答を誘発する重要なエピトープを含んでいる（＾ｒｔｈｕｒ、Ｌ、＾、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｅｉ、Ｕｓ＾、８４：　８５８３〜８５８７　（１９８７）　）　、同様に、ヘルペス単純ウィルスタンパク質クｇＢ及び狂犬病糖タンパク質の双方は、ウィルス中和性抗体応答を誘発し、更に、別のウィルスタンパク質が存在しなくても同族の病原体による抗原刺激に対する感染防御を示したＣ　Ｐａｏｌｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、ｓｅｉ。

」、　８１　：　１９３〜１９７　（１９８４）　：　１ｌｌｉｋｔｏｒ　ら　、　Ｐｒｏｅ　、Ｎａｔ　、　＾ｅａｄ　。

Ｓｃ　ｉ　、　ＵＳ＾、８１　：　７１９４〜７１９８　（１９８４）　）　。

残念ながら、自己気合性ウィルスキャプシドの異種発現に用いることができないことが証明されたウィルスも多数存在する０例えば、ヘルペスウイルスキャアシドの形成には、入手可能な発現ベクターに実際に収容できるよりも多い数の遺伝子の発現が必要であろう、螺旋状ＲＮＡウィルスのようないくつかの別のウィルスの場合は、その粒子集合メカニズムが異種発現系がらのウィルス様粒子の自己集合を可能にするか否かが確かめられていない、しかしながら、エンベロープを有するウィルスのいずれかから得られた膜着タンパク質を含む非感染性の自己集合性ウィルス様粒子を産生できれば有用であろう。

種々の科のウィルスから得られるエンベロープ糖タンパク質は、特に偽型形成（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐ　ｉｎｇ　）または表現型混合として知られた生物学的現象によって異種ウィルス粒子に低頻度で取込まれ得る。同時感染実験においては、１つのウィルス種のゲノムは、別の種から得られた環タンパク質と物理的に結合することを証明し得る。この現象に関する文献（Ｚａｖａｄａ、　Ｊ、Ｃｅｎ、Ｖｉｒｏｌ　、、６３　：　１５〜２４　（１９８２）　）は、例えば、レトロウィルスとトガウィルス、ラブドウィルス、パラミクソウィルスまたはヘルペスウィルスとの間の偽型形成の例を引用している。偽型形成を生起させるためには、２種のウィルスが適合性の生活環を有していなければならない、即ち、いずれのウィルスも他方の複製を妨害してはならない、最近の文献（Ｚｈｕ、　Ｊ、＾ｃ　ｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉ−ｅｎｃ　Ｓ　ｎｄｒｏｍｅｓ、３　：　２１５〜２１９　（１９９０）　）は、ＨＩＶと水痘性口内炎またはヘルペス単純ウィルスとの間の表現型混合を記載している。

ｉｉへ１」本発明は、自己集合性複製欠陥型ハイブリッドウィルス様粒子に間する。少なくとも２つの異なるウィルス種に由来のポリペプチドまたはポリペプチドの部分を含有するこれらの粒子は、１つのウィルス種に由来のキャプシドポリペプチドが１種またはそれ以上の異なるウィルス種に由来の１種またはそれ以上のウィルスエンベロープ糖タンパク質の少なくとも１部分を含む膜によって包囲された集合キャプシドポリペプチドを含む０粒子は、（１）ウィルスキャプシドタンパク質をコードする異種遺伝子と、（２）エンベロープ糖タンパク質をコードする同穫または異種の遺伝子とを発現する組換えＤＮＡウィルスを使用して産生される。

キャプシドタンパク質及びエンベロープ糖タンパク質は同じ組換えウィルス中にコードされ得る。この場合、適当な宿主細胞に組換えウィルスを感染させると、コードされた異種キャプシドタンパク質とエンベロープ糖タンパク質とを含むハイブリッドウィルス様粒子が産生されるであろう、または、キャプシドタンパク質とエンベロープ糖タンパク質とが同じ種の２つ以上の異なるキャリアーウィルスにコードされ得る。この場合、適当な宿主細胞とキャリアーウィルスとの同時感染によってハイブリッドウィルス様粒子が産生される。

本発明はまた、粒子を含むタンパク質を発現する組換えェまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏ″Ｃ親ウィルスと組換えられる中間ＤＮＡベクターに関する。更に、本発明は、非複製型自己集合性ハイブリッドウィルス粒子の産生方法、及び、適当な配合物中で生物医薬として粒子を使用する方法または粒子を発現する組換えウィルスをデリバリ−ビヒクルとして使用する方法に関する。

ハイブリッドウィルス様粒子及び／または該粒子を発現し得るウィルスは、互いに関係のある異種病原体に対するワクチンとして使用され得る０粒子は、例えば、レトロウィルス（ＨＩＶ、ＳＩＶ、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）、ネズミのレトロウィルス、ウマ感染性貧血、ビスナウィルス及びその他のレトロウィルス、など）、または、その他のエンベロープ付きウィルスに由来のキャプシドポリペプチドを、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、トガウィルス、ラブドウィルス、パラミクソウィルス、オルトミクソウィルスまたはコロナウィルスに由来のエンベロープ糖タンパク質と共に含有し得る。これらの粒子は病原性ウィルスに対するワクチン接種のためまたは感染個体における免疫応答増強のような治療目的で免疫原として単独使用されてもよく、または別の免疫原と組み合わせて使用されてもよい０本発明のハイブリッドウィルス様粒子はまた、細胞障害性薬剤または核酸のような治療薬を特定の細胞型に送達するためのターゲット化に使用され得る。

パ　の　ｔ　・図１は、ワクシニア４０にプロモーターの転写調節下に全ＳＩＶ　ｍ二Ｕユ１域を含むプラスミドｐＡｂＴ４６６０の構造の説明図である。

図２は、ワクシニア４０にプロモーターの転写調節下に偽狂犬病ウィルスｇＩＩＩ遺伝子を含むプラスミドｐＡｂＴ４６ｏ２の構造の説明図である。

図３は、ヘルペス単純ウィルス２型のｇＤ遺伝子を含むプラスミドｐＡｂＴ１５２７の構造の説明図である。

のＬｌｌｊ本発明は、自己集合性複製欠陥型ハイブリッドウィルス様粒子に関する。ウィルス粒子が少なくとも２つの異なるウィルス種に由来のポリペプチドを含むのでハイブリッドと呼ぶ６本発明は、偽型形成現象を利用して異種ポリペプチドを結合させ、新規なハイブリッドウィルス粒子として集合させるように設計されている。偽型形成現象は、Ｚａｖａ好ましくは、ハイブリッドウィルス様粒子はレトロウィルスのキャプシドポリペプチド、例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ウマ感染性質血、ビスナウィルスなどのレンチウィルスのようなレトロウィルス、またはネズミ白血病ウィルスのような別のレトロウィルスに由来のキャプシドポリペプチドを含むであろう０粒子はまた、異なるウィルス種に由来のエンベロープ糖タンパク質を含むであろう、かかる別のウィルスは、ＤＮＡウィルスまたはＲＮＡウィルスのいずれでもよい９粒子は更に、ウィルスエンベロープ糖タンパク質に適正に結合されたその他の好ましいポリペプチドを含むであろう、ウィルス粒子は、粒子内部にパッケージされたＲＮＡを実賀的にほとんどまたは全く含まない。

または、ターゲット細胞に異種遺伝子を送達するための特異的ＲＮＡを含み得る。かがるウィルス粒子の産生方法は１９９０年６月１９日出願の米国特許出願ｏ７１５４ｏ。

１０９に記載されている。該特許出頭の記載内容は本発明に含まれるものとする。

ハイブリッドウィルス様粒子の産生方法、これらの粒子を発現する組換えウィルス、及びその使用に関しては以下の項及び実施例において詳細に説明する。

１、ウィルス　ヤプシドポリペプチドをコードする遺−欠陥型の非自己増殖ハイブリッドウィルス粒子として自己集合し得るウィルスポリペプチドをコードする遺伝子は、ＤＮＡウィルスのゲノムＤＮＡまたはＲＮＡウィルスのゲノムｃＤＮＡまたは遺伝子を含む有効な（ａｖａｉｌａｂｌｅ）サブゲノムクローンから得ることができる。これらの遺伝子は、ウィルスキャプシドタンパク質（即ちウィルスタンパク質シェルを含むタンパクｉｔ＞をコードする遺伝子を含むであろう、キャプシドタンパク質の成熟及び粒子の自己集合のためには追加のウィルス遺伝子も必要であろう、これらは例えば、キャプシドタンパク質のプロセッシングの機能を果たすウィルスプロテアーゼをコードするであろう。

