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Vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique
La présente invention concerne un vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique, encore connu sous le nom de virus de la maladie d'Aujeszky
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(ADV), de virus porcin de l'herpès 1 (PHV-1) ou de virus herpès-l Suid (SHV-I)
La maladie d'Aujeszky est une maladie d'origine virale à laquelle la plupart des mammifères sont sensibles. Cependant, l'homme ne semble pas être sensible à cette maladie
L'agent provoquant cette maladie est un virus enveloppé à ADN bicaténaire de la famille des Herpesviridae, sous-famille des alpha-herpesvirinae, à savoir, le virus pseudorabique (PRV).
Le génome du virus PRV est formé par une molécule d'ADN bicaténaire d'environ 150 kb et consiste en une région unique longue (UL) et en une région unique courte (Us) qui est flanquée par deux séquences répétées inverses, l'une terminale (TR) et l'autre interne (IR) (BEN-PORAT, T. et al, 1979, Virology 95, p 285-294)
Le génome du virus de la maladie d'Aujeszky contient au moins 70 gènes.
Les principales caractéristiques et propriétés biologiques des gènes du PR V les mieux caractérisées sont reprises dans le Tableau 1 ci-dessous.
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Tableau 1 Propriétés de certains gènes du PRV, leurs caractéristiques et propriétés biologiques (extrait de Mettenleiter T, Acta Veterinaria Hungarica, 42 (2-3), p. 153-177 (1994))
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<tb>
<tb> Segment <SEP> Désignation <SEP> Désignation <SEP> Protéine <SEP> Taille <SEP> (kDa) <SEP> Essentielle <SEP> Fonction/Activité <SEP> Virulence
<tb> du <SEP> Génome <SEP> Gène <SEP> (HSV) <SEP> Gène <SEP> (PRV) <SEP> (réplication <SEP> in
<tb> vitro)
<tb> UL <SEP> gB <SEP> gll <SEP> 913 <SEP> aa <SEP> 110-68-55 <SEP> + <SEP> pénétration, <SEP> fusion <SEP> +
<tb> cellulaire
<tb> gC <SEP> gIII <SEP> 479 <SEP> aa <SEP> 92 <SEP> adsorption, <SEP> +
<tb> relargage
<tb> TK <SEP> TK <SEP> 320 <SEP> aa <SEP> 35 <SEP> thymidine <SEP> kinase <SEP> +
<tb> gH <SEP> gH <SEP> 686 <SEP> aa <SEP> 84 <SEP> + <SEP> pénétration,
<SEP> fusion <SEP> na
<tb> cellulaire
<tb> Us <SEP> prot. <SEP> kinase <SEP> PK <SEP> 336 <SEP> aa <SEP> 41 <SEP> protéine <SEP> kinase <SEP> +
<tb> G <SEP> gX <SEP> 498 <SEP> aa <SEP> - <SEP> inconnu <SEP> gD <SEP> gp50 <SEP> 402 <SEP> aa <SEP> 60 <SEP> + <SEP> pénétration <SEP> n <SEP> a
<tb> gl <SEP> gp63 <SEP> 350 <SEP> aa <SEP> 63 <SEP> - <SEP> inconnu <SEP> +
<tb> gE <SEP> gl <SEP> 577 <SEP> aa <SEP> 110 <SEP> - <SEP> relargage, <SEP> +
<tb> transmission <SEP> de
<tb> cellule <SEP> à <SEP> cellule
<tb> TEG <SEP> 11K <SEP> 106 <SEP> aa <SEP> 11 <SEP> - <SEP> protéine <SEP> du <SEP> inconnu
<tb> tégument
<tb>
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La transmission du virus se réalise habituellement par voie orale, respiratoire ou par contact direct entre un animal infecté et un animal sain.
La maladie est devenue préoccupante pour les élevages porcins où elle se manifeste sous plusieurs formes : 1 Les adultes développent peu de signes cliniques, mais deviennent des sources d'infection permanentes. Toutefois, le virus PRV peut provoquer l'avortement des truies en gestation.
2 Les porcelets subissent une atteinte grave du système nerveux central Les porcelets présentent une sensibilité élevée à la naissance qui diminuera progressivement. Jusqu'à l'âge de 10 jours, les porcelets atteints, ne bénéficiant pas d'immunité passive provenant de la mère, succombent en quelques heures. Plus âgés, ils sont sujets à des tremblements musculaires, des contractions, mais l'évolution est plutôt bénigne.
Dans d'autres espèces la maladie peut être mortelle et la durée d'incubation est variable et comprise entre 15 heures et 12 jours
Il existe actuellement plusieurs méthodes de vaccination contre la maladie d'Ausjeszky.
Une des méthodes classiques consiste en l'injection de virus vivants, qui doivent être atténués pour éviter que la maladie ne se déclare.
Ainsi, on utilise pour la vaccination des porcs, des virus PRV de la souche Bartha qui comprennent des mutations dans le génome codant pour les glycoprotéines gl, gp63 et gIII ainsi que pour une protéine de la capside virale dont le gène se situe sur le fragment Bamill4. (Mettenleiter T, Acta Veterinaria Hungarica, 42 (2-3), p. 153-177 (1994)).
On utilise aussi les vaccins vendus sous les noms OMNIVAC*-PRV (FERMENTA ANIMAL HEALTH Co, Kansas City, MO. USA) et OMNIMARK*-PRV (FERMENTA ANIMAL HEALTH Co, Kansas City, MO, USA) qui comprennent des virus PRV de la souche Bucharest, manipulés génétiquement.
Ces souches comportent des délétions dans les gènes codant respectivement pour la thymidine kinase ou pour la thymidine kinase et gIII Bien entendu, il existe encore d'autres vaccins contre la maladie d'Aujeszky qui fonctionnent selon le même principe
Cette methode de vaccination confère au sujet vacciné une bonne protection qui est due à l'action intracellulaire du virus vivant En effet, les virus vivants pénètrent dans les cellules où les antigènes viraux seront synthétisés Ensuite, les peptides dérivés de ces antigènes viraux sont présentés à la surface
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des cellules infectées en association avec le complexe majeur d'histocompatibilité de classe 1 (MHC 1)
Une réponse cytotoxique peut ainsi être provoquée en plus de la réponse humorale ce qui induit chez le sujet vacciné une meilleure protection contre le virus.
Bien que les virus soient atténués par des mutations, un risque existe que les virus redeviennent pathogènes par des mutations spontanées ou par des recombinaisons avec des virus de type sauvage
Les vaccinations par des agents viraux vivants peuvent aussi entrainer, sous certaines conditions, une prolifération de virus vivants Cette prolifération de virus vivants, même atténués, constitue un risque pour des sujets plus susceptibles, tels que des nouveau-nés ou des sujets en gestation.
Une autre technique mise au point plus récemment, consiste en l'utilisation d'un vecteur vivant non-pathogène portant des gènes sélectionnés du virus PRV
M. ELOIT et al (J. T. van Oirschot (ed.), Vaccination and control of Aujeszky's Disease, p 61-66, ECSC, EEC, EAEC, Brussels and Luxembourg, 1989) ont mis au point un vaccin basé sur l'adénovirus type 5 (AD5) recombinant qui donne lieu à l'expression du gène gp50 du virus PRV.
W L. MENGELING et al (Arch. of Virology, V 134, n* 3-4, p. 259-269, 1994) ont publié des résultats d'essais avec un virus vaccinia (NYVAC) contenant
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les gènes du PRV codant pour les glycoprotéines gp50, gll et glII. Cependant, l'efficacité de ce type de vaccin est limitée.
Par contre M. L. VAN DER LEEK et al (The Veterinary Record (1994) 134, p 13-18) ont abouti à des résultats encourageants avec une vaccination de porcs contre le virus PRV par scarification ou par injection intramusculaire d'un recombinant du virus de la variole porcine et du virus PRV (rSPV-AD). Ce recombinant a été obtenu par insertion des gènes PRV codant pour les gp50 et gp63 attachés au promoteur P 7.5 du virus vaccinia dans le gène de la thymidine kinase du virus SPV
Bien entendu, il existe encore d'autres vaccins contre la maladie d'Aujeszky qui fonctionnent selon le même principe.
Une nouvelle approche pour induire une réponse immunologique a été décrite récemment par ULMER et al, 1993, Sci. 259 1745). Des souris ont été immunisées par injection intramusculaire d'un plasmide comprenant le gène de la nucléoprotéine du virus de l'influenza sous le contrôle d'un promoteur mammalien. Cette immunisation par injection du plasmide a apparemment conduit à une transfection de cellules musculaires, suivie d'une expression in situ
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de la protéine, aboutissant à une réponse immunologique spécifique contre le virus de l'influenza, de type cellulaire et humoral, et par conséquent à une protection contre une attaque par ce virus.
Il semble, d'après les expériences publiées, que des parties de protéines virales produites à l'intérieur des cellules transfectées soient reprises par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe 1 et présentées à la surface de la cellule
ROBINSON et al, décrivent en 1993, dans Vaccine Il, 957-960 une immunisation de poules contre le virus de l'influenza par des injections intraveineuses, intrapéritonéales et sous-cutanées de plasmide. De 28 % à 100 % des animaux ainsi immunisés résistent à un"challenge"par une dose létale du virus. Il est a noter que l'efficacité dépend fortement de la voie et du système utilisé pour l'injection et d'un éventuel prétraitement du site d'injection (DANKO et al, Vaccine 12, 1499-1502 (1994)).
GRAHAM 1. M. COX et al ont décrit une méthode de vaccination de bovins et de souris contre le virus BHV-1 par injection d'ADN plasmidique, dans J Virol. 1994 p 5685-5689 On a pu montrer que l'injection intramusculaire de bovins et de souris (dans le quadriceps) d'ADN plasmidique contenant le gène des glycoprotéines de gl, gIII ou gIV de BHV-1 suscitait une réponse immunitaire dans l'animal vacciné. La réponse immunitaire dépend fortement de la quantité d'ADN injecté, et de la glycoprotéine.
Ainsi, le gène de la protéine gIV provoquait une réponse supérieure à celle des protéines gl et gIII
Aucun des vaccins plasmidiques décrits à ce jour n'est efficace contre des maladies virales infectant les porcs et autres espèces tels que la maladie d'Aujeszky causée par le virus PRV
Le but de la présente invention est de proposer un vaccin plasmidique contre le virus PRV responsable de la maladie d'Aujeszky
Ce but est atteint par un vaccin comprenant au moins un plasmide codant pour la glycoprotéine gIII du virus PRV ou pour une protéine présentant la même antigénicité que la glycoprotéine gIII du virus PRV et un excipient pharmaceutiquement acceptable pour celui-ci.
Un des avantages de cette méthode réside dans le fait que cette méthode est peu onéreuse
En effet, le plasmide peut être produit, selon des techniques bien maîtrisées, dans des bactéries telles que E coli
L'extraction de plasmides est bien connue et un rendement élevé peut être
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obtenu
Il n'est pas nécessaire que le gène introduit dans le plasmide code pour la protéine gIII entière, il suffit qu'il code pour une partie ou un homologue de la protéine gIII du PRV qui a la même antigénicité que la protéine gIII c. -à-d le
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même effet sur le système immunologique que la protéine gIII.