自己集合性キャプシドタンパク質をコードする遺伝子の単離ソースとなり得るウィルスの１つの種属は、レンチウィルスであり、ＨＩＶはその一例である。ＨＩＶ　ＬＬＬタンパク質は前駆体ポリペプチドとして合成され、その後にウィルス１０テアーゼによって成熟キャプシドポリペプチドにプロセッシングされる。しかしながら、ＬＬＬ前駆体ポリペプチドは、タンパク質プロセッシングを要せずに自己集合してウィルス様粒子を形成し得る。　（Ｇｈｅｙｓｅｎら、Ｃｅｌ± 、５９　：　１０３　（１９８９）　；　Ｄｅｌｃｈａ＋５ｂｒｅら、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、、８：　２６５３〜２６６０　（１９８９）　、　Ｉ−Ｉ　Ｉ　Ｖキャプシドは、ウィルス糖タンパク質を含むゆるやかな膜状エンベロープによって包囲されている。天然型ウィルスではこれらがＨＩＶ　ｅｎＬ遺伝子によってコードされている。

２、エンベロープタンパク非自己増殖性ハイブリッド粒子を産生させるためには、キャプシド遺伝子のソースとして使用されたウィルス以外のウィルスに由来の１つまたはそれ以上のエンベロープ糖タンパク質の遺伝子の一部または全部が必要である。

エンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子は、多数の多様なエンベロープ付きウィルスのいずれかから単離できる。これらのウィルスは、ＤＮＡＭまたはＲＮＡ類のいずれでもよい。エンベロープ付きウィルスの例は、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、トガウィルス、ラットウィルス、パラミクソウィルス、オルトガクンウイルス及びコロナウィルスである。エンベロー１糖タンパク質の典型的な特徴は、細胞内領域、細胞外領域及びトランスメンブラン領域が区別されていることである。エンベロープ付きウィルスは１種またはそれ以上のエンベロープ糖タンパク質を発現でき、これらのタンパク質はしばしばウィルスの主要免疫原決定基である。ウィルスエンベロープ糖タンパク質はまた、ウィルスが細胞内部に吸着され浸透するために特異的細胞表面レセプターをターゲット化する機能を果たす。

３、祖盈＝口止ノ。

例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ウマ感染性ｉｔｍ及びビスナウィルス、アデノウィルス、ヘルペウイルス及びポックスウィルスのようなレトロウィルスを含む多数のウィルスが非対応抗原を発現するための生きたウィルスベクターとして開発された。Ｃｅｐｋｏら、恒肚、３７　：　１０５３〜１０６２（１９８４）；　Ｍｏｒｉｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｅｉ、Ｕｓ＾、８４　：　４６２６−４６３０（１９８７）　ＨＬｏｓｅら、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、ｓｃｉ、υＳ＾、８４．３８９６〜３９００　（１９８７）　；　Ｐａｎ１ｃａｌｉ　＆　Ｐａｏｌｅｔｔｉ、　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ　。

Ｓｅｉ、ＵＳ＾、７９　：　４９２７〜４９３１　（１９８２）　；　Ｍａａｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｌｌｓ＾、７９　：　７４１５〜７４１９　（１９８２）　、与えられた実施例は、ポックスウィルス科の使用を示している。好ましいポックスウィルスとしては、天然痘ワクチンとして長年使用されてきた比較的良性のウィルスであるワクシニアウィルスがある。ワクシニアウィルスは感染性真核細砲クローニングベクターとして開発され（Ｐａｏｌｅｔｔｉ　＆　Ｐａｎ１ｃａｌｉ、米国特許第４，６０３．１１２号）、組換えワクシニアウィルスはいくつかの実験系でワクチンとしての使用に成功した。このウィルスは非腫瘍性であると考えられており、十分に特性決定されたゲノムを有しており、感染性を喪失することなく大量の外来ＤＮＡを担持し得る。　Ｍａｃｋｅｔｔ、　Ｍ、　＆　Ｇ、Ｌ。

Ｓｍ１ｔｈ、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、６７　：　２０６７　（１９８６）　、別の好ましいポックスウィルスは、家きんの病原体であるニワトリポックスウィルスである。このウィルスもまた、真核細胞クローニングベクターとして開発された。Ｂｏｙｌｅら、１９８７年９月２２日公開のＰＣＴ出願−０８８／　０２０２２及び１９８９年８月２４日公開の−０８９１０７６４４：　１９８８年９月２８日公開のＹａｎａｇｉｄａら、ＥＰ２８４４１６　、１９９１年３月８日公開のＰＣＴ出願−０９０１０２１９０゜本発明の方法によれば、複製欠陥型ハイブリッドウィルス粒子として集合し得るポリペプチドをコードするウィルス遺伝子を、少なくとも１つの親ウィルスのゲノムに、親つイルスノタンパク質の自然相補ｉｌｌ　（ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　）の発現に伴って該遺伝子が発現され得るように挿入する。

このためには、まず、親ウィルスのｉｎ　ｖｉｖｏ組換えに使用されるＤＮＡドナーベクターを構築する。

ＤＮＡドナーベクターは一般に以下の要素を含む＝（ａ）ベクターが原核細胞宿主中で増幅できるような原核細胞性複製起点；（ｂ）ベクターを含む原核細胞宿主を選択し得るマーカーをコードする遺伝子（例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子）；（ｃ）少なくとも２つの異なるウィルスに由来し、各々が隣接遺伝子の発現を指令し得る転写プロモーター（例えばワクシニア７．５Ｋ、３０Ｋ、４０Ｋ、１１ＫまたはＢａｍＦプロモーターまたはこれらのプロモーターの修飾形）の近傍に局在する異種遺伝子；及び（ｄ）（１つ以上の）外来遺伝子が挿入された親ウィルスゲノムの領域に相同のＤＮＡ配列（例えばワクシニアウィルスまたはＨｉｎｄｌＩＩ　Ｍ配列）０項（ｄ）のＤＮＡ配列は項（ｃ）の構築物にフランキングされる。

複数の外来遺伝子をポックスウィルスに多重導入するためのドナープラスミドの構築方法は１９８８年３月３０日公開の欧州特許第０２６１９４０号、「偽狂犬病ワクチン」、に記載されている。該特許の技術は本明細書に含まれるものとする。概して、転写プロモーターを含むフラグメント、外来遺伝子を挿入すべき親ウィルスのゲノム領域に相同の配列を含むフラグメント、のようなフラグメントから成るドナーベクター構築用のウィルスＤＮＡフラグメントはすべて、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはクローン化したＤＮＡフラグメントから得られる。

ドナーベクターは好ましくは、挿入された外来ＤＮＡを含む組換えウィルスを同定できる選択マーカーをコードする追加の遺伝子を別のプロモーターの調節下に含む。組換えウィルスを同定及び単離するために数種のマーカー遺伝子を使用し得る。これらの例として、抗生物質耐性または化学薬品耐性をコードする遺伝子（Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓら、ＪＪｉｒｏｌ　。

、６２　：　１０４６　（１９８８）　：　Ｆａｌｋｎｅｒ　＆　Ｍｏ５ｓ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６２：１８４９　（１９８８）　；Ｆｒａｎｋｅ　ら　、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　、Ｂｉｏｌ　、　、５：１９１８　（１９８５）　、及び大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のように比色アッセイによって組撓えウィルスプラークを同定し得る遺伝子（Ｐａｎｉｃａｌｉら、１阻、４７　：　１９３〜１９９　（１９８６）　）がある。

組換えワクシニアウィルスの選択方法は、ワクシニアにコードされた単一機能、即ち２９に宿主域の遺伝子産物に依存する。　Ｇ１１ｌａｒｄら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾、８３　：　５５７３（１９８６）　、この方法は、１９８９年１２月１８日公開のＰＣＴ出１！ＷＯ３９／１２１０３、「組換エホックスウイルスの選択方法」、に記載されている。該特許出願の記載内容は本明細書に含まれるものとする。

５、ウイルスノゲノム　への　ＤＮＡ　の　゛み　び【ｌＬ鮫へ１１感染細胞内のドナープラスミドＤＮＡとウィルスＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、所望の要素を取込んだ組換えウィルスが形成される。ｉｎ　ｖｉｖｏ組換え用の適当な宿主細胞は一般に、ウィルスに感染し且つプラスミドベクターによってトランスフェクトされ得る真核細胞である。ポックスウィルスと共に適当に使用できるこのような細胞の例は、ニワトリ胚繊維芽細胞、ＲＫ１３（ウサギ）細胞、ＨｕＴＫ１４３（ヒト）ｌＩＩ！胞、及びＣＶ−１及びＢ５Ｃ−４０（双方ともサル腎臓）細胞である。細胞にポックスウィルスを感染させ、これらの細胞をプラスミドベクターでトランスフェクションするためには、当業界の標準技術を用いる（Ｐａｎｉｃａｌｉ　＆　Ｐａｏｌｅｔｔｉ、米国特許第４，６０３゜１１２号）。

ｉｎ　ｖｉｖｏ組換え後に、組換えウィルスの後代を複数の技術のいずれかを用いて同定し得る２例えば、外来遺伝子が親ウィルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）に挿入されるようにＤＮＡドナーベクターを設計したときには、組込まれたＤＮＡを含むウィルスはＴＫ−であり、これに基づいて選択できる（　Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾、７９　：　７４１５　（１９８２）　）　、または、マーカーまたは指標遺伝子をコードする遺伝子と上記のごとき該当する（１つまたは複数の）外来遺伝子との同時組込みを使用して、組換え体の後代を同定し得る。好ましい指標遺伝子の一例は大腸菌Ｉ　ａｃＺ遺伝子である。β−ガラクトシダーゼを発現する組換えウィルスは１色素産生性の酵素基質を使用して選択できる（Ｐａｎｉｃａｌｉら、ε：ｎｅ、　４７　：　１９３　（１９８６）　）　、組換えワクシニアウィルスと共に使用される第２の好ましい指標遺伝子はワクシニア２９に遺伝子である。野性型２９に遺伝子にコードされた機能を発現する組換えウィルスは、ＲＫ−１３細胞で増殖させることによって選択できる。該当する遺伝子を含有する組換えウィルスを同定するための別の方法は、ｉｎ　５ｉｔｕエンザイムイムノアツセイ（ｅｎｚｙｍｅ　ｂａｓｅｄ　ｉ＋＊＋５ｕｎｏａｓｓａｙ　）であり、このアッセイでは一ワクシニア感染細胞によって発現された外来タンパク質をウィルスプラークから検出する。

実施例でより十分に後述するごとく、ＳＩＶまたは偽狂犬病ウィルス遺伝子を含むドナープラスミドは、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ領域またはＴＫ領領域ワクシニアウィルスに取込まれる。どちらの挿入部位を用いた場合にも組損えウィルスを上記のごとく選択し得る。

組換えウィルスの同定後、挿入された遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を検定するために種々の方法を使用し得る。これらの方法として、ブラックプラークアッセイ（ウィルスプラークに対して行なうｉｎ　５ｉｔｕエンザイムイムノアツセイ）、ウェスタンプロット分析、放射性免疫沈降法（ＲＩＰＡ）及びエンザイムイムノアツセイ（ＥＩＡ）がある、ウィルス病原体によって発現された抗原に対する抗体は、容易に入手できるか、または当業界で公知の方法によって製造され得る０例えば、サル免疫不全ウィルスの場合、抗体はＳＩＶ感染したアカゲザルに由来の血清でよい。

７、ウィルス挿入された異種ウィルス遺伝子によってコードされるポリペプチドの合成は前項に記載の発現分析を使用して確認できるが、これらのポリペプチドがｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏで複製欠陥型ウィルス粒子として集合するか否かに間する疑問は解決できない０本発明によれば、これを実験によって容易に決定できる。

レトロウィルスｍまたは　ａ　−ｏｌ遺伝子のようにキャプシドポリペプチドを発現させる第１のＤＮＡキャリアーウィルスと、エンベロープ糖タンパク質遺伝子を発現させる第２のキャリアーウィルスとを細胞にｉｎ　ｖｉｔｒｏ感染させる。好ましくは、細胞に同時感染させる。

より好ましくは、同種のキャリアーＤＮＡウィルスによって同時感染させる。または、キャプシドポリペプチド遺伝子とエンベロープ遺伝子との双方を発現させる単一キャリアーウィルスを使用してもよい。

自己集合が生じるためには、キャプシド及びｅｎｖの遺伝子産物がほぼ同時に発現しなければならない、これは通常の知識を有する当業者によく知られた種々の方法によって容易に得られる０例えば、異種のｅｎｖ遺伝子とキャプシド遺伝子とを含む１つのウィルスベクターを使用し得る。

または、１つのウィルスベクターが異種キャプシド遺伝子を発現させ且つ第２のウィルスベクターがｅｎｖ糖タンパク質を発現する遺伝子を含むような２つのウィルスベクターを同時に細胞に感染させてもよい、ウィルスベクターが同様の生活環を有しているのが好ましく、その結果としてキャプシド及びｅｎｖの遺伝子産物がほぼ同時に発現される。ウィルスベクターが同じウィルスゲノムに対応するのがより好ましい、別の実施態様においては、ｅｎｖ及び／またはキャプシドの遺伝子を誘発プロモーターの調節下に維持し得る（例えば、１９９１年５月２日公開のＨａｙｎｅｓらのｐｃＴ出願１ｌＩ０９１１０５８６’４照）、これらの遺伝子がほぼ同時に「オン」になり、夫々の遺伝子産物をほぼ同時に発現し、従って、粒子の自己集合が可能になる。別の実施態様においては、一方の遺伝子だけを誘発プロモーター、例えばヒトメタロチオネインＩｌａプロモーターの調節下に維持する必要がある０次に、このウィルス遺伝子を含むｌｌ５ｌＩｌを別のウィルスベクターによって形質転換し、線取内に既に存在していた遺伝子を誘導してその調節下に、細胞の形質転換に使用されたベクターの遺伝子の発現と一致するようにキャプシド遺伝子またはｅｎｖ遺伝子を発現させる。

異種ウィルスポリペプチドを発現する組換えウィルスによって産生される欠陥型ハイブリッドウィルス粒子を特性決定するために、放射性標識アミノ酸の存在下に（１種または複数の）組換えウィルスを細胞に感染させる０次いで高速遠心を使用して培養培地から粒子を沈降させる。培養培地の遠心によって得られたベレットを再懸濁させ、ベレットと上清との双方を適当な抗血清で免疫沈降させ、得られた各分画中に存在するポリペプチドを分析する０例えば、ＳＩＶキャプシドポリペプチドを発現する組換え体の場合には、キャプシドポリペプチドを分析するためにアカゲザル抗ＳＩＶ抗血清を使用し得る。糖タンパク質に特異的な第２抗体を使用して粒子調製物中の糖タンパク質の有無を検出する。

培養培地の遠心によって得られたペレット化物質を更に特性決定するために、ベレットを再懸濁させ、ショ糖濃度勾配遠心によって分析してもよい０次に勾配を分画化し、分画を適当な抗血清で免疫沈降させる。これらの実験は、ベレットが欠陥ウィルス粒子の予想密度にバンドを生じるキャプシド物質を含有するか否が、及び、エンベロープ糖タンパク質がこの密度にバンドを生じる欠陥型ウィルス粒子と特異的に結合しているが否かを示す。

または、ハイブリッド粒子の形成を電子謬微鏡を用いて証明してもよい、キャプシド及びエンベロープ糖タンパク質遺伝子を発現する（１種または複数の）組換えウィルスを適当な宿主細胞に感染させ、上記と同様の高速遠心によって培養培地から粒子を採集する０粒子の表面にエンベロープ糖タンパク質が存在するか否がを、エンベロープ糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いたイムノゴールド染色及び電子厘微鏡観察を順次行なうことによって法覆製欠陥型ハイブリッドウィルス粒子として自己集合し得る異種ウィルス抗原を発現する生きた組換えウィルスベクターは、欠陥型異種ウィルス粒子の発現に使用されたウィルスベクターが、ワクチン接種した宿主に感染するが有意な疾患を発症させない場合には、感染に感受性のヒトまた動物用のワクチンとして使用できる。かがる良性ウィルスベクターの例としては、ある種のポックスウィルス、アデノウィルス及びヘルペスウィルスがある。

または、これらの組換えベクターウィルスによって産生された欠陥型ハイブリッドウィルス粒子は、組換えベクターウィルスでｉｎ　ｖｉｔｒｏ感染させた細胞の培養培地から単離できる。ウィルス感染に感受性の個体のワクチン接種に使用される精製粒子は、適正なエンベロープ糖タンパク質を宿主免疫系に与えるであろうが、感染性のウィルス遺伝物質は含んでいないであろう、従って、感染予防ワクチンとしては従来の北回ウィルスワクチン調製物の利点を維持しており、しかも死菌ウィルスのワクチン使用に伴う主要な欠点は解消されている。この欠点は例えば、死菌ウィルスワクチン調製物の不完全な不活化の危険があること、及び、レトロウィルスのようなある種のウィルスの場合に全ウィルスゲノム（例えばＨＩＶゲノム）を血清陰性個体に導入し難いこと、などである。

これらの複製欠陥型ハイブリッドウィルス粒子を利用するワクチン組成物は一般に、医薬として許容されるビヒクル中に免疫感作量のウィルス粒子を含有するであろう、ワクチンは、定量製剤に適合する方法で治療有効量且つ免疫原性量で投与されるであろう。