En effet, une partie seulement de la protéine gIII est identifiée par le système immunologique de l'animal, les autres parties de la protéine, bien que jouant certainement un rôle dans la vie du virus, ne sont pas essentielles dans la reconnaissance de la protéine par l'organisme infecté.
Un autre avantage est qu'on peut facilement distinguer les animaux vaccinés des animaux infectés par le virus PRV. En effet, les animaux vaccinés ne développent que des anticorps contre la protéine gIII tandis que les animaux infectés par le virus PRV développent aussi des anticorps contre d'autres protéines du virus
De plus, la méthode est sûre, car une prolifération de virus vivants n'est pas à craindre. Comme on n'injecte qu'une partie bien déterminée du génome du virus, il n'y a pas d'infection par des virus et donc par voie de conséquence il ne peut y avoir de prolifération de virus.
Du fait que les cellules musculaires ont une grande longévité et ne circulent pas dans le corps de l'animal, l'expression locale et continue de l'antigène à de faibles concentrations peut stimuler la réponse immunologique à long terme.
La vaccination par le vaccin selon la présente invention peut être utilisée comme outil diagnostique car elle induit la formation d'anticorps mono spécifiques. Ces anticorps peuvent être utilisés pour la détection de l'antigène p. ex. lors des tests ELISA ou autres.
Un effet surprenant de l'invention réside dans l'efficacité de l'immunisation contre le virus PRV Bien que l'importance de la glycoprotéine gIII dans l'immunisation soit bien connue, l'injection de la protéine gIII purifiée ne semble pas avoir d'effet prononcé d'immunisation
Z. H. BISEIBUTSU et al décrivent, dans la demande de brevet japonaise JP 05/246888, un vaccin contre le virus PRV, à base de la glycoprotéine gIII purifiée et d'un adjuvant à base d'huile. Cette approche n'est pas utilisée à l'échelle commerciale.
A. MATSUDA TSUCHIDA et al montrent dans un article publié au J.
Vet med. Sci 54 (3) 447-452,1992, qu'un mélange de glycoprotéines gll, gIII et gIV purifié injecté ensemble avec un adjuvant classique à base d'huile, confère une
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meilleure protection à des souris contre un challenge par des virus PRV virulents que les glycoprotéines injectées individuellement.
Il reste à noter que des vaccins employant des protéines purifiées sont, en général, très onéreux car les étapes de purification sont longues et compliquées.
Selon un premier mode de réalisation avantageux, le plasmide est le plasmide pEVhis 14gIII.
Le plasmide pEVhis 14gIII a l'avantage de comporter un gène conférant une résistance à l'ampicilline, de sorte que les bactéries transformées, ayant incorporé le plasmide, sont aisément sélectionnables en ajoutant de l'ampicilline dans leur milieu de croissance.
Bien entendu, on peut envisager d'utiliser d'autres plasmides Il suffit que le plasmide comprenne un gène codant pour une protéine ayant la même antigénicité que la glycoprotéine gIII du virus PRV, inséré dans le plasmide de façon à ce qu'il soit exprimé dans l'organisme vacciné Un marqueur tel qu'un gène conférant une résistance à un antibiotique permet de sélectionner les bactéries transformées par le plasmide.
Pour augmenter l'efficacité du vaccin, le plasmide peut contenir outre le gène codant pour la glycoprotéine gIII du virus PRV ou pour une protéine présentant la même antigénicité que la glycoprotéine gIII du virus PRV, un ou plusieurs gènes codant pour des cytokines.
Certaines cytokines sont connues pour exercer une activité adjuvante sur les vaccins. Le fait de les introduire dans le plasmide de façon à ce qu'elles puissent être exprimées dans les cellules augmentera l'efficacité du vaccin.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le vaccin comprend aussi un excipient pharmaceutiquement acceptable dans lequel le plasmide est incorporé Le terme"excipient pharmaceutiquement acceptable", mentionné dans ce document, se réfère soit à des milieux liquides soit à des milieux solides susceptibles d'être utilisés comme excipient (véhicule) pour introduire le plasmide dans l'animal à vacciner
Citons comme exemple des milieux liquides, l'eau, le sérum physiologique, le tampon phosphate-salin, les solutions contenant des adjuvants, des détergents, des stabilisants et substances favorisant la transfection, les suspensions de liposomes, de virosomes et les émulsions
Citons comme exemple des milieux solides, les microbilles d'or recouvertes de plasmide, destinées à être projetées par bombardement ("gene gun")
dans les tissus de l'animal et les microparticles contenant de l'ADN,
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utilisables par voie parentérale et orale.
La vaccination par ADN peut être éventuellement précédée d'un prétraitement du site de vaccination (par ex. utilisation d'un anesthésiant local) de façon à améliorer son efficacité.
La présente invention propose également un vaccin plasmidique contre le virus PRV comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine gIII du virus PRV ou pour une protéine présentant la même antigénicité que la glycoprotéine gIII du virus PRV ou une construction d'ADN comprenant une cassette d'expression incluant : a) une séquence d'ADN codant pour un polypeptide contenant au moins un déterminant antigénique de la glycoprotéine gIII ou un fragment immunogénique de celle-ci, et b) des séquences de contrôle reliées opérativement auxdites séquences codantes où ladite séquence codante peut être transcrite et traduite dans une cellule et où lesdites séquences de contrôle sont homologues ou hétérologues à ladite séquence codante.
Avantageusement, le vaccin plasmidique contient un ou plusieurs gènes codant pour des cytokines.
Selon encore un autre aspect de la présente invention, on propose d'utiliser le plasmide pEVhisl4gIII dans la fabrication d'un vaccin.
On propose également d'utiliser le plasmide pEVhisl4gIII dans la fabrication d'un vaccin contre le virus PRV.
L'invention est décrite plus en détail, à titre d'illustration, dans les exemples qui suivent.
Exemple 1. Obtention d'un vaccin.
Le vaccin a été obtenu en trois étapes, comprenant la construction d'un plasmide (pEVhis14gIII) contenant le gène de la glycoprotéine gIII du virus PRV, la production de ce plasmide dans des bactéries transformées et la formulation du vaccin comprenant le plasmide et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Etape A : Construction d'un plasmide (pEVhis14gIII) contenant le gène de la glycoprotéine gIII du virus PRV
L'ADN du plasmide pEVhis14gIlI a été obtenu de l'Institute for Animal Science and Health, (ID DLO, Lelystad, NL). Il comprend le gène de la glycoprotéine gIII du virus PRV, sous contrôle du promoteur HCMV et le gène marqueur de la résistance à l'ampicilline ; il est utilisé en tant que vaccin à ADN (ADN+) La carte du plasmide est donnée à la Figure 1
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Le plasmide a été déposé conformément au Traité de Budapest le
16 novembre 1995 à la collection nommée"Belgian Coordinated Collections of Microorganisms-Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasrniden collectie" (LMBP), Universiteit Gent, K. L.
Ledeganckstraat 35 Gent, Belgique B-9000 sous le numéro d'accession LMBP3377 Etape B : Production du plasmide dans des bactéries transformées.
Préparation de cellules d'E. coli traitées au RbC !.
Avant d'être transformées, les cellules d'E. coli, souche DH 5* (Gibco) ont été soumises à un traitement au RbCl pour augmenter l'efficacité de la transformation. La procédure qui a été suivie, à l'exception près que nous avons utilisé une souche E. coli DH 5a, est décrite dans le bulletin d'information"The
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NEB transcript", vol. 6 (1) p7, may 1994, édité par NEW ENGLAND BIOLABS, Inc, Beverly, MA01915.
Transformation de cellules d'E. coli traitées au RbCh 100 nul de cellules traitées au RbCI et 1 ul de solution d'ADN contenant 250 ng de plasmide pEVhis14gIII ont été incubés pendant 10 minutes sur de la glace (à 0 C) et ensuite pendant 5 minutes à 37 C. Le mélange a ensuite été transféré dans 2 ml de milieu RB (bactopeptone 1 % (p/v), extrait de levure 0 5 % (p/v), NaCI 1 % (p/v)) et incubé entre 30 minutes et 2 heures à 37 C sous agitation. L'abréviation % (p/v) représente un pourcentage exprimé en poids par volume
100 et 500 | de la culture de cellules ont été étalés sur une boîte de Pétri contenant un milieu RB + ampicilline 1 00 glml + agar 2 % (p/v).
Mini préparation d'ADN plasmidique pEVhis14gm.
Les colonies obtenues ci dessus ont d'abord été utilisées pour effectuer des mini préparations afin de vérifier la production et la structure du plasmide pEVhisl4gIII. Des colonies individuelles ont été mises en culture pendant une nuit dans 2 ml de milieu RB + ampicilline 100 g/ml.
Les cultures ont été traitées ensuite comme décrit dans"Molecular cloning, a laboratory manual", J Shambrook, E. F. Fritsch et T Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) sous le chapitre"Small scale preparations of plasmid DNA", µ 1 21 1 28 à l'exception près que pour les étapes 1 4, les centrifugations ont été faites à température ambiante et que la composition de la solution III a été modifiée de façon à contenir de l'acétate de sodium 3 M, à pH
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4, 8 Les culots ont été séchés sous vide et repris dans 100 à 200 u) d'eau
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(filtrée sur appareil Milli Q, Millipore, USA) sans traitement par la RNAse
L'analyse par digestion au moyen de diverses enzymes de restriction,
suivi d'une électrophorèse sur gel d'agarose a permis de vérifier la conformité du plasmide (voir aussi"Molecular cloning, a laboratory manual", J. Shambrook,
E. F. Fritsch et T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), µ6)
Maxi-préparation d'ADN plasmidique pEVhis14gill.
Afin d'obtenir de l'ADN plasmidique en quantité suffisante pour les vaccinations, l'ADN plasmidique a été produit en plus grande quantité selon un des deux modes opératoires suivants.
Une suspension de E. coli transformé par le plasmide pEVhis14gIII est incubée pendant une heure dans 2 ml de milieu RB et ensuite répartie dans 1 à 4 flacons de 400 ml de milieu RB contenant de l'ampicilline à raison de 1 00 g/ml.
Les cultures ont été incubées pendant une nuit à 37 C sous agitation à environ 150-200 tours par minute.
Les cultures ont été centrifugées dans des tubes Nalgene de 500 ml pendant 7 minutes à 8 670 g. Toutes les centrifugations ont été effectuées dans une centrifugeuse Beckman modèle J2-21.
Le surnageant a été éliminé et le culot a été remis en suspension dans 10 ml de solution 1 (glucose 1 % (p/v) ; tris-HCl 25 mM ; pH = 8,0 ; EDTA 10 mM ; lysozyme 1 % (plv)) et transvasé dans un tube Nalgene de 40 ml. Le tube a été laissé pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite 10 ml de la solution 2 (NaOH 0,2 M ; SDS (sodium dodécyl sulfate) 1 % (p/v)) ont été ajoutés, les tubes ont été agités et laissés pendant 5 minutes à température ambiante. 10 ml de solution 3 (acétate de sodium 3 M ; pH = 4,8) ont été ajoutés et les flacons ont été agités puis centrifugés pendant 30 minutes à 48 400 g à 0 C. 25 ml du surnageant ont été transvasés dans un tube Falcon de 50 ml recouvert de six couches de gaze.