Ｉ！に後に、精製された粒子をワクチン接種の全プロトコルの一部として生きた組換えウィルスと組み合わせて使用してもよい、この場合、粒子を一次免疫感作物質として使用し、生きた組換えウィルスを後でワクチン接種してもよく、または生きた組換えウィルスによる一次ワクチン接種後に全免疫応答を追加刺激するために粒子を使用してもよい。

９、及菓二ム４プ」ラドウィルス　し　ム　ウィルス　る　゛ウィルスの゛　、　・これらの　゛ウィルスによって　された　バイブ１ツドウイルス　の゛　、免疫感作によって初期感染に対する防御を与えることができない場合でも、ハイブリッド粒子を予め感染させることによって行なう個体の免疫感作は、ある稽のウィルスに対しては発病を防御するために十分な追加免疫刺激になるであろう０例えば狂犬病ワクチンはこのようにして治療に使用されている。または、潜伏期間を有するウィルスの場合には、感染個体の免疫感作によって個体内部での該ウィルスの潜伏期間が延長されるであろう（Ｓａｌｋ、Ｎａｔｕｒｅ、３２７：４７３〜４７６　（１９８７）　）。これは、ＨＩＶまたはヘルペスウィルス感染のような長い潜伏期間を特徴とするウィルス感染の場合に特に重要であろう。

本発明の欠陥型ハイブリッドウィルス粒子はまた、異種遺伝子（例えばアンチセンス遺伝子、毒素をコードする遺伝子、免疫原をコードする遺伝子）をターゲット化細胞に送達するために使用され得る。かかるウィルス粒子を産生ずる方法は、１９９０年６月１９日出願の米国特許出願０７１５４０．１０９に記載されている。該特許出願の記載内容は本明細書に含まれるものとする。ハイブリッドウィルス粒子は、ターゲット細胞中で直接翻訳されコードされたタンパク質産物になるｍＲＮＡをターゲット細胞に送達するために使用される。または、活性逆転写酵素及びその他のＬＬ二にコードされた機能を含むハイブリッドレトロウィルス粒子内にパッケージされた特異的ＲＮＡがターゲット化細胞に送達され逆転写されてＤＮＡを生じる。このＤＮＡが次に宿主ゲノムに取込まれ、コードされた遺伝子が宿主転写／翻訳メカニズムによって発現されるであろう、これらの方法は、ターゲット化細胞（例えばウィルス感染細［２１＞毒性産物をコードする遺伝子を送達するために使用できる。別の用途では、コードされた遺伝子産物に対する免疫応答を誘発するために異種遺伝子をコードするＲＮＡを含む粒子を個体に投与し得る。

１０、ＩＩＬＵ　ターゲット　での　ハイブリッドウィルス　の゛欠陥型非自己増殖ウィルス粒子はまた、ウィルスレセプターを有する細胞にある種の薬１Ｉｉｑ（例えば細胞障害薬、抗ウィルス薬、核酸）を送達するために使用できる。この種の薬剤は、当業界で公知の技術によってウィルス粒子の外面に結合するかまたはその内部に取込まれ、ターゲット細胞に高い特異性で送達され得る０例えば、細胞障害薬は、欠陥型ＨＩＶ粒子に結合し、高度の特異性でＣＤ４”　Ｔ細胞に送達され得る。その理由は、これらの粒子の上に存在するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質がＣＤ４分子に特異的に且つ高親和性で結合するからである。

治療薬の特異的ターゲット化のためには、特定の細胞型の表面レセプターに向性を有する糖タンパク質を異種糖タンパク質として選択するとよい０例えば、ヘルペスウィルス糖タンパク質を含むハイブリッド粒子は神経系の細胞をターゲット化するために使用できる。また、Ｂ型肝炎表面抗原を含むハイブリッド粒子は肝細胞をターゲット化するために使用できる。

本発明を実施例によって以下に詳細に説明する。

Ｘ１目１１１１１す１ウィルスすべてのプラスミドの増殖用宿主としては、大腸菌ＭＣ１０６１株（Ｃａｓａｄａｂａｎ　＆　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、Ｍｏ１−、Ｂｉｏｌ、、１３８：１７９（１９８０）　）を使用した。ワクシニア感染及びトランスフェクションのためには、サル腎臓細胞系Ｂ５Ｃ−４０（Ｂｒ。

ｅｋｓａｎ　＆　Ｎａｔｈａｎｓ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾、　７１　：　９４２（１９７４）　）及びウサギ腎臓細胞系ＲＫ−１３（＾ＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ３７　；　Ｂｅａｌｅら、Ｌａｎｃｅｔ、２　：　８４０　（１９６３）　）を使用した。５％ウシ胎仔血清（Ｆｅ２）を補充したダルベツコ改質イーグル培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　＋　Ｇｉｂｃｏ、　にｒａｉｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ　Ｙ　）中で細胞を増殖させた。

２９に−１ａｃＺ＋菌ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　３３株（１９８８年６月１０日出願の米国特許出願第２０５，１８９号参照、該特許出願の記載内容は本明細書に含まれるものとする）をｉｎ　ｖｉｖ。

組換え用の親細胞として使用した。ウィルス感染、トランスフェクション、プラーク精製及びウィルス増幅はほぼ記載された手順（５ｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓら− ＪＪｉｒｏｌ　、、６２　：　１０４６　（１９８８）で行なった。

クローニング制限酵素消化、ＤＮＡフラグメント及びプラスミドの精製、Ｋｌｅｎｏｗ、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、仔つシ腸アルカリホスファターゼ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、またはリンカ−によるＤＮＡの処理、大腸菌の形質転換はほぼ記載された手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕユａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ−Ａ玉ａｂｏ−ｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８２．該大獄の記載内容は本明細書に含まれるものとする）で行なった。制限酵素はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏｌａｂｓまたはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ−がら入手した。

ＤＮＡポリメラーゼの大きいフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）はＵｎｉｔｅｃｌ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｃｌ　Ｂｉｏｌａｂｓがら入手し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ及び仔つシ腸アルカリホスファターゼはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した。

ｖｏ［換えに使用されるＳＩＶ遺伝子を含む組損えプラスミド（ＩＶＲベクター）の構築を説明する。プラスミドｐＡｂＴ４５７９の構築及び構造は１９８９年１２月１４日公開のＰＣＴ出願ＷＯ３９／１２０９５４．：記載されテイル。

プラスミドｐＡｂＴ４５９２及びｐＡｂＴ４５９３の構築及び構造は１９８９年６月１日出願の米国特許出願第３６０．０２７号に記載されている。これらの特許出願の記載内容は本明細書に含まれるものとする。

ａ、ＡｂＴ　６６０の　１プラスミドｐＡｂＴ４５９２をＨｉｎｄｌｌＩで部分消化し、次いでＳａｃ　Ｉで完全に消化したｉｌｌｌｌプレプリコンノムのＨｉｎｄｌｌ１Ｍ領域に組込まれるワクシニア配列、ワクシニア４０にプロモーター及びＳＩＶ　Ｌ３ＪＬ遺伝子を含む約４９９０塩基対（ｂｐ）のフラグメントを単離した。このフラグメントと、プラスミドｐＡｂＴ４５７９をＨＩｎｄｌｌｌ及びＳａｃ　Ｉで完全消化した後に得られた３７８０ｂｐのフラグメントと結合させるとプラスミドｐＡｂＴ４６６０が得られた。ｐＡｂＴ４６６０は、全５ＩＶａ−ｏ１領域をワクシニア４０にプロモーターの転写指令下に含んでいた。

Ｋ１１エウィルス　ＰＲＶ）の　ＩＩＩ　−を　む　えブースミドのこの実施例では、ワクシニアウィルスによるｉｎ　ｖｉｖｏ組換えに使用されるＰＲＶ　ｇｌｌｌ遺伝子を含む組換えプラスミド（ＩＶＲベクター）の構築を説明する。プラスミドｐＡｂＴ１７５の構築及び構造は１９８８年３月３０日公開の欧州特許第０２６１９４０号に記載されている。プラスミドｐＡｂ７４５８７の構築及び構造は、１９９０年２月２２日公開のＰＣＴ出願ＷＯ９０１０１５４６に記載されている。これらの特許出願の記載内容は本明細書に含まれるものとする。

ａ、ＡｂＴ４６０２の　２プラスミドｐＡｂＴ１７５を消化し−ＰＲＶ　ｇｌＩＩ遺伝子を含む２５００ｂｐのＮｃｏＩフラグメントを単離した。ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントによって両端を修復した。このフラグメントと、Ｓｍａ　Ｉで消化し仔つシ腸ホスファターゼで処理しておいたベクターｐＡｂＴ４５８７とを結合した。この結果、ワクシニアウィルス４０にプロモーターの下流にｇｉｌｌ遺伝子が配置されたｐＡｂＴ４６０２が得られた。