Si nécessaire, le volume peut être ajusté avec du TE (tris-HCI 10 mM ; pH = 8,0, EDTA 1 mM) Ensuite, on a ajouté 15 ml d'isopropanol à température ambiante, agité et transféré le mélange dans un tube Nalgene de 40 ml. Après centrifugation pendant 15 minutes à 48 400 g à 0 C, le surnageant a été éliminé Après avoir bien drainé le liquide et dissout le culot dans 5 ml de TE, les suspensions ont été incubées pendant 30 minutes à 37 C sous agitation en présence de RNase A à une concentration finale de 0, 1 mg/ml. Ensuite on a ajouté 10 ul de protéinase K en solution (10 mg/ml) et incubé pendant 30 minutes à 37 C minimum sous agitation.
Les colonnes TIP 500 QIAGEN (QIAGEN, INC, CA, USA) ont été
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équilibrées par 10 ml de tampon QBT (NACI 750 mM, MOPS 50 mM, éthanol 15 % (v/v), Triton X-100 0, 15 % (v/v) ; pH = 7,0) par un écoulement sous simple gravité L'abréviation MOPS représente l'acide sulfonique 3- (Nmorpholino) propane. Les échantillons ont été déposés sur les colonnes, et les
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colonnes ont été lavées 6 fois par 10 ml de tampon QC (NaCI 1 000 mM ; MOPS 50 mM, éthanol 15 % (v/v) ; pH = 7,0). Après élution par 20 ml de tampon QF' (NaC) 1 250 mM, MOPS 50 mM, éthanol 15 % (v/v) ; pH = 8,2), la solution a été récupérée dans des tubes Nalgene de 40 mi 14 ml d'isopropanol ont été ajoutés à température ambiante.
Après agitation, le mélange a été centrifugé pendant 15 minutes à 48 400 g à 0 C Le surnageant a été éliminé et le culot a été séché
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sous vide et repris dans 500 ut d'eau Milli-Q. Après trois extractions du surnageant par 500 ut de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1, v/v/v) et une extraction par un volume d'éther, l'ADN a été précipité avec 50 ul d'acétate de sodium 3 M et 0,7 ml d'isopropanol.
Après centrifugation pendant 10 minutes à 0 C à 18 320 g, le culot a été lavé avec 1 ml d'éthanol à 70 % (v/v) Le surnageant a été éliminé après une centrifugation de 10 minutes à 18 320 g à 0 C et le culot comprenant l'ADN plasmidique a été séché sous vide et mis en solution
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dans 500 ul d'eau Milli-Q L'abréviation % (v/v) représente le pourcentage de volume par volume
Une autre méthode pour produire de l'ADN plasmidique en grande quantité en utilisant des colonnes PZ523 (5 Prime--+ 3 Prime, INC, Boulder, CO, USA), est reprise ci-dessous
Les cultures de 400 ml ont été centrifugées pendant 10 minutes à 8 670 g
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dans un godet Nalgene de 500 ml (Beckman J2-21).
On a ajouté 10 ml de solution 1 (glucose 1 % (p/v) ; tris-HCI 25 mM pH = 8, EDTA 10 mM ; lysozyme 1 % (p/v) (SIGMA)) et on a transvasé 10 ml de ce mélange dans un autre tube Nalgene de 40 ml. Après incubation pendant 5 minutes à température ambiante, on a ajouté 10 ml d'une solution 2 (NaOH 0,2 M, SDS 1 % (p/v) fraîchement préparée.
Après légère agitation, le mélange a été incubé pendant cinq minutes sur de la glace Après ajout de 10 ml de solution 3 (acétate de sodium 3 M, pH = 4,8) froide et centrifugation du tube pendant 20 minutes à 0 C à 48 400 g, le surnageant, environ 25 ml, a été transvasé dans un tube Falcon de 50 ml recouvert de six couches de gaze Après avoir ajouté 15 ml d'isopropanol, les 40 ml d'échantillon ainsi obtenus ont été transvasés dans un autre tube Nalgene de 40 ml et centrifugés pendant 20 minutes à 0 C à 48 400 g. Le surnageant d'isopropanol a été éliminé, le culot obtenu a été lavé avec 1 ml d'éthanol à 70 % (v/v) et le
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liquide a été bien drainé.
Le culot a été resuspendu dans 5 ml de TE auquel on a ajouté 50 ul de RNase A (solution à 10 mg/ml) et incubé pendant 30 minutes à
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37 C sous agitation 10 ul de protéinase K (solution à 10 mg/ml) ont été ajoutés et le mélange a été incubé pendant au moins 30 minutes à 37 C sous agitation Pour les deux extractions consécutives au phénoVchloroforme/alcool isoamylique (25/24/1, v/v/v), 5 ml de cette solution de phénol ont été ajoutés dans un tube Greiner à visser, puis l'échantillon. Après légère agitation pendant 20 à 30 secondes pour mélanger, la solution a été centrifugée pendant 5 minutes à 3 920 g dans un rotor de type"swinging bucket".
Après avoir passé la solution dans un tube Nalgene, ! ml d'acétate d'ammonium 7,5 M et 10 rnl d'éthanol absolu ont été ajoutés. Après centrifugation pendant 20 minutes à 0 C à 48 400 g (Beckman
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J2-21), le culot a été lavé avec 1 ml d'éthanol à 70 %, puis séché sous vide et remis en suspension dans 1, 8 ml de solution 4 (Tris 10 mM ; EDT A 1 mM, NaCI 1 M)
Après avoir ôté le bouchon supérieur puis le bouchon inférieur de la colonne, celle-ci a été posée sur un tube de collecte et ensuite centrifugée pendant 1 minute à 980 g. Le tube de collecte ayant recueilli le tampon d'équilibrage a été éliminé. La colonne a été placée sur un autre tube de collecte et l'échantillon dissous (1,8 ml) a été déposé au sommet de la résine.
La colonne a été centrifugée pendant 12 minutes à 980 g dans un rotor de type"swinging bucket" La solution plasmidique recueillie a été divisée en deux tubes Eppendorf auxquels on a ajouté 600 pl d'isopropanol. Après centrifugation pendant 15 minutes à 18 320 g (centrifugeuse SIGMA 2K15), le culot a été lavé avec 300 11 d'éthanol à 70 % (v/v) et séché sous vide. Le culot comprenant l'ADN plasmidique est remis en solution dans 500 III d'eau Milli-Q (Millipore, USA) et conservé au froid jusqu'à la vaccination.
En ce qui concerne la préparation du plasmide ADN+, environ 11 mg ont été préparés selon la méthode utilisant les colonnes PZ523 et environ 16 mg en utilisant les colonnes Qiagen. Ces deux préparations ont été melangées et mises en oeuvre pour les exemples décrits.
Etape C Formulation du vaccin comprenant le plasmide et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Le culot d'ADN plasmidique étant remis en solution dans de l'eau, la concentration en ADN a été déterminée par dépôt sur gel d'agarose et révélation au bromure d'éthidium (voir"Molecular cloning, a laboratory manual", J Shambrook, E F Fritsch et T Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press
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(1989), µ 6 et appendix E et Winnacker E.
L"From gènes to clones", VCH (1987), µ2122) La concentration en ADN a été ajustée de façon à se situer
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entre 0 3 et 1 ug d'ADN par ut d'eau
Exemple 2 Utilisation du vaccin plasmidique chez la souris pour stimuler l'induction d'une réponse en anticorps et d'une réponse de cellules T cytotoxiques
L'expérience menée chez la souris pour prouver l'efficacité du vaccin plasmidique requiert la construction d'un plasmide témoin dérivé du plasmide pEVhis 14gIII, en préalable à l'immunisation des animaux et à l'analyse de la réponse immunitaire.
Etape 1 Construction d'un plasmide dérivé du plasmide pEVhis14gIlI par délétion de la séquence codante du gène gIII
Un plasmide dérivé du plasmide pEVhis14gIII par délétion de la séquence codante du gène de la glycoprotéine gIII a été utilisé en tant que contrôle négatif (pEVhis14gIlI-, ADN-). Ce plasmide délété a été obtenu de la manière suivante le plasmide pEVhis 14gIII a été digéré par les enzymes de restriction Asp 718 et EcoRV L'ADN a été ensuite traité à l'aide d'ADN polymérase T4 pour obtenir des fragments à bouts francs. L'ADN ainsi obtenu a été ligaturé à l'aide de l' ADN ligase T4 (voir"Molecular cloning, a laboratory manual", J.
Shambrook, E F Fritsch et T Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), µ 1 53 1 73)
En ce qui concerne la préparation du vaccin contenant le plasmide délété, les mêmes étapes ont été suivies que celles décrites pour le plasmide ADN+, à l'exception près que lors de la production du plasmide pEVhis14gIII par maxi préparation, les colonnes PZ523 ont été utilisées uniquement Etape 2 : Immunisations des souris
5 groupes de 6 à 10 souris femelles de la souche consanguine Balb/c âgées de 16 à 18 semaines à la première injection, ont été utilisées.
Les souris doivent êtres consanguines pour mesurer les réponses de cellules T cytotoxiques (CTL) car la compatibilité du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) entre les cellules T cytotoxiques et les cellules cibles, - des cellules (fibroblastes) 3T3-swiss albino (haplotype H-2D)-, doit être garantie. Les cellules cibles ont été cultivées dans un milieu DME à 10 % (v/v) de sérum de veau foetal.
L'ADN plasmidique du plasmide pEVhisI4gIII, contenant le gène de la glycoprotéine gIII du virus PRV, a été utilisé en tant que ADN positif, (ADN')
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tandis que le plasmide équivalent, sans le gène gIII, (ADN-), a été utilisé en tant que contrôle négatif ! 00 g d'ADN ont été injectés dans chaque souris de manière intramusculaire, dans l'arrière train supérieur gauche et droit, en deux portions contenant de 50-150 l de solution aqueuse, selon le protocole d'immunisation suivant.
Le groupe 1 comprenant 10 souris marquées par un code coloré, a éte vacciné quatre fois, à la semaine 0 (ADN1 +) à la semaine 3 (ADN2 +), à la semaine 5 (ADN) et à la semaine 10 (ADN4+) avec de l'ADN+ Du sérum, sADN, a été prélevé 2 jours avant la dernière injection, du sérum sADN4 a été prélevé 6 jours après le premier prélèvement c.-à-d. 5 jours après la dernière injection ADN.
La semaine 11, les cellules de la rate ont été prélevées et restimulées in vitro Les tests CTL ont été effectués 4 jours plus tard.
Le groupe 2 comprenant également 10 souris marquées par un code coloré, a été vacciné trois fois, à la semaine 0 (ADN1+), à la semaine 3 (ADN2+) et à la semaine 5 (ADN3+) avec de l'ADN+ Du sérum, sADN2+, a été prélevé 2 jours avant la dernière injection et du sérum sADN3 a été prélevé à la semaine 9 c-à-d 4 semaines après la dernière injection ADN3+.