Ｘｌ」［とＳＩＶ　ａ　−ｏｌ　またはＰＲＶ　ＩＩＩ　仁ワクシニアウィルスの組換えワクシニアウィルスの製造方法ではｉｎ　ｖｉｖ、９−組換えが使用される（　Ｎａｋａｎｏら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ。

贋イ１．７９　：　１５９３　（１９８２）　；　Ｐａｏｌｅｔｔｉ　＆　Ｐａｎ１ｃａｌｉ、米国特許第４，６０３，１１２号）、これらの組換えウィルスは、ワクシニアウィルスを感染させておいた細胞に該当遺伝子を含むＤＮＡをトランスフェクトすることによって形成される。少ない割合の後代ウィルスがワクシニアゲノムの特定部位に組込まれた該当遺伝子を含むであろう、これらの組換えウィルスは、外来起源の遺伝子を発現し得る。Ｐａｎ１ｃａｌｉ　＆　Ｐａｏｌｅｔｔｉ−Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾、７９　：　４９２７（１９８２）　；　Ｐａｎ１ｃａｌ　ｉら、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾　８０　：　５３６４（１９８３）　。

ａ、ワクシニア　イルスｖＡｂＴ３３　への５ＩＶａ−０１のワクシニアウィルスｖＡｂＴ３３株のＨｉｎｄｌｌｌ　Ｍ領域でワクシニアウィルスゲノムに５ＩＶａ−。

Ｌ遺伝子を挿入するために、この領域に局在する２９に宿主域遺伝子に基づく選択スキームを使用した。　Ｇ１１ｌａｒｄら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾、８３　：　５５７３　（１９８６）　、組換えワクシニアウィルスｖＡｂＴ３３は、２９に遺伝子の一部分に買換した１ａｃＺ遺伝子を含む、この１ａｃＺ挿入によって２９に遺伝子の機能が破壊される。従って、ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　３３は、２９に遺伝子産物を要するＲＫ−１３細胞ではほとんど増殖しない、更に、ｖＡｂＴ３３は、ｌ　ａｃＺ遺伝子の存在によってβ−ガラクトシダーゼの色素産生性基質Ｂｌｕｏｇａｌ　（登録商標）の存在下に透過細胞上に青色プラークを形成する。１９８９年１２月１８日公開のＰＣＴ出願ＷＯ３９／１２１０３参照。

ワクシニアウィルスｖＡｂＴ３３を感染させたＢ５Ｃ−４０細胞にＩＶＲベクターｐＡｂＴ４６６０をトランスフェクトした。ウィルス感染及びプラスミドトランスフェクションはほぼ記載された手順（Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６２：　１０４６　（１９８８）　）で行なった０組換えウィルスをＢｌｕ。

ｇａｌの存在下にＲＫ−１３細砲上の白色プラークとして選択した。プラークを採取し、精製し、ｖＡｂＴ３９４と命名した最終組換え体を増幅させた。

ｂ、ワクシニアｖＡｂＴ３３　へのＰＲＶ　ＩＩＩのワクシニアウィルスのＨｉｎｄ［ＩＩ部位でワクシニアウィルスゲノムにＰＲＶ　ｇｉｒｌ遺伝子を挿入するために、Ｂ５Ｃ−４０細胞にｖＡｂＴ３３を感染させ、ｐＡｂＴ４６０２でテランスフェクトし、実施例３ａに記載のスキームによって組換え体を選択した。

これにより、ワクシニア組換え体ｖＡｂＴ２８２が得られた。

ｃ、ｖＡｂＴ３９４　びｖＡｂＴ２８２の　ンプロットた１ワクシニアウィルス感染細胞から記載された方法でＤＮＡを抽出しくＥｓｐｏｓｉｔｏら、ＪＪｉｒｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１）５（１９８１）　）、制限酵素消化及び５ＩＶａ−ｏ１遺伝子またはＰＲＶ　ｇｌｌｌ遺伝子に対応する放射性標識プローブとのサザンハイプリダイゼーシタンによって分析した。　Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ−１Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｆｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＮＹ　（１９８２）　。

この分析によって、組換えウィルス内部にこれらのＳＩＶ及びＰＲＶの配列が存在することが確認された。

え１燵上えワクシニアウィルスに、染した　からの５ＩＶＰＲＶ　の　゛本質的に１９８８年３月３０日公開の欧州特許第０２６１９４０号に記載の方法で組換えワクシニアウィルスｖＡｂＴ３９４及びはｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　２８２を感染させたＢ５Ｃ−４０またはＲＫ−１３細胞を（”Ｓ）−メチオニンで代謝標識し、その後に免疫沈降によって分析した。該特許の記載内容は本明細嘗に含まれるものとする。ｖＡｂＴ２８２によって発現されたｇｌＩＩを免疫沈降させるためにモノクローナル抗体Ｍ　７　（Ｈａｍｐｅｌら、ＪＪｉｒｏｌ、、５２　：　５８３〜５９０（１９８４）　）を使用した。ｖＡｂＴ３９４によって発現されたＳＩＶタンパク質を免疫沈降させるためにＩｇＧ精製したアカゲザル抗ＳＩＶ抗血清を使用した０表１に要約した結果は、これらのワクシニア組換え体の各々が、コードされた（１つまたは複数の）ポリペプチドを発現することを示す。

衣」− ゛ワクシニアウィルスからのＳＩＶ　びＰＲＶポリペプチドの　゛゛ワクシニア　１友ｌｉｉ　検」壮」−ンノｊクニ質−ｖＡｂＴ３９４　ＳＩＶ　Ｌｌ」１−ｐ８６．ｐ５５、ｐ４２．ｐ３２、ｐ２７．ｐ１７、ｐｌＯ１ｐ９ｖ　ＡｂＴ２９２　ＰＲＹ　ｇ　ＩＩＩ　ｇｐ７６ｍエワクシニア　゛　ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　２８２　ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　３９４の０　感　によって　されたハイブリッドレトロウィルスの」１比− ワクシニア組換え体ｖＡｂＴ３９４（ＳＩＶ　Ｋ」工り二−Ｌｌ二）が哺乳類細胞に感染したときにレトロウィルス様粒子が産生されること、及び、ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　３９４とｖＡｂＴ２８２　（ＰＲＶ　ｇｌｌＩ）とが哺乳類細胞に同時感染したときにＳＩＶコアタンパク質及びＰＲＶ　ｇＩＩＩエンベロープ糖タンパク質を含むハイブリッドレトロウィルス様粒子が産生されることを示すために、以下の実験を行なった。

実施例３に記載のような（３５Ｓ）−メチオニンの存在下にＢ５Ｃ−４０細胞にｖＡｂＴ３９４及びｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　２８２を個別に及び−緒に感染させた。感染の１６〜１８時間後に、各感染の培養培地を収集し、３０００ｒｐｍで５分間の遠心を２回行なって清澄化した。清澄化した培地を２５゜０００ｒｐｍで９０分間遠心した。上清を除去した後で、得られたペレットの各々を４００μｌのＩＰバッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ　ｐＨ７，２，０，５ｍＭのＮａＣ１，１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１％のＮａＤＯＣｌｏ。

１％のＳＤＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビター）に再懸濁させた０次に、３つのペレットサンプルの各々を、実施例４と同様に、アカゲザル抗ＳＩＶ抗体及び抗ＰＲＶ　ｇｌｌｌモノクローナル抗体Ｍ７を用いた免疫沈降処理によって分析した。結果を表２に示す。

宍」しｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　３９４　び　またはｖＡｂＴ２８２に７　したの　に　れかウィルス　からのＳＩＶ　びＰＲＶポ魯ベプ　ドの　゛恐ｊしム歪通≦（１月ＪｉＪＬ　挾１ビー乙が）」ＬｖＡｂＴ３９４（ＳＩＶ□ ）Ｍ７無ｖＡｂＴ３９４　アカゲザル抗ＳＩＶ　ｐ６６、ｐ５ｊｐ４２、ｐ３２ｐ２７、ｐ１７、ｐｌｏ、ｏ９ｖＡｂＴＺ８２（ＰＲＹ　ｇｉｌｌ）　Ｍ　７　ｇｐ７６（弱）ｖＡｂＴ２８２　アカゲザル抗ＳＩＶ　無ｖＡｂＴ３９４＋ｖＡｂＴ２８２　Ｍ　７　ｇｐ７６ｖＡｂＴ３９４＋ｖＡｂＴ２８２　アカゲザル抗ＳＩＶ　ｐ６６、ｐ５５、ｐ４２、ｐ３２ｐ２７、ｐ１７−ｐｌｏ−ｐ９これらの結果は、ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　３９４が、感染細胞の培養培地中に遊離され高速遠心によって培地からベレット化され得るｍ及びＰユ９」エポリペプチドを含む構造を産生することを示した。これらの構造がレトロウィルス様粒子であると考えられる。更に、細胞にｖＡｂＴ３９４とｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　２８２とを同時感染させると、ＳＩＶポリペプチドとＲＰ　Ｖ　ｇ　ＩＩＩとの双方を含む細胞外構造が産生される。ｖＡｂＴ３９４とＶＡｂＴ２８２とを細胞に同時感染させたときに培養培地からベレット化された物質の免疫沈降によって検出されたｇ　ＩＩＩの量は、ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　２８２をｌＩＩＩｇ！！に単独感染させた場合に比べてかなり多い、これらの結果は、２つの組換えワクシニアウィルスによって同時感染させると、Ｐ　ＲＶ　ｇ　ＩＩＩ糖タンパク質分子を含む膜で包囲されたＳＩＶコアを含むハイブリッドウィルス様粒子が得られることを示す。