La semaine 9, les cellules de la rate ont été restimulées in vitro. Les tests CTL ont été effectués 6 jours plus tard.
Le groupe 3 comprenant 8 souris marquées par un code coloré, a été vacciné seulement deux fois, à la semaine 0 (ADN 1 +) et à la semaine 3 (ADN2+) Du sérum, sADN, a été prélevé 2 semaines après la dernière injection et à la semaine 9
La semaine 9, les cellules de la rate ont été restimulées in vitro Les tests CTL ont été effectués 6 jours plus tard.
Le groupe 4, ou groupe de contrôle, comprenant 10 souris marquées par
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un code coloré, a été vacciné trois fois avec de l'ADN-, à la semaine 0 avec 200 gg d'ADN- (ADN 1-), à la semaine 2 avec 100 ug (ADN2-) et à la semaine 7 avec 100 Ilg d'ADN- (ADN3-). Du sérum, sADN2-, a été prélevé 2 jours avant la dernière injection et du sérum sADN'a été prélevé à la semaine 8 c -à-d 1 semaine après la dernière injection ADN3-.
La semaine 8, les cellules de la rate ont été prélevées et restimulées in vitro Les tests CTL ont été effectués 4 jours plus tard.
Le groupe 5 (groupe témoin positif), comprenant 6 souris, a été vacciné
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trois fois avec du virus vivant, souche NIAS M207 (obtenue de l'Institute for
Animal Science and Health, ID-DLO, NL) à la dose de 107 PFU (Plaque Forming
Unit) par souris et par injection dans les cous de pied, à la semaine 0, à la semaine
16 et à la semaine 17
Du sérum a été prélevé 2 jours après la deuxième injection. Un mélange de sérum provenant de 5 animaux a été utilisé pour les analyses.
La semaine 18, les cellules de la rate ont été prélevées et restimulées in vitro. Les tests CTL ont été effectués 4 jours plus tard Etape 3 Analyse de la réponse immunitaire humorale et cellulaire (test CTL)
Selon le cas, les animaux ont été euthanasiés et la rate a été prélevée dans des conditions aseptiques entre 7 jours et jusqu'à six semaines après la dernière injection d'ADN Partie A-Mise en culture et restimulation in vitro des effecteurs
Les souris vaccinées et les souris témoins ont été euthanasiées par dislocation cervicale et rincées à l'alcool (70 % v/v). Les rates de ces animaux ont été déposées dans une boîte de Pétri contenant du PBS (Gibco) et ont été écrasées dans ces boîtes à l'aide d'une gaze en Nylon et d'un tube en plastique recourbé.
L'élimination des agrégats et du tissu conjonctif entourant la rate s'est faite par filtration (au travers de la gaze en Nylon) du broyat obtenu. Après une centrifugation à 220 g pendant 4 minutes, le culot a été récupéré et les
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érythrocytes ont été lysés par ajout de 4 ml/rate de solution stérile ACK (0, 15 M NH4CI, 1 mMKHC03, 0, 1 mM NaEDTA, pH = 7, 2-7, 4)
Ensuite, deux lavages ont été réalisés avec du milieu effecteur stérile [composé de milieu DME (Dulbecco's modified Eagle, Gibco), complété par 10 % (v/v) de sérum de veau foetal (Gibco), 1 % (v/v) de L-glutamin 200 mM (Gibco), 1 % (v/v) de la solution d'antibiotique pénicilline-streptomycine (pénicilline à 10 000 U/ml et streptomycine à 10000 Ilg/ml (Gibco), 10 mM de tampon HEPES (pH = 7, 4) (Sigma),
2 x 10-5 M de 2-mercaptoéthanol (Gibco), 2 mM de pyruvate de sodium (Merck)]. Les cellules ont été remises en suspension à raison de 5 x 106 cellules par ml dans ce milieu stérile Les cellules de rate sont réparties pour leur mise en culture in vitro dans des flacons de culture de 25 cm2 (Falcon) au taux de 25 x 106 cellules/flacon. Une partie de ces cellules a reçu une restimulation in vitro par ajout d'une des souches virales citées plus haut avec une multiplicité d'infection (MOI) égale à 2 et les autres ont servi de témoins non restimulés Ces flacons ont été disposés verticalement dans un incubateur pendant 4 à 7 jours (à 37 oC, 3 % (v/v) de C02 et une humidité supérieure à 90
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% de la saturation) comme décrit plus haut.
Partie B-Le test CTL.
Les cellules de la lignée histocompatible (fibroblastes) 3T3-swiss albino (haplotype H-2D) sont utilisées comme cibles.
Le test CTL comporte plusieurs étapes. a) Les cellules cibles ont été infectées ou non par une souche du virus Aujeszky (NIA3 M207) à une MOI égale à 10, les cellules infectées étant désignées CVI et les cellules non infectées CV-. Quatre-vingt-dix minutes plus tard, le marquage des cellules cibles en suspension a débuté (voir plus loin-Marquage à l'Eu des cellules cibles (3T3) en suspension.
b) Quant aux effecteurs mis en culture in vitro 4 à 7 jours (comme décrit plus haut) auparavant, ils ont été repris dans des flacons de culture, lavés 2 x avec du milieu effecteur et comptés pour être remis en suspension à raison de 5 x
106 cellules/ml Six heures après le début de l'infection des cellules cibles, celles-ci ont été mises au contact des effecteurs (parmi lesquels des lymphocytes Tc) Dans une plaque de 96 puits à fond rond, 5 000 cellules cibles dans 50 ut de milieu effecteur (marquées à l'Eu et infectées ou non) ont été déposées sur respectivement 500 000,250 000, 125 000,62 500,31 250,
15 625 effecteurs dans 100 ut (c.-à-d. des rapports effecteurs/cibles allant de
100/1 à 3/1). Des répétitions (3 ou 4 fois) sont effectuées pour chaque condition.
La plaque a été centrifugée à 50 g pendant 4 minutes et mise à 37 *C durant 4 heures. L'évaluation de la quantité de cellules cibles Iysées par les lymphocytes Tc a été effectuée par un prélèvement de surnageant après une nouvelle centrifugation de 4 minutes à 50 g. Celui-ci a été déposé dans une plaque de 96 puits à fond plat dans 200 ut d'une solution amplificatrice de la fluorescence (DELFIA"Enhancement solution, Pharmacia, Sweden) dans le cas du marquage à l'Eu. Le comptage au fluorimètre (delayed-time fluorimeter, 1234 DELFIA Recherche, Wallac) a été effectué 12 heures plus tard en ayant pris soin de mettre les plaques contenant le mélange à l'obscurité et à température ambiante.
La quantification de la lyse spécifique (en %) a été estimée à l'aide de la formule suivante : Libération expérimentale-bruit de fond ---.-.---.------.------ x 100 = Lyse spécifique (%) Libération maximale-bruit de fond Partie C-Marquage à l'Eu des cellules cibles en suspension
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Ce type de marquage est d'application tant pour des cellules se développant en suspension que pour des cellules adhérentes
Des flacons de culture à confluence maximale ont été utilisés pour les différents marquages des cellules cibles 3T3
Le flacon de culture contenant les cellules cibles 3T3 adhérentes a été débarrassé de son milieu de croissance et lavé 1 x avec du PBS (Gibco) 5 ml de trypsine-EDTA (Gibco)
à 37 C ont été déposés dans le flacon sur le tapis cellulaire Au bout d'une minute, les cellules ont été décrochées par petits coups secs sur le flacon. Le décrochage complet réalisé, 7 ml de milieu effecteur stérile [décrit au-dessus ont été ajoutés. Les cellules ont été lavées 1 x avec une solution composée de tampon HEPES [50 mM HEPES (acide (hydroxy-2-éthyl)- 4-pipérazinyl-1, 2-éthanesulfonique) (pH = 7,4), (Sigma) ; 93 mM NaCl (Merck) ; 5 mM KCI (Merck) ; 2 mM MgC12. 6H20 (Merck)] et remises en suspension à raison de 6 x 106 cellules/ml dans ladite solution. Le comptage de cellules vivantes a été effectué avec du Bleu Trypan (solution à 0,4 % (p/v), Sigma).
Un ml de cette suspension a été complété par.
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- 750 ul de la solution du tampon HEPES (pH 7, 4), - 200 ut de la solution d'Eu-DTPA (1, 52 ml de la solution standard d'Eu (1 000 f. 1g/ml dans 1 % (v/v) d'acide nitrique) (Aldrich) ; 8 ml de la solution du tampon HEPES (pH 7,4) ; 0,5 ml de DTPA acide diéthylène triaminepentaacétique (Merck) à 3,93 g dans 100 ml de la solution du tampon HEPES) et après 2 minutes, par 100 ul de sulfate de dextran (50 mg sulfate de dextran, M W = 500 KDa, Pharmacia dans 10 ml de la solution du tampon HEPES)
Trente minutes ont été nécessaires au marquage à température ambiante.
Pendant ce marquage, les tubes ont été agités faiblement toutes les 10 minutes Après quoi, 7 ml de tampon de réparation [0, 588 g de CaC12 2H20 (Merck), 1, 8 g de glucose (Merck) dans 1 litre de la solution tampon HEPES pH 7, 4] ; 3 ml de milieu effecteur (voir plus haut) et 12 gl d'ADNase à 17 000 unités/ml (Boehringer Mannheim) ont été ajoutés Une pause de 8 minutes a été observée Ensuite, un lavage avec le milieu effecteur a été suivi d'un coussin de Ficoll-Paque (Ficoll et diatrizoate de sodium, Pharmacia LKB).
Pour ce faire, les cellules ont été resuspendues dans 5 ml de milieu effecteur dans un tube de 50 ml (Falcon), et 5 ml de Ficoll-Paque ont été déposés dans le fond
Après quinze minutes de centrifugation à 800 g et 20 C, la partie supérieure de la solution dans le tube jusqu'à l'interface comprise a été récupérée
Les cellules ont été débarrassées de toutes traces de Ficoll-Paque par un
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lavage avec le milieu effecteur. Après comptage, les cellules ont été remises en suspension à une concentration de 105 cellules/ml.
Pour l'évaluation du marquage, 5 000 cellules cibles ont été déposées dans une plaque de 96 puits à fond rond en présence de 100 ut de milieu effecteur pour déterminer la quantité de bruit de fond de l'Eu.
La même quantité de cellules a été déposée dans ! 00 ut de Triton X-l 00 (1 % v/v, Merck) pour la libération maximale d'Eu. Après une centrifugation de 4 minutes à 50 g, 20 ut de surnageant ont été prélevés et déposés dans 200 ut d'une solution amplificatrice (voir plus haut) de la fluorescence et la plaque de 96 puits à fond plat a été passée au fluorimètre (1234 DELFIA Recherche, Wallac) après une incubation de 1 heure dans l'obscurité de façon à atteindre une lecture stable Partie D-Résultats du test CTL.
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Tableau 2 Comparaison de la lyse spécifique des splénocytes avant et après passage sur un gradient Ficoll-Paque.
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<tb>
<tb>
Groupes/in <SEP> vitro/cibles <SEP> Lyse <SEP> spécifique <SEP> (en <SEP> %)
<tb> #déviation <SEP> standard <SEP> (en <SEP> %)
<tb> Rapport <SEP> E/C
<tb> 100/1 <SEP> 50/1 <SEP> 25/1 <SEP> 12/1 <SEP> 6/1 <SEP> 3/1 <SEP> n
<tb> Groupe <SEP> 5
<tb> SB++/MOI2/CV+ <SEP> 37,6 <SEP> 22,9 <SEP> 16,1 <SEP> 8,4 <SEP> 3,8 <SEP> -0,5 <SEP> 4
<tb> Avant <SEP> Ficoll <SEP> #10,0 <SEP> #5,8 <SEP> #4,7 <SEP> #2,2 <SEP> #1,2 <SEP> #0,2
<tb> SB++/MOI2/CV+ <SEP> 42,2 <SEP> 35,5 <SEP> 20,3 <SEP> 17,0 <SEP> 9,1 <SEP> 11,4 <SEP> 4
<tb> Après <SEP> Ficoll <SEP> #16,4 <SEP> #12,2 <SEP> #6,4 <SEP> #6,9 <SEP> #3,3 <SEP> #4,5
<tb> Groupe <SEP> 1
<tb> ADN4+/V-/CV- <SEP> 7,5 <SEP> 6,1 <SEP> 2,8 <SEP> 1,2 <SEP> -0,7 <SEP> -0,9 <SEP> 4
<tb> Avant <SEP> Ficoll1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 2
<tb> ADN4+/V-/CV <SEP> 9,2 <SEP> 9,1 <SEP> 5,5 <SEP> 2,
7 <SEP> 1,9 <SEP> 1,2 <SEP> 4
<tb> Après <SEP> Ficoll <SEP> #1,6 <SEP> #1,5 <SEP> #0,6 <SEP> #0,5 <SEP> #0,2 <SEP> #0,2
<tb> ADN4+/V-/CV+ <SEP> 11,9 <SEP> 9,3 <SEP> 1,8 <SEP> -2,1 <SEP> -2,7 <SEP> -3,6 <SEP> 4
<tb> Avant <SEP> Ficoll <SEP> #4,0 <SEP> #3,5 <SEP> #0,6 <SEP> #0,6 <SEP> #0,8 <SEP> #1,0
<tb> ADN4+/V/CV+ <SEP> 31,8 <SEP> 49,4 <SEP> 45,6 <SEP> 20,6 <SEP> 19,8 <SEP> 10,7 <SEP> 4
<tb> Après <SEP> Ficoll14, <SEP> 2 <SEP> 20, <SEP> 3 <SEP> 23, <SEP> 8 <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 7
<tb> ADN4+/MOI2/CV- <SEP> -0,3 <SEP> -0,7 <SEP> -1,0 <SEP> -0,6 <SEP> -1,3 <SEP> -1,2 <SEP> 4
<tb> Avant <SEP> Ficoll <SEP> #0,1 <SEP> #0,1 <SEP> #0,2 <SEP> #0,1 <SEP> #0,2 <SEP> #0,2
<tb> ADN4+/MOI2/CV- <SEP> -2,0 <SEP> -1,6 <SEP> -1,2 <SEP> -2,7 <SEP> -1,1 <SEP> -1,3 <SEP> 4
<tb> Après <SEP> Ficotl0, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0,
<SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 2
<tb> ADN4+/MOI2/CV+ <SEP> -5,3 <SEP> -6,2 <SEP> -5,4 <SEP> -5,1 <SEP> -4,1 <SEP> -3,3 <SEP> 4
<tb> Avant <SEP> Ficoll1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 9
<tb> ADN4+/MOI <SEP> 2/CY+ <SEP> 15,4 <SEP> 12,8 <SEP> 19,1 <SEP> 15,3 <SEP> 7,6 <SEP> 22,9 <SEP> 4
<tb> Après <SEP> Ficoll <SEP> #6,6 <SEP> #5,8 <SEP> #8.6 <SEP> #7,2 <SEP> #2,9 <SEP> #13,3
<tb> Groupe <SEP> 4
<tb> ADN3-/MOI2/CV+ <SEP> -5,5 <SEP> -5,2 <SEP> -3,9 <SEP> -3,3 <SEP> -3,9 <SEP> -3,7 <SEP> 4
<tb> Avant <SEP> Ficoll <SEP> #1,7 <SEP> #1,5 <SEP> #1,2 <SEP> #1,1 <SEP> #1,2 <SEP> 1,3
<tb> ADN3-/MOI2/CV+ <SEP> -10,3 <SEP> -5,8 <SEP> -7,8 <SEP> -2,4 <SEP> -3,5 <SEP> 6,5 <SEP> 4
<tb> Après <SEP> Ficoll <SEP> #4,2 <SEP> #2,1 <SEP> #3,4 <SEP> #1,1 <SEP> #1,3 <SEP> #2,
8
<tb>
Notes explicatives concernant les traitements de restimulation in vitro et la préparation des cibles v- cellules de rate mises en culture in vitro en l'absence de virus
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MOI 2 cellules de rate mises en culture in vitro et restimulées par ajout de virus vivant (NIA3 M207) avec une multiplicité d'infection (MOI) égale à 2.
CY- cellules cibles non-infectées, marquées à l'Europium CV+ cellules cibles infectées par le virus NIA3 M207 à une MOI égale à
10, et marquées à l'Europium SB++ groupe 5, témoin positif vacciné par du virus vivant ADN4 groupe l, animaux injectés 4 fois avec l'ADN+ ADN'groupe 4, animaux injectés 3 fois avec l'ADN- n nombre de répétitions
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La lyse des cellules cibles non infectées s'est située entre 0 et 9 % et n'était pas affectée par le passage sur le gradient de Ficoll-Paque Par contre, le témoin positif (groupe 5), aussi bien avant que après traitement Ficoll a présenté un taux de lyse cellulaire significativement positif. Les pourcentages de lyse des cibles infectées étaient augmentés par le passage sur Ficoll-Paque pour les animaux immunisés avec l'ADN.
Le test CTL du groupe 1, injecté 4 fois avec l'ADN+ (ADN4+) a montré une activité lytique
Le test CTL du groupe 2, injecté 3 fois avec l'ADN+ (ADN3+) n'a pas montré d'activité lytique.
Le test CTL du groupe 3, injecté 2 fois avec l'ADN+ (ADN2+) n'a pas montré d'activité lytique.
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Le test CTL du groupe 4, injecté 3 fois avec l'ADN- (ADN3-) n'a pas montré d'activité lytique.
Bien entendu d'autres fréquences et d'autres intervalles sont envisageables, ainsi que d'autres dosages et voies d'immunisation.
Partie E-Analyse de la réponse immunologique humorale.
Le sérum a été collecté deux fois au cours de l'expérience, la dernière collecte se faisant juste avant le sacrifice des animaux pour l'obtention des cellules de la rate en vue d'un test CTL, et les réponses anticorps ont été mesurées par - un test de séroneutralisation du virus PRV (SN) - un test immunoenzymatique (ELISA) pour la mesure dans le sérum de souris des anticorps dirigés contre un extrait de toutes les glycoprotéines PRV
Le test de séroneutralisation du virus PRV a été effectué selon le mode opératoire qui est repris ci-dessous
Des cellules PD5 (SOLVAY-DUPHAR, NL) et des virus de la souche
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Bartha K61 (SOLVAY-DUPHAR, NL) ont été utilisés. L'expérience a été réalisée dans des plaques à 96 micropuits à fond plat de Greiner (France).
Le milieu dans lequel le test SN a été effectué avait la composition suivante 340 ml Milieu essentiel Eagle minimum (Flow), 100 ml hydrolysat de lactalbumine 2,5 % (p/v) ; 5-10 ml de NaHC03 à 5,6 % (p/v) et 50 ml de sérum de veau foetal (Gibco).
Le sérum à tester a été dilué en série de 2 en 2 dans le milieu, les dilutions allant de 1 2 à 1 4096 (50 ni de sérum + 50 ut de milieu chaque fois), dans la plaque à 96 puits a fond plat (Greiner) Chaque échantillon a été testé en double.
Le virus a été dilué à 100 TCID50 (tissue culture infectious dose at 50 %) dans 0,05 ml de milieu et 50 ut de cette solution diluée de virus ont été ajoutés à
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chaque puit. Le mélange sérum/virus a été incubé pendant 24 heures à 37 C. 50 ut de la suspension de cellules PD5 ayant une concentration de 4 x 105 cellules/ml ont été ajoutés à chaque échantillon de sérum/virus. Les plaques ont ensuite été incubées à 37 C pendant 5 jours.
Les résultats ont été observés au microscope et les titres ont été calculés en prenant l'inverse de la dilution qui correspond à 50 % de la dilution limite.
Le virus a été contrôlé en incubant un échantillon de virus dilué pendant
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24 heures à 4 C et un autre échantillon de virus pendant 24 heures à 37 C Les deux suspensions de virus ont été diluées (v/v) avec le milieu du test SN (voir plus haut) 1 : 10 ; 1 : 100 et 1 1000. Puis, 0, 05 ml de chaque dilution des suspensions de virus ont été ajoutées par puit en utilisant 8 puits pour chaque dilution Puis 0,05 ml de milieu et 0,05 ml de suspension de cellules ont été ajoutés. L'interprétation des résultats sous le microscope a eu lieu après une incubation de 5 jours à 37 C.
Les réponses humorales mesurées par le test SN, après deux, trois et quatre injections d'ADN, ont montrés des valeurs nulles ou faiblement positives
Il est à noter qu'après immunisation avec du virus vivant à fortes doses, des titres mesurables mais relativement bas ont été observés dans l'essai de séroneutralisation Ces observations sont confirmées par la littérature
Le mode opératoire du test ELISA est décrit par M ELOIT et al dans ARCH.
virol (1992), 123,135-143
En plus du sérum provenant des groupes d'animaux traités comme décrit sous"immunisation des souris", 2 sérums supplémentaires ont été inclus dans l'analyse, un sérum positif (sérum +) et un sérum négatif (sérum-) Le sérumprovient de souris non-injectées (souris OF I, âgées de 3 semaines) Un melange
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de sérum de 10 souris a été effectué Le sérum + est un mélange de sérum provenant de 10 souris OF 1 ayant reçu à 3 semaines 109 TCID (tissue culture infectious dosis) d'adénovirus recombinant exprimant le gène gD par voie intramusculaire et prélevé 3 semaines plus tard.
Le Tableau 3 et le Tableau 4, repris ci-dessous, montrent la densité optique (OD) en fonction des dilutions du sérum. Les échantillons ont d'abord été testés à une dilution de 1/1 0 (Tableau 3 - test 1) afin d'identifier les échantillons positifs c à-d les échantillons pour lesquels l'OD était supérieure à la densité optique du sérum du contrôle négatif (OD x 100 = 509) Les échantillons positifs ainsi identifiés ont été testés une deuxième fois à des dilutions variables (Tableau 4)
Dans le sérum des animaux auxquels on avait injecté de l'ADN plasmidique sans le gène gIII (ADN- - pEVhis14gIII-), on n'a découvert aucun anticorps dirigé contre la glycoprotéine gIII.