実施例６辻Ｖ　びＰＲＶ　ワクシニア　゛　のｉ泉たよユニ１１番　ｆ−ハ　ブト・ドレ　ロウイルス粒子の一：４ｖＡｂＴ２８２とｖＡｂＴ３９４とを同時感染させた薯胞からＳＩＶキャプシドポリペプチドとＰＲＶ　ｇＩＩＩ糖タンパク質との双方を含むレトロウィルス様粒子が産生されることを確認するために、以下の実験を行なった。

実施例４に記載したように、Ｂｓ５）−メチオニンの存在下に組換えワクシニアウィルスｖＡｂＴ２８２及びｖＡｂＴ３９４を、細胞あたり１０プラ一ク形成単位（ｐｆｕ）の多重度でＢ５Ｃ−４０細胞に同時感染させた。感染の２０〜２４時間後に培養培地を収集し、３０００ｒｍｐで５分間の遠心を２回行なって清澄化した０次に、清澄化した培地を２５、ＯＯＯｒｐｍで９０分間遠心してウィルス様粒子をベレット化した。上清を除去し、得られたベレットを３ｍｌのＰＢＳバッファ（１３６ｍＭのＮａＣｌ　、２．７ｍＭのＫＣＩ、８．１ｍＭのＮａ、ＨＰＯ，，１，５ｍＭのＫＨ２ＰＯ，）に再懸濁させた。再懸濁したベレットを１５〜４５％の連続ショ糖密度勾配に入れ、５Ｗ２８０−タ内で２５．０００ｒｐｍで９０分間遠心した。分画を１滴ずつ収集した。各ショ糖勾配分画のサンプルを、実施例４に記載のごとく、アカゲザル抗Ｓ■■抗血清またはマウスモノクローナル抗−ＰＲＶ　ｇＩＩＩ（Ｍ７）を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、タンパク質バンドをシンチレーションオートフルオログラフィー　（Ｂａｎｎｅｒ　＆　Ｌａ５ｋｅｙ、５Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４６　：　８３〜８８　（１９７４）　）によって可視化した。プロセッシングしたｍポリペプチド、逆転写酵素及びエンドヌクレアーゼを含むＳＩＶ特異特異的タンパクンバンドＩｖ粒子の予想密度の勾配中に同時沈降した。これらの結果は、ベレット化された物質がレトロウィルスポリペプチドの単なる凝集塊でなくレトロウィルス様粒子を含むことを示す。これらの分画中のＰ　ＲＶ　ｇ　ＩＩＩの有無も分析した。結果は、　ａ　−０１抗原のピーク濃度を含むショ糖勾配分画がｇ　ＩＩＩ抗原のピーク濃度も含むことを示した。

これらの結果は、組換えワクシニアから産生されたｇｌｌｌ、ｍ及びＬＬ二タンパク質が自己集合してハイブリッドレトロウィルス様粒子を形成し得ることを強力に示唆する。

！ワクシニアプロモー　−の−　に５ＩＶａ−。

ｌ　ウマヘルペスウィルス−ＩＥＨＶ−Ｂ−のワ　シニ　゛　のキャプシドポリペプチドと該当ウィルス糖タンパク質との双方を発現させる単一の組換えウィルスからハイブリッドウィルス粒子を産生ずることが可能である０例えば、ゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ領域に挿入されたＳＩｖ　ＪＬｉＬ二ＬＬＬ遺伝子を含む組換えワクシニアウィルス（ｖＡｂＴ３９４）は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（ゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ　Ｊ領域）に挿入したエンベロープ糖タンパク質遺伝子を適当なＩＶＲベクターとのｉｎ　ｖｉｖ。

組換えによって挿入するための親ウィルスとして使用できる。この目的に適う１つのＩＶＲベクターはｐＡｂＴ８１７であり、その構築は１９９０年２月２２日公開のＰＣＴ出１１ＷＯ９０１０１５４６に記載されている。該特許出願の記載内容は本明細書に含まれるものとする。ｐＡｂＴ８１７は、ワクシニア４０にプロモーターの調節下のウマへルベスウイルスーｌ　（ＥＨＶ−１）糖タンパク質Ｂ　（ｇＢ）遺伝子と、ワクシニア内の組換えを指令するワクシニアＴＫ遺伝子と、組換え体を選択するためのワクシニアＢａｎＦプロモーターの調節下の大腸菌１　ａｃＺ遺伝子と、細菌レプリコンと、大腸菌中で増殖及び選択するためのアンピシリン耐性遺伝子とを含んでいる。

ＥＨＶ−１ｇＢ及び５ＩＶａ−ｏｌを同時発現させる組換えウィルスを得るために、ＩＶＲベクターｐＡｂＴ８１７を、ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　３９４に感染させたＴＫ−宿主細胞（Ｈｕ１４２ＴＫ−）にトランスフェクトし得る。ワクシニアＴＫ遺伝子に外来ＤＮＡを挿入することによってＴＫ−となった所望の組換え体は、ＴＫ“ウィルス致死性であるが組換えＴＫ−ウィルスを増殖させ得るブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）を用いて選択できる。更に、組換えウィルスは、大腸菌１　ａｃＺ遺伝子を含み、β−ガラクトシダーゼを発現する。従って、Ｂｌｕｏｇａｌの存在下で青色プラークを形成する能力に基づいて組換えウィルスを同定することもできる。

この組換えウィルスに感染した細胞中でキャプシドが形成されることは、本質的に前記の実施例に記載の手順で証明できる。５ｒＶａ−ｏｌ及びＥＨＶ−１ｇＢタンパク質の双方を発現する組換え体を細胞に感染させた後で、ＥＨＶ−１ｇＧ糖タンパク質及びＳＩＶキャプシドタンパク質を含むウィルス様粒子の産生を証明するために、本文中に記載した沈降、免疫沈降及びＰＡＧＥなどの方法によって培養培地を分析する。

！Ｌ［ｆＬＬ。

ヘルペス　ウ　ルス２　ＨＳＶ−２の　Ｄ”ブース之ドベクターの　３この実施例は、ワクシニアウィルスに挿入するためのＨＳＶ−２ｇＤ遺伝子（ｇＤ２）を含む組換えプラスミドベクターの構築を示す。

Ｖｉｃｋｉｅ　Ｌａｎｄｏｌｆｉ　（Ｌｅｄｅｒｌｅ−Ｐｒａｘｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　ＰｅａｒｌＲｉｖｅｒ、　Ｎ　Ｙ　）から得られたプラスミドｐ３２２ｇＤ−２を５ｐｅＩ及びＰｓｔＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理した。得られたｇＤ２遺伝子を含む１４００ｂｐのフラグメントを、Ｓｍａ　Ｉで消化し仔つシ腸ホスフェートで処理しておいたプラスミドベクターρＡｂＴ４５８７に結合すると（前記実施例２参照）、プラスミドｐＡｂＴ１５２７が得られた。ｐＡｂＴ１５２７はｇＤ２遺伝子をワクシニアウィルス４０にプロモーターの調節下に含んでいた。

えＩ匠１ＨＳＶ−２の　Ｄ　゛ワクシニアウィルスへ１１ｇＤ２遺伝子をワクシニアウィルスのＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ部位でワクシニアウィルスゲノムに挿入するために、Ｂ１０−４０細胞にｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　３３を感染させ、ｐＡｂＴ１５２７でトランスフェクトし、組換えウィルスを選択し、実施例３ａに記載の手順で精製した。この結果としてワクシニア組換え体ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　５０９が得られた０組換えウィルスゲノム中にｇＤ２が存在することを確認するために、ｖＡｂＴ５０９に感染した細胞からＤＮＡを抽出し、実施例３Ｃに示したように、制限酵素消化及びｇＤ２遺伝子に対応する放射性標識１０−ブを用いたサザンハイプリダイゼーシタンによって分析した。