Il a été montré qu'après 4 injections de plasmides ADN+, espacées de 2 semaines ou plus, les souris ont montré une bonne réponse humorale contre le virus. Sept animaux sur 9 testés ont montré des anticorps anti-gIII après quatre injections.
Même après trois injections d'ADN+, le sérum de 9 animaux sur 10 montrait des titres d'anticorps anti-gIII mesurables. De même, après 2 injections d'ADN+, le sérum de 7 animaux sur 8 montrait des réponses positives en ELISA
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Tableau 3 Test ELISA Densité optique (OD) en fonction des dilutions du sérum-Identification des échantillons positifs.
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<tb>
<tb>
OD <SEP> (x100)
<tb> n <SEP> de <SEP> souris <SEP> dilution <SEP> 1/10
<tb> Témoin <SEP> positif <SEP> (NIA3 <SEP> M207) <SEP> mélange <SEP> 2000
<tb> sADN2- <SEP> 1+2+3 <SEP> 552
<tb> 4+5+6 <SEP> 545
<tb> 7+8+9+10 <SEP> 395
<tb> sADN3-1+2+3 <SEP> 587
<tb> 4+5+6 <SEP> 679
<tb> 7+8+9+10 <SEP> 697
<tb> sADN3+ <SEP> 1 <SEP> 2000
<tb> 2 <SEP> 2000
<tb> 3 <SEP> 2000
<tb> 4 <SEP> 511
<tb> 5 <SEP> 1263
<tb> 5 <SEP> 1263
<tb> 6 <SEP> 2000
<tb> 7 <SEP> 2000
<tb>
<Desc/Clms Page number 24>
EMI24.1
<tb>
<tb> 8 <SEP> 2000
<tb> 9 <SEP> 2000
<tb> 10 <SEP> 2000
<tb> sADN4'2 <SEP> 2000
<tb> 3 <SEP> 2000
<tb> 4 <SEP> 874
<tb> 5 <SEP> 759
<tb> 6 <SEP> 2000
<tb> 7 <SEP> 2000
<tb> 8 <SEP> 2000
<tb> 9 <SEP> 2000
<tb> 10 <SEP> 2000
<tb> sérum-mélange <SEP> 509
<tb> sérum <SEP> + <SEP> mélange <SEP> 2000
<tb>
notes explicatives sADN2-sérum provenant d'animaux injectés 2 fois avec
ADN- sADN3'sérum provenant d'aminaux injectés 3 fois avec ADNsADN3 sérum provenant d'animaux injectés 3 fois avec ADN+ sADN4+ sérum provenant d'animaux injectés 4 fois avec ADN+ témoin positif (NIA3 M207) sérum provenant d'animaux injectés avec du virus vivant NIA3 M207
<Desc/Clms Page number 25>
sérum-sérum provenant d'animaux non-injectés sérum + sérum provenant d'animaux injectés avec de l'adénovirus exprimant le gène gD.
Tableau 4 Test ELISA-densité optique (OD) en fonction des dilutions du
EMI25.1
sérum test 2
EMI25.2
<tb>
<tb> groupe <SEP> souris <SEP> N <SEP> dil. <SEP> 1/100 <SEP> 1/300 <SEP> 1/900 <SEP> 1/2700
<tb> témoin <SEP> positif <SEP> moyenne <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 2000
<tb> (M207)
<tb> sADN2 <SEP> + <SEP> 3 <SEP> 1087 <SEP> 599 <SEP> 287 <SEP> 171
<tb> 4 <SEP> 1378 <SEP> 622 <SEP> 303 <SEP> 192
<tb> 5 <SEP> 1506 <SEP> 866 <SEP> 405 <SEP> 261
<tb> 6 <SEP> 673 <SEP> 261 <SEP> 152 <SEP> 136
<tb> 7 <SEP> 1676 <SEP> 913 <SEP> 353 <SEP> 205
<tb> 8 <SEP> 1731 <SEP> 837 <SEP> 355 <SEP> 229
<tb> 9 <SEP> 1710 <SEP> 778 <SEP> 274 <SEP> 167
<tb> 1 <SEP> Négatif <SEP> à <SEP> dill/10
<tb> 2 <SEP> et <SEP> 10 <SEP> non <SEP> testé
<tb> sADN3+ <SEP> 1 <SEP> 2000 <SEP> 1029 <SEP> 329 <SEP> 142
<tb> 2 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 879 <SEP> 296
<tb> 3 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 2000
<tb>
<Desc/Clms Page number 26>
EMI26.1
<tb>
<tb> 5 <SEP> 197 <SEP> 123 <SEP> 89 <SEP> 83
<tb> 6 <SEP> 2000 <SEP> 1704 <SEP> 528 <SEP> 244
<tb> 7 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 1084 <SEP> 435
<tb> 8 <SEP> 2000 <SEP> 809 <SEP> 188 <SEP> 122
<tb> 9 <SEP> 2000 <SEP> 1501
<SEP> 285 <SEP> 169
<tb> 10 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 722 <SEP> 263
<tb> 4 <SEP> Négatif <SEP> à <SEP> dil <SEP> 1/10
<tb> sADN4 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 684 <SEP> 262
<tb> 3 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 2000
<tb> 4 <SEP> 263 <SEP> 138 <SEP> 98 <SEP> 103
<tb> 5 <SEP> 143 <SEP> 110 <SEP> 96 <SEP> 104
<tb> 6 <SEP> 2000 <SEP> 1641 <SEP> 566 <SEP> 256
<tb> 7 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 1122 <SEP> 419
<tb> 8 <SEP> 2000 <SEP> 1097 <SEP> 350 <SEP> 143
<tb> 9 <SEP> 2000 <SEP> 1739 <SEP> 462 <SEP> 211
<tb>
<Desc/Clms Page number 27>
EMI27.1
<tb>
<tb> 10 <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> 549 <SEP> 249
<tb> 1 <SEP> non <SEP> testé
<tb> sérum-mélange <SEP> 155 <SEP> 96 <SEP> 83 <SEP> 92
<tb> sérum <SEP> + <SEP> mélange <SEP> 827 <SEP> 305 <SEP> 146 <SEP> 106
<tb>
notes explicatives :
sADN'sérum provenant d'animaux injectés 2 fois avec ADN- sADN'sérum provenant d'aminaux injectés 3 fois avec ADNsADN3+ sérum provenant d'animaux injectés 3 fois avec ADN+ sADN4+ sérum provenant d'animaux injectés 4 fois avec ADN+ témoin positif (NIA3 M207) sérum provenant d'animaux injectés avec du virus vivant NIA3 M207 sérum-sérum provenant d'animaux non-injectés sérum + sérum provenant d'animaux injectés avec de l'adénovirus exprimant le gène gD Exemple 3 Induction d'une protection chez la souris contre une inoculation d'épreuve avec des virus virulents.
Partie A-Protocole d'immunisation
Cinq groupes de dix souris (Charles River, Germany) femelles de 16 semaines d'âge de la souche consanguine Balb c ont été utilisés.
Pour le groupe GO, le contrôle négatif, on a utilisé uniquement un tampon PBS (Gibco).
Le groupe Gui (le contrôle positif) a été vacciné à l'aide d'un virus atténué (souche NIA3 M207) par voie intrapéritonéale.
107 PFU (unités formant des plaques) ont été utilisées pour chaque souris.
Ceci est une dose très élevée par comparaison aux doses utilisées pour la vaccination des porcs avec les souches vaccinales atténuées utilisées traditionnellement à la dose de 105, 5 PFU
Les trois autres groupes ont reçu de l'ADN plasmidique obtenu selon la méthode décrite à l'exemple 1
La vaccination par l'ADN plasmidique a été réalisée par injection intramusculaire de 100 ug dans 2 fois 100 ul d'eau/souris dans l'arrière-train
<Desc/Clms Page number 28>
gauche et droit pendant plusieurs jours consécutifs.
Le groupe C a été vacciné deux fois, le vendredi et le lundi respectivement
Le groupe B a reçu quatre injections consécutives réparties du mercredi
EMI28.1
au lundi
Le groupe A a reçu 6 doses réparties du lundi au lundi suivant
Les animaux ont été logés dans des cages, séparés par groupe et les individus ont été marqués individuellement au feutre bleu.
Le sérum prélevé sur chaque animal a été codé de façon à pouvoir suivre chaque animal individuellement en ce qui concerne le dosage d'anticorps et la protection conférée par les vaccinations.
Partie B-Analyse des réponses immunitaires
Le développement des réponses humorales a été contrôlé selon le protocole ELISA présenté à l'exemple 2.
Le test de neutralisation de virus du sérum a été effectué selon la méthode décrite à l'exemple 2.
Des échantillons de sérum ont été prélevés au début de la période d'immunisation, c.-à-d. 3 jours après la dernière injection de vaccin, à la fin de la période d'immunisation, c.-à-d. un mois après la dernière injection de vaccin et juste avant l'inoculation d'épreuve par le virus virulent qui a eu lieu 9 jours plus tard. Enfin, un mois après le challenge, du sérum a été prélevé à nouveau.
Partie C-Inoculation d'épreuve.
Environ 37 jours après la dernière vaccination, toutes les souris ont été exposées à l'infection par un virus virulent vivant de la souche NIA3 à raison de 7 000 PFU dans 200 ml par animal injecté intrapéritonéalement. Le dosage est très élevé car la dose létale pour 50 % des animaux est environ 100 fois moins élevée (LD50 = 70 PFU).
Les animaux sont observés et les décès sont enregistrés pendant les 15 jours suivant le challenge comme indiqué au Tableau 5
Les résultats montrent l'évolution du taux de survie exprimé en pourcentage en fonction des jours suivant le challenge.
Tous les animaux du groupe de contrôle négatif sont morts après le challenge.
<Desc/Clms Page number 29>
Tableau 5 Suivi du taux de survie des souris après une inoculation d'épreuve avec virus virulents.
EMI29.1
<tb>
<tb>
Groupes <SEP> de
<tb> souris <SEP> (Dix <SEP> Taux <SEP> de <SEP> survie <SEP> (en <SEP> %) <SEP> en <SEP> fonction <SEP> des <SEP> jours <SEP> après <SEP> l'épreuve
<tb> par <SEP> groupe)
<tb> 4 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours <SEP> 6 <SEP> jours <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> 10 <SEP> jours <SEP> 15 <SEP> jours
<tb> GO <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> GI <SEP> 100 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80
<tb> ADN+ <SEP> 50 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 100 <SEP> mg
<tb> ADN+ <SEP> 80 <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30
<tb> 4 <SEP> x <SEP> 100 <SEP> mg
<tb> ADN+ <SEP> 90 <SEP> 60 <SEP> 60 <SEP> 60 <SEP> 60 <SEP> 60
<tb> 6 <SEP> x <SEP> 100 <SEP> mg
<tb>
Les résultats montrent qu'une protection a eu lieu même à la dose de vaccination la plus faible c.-à-d.
2 x 100 ug. En effet, la mort de ces animaux a été retardée par rapport au groupe de contrôle négatif (GO).
A un dosage de 4 x 100 g, 30 % des animaux ont survécu, tandis qu'à 6 x 100 ug, 60 % des animaux ont survécu. Les résultats montrent que la protection induite par cette nouvelle méthode de vaccination plasmidique est efficace, surtout si on la compare au taux de survie de 80 % observé dans le groupe G1 (le contrôle positif) c. -à-do le groupe d'animaux vaccinés par le virus atténué à dose très élevée (107 PFU).
Il reste à noter que la méthode de vaccination utilisée dans cet exemple peut encore être optimisée. D'après les résultats de l'essai de cytotoxicité contre le virus PRV, la vaccination par injection plasmidique pendant plusieurs jours consécutifs n'a pas induit de réponse CTL tandis que l'injection de la même quantité d'ADN à des intervalles de 3 semaines ou plus, telle qu'utilisée dans l'exemple 2 a induit une réponse CTL prononcée.
De plus, la réponse humorale induite, mesurée par la réponse des anticorps anti-gIII dans le test ELISA, était plus faible suite aux injections plasmidiques pendant plusieurs jours consécutifs que la réponse humorale induite par des injections de la même quantité d'ADN à des intervalles de 3 semaines, décrite dans l'exemple 2 Exemple 4 Induction d'une protection chez la souris contre une inoculation d'épreuve avec des virus virulents.
Pour ces expériences, le protocole d'immunisation de l'exemple 3 a été suivi, à la seule différence que des injections d'ADN plasmidiques ont eté
<Desc/Clms Page number 30>
effectuées toutes les trois semaines et que les souris étaient âgées de 19 semaines.
Pour le groupe GO (contrôle négatif), on a utilisé uniquement du tampon
PBS (Gibco)
Le groupe G 1 (contrôle positif) a été vacciné à l'aide du virus atténué (souche NIAS M207) dans les cous de pied avec une dose de 107 PFU par souris Quatre injections d'ADN plasmidique ont été réalisées par voie intramusculaire dans les deux arrière trains de groupes de souris comprenant chacun 10 animaux, marqués par un code coloré.
Du sérum a été prélevé soit le jour même, soit dans les trois jours précédant la nouvelle immunisation.
Trois semaines après la dernière injection de plasmide et six semaines après les immmunisations des groupes de contrôle, toutes les souris ont été exposées au virus virulent NIAS à raison de 7 000 PFU/animal, injecté intrapéritonéalement. Les décès sont enregistrés pendant les 15 jours suivant l'épreuve et sont repris dans le tableau 6. Les résultats montrent les taux de survie exprimés en pourcentage en fonction des jours suivant l'épreuve.
Tableau 6 : Suivi du taux de survie des souris après une inoculation d'épreuve avec virus virulents.
EMI30.1
<tb>
<tb>
Groupes <SEP> de <SEP> Taux <SEP> de <SEP> survie <SEP> (en <SEP> %) <SEP> en <SEP> fonction <SEP> des <SEP> jours <SEP> après <SEP> l'épreuve
<tb> souris <SEP> (Dix
<tb> par <SEP> groupe)
<tb> 4 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours <SEP> 6 <SEP> jours <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> 10 <SEP> jours <SEP> 15 <SEP> jours
<tb> GO <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> G1100 <SEP> 100 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80
<tb> ADN+ <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 50 <SEP> 40 <SEP> 40
<tb> 4 <SEP> x <SEP> 100 <SEP> Ilg
<tb>
Tous les animaux du groupe GO (contrôle négatif) sont morts après l'épreuve Un taux de 80 % de survie est observé dans le groupe Gl, c. à d. les animaux vaccinés par le virus atténué à dose très élévée.
A un dosage de 4 fois 100 mg d'ADN plasmidique, 40 % des animaux ont survécu. La méthode d'immunisation par laquelle les animaux sont vaccinés avec de l'ADN plasmidique (4 injections) toutes les trois semaines s'est montrée plus efficace en comparaison aux injections journalières (meilleur taux de survie de 40 % au lieu de 30 % et retardement relatif de la mort des animaux) Exemple 5 Induction d'une réponse humorale chez le porc
Trois groupes de porcs de 3 animaux, âgés de 5 semaines ont été utilisés Les animaux proviennent d'un élevage exempt de PRV et de la même portée Ils
<Desc/Clms Page number 31>
sont marqués individuellement par une bague à l'oreille
Un groupe de 3 animaux (# 1, 2 et 3) qui n'ont pas été vaccinés est utilisé comme contrôle négatif
Pour les 2 autres groupes,
trois injections intramusculaires du plasmide pEVhis14gIII ont été effectuées à l'âge de 5,7 et 9 semaines
Trois animaux (# 4,5 et 6) ont reçu une dose de 75 gg de plasmide, alors que 3 autres porcs (# 7,8 et 9) recevaient 560 gg de plasmide à chaque injection La dose d'ADN a été diluée dans 4 ml de tampon PBS (Gibco, USA) et administrée en 4 portions de 1 ml à 4 endroits d'inoculation : des 2 côtés de la nuque et au centre de l'arrière train gauche et droit L'injection s'est pratiquée à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille Terumo de 40 mm de long avec une ouverture de 09mm.
Du sérum a été prélevé lors de chaque injection et 2 semaines après la dernière injection L'analyse des réponses humorales (anticorps contre la protéine glII) avant et pendant l'immunisation a été effectuée par un test de séroneutralisation (test sensible à la mediation par le complément, voir Bitsch et Eskilsen, curr Top. Vet. Med. Anim. Sci. 12, 41 49, 1982) et par un test IPMA (Immuno Peroxydase Monolayer Assay).
Le test IPMA a été effectué selon le mode opératoire qui est repris ci dessous. A chaque puit des plaques à 96 puits (Coming, USA) recouvert d'un tapis de cellules SK 6 confluentes (ATCC, USA) ont été ajoutés 500 TCID50 de virus PRV de la souche 89V87 ( (Nauwynck H., Pensaert M, Am. J. Vet. Research, 53 (4) 489 (1992)) dans du milieu MEM (Gibco, USA). Dès l'apparition d'un effet cythopathique les plaques sont thermofixées : après un lavage au tampon PBS, les plaques sont séchées à 37 C jusqu'à évaporation du liquide.
Ensuite elles sont incubées à 80 C pendant 1 heure Le sérum à tester, dilué de 2 en 2 en série dans du PBS a été distribué dans les puits et la plaque a éte incubée pendant 1 heure à 37 C Le sérum a été retiré et les plaques ont subi 2 lavages au PBS, suivis d'une incubation d'une heure en présence d'anticorps anti porcins marqués à la peroxydase (Nordic, Hollande) et dilués 100 fois dans du PBS Après 1 heure, les plaques ont été incubées en présence de substrat 3 amino 9 éthylcarbazole (2 mg
EMI31.1
AEC dans 10 ml de tampon acétate de sodium (0.
05 M à pH 5) et 75 ul de H202 à 30 %) L'apparition d'une coloration rouge est observée au microscope optique La réaction a été interrompue après 15 minutes par 3 lavages a l'eau de ville Les
<Desc/Clms Page number 32>
titres IPMA sont calculés en prenant l'inverse de la dilution la plus forte qui engendre une coloration rouge des foyers d'antigène viral sur les cellules infectées Les résultats du test de séroneutralisation et du test IPMA sont repris dans le tableau 7 Tableau 7 Titres en anticorps contre le virus PRV déterminés par le test de séroneutralisation et par le test IPMA
EMI32.1
<tb>
<tb> Titres <SEP> en <SEP> anticorps <SEP> en <SEP> fonction <SEP> de <SEP> l'âge
<tb> âge
<tb> ? <SEP> Dose <SEP> de <SEP> 5 <SEP> semaines <SEP> 7 <SEP> semaines <SEP> 9 <SEP> semaines <SEP> 11 <SEP> semaines
<tb> du
<SEP> plasmide
<tb> porc <SEP> pEVhis <SEP> 14gIII
<tb> administrée
<tb> SN <SEP> IPMA <SEP> SN <SEP> IPMA <SEP> SN <SEP> IPMA <SEP> SN <SEP> IPMA
<tb> JOmg <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5
<tb> 2Omg <SEP> < 2 <SEP> < <SEP> 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5
<tb> 3 <SEP> Omg <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5
<tb> 4 <SEP> (75 <SEP> mg) <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> 4 <SEP> < 5 <SEP> 6 <SEP> 128
<tb> 5 <SEP> (75 <SEP> mg) <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5
<tb> 6 <SEP> (75 <SEP> mg) <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> 4 <SEP> 128
<tb> 7 <SEP> (560 <SEP> mg) <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5
<tb> 8 <SEP> (560 <SEP> mg)
<SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5
<tb> 9 <SEP> (560 <SEP> mg) <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < <SEP> 5 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> 3 <SEP> 128
<tb>
Notes explicatives SN. titre en anticorps séroneutralisants IPMA titre en anticorps déterminés par la méthode IPMA
Les résultats montrent qu'aucun des animaux non vaccinés n'a développé des anticorps contre le virus PRV. Les résultats indiquent que même à la dose de vaccination la plus faible c'est à dire 3 x 75 ug, une réponse humorale a été induite dans 2 porcs sur 3 Un seul animal sur 3 a réagi à un dosage de 560 ug.
Les réponses sont faibles et les différences entre les 2 groupes immunisés ne sont pas significatives.
<Desc/Clms Page number 33>
Exemple 6 Induction d'une protection contre une épreuve avec un virus virulent chez le porc.
On reproduit exactement le protocole de l'exemple 5
On a utilisé trois groupes de 3 porcs agés de 5 semaines. Les animaux proviennent d'un élevage exempt de PRV et de la même portée. Ils sont marqués individuellement par une bague à l'oreille
Un groupe de 3 animaux qui n'ont pas été vaccinés, a été utilisé comme contrôle négatif.
Pour les 2 autres groupes, trois injections intramusculaires du plasmide pEVhis 14glII ont été effectuées à l'âge de 5,7 et 9 semaines conformément à la technique décrite à l'exemple 5 Trois animaux (No de porc 4,5 et 6) ont reçu une dose de 75 ug de plasmide, alors que les trois autres animaux (No de porc 7,8 et 9) ont reçu une dose de 560 ig de plasmide.
L'épreuve par virus virulent a été effectuée selon la méthode décrite dans Vaccine 1994,12 (7), p. 661 665 et est décrite ci après.
27 semaines après, c'est à dire 18 semaines après la dernière injection de plasmide, tous les animaux sont transférés dans une unité isolée en vue d'une exposition au virus virulent PRV souche 75V19 (Andries K, Pensaert MB, Vandeputte J, Am. J Vet Res., 1978,39, p. 1282 1285).
La température de l'unité isolée est maintenue à 18 C et la ventilation à 0,2 mis 105, 0 TCID50 de virus PRV (souche 75V19) mis en suspension dans 5 ml de tampon phosphate sont administrés à tous les animaux. 2 ml de cette suspension est donné oralement et 1,5 ml de cette suspension est instillé dans chaque narine.