Ｘ１ヱ１−四 ′ワクシニアウィルスに、した　に　の　Ｄ２１１Δた１丸１Ｖｉｃｋｉｅ　Ｌａｎｄｏｌｆｉ　（Ｌｅｄｅｒｌｅ−Ｐｒａｘｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　ＰｅａｒｌＲｉｖｅｒ、Ｎ　Ｙ　）から得られたＤＬ６と命名されたｖＡｂＴ５０９及び抗ｇＤ２モノクローナル抗体を用いて実施例４に記載のごとく免疫沈降分析を行なった。その結果から、ｖＡｂＴ５０９に感染した細胞中でｇＤ２抗原が産生することが確認された。

え１１ＬＬワ　シニア　ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　５０９　ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　３９４のに　つ　れたバイブ１ツドレトロウイルス子！口１比− ｖＡｂＴ３９４とｖＡｂＴ５０９　（ｇＤ　２　）とを哺乳類＃ｉｌ！ｉＩに同時感染させると、ＳＩＶコアタンパク質とＨ３ＶｇＤ２糖タンパク質とを含むハイブリッドレトロウィルス様粒子が産生されることを証明するなめに、以下の実験を行なった。集密的Ｂ５Ｃ−４０細胞に５ｐｆｕ／細胞の感染多重度で、ｖＡｂＴ５０９単独またはｖＡｂＴ３９４単独またはｖＡｂＴ５０９とｖＡｂＴ３９４との双方を感染させた。感染２０時間後に培養培地を採取し、３，０００ｒｐｍで１０分間ずつ２回遠心して清澄化した。５Ｗ２８゜１０−タ内で１２０，０００ｇで９０分間遠心することによって各サンプル中の粒状物質を採気した。各サンプルに由来のペレット化物質を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ７，２中の１．０ｍｌの１０％グリセロールに再懸濁させ、５Ｗ２８．１０−タ内で１２０，０００ｇで９０分間遠心し、１．０ｍｌの６０％ショ糖クッションに積層した１５−４５％直線ショ糖勾配に通した。ショ糖勾配を管の底部から滴下させて分画化した０次いで、分画をクロロホルム／メタノール沈殿させ、サンプルを１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた０分離したタンパク質を電気泳動によってミリポアフィルタ−に移し、タンパク質をｇＤ２特異的モノクローナル抗体ＤＬ６またはアカゲザル抗ＳＩｖ血清と反応させた。フィルターに結合した抗原／抗体複合体を化学発光性の第二抗体との反応によって可視化した。

ワクシニア組換えｖＡｂＴ５０９に感染した細胞から得られたベレット分画中のｇＤ２は、ショ糖勾配沈殿後に、勾配の頂部近傍に泳動した。この糖タンパク質は、清澄化培地の超遠心によってペレット化された膜フラグメントに対応すると推定される。これに対して、ｖＡｂＴ３９４に感染した細胞から得られたベレット分画中に含まれていたＳＩＶポリペプチドの大部分は、レンチウィルス様粒子の予想密度に対応する勾配分画中に局在していた。

単独感染で得られた結果と対照的に、ｖＡｂＴ５０９及びｖＡｂＴ３９４に同時感染した細胞から得られたペレット化物質に含まれていなｇＤ２の大部分は、ＳＩＶ様粒子の密度に対応する勾配分画中のＳＩＶポリペプチドと共沈した。これらの結果は、ＳＩＶコアタンパク質とＨ３ＶｇＤ２糖タンパク質とを含む偽型ウィルス様粒子が、これらのポリペプチドを発現する組換えワクシニアウィルスに同時感染した細胞中で産生されることを示す。

え１１ＬＬＤ２　ＳＩＶウィルス　の偽型ウィルス様粒子（ＶＬＰ−ｇＤ２）ＩＩ製物を、各ウィルスの感染多重度３ｐｆｕ／細胞でｖＡｂＴ３９４及びｖＡｂＴ５０９に１８時時間待感染させたＢ５Ｃ−４０４８１胞培養物（５Ｘ１０−細胞）の５つの回転培養瓶の上清培地から調製した。上清培地を３．ＯＯＯｒｐｍで１０分間ずつ２回遠心することによって清澄化した。清澄化した上清を２５％ショ糖クッションの頂部に積層し、５ｗ２Ｂロータ内で１２０，０００ｇで９０分間遠心した。沈殿物を５００μｌのＰＢＳに再懸濁させ、０．８％のホルマリンと共に４０℃で一夜処理した。この物質の５μｌのサンプルをＢ５Ｃ−４０細胞に２回盲綴代接種しても細胞培養物中に観察可能な感染の徴候は生じていなかった。６週齢のマウスを５匹ずつ１グループにして筋肉内（ＩＭ）または皮下＜ＳＣ）経路で２５０μ！の物質によって免疫感作した。ＩＭ免疫感作に使用した免疫原（ＶＬＰ−ｇＤ２）″Ａ製物はリン酸アルミニウムで沈殿したが、ＳＣ免疫感作に使用した物質はリン酸アルミニウムで沈殿しなかった。３週間後に、同様に処理した同量の物質を一次免疫感作と同じ経路でマウスに与えて再度免疫感作した。即ち、免疫感作に使用した各マウスあたりの投与量は、５つの回転培養瓶内で出発細胞培養物から得られた物質の１／１ｏであった。別の５匹のマウスを、最初に尾部乱切法（Ｔｓ）、次いで３週間後の鼻腔的点滴（ＩＮ）によってｌＸ１０’ＰｆｕのｖＡｂＴ５０９を投与して免疫感作した。２回目の免疫感作の２週後に全部のマウスから採血した。抗ワクシニア及び抗ｇＤ２免疫応答をＥＬＩＳＡによって決定した。

ワクシニア細胞溶解液またはＨＳＶ−２感染細胞から精製したＨＳＶ　ｇＤ２抗原をＥＬＩＳＡプレートに塗布した。

力価は、陽性対照（マウス抗ワクシニア血清またはモノクローナル抗ｇＤ２　ＤＬ６）の最大値の５０％を達成する希釈度の逆数であると定義できる。結果を表３に示す。

宍」しウィルス　の ■　ｕＬｊゴ【　抜戯力１（５マウス）　（５マウス）無　＜　１０　＜　１０生ｖＡｂＴ５０９　ＴＳｊＮ　４８０　４８０９６０　ｔｚｓ。

ＶＬＰ−ｇＤ２　５ＣｊＣ＜　１０　１０ＶＬＰ−ｇＤ２　ＩＭｊＭ　＜　１０　２０＜　１０　１９２０最初に尾部乱切法、次いで３週間後に鼻腔内点滴を用いてｌＸ１０’ｐｆｕの生きた組換えｖＡｂＴ５０９によって免疫感作したマウスは、ワクシニア抗原及びＨ８Ｖ　ｇＤ２抗原に対する抗体を産生じた。対照的に、皮下または筋肉内の経路でｇＤ２／ＳＩｖ偽ピリオンで免疫感作したマウスでは、ｇＤ２糖タンパク質に対する抗体は増産されたが、ワクシニアに対する抗体応答は生ワクシニアで免疫感作したマウスよりも数桁低い値であった。従って、ｖＡｂＴ５０９によるマウスの感染中に組換えワクシニアウィルスによって発現されたｇＤ２糖タンパク質とｖＡｂＴ３９４及びｖＡｂＴ５０９による細胞の同時感染後にペレット分画中で回収されたｇＤ２糖タンパク質との双方は、精製されたｇＤ２糖タンパク質を認識する抗体を誘発した。

７Ｊ二孔ユ」５【丘− ブダペスト条約の規約に基づいてプラスミドｐＡｂＴ４６６０及びｐＡｂＴ４６０２を１９９０年８月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　ｌｅ、ＭＤに寄託した。プラスミドは夫々ＡＴＣＣ受託番号４０８６６及び４０８６５で受託された。

プダベスト条約の規約に基づいてプラスミドｐＡｂＴ１５２７を１９９１年８月　日にＡＴＣＣに寄託し、受託番号　で受託された。

当業者は、慣用の実験方法を使用して本文中に記載の特定実施例と等価の多くの実施態様を認識し確認できよう。

かかる等価の実施態様は以下の請求の範囲に包含されると理解されたい。

ＦＩＧ、１ＦＩＧ、２ＬＩＧＡＴＥ国際調査報告ＰＣＴ／ＵＳ９１／の５６５のＰＣＴ／ＵＳ９１／の５６５のＧｒｏｕｐ　ＸＩＩＩ；　Ｃｌａｉｍｓ　コ５　ａｎｄ　コロ　ａｒｅ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｐｌａｇｍｔｄｓ　ａｎｄ　ｄｏｎｏｒＤＮ＾　ｖｅｃｔｏｒｓ。

フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ　６１　Ｋ　４８１００　８３１４−４ＣＣ１２Ｎ　７／叶Ｃｌ２Ｐ　２１１００　８２１４−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１００Ｃ１２Ｒ１：９２）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ウイルスキャプシドポリペプチドをコードする異種遺伝子と、ウイルスキャプシドとは異なるウイルスに由来のウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子とを真核細胞中で同時発現させるために十分なＤＮＡウイルスゲノムの部分を含み、コードされたキヤプシドポリペプチドとエンベロープ糖タンパク質とが複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子として自己集合し得ることを特徴とするウイルスベクター。
２．ＤＮＡウイルスが、ボックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パポーバウイルスから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクター。
３．ボックスウイルスがニワトリボックスであることを特徴とする請求項２に記載のウイルスベクター。
４．ボックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求項２に記載のウイルスベクター。
５．キャプシドポリペプチドがレトロウイルスに由来することを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクター。
６．レトロウイルスがレンチウイルスであることを特徴とする請求項５に記載のウイルスベクター。
７．レンチウイルスがヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルスまたはビスナウイルスであることを特徴とする請求項６に記載のウイルスベクター。
８．エンベロープ糖タンパク質がＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに由来することを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクター。
９．ＤＮＡウイルスがヘルペスウイルスであることを特徴とする請求項８に記載のウイルスベクター。
１０．エンベロープ糖タンパク質がヘルペス単純ｇＤ２であることを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクター。
１１．エンベロープ糖タンパク質が偽狂犬病ｇＩＩＩであることを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクター。
１２．１つのウイルスに由来のウイルスキャプシドが該ウイルスキャプシドとは異なるウイルスに由来の少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質を有するウイルスエンベロープによって包囲されていることを特徴とする遺伝子操作されて自己集合した複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子。
１３．ウイルスキャプシドがレトロウイルスに由来することを特徴とする請求項１２に記載のハイブリッドウイルス粒子。
１４．ウイルスエンベローアが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、トガウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルスまたはコロナウイルスに由来することを特徴とする請求項１２に記載のハイブリッドウイルス粒子。
１５．ウイルスキヤプシドポリペプチドをコードする異種遺伝子と、ウイルスキャプシドとは異なるウイルスに由来のウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子とを同時発現させるために十分なＤＮＡウイルスゲノムの部分を含むＤＮＡウイルスベクターに感染した真核細胞によって発現されるハイブリッドウイルス粒子であって、コードされたキャプシドポリペプチドとエンベロープ糖タンパク質とが複製欠陥ハイブリッドウイルス粒子として自己集合し得ることを特徴とする自己集合した複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子。
１６．ＤＮＡウイルスが、ボックスウイルス、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１５に記載のハイブリッドウイルス粒子。
１７．ボックスウイルスがニワトリボツクスであることを特徴とする請求項１６に記載のハイブリッドウイルス粒子。
１８．ボックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求項１６に記載のハイブリッドウイルス粒子。
１９．キャプシドポリペプチドがレトロウイルスに由来することを特徴とする請求項１５に記載のハイブリッドウイルス粒子。
２０．レトロウイルスがレンチウイルスであることを特徴とする請求項１９に記載のハイブリッドウイルス粒子。
２１．レンチウイルスがヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルスまたはビスナウイルスであることを特徴とする請求項２０に記載のハイブリッドウイルス粒子。
２２．ウイルスエンベロープが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、トガウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルスまたはコロナウイルスに由来することを特徴とする請求項１５に記載のハイブリッドウイルス粒子。
２３．医薬として許容される担体中に、免疫感作量の請求項１に記載の組換えＤＮＡウイルスベクターを含むワクチン組成物。
２４．更に、１つのウイルスに由来のウイルスキャプシドが該ウイルスキャプシドとは異なるウイルスに由来の少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質を有するウイルスエンベロープによって包囲されている自己集合した複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子を含む請求項２３に記載のワクチン組成物。
２５．医薬として許容される担体中に、免疫感作量の請求項１２に記載の自己集合した複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子を含むワクチン組成物。
２６．医薬として許容される担体中に、免疫感作量の請求項１５に記載の自己集合した複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子を含むワクチン組成物。
２７．ウイルスキヤプシドポリペプチドをコードする異種遺伝子とウイルスキャプシドとは異なるウイルスに由来のウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子とを同時発現させるために十分なＤＮＡウイルスゲノムの部分を含む免疫感作量のＤＮＡウイルスベクターを、医薬として許容されるビヒクル中で宿主に投与する段階を含み、コードされたキャプシドポリペプチドとエンベロープ糖タンパク質とが複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子として自己集合し得ることを特徴とするウイルス抗原に対する免疫応答の誘発方法。
２８．１つのウイルスのウイルスキャプシドポリペプチドと別のウイルスの少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質とを含む免疫感作量の自己集合した複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子を、医薬として許容されるビヒクル中で宿主に投与することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
２９．免疫感作量の請求項１２に記載の自己集合した複製欠陥型ハイブリッドウイルスを医薬として許容されるビヒクル中で宿主に投与することを特徴とするウイルス抗原に対する免疫応答の誘発方法。
３０．請求項１２のウイルス粒子に結合または取込まれた治療薬を含むことを特徴とするターゲット化治療薬。
３１．治療薬が抗ウイルス剤または細胞障害剤であることを特徴とする請求項３０に記載のターゲット化治療薬。
３２．ハイブリッドウイルス粒子がレトロウイルスに由来のキャプシドポリペプチドを含むことを特徴とする請求項３０に記載のターゲット化治療薬。
３３．医薬として許容されるビヒクル中の請求項１２に記載のハイブリッドウイルス粒子に結合または取込まれた治療薬を投与することを特徴とする治療薬を細胞に送達するためのターゲット化方法。
３４．組換えワクシニアウイルスｖＡｂＴ２８２、ｖＡｂＴ３９４またはｖＡｂＴ５０９。
３５．ＡＴＣＣ受託番号４０８６５、４０８６６及びを夫々有するプラスミドＤＮＡベクターｐＡｂＴ４６０２、ｐＡｂＴ４６６０またはｐＡｂＴ１５２７。
３６．複製欠陥型ハイブリツドウイルス粒子として自己集合し得る異なるウイルス種に由来のウイルスキャプシドポリペプチド及びエンベロープ糖タンパク質をコードするＤＮＡをｉｎｖｉｖｏ組換えによって組換えＤＮＡウイルスベクターに挿入するためのＤＮＡドナーベクターであって、（ａ）ベクターが原核細胞宿主中で増幅できるようにするための原核細胞複製起点と、（ｂ）ベクターを含む原核細胞宿主を選択し得るマーカーをコードする遺伝子と、（ｃ）ウイルスキャプシドポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子として自己集合できるウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする別のウイルスに由来の少なくとも１つのＤＮＡ配列と、（ｄ）ＤＮＡウイルスゲノムの領域に相同のＤＮＡ配列とを含み、（ｃ）のＤＮＡ配列の各々が転写プロモーターの近傍に局在しており、（ｄ）のＤＮＡ配列が（ｃ）の構築物の末端に結合することによって挿入されることを特徴とするＤＮＡドナーベクター。
３７．ウイルスキャプシドポリペプチドをコードする異種遺伝子と、ウイルスキャプシドとは異なるウイルスに由来のウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子とを真核細胞中で同時発現させるＤＮＡウイルスベクターを真核細胞に感染させる段階から成り、コードされたキヤプシドポリペプチドとエンベロープ糖タンパク質とが複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子として自己集合し得ることを特徴とする自己集合した複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子の産生方法。
３８．キャプシドポリペプチドをコードする異種遺伝子を発現させる第１ベクターとウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子を発現させる第２ベクターとから成る同一ウイルス種に由来の少なくとも２つのＤＮＡウイルスベクターを真核細胞に感染させる段階から成り、コードされたキャプシドポリペプチドとエンベロープ糖タンパク質とがハイブリッドウイルス粒子として自己集合し得ることを特徴とする自己集合した複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子の産生方法。
３９．異種ウイルスキヤプシドポリペプチドをコードする第１ベクターと、ウイルスキャプシドとは異なるウイルスに由来の少なくとも１つのウイルスエンベロープ糖タンパク質を発現させる第２のウイルスベクターとから成る少なくとも２つのベクターで感染または形質転換された発現系であって、コードされたキャプシドポリペプチドとエンベロープ糖タンパク質とが複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子として自己集合し得ることを特徴とする発現系。
４０．ウイルスベクターが同一ウイルス種に対応することを特徴とする請求項３９に記載の発現系。
４１．ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つまたはウイルスキャプシドポリペプチドをコードする遺伝子が誘発プロモーターに作動的に結合されていることを特徴とする請求項３９に記載の発現系。
４２．誘発プロモーターを含むベクターが細胞を形質転換させるために使用されることを特徴とする請求項４１に記載の発現系。
４３．キャプシドポリペプチドをコードする遺伝子とウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子との双方が誘発プロモーターの調節下にあることを特徴とする請求項４１に記載の発現系。