Tous les animaux ont été observés quotidiennement durant les deux semaines qui suivent l'épreuve. La température du corps des animaux a été notée, ainsi que leur poids. Le gain de poids relatif (RDWG) a été calculé selon la formule ci après, en vue de comparer les performances des trois groupes RDWG à partir du jour de l'épreuve jusqu'au jour x : poids au jour x poids au jour de l'épreuve RDWG =------------------------------------------------------- poids au jour de l'épreuve
Les secrétions nasales de tous les animaux ont été prélévées avec un écouvillon tous les deux jours durant 14 jours après l'épreuve Le poids des sécrétions nasales prélevées a éte noté Les sécrétions nasales prelévées ont été
<Desc/Clms Page number 34>
mises en suspension dans un tampon phosphate.
Des dilutions décimales de ces suspensions ont été inoculées à des cultures de cellules en monocouche, ces cellules venant d'une lignée cellulaire continue de testicule de porc (ST). Ensuite, la présence d'un effet cytologique pour ces cultures de cellules a été contrôlée durant cinq jours La dose léthale 50 a été calculée selon la méthode de Reed et Muench (Amer J. Hyg., 1938,27, 493 497). Les titres en virus ont été exprimés en TCID50 par gramme de sécrétion nasale.
Les résultats des examens sérologiques sont rassemblés dans le tableau 8.
<Desc/Clms Page number 35>
EMI35.1
Tableau 8 Titres en anticorps contre le virus PRV déterminés par le test de séroneutralisation (SN) et par le test IPMA
EMI35.2
<tb>
<tb> NO <SEP> Dose <SEP> de <SEP> Titres <SEP> en <SEP> anticorps <SEP> en <SEP> fonction <SEP> de <SEP> l'âge
<tb> de <SEP> plasmide
<tb> porc <SEP> pEVhis <SEP> 14gill
<tb> administrée
<tb> 5 <SEP> semaines <SEP> 7 <SEP> semaines <SEP> 9 <SEP> semaines <SEP> 11 <SEP> semaines <SEP> 27 <SEP> semaines <SEP> 27 <SEP> semaines <SEP> 29 <SEP> semaines
<tb> (1re <SEP> vaccination) <SEP> (2e <SEP> vaccination) <SEP> (3e <SEP> vaccination) <SEP> (épreuve) <SEP> 5 <SEP> jours <SEP> (14 <SEP> jours <SEP> après
<tb> (5 <SEP> jours <SEP> apres <SEP> l'epreuve)
<tb> l'épreuve)
<tb> SN <SEP> IPMA <SEP> SN <SEP> IPMA <SEP> SN <SEP> IPMA <SEP> SN <SEP> IPMA <SEP> SN <SEP> SN <SEP> SN
<tb> Co* <SEP> Se* <SEP> Co* <SEP> Se* <SEP> Co* <SEP> Se* <SEP> Co* <SEP> Se* <SEP> Co* <SEP> Se* <SEP> Co* <SEP> Se* <SEP> Co* <SEP> Se*
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> g <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> 96 <SEP> #384
<tb> 2 <SEP> 0 <SEP> ug <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> 64 <SEP> #384
<tb> 3 <SEP> 0 <SEP> g <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> 128 <SEP> 84
<tb> 4 <SEP> 75 g <SEP> < 2 <SEP> < 2
<SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> 4 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> 6 <SEP> 128 <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> #384 <SEP> #384
<tb> 5 <SEP> 75 <SEP> g <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> 128 <SEP> #384
<tb> 6 <SEP> 75 <SEP> g <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> 4 <SEP> 128 <SEP> 6 <SEP> 24 <SEP> 4 <SEP> 32 <SEP> > 384 <SEP> > 384
<tb> 7 <SEP> 560 <SEP> g <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> 2 <SEP> 128 <SEP> #384
<tb> 8 <SEP> 560 <SEP> g <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> 4 <SEP> 24 <SEP> 4 <SEP> 48 <SEP> 192 <SEP> #384
<tb> 9 <SEP> 560
<SEP> G <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> < 2 <SEP> < 5 <SEP> < 2 <SEP> 3 <SEP> 128 <SEP> < 2 <SEP> 8 <SEP> < 2 <SEP> 24 <SEP> 192 <SEP> #384
<tb>
Co* conventionnel Se* sensible
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L'analyse des réponses humorales a été effectuée par un test de séroneutralisation sensible (test sensible à la mediation par le complément selon la technique décrite par Bitsch et Eskilsen, Curr Top Vet Anim Sci, 1982, 12, p 41 49) et par un test de séroneutralisation conventionnel (selon la technique décrite par Andries K, Pensaert MB, Vandeputte J, Am. J Vet Res., 1978,39, p 1282 1285)
Ces résultats montrent qu'une réponse sérologique a été trouvée pour seulement un des six animaux vaccinés au moment de la dernière vaccination.
Deux et dix huit semaines après, des titres en anticorps séroneutralisant entre 3 et
EMI36.1
24 ont été observés respectivement pour trois des animaux (No du porc 4, 6 et 9) et pour quatre des animaux (No du porc 4, 6, 8 et 9)
14 jours après l'épreuve, les titres en anticorps séroneutralisant ont été observés entre 64 et 128 pour les animaux faisant partie du groupe contrôle négatif, entre 128 et > 384 pour les animaux ayant reçu une dose de 75 ug de plasmide, et entre 128 et 192 pour les animaux ayant reçu une dose de 560 ug de plasmide
Tous les animaux ont été hébétés et anorexiques. Ils ont éternué du troisième jour après l'épreuve jusqu'au huitième ou neuvième jour après l'épreuve. Des vomissements et des troubles nerveux ont été observés pour deux animaux (No de porc 3 et 5).
Tous les animaux, sauf un ( ? de porc 8), ont eu de la fièvre ( > 40 OC) du troisième jour jusqu'a septième jour après l'épreuve La température moyenne maximale a été de 41, 3 C pour le groupe contrôle négatif et de 41 C pour les deux autres groupes
Les résultats concernant les changements de poids par animal sont rassemblés au tableau 9.
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Tableau 9 Changement de poids des animaux
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<tb>
<tb> Groupe <SEP> ? <SEP> de <SEP> porc <SEP> AG7 <SEP> AG14 <SEP> RDWG <SEP> 7 <SEP> RDWG <SEP> 14
<tb> Contrôle <SEP> 1-5, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 8-0, <SEP> 861 <SEP> 0,223
<tb> négatif <SEP> 2-5, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 4-0, <SEP> 845 <SEP> 0,256
<tb> 3 <SEP> -5 <SEP> -10, <SEP> 7 <SEP> -1, <SEP> 26 <SEP> -1, <SEP> 352
<tb> 75 <SEP> Ilg <SEP> 4-0, <SEP> 4 <SEP> 9, <SEP> 7-0, <SEP> 092 <SEP> 1, <SEP> 110
<tb> vacciné <SEP> 5 <SEP> -5,4 <SEP> -8,1 <SEP> -1,467 <SEP> -1,099
<tb> 6-3, <SEP> 3 <SEP> 4, <SEP> 3-0, <SEP> 630 <SEP> 0,411
<tb> 560 <SEP> Ilg <SEP> 7 <SEP> 0,8 <SEP> 7,7 <SEP> 0,178 <SEP> 0,857
<tb> vacciné <SEP> 8-1, <SEP> 1 <SEP> 7-0, <SEP> 185 <SEP> 0,587
<tb> 9 <SEP> -3,5 <SEP> 7,6 <SEP> -0,661 <SEP> 0,
718
<tb>
AG7 = poids 7 jours après l'épreuve-poids le jour de l'épreuve A G14 = poids 14 jours après l'épreuve-poids le jour de l'épreuve RDWG7 = RDWG 7 jours après l'épreuve RDWG14 = RDWG 14 jours après l'épreuve
Tous les animaux, sauf un ( ? de porc 8) ont perdu du poids durant la première semaine après l'épreuve.
Quatorze jours après l'épreuve, seulement deux animaux (No de porc 3 et 5), n'avaient pas repris le poids qu'ils avaient avant l'épreuve. Ils ont, de plus, continué à perdre du poids. Les trois animaux ayant reçu une dose de 560 Rg de plasmide et un animal (No de porc 4) ayant reçu une dose de 75 ag de plasmide, ont montré un gain de poids compensatoire entre le septième et le quatorzième jour après l'épreuve, de telle sorte qu'ils avaient repris leur courbe de croissance initiale entre le onzième et le quatorzième jour après l'épreuve Les deux groupes d'animaux vaccinés montrent une valeur moyenne de gain de poids significativement positive, alors que le groupe de contrôle, animaux non vaccinés, montre une valeur moyenne de gain de poids négatives (= perte de poids).
Les résultats des titrations en virus dans les sécrétions nasales sont rassemblés dans le tableau 10
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Tableau 10 Sécrétion de virus après l'épreuve
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<tb>
<tb> Groupe <SEP> ? <SEP> de <SEP> Sécrétion <SEP> de <SEP> virus <SEP> exprimé <SEP> en
<tb> porc <SEP> (log <SEP> 1 <SEP> OTCID <SEP> 50) <SEP> en <SEP> fonction <SEP> du <SEP> nombre <SEP> de <SEP> jours <SEP> après
<tb> l'épreuve
<tb> jours <SEP> après <SEP> l'épreuve
<tb> 0 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 14
<tb> Contrôle <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 3,2 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 5,5 <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> #1, <SEP> 5 <SEP> 1,7 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> négatif <SEP> 2 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 5,0 <SEP> 7,5 <SEP> 3,0 <SEP> 2,3 <SEP> 2,0 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> 3 <SEP> # <SEP> 1,
<SEP> 5 <SEP> 2,7 <SEP> 6,7 <SEP> 7,3 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 4,5 <SEP> 4,3 <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> 75 <SEP> g <SEP> 4 <SEP> < t, <SEP> 5 <SEP> 2,0 <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 7,3 <SEP> 1,7 <SEP> #1, <SEP> 5 <SEP> #1, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> vacciné <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 4,7 <SEP> 6,3 <SEP> 3,7 <SEP> 2,0 <SEP> :
<SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> 6 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> < <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 6,7 <SEP> 7,5 <SEP> < <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> !, <SEP> 5 <SEP> #1, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> 560 <SEP> g <SEP> 7 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 2,7 <SEP> 6,3 <SEP> 8,0 <SEP> 4,5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> #1, <SEP> 5
<tb> vacciné <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> 9 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 6,3 <SEP> 6,3 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5
<tb>
Les premiers virus ont été isolés des sécrétions nasales, deux jours après l'épreuve, pour deux des trois animaux dans chaque groupe.
Les titres en virus ont atteint un niveau maximum entre le quatrième et le sixième jour après l'épreuve, les titres en virus étant compris entre 105, 5 et 108, 0 TCID50. La sécrétion de virus a été stoppée entre le sixième et le huitième jour après l'épreuve pour les animaux vaccinés, alors qu'elle a continué jusqu'au douzième jour après l'épreuve pour les animaux du groupe contrôle négatif