CN112625096B - 一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由IBV‑S、IBV‑M、IBV‑E基因分别转入到杆状病毒表达系统中，获得3种重组杆粒，再分别将3种重组杆粒转染到昆虫细胞中，获得重组杆状病毒rHBM‑S、rHBM‑M和rHBM‑E，然后通过共感染的形式，初步构建得到，该病毒样颗粒应用于制备疫苗中，具有巨大的开发潜力。

Description

一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程与医学免疫学技术领域，更具体地说是涉及一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由冠状病毒鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性高度接触性传染性疾病，是国际兽疫局及我国规定的家禽二类传染病之一。不同日龄、性别、品种鸡均对IB易感。该病危害主要在三个方面：第一，破坏呼吸道黏膜的完整性，促进其它条件性疾病如支原体混合感染以及大肠杆菌等继发感染等的发生而使鸡群的死亡率增加；第二，侵害种鸡生殖系统，使后备母鸡发生输卵管炎，导致输卵管堵塞，造成产蛋障碍综合症，即所谓的“假母鸡”；第三，侵害肾脏、肠道、肌肉等，导致鸡的增重、产蛋和蛋品质、饲料报酬率等均降低，给养鸡生产带来额外的损失。尽管使用多种商品疫苗免疫，但近年来IB仍大面积频繁地发生，给养禽业造成很大的经济损失。
IBV属冠状病毒科冠状病毒属，是不分节段的单股正链RNA病毒。病毒粒子在电镜下呈圆形或多边形，有囊膜，直径在90nm～200nm，表面有长约20nm的棒状纤突。其基因组大约由27600个核苷酸组成，全长约27kb，有4种结构蛋白，即纤突(S)蛋白、小囊膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白。S蛋白具有许多重要的生物学功能，包括含有与病毒中和、血凝抑制抗体、细胞吸附、组织亲和性、毒力、血清型特异性有关的抗原位点，也是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白；M蛋白能控制并介导病毒粒子组装，在有补体存在的情况下，M蛋白还可中和病毒的感染；E蛋白对包膜形成非常重要。M蛋白和E蛋白间的相互作用对病毒样颗粒形成非常重要，是形成病毒粒子的最小组成单位。
IBV容易变异，血清型和基因型众多，各型间交叉保护作用弱。目前，疫苗接种仍然是当前防控该病的主要有效手段，然而传统的灭活苗和弱毒苗分别在安全性和免疫原性方面存在缺陷，无法提供完全有效的保护。弱毒疫苗存在毒力返强的风险，并可为IBV的基因重组提供条件。灭活苗存在灭活不全的危险，单价的灭活疫苗很难控制IBV变异株引起的IB暴发，往往需要制备多价油乳灭活疫苗，且存在使用量大、需配合佐剂使用、制备复杂、抗原结构易受破坏、成本较高等缺点。此外，由于流行毒株血清型与所用疫苗株不同，常常出现免疫偏差，导致免疫失败。因此，研制与流行毒株血清型相同的有效安全的疫苗非常有必要。
病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是由病毒的一个或多个结构蛋白在异源系统中重组表达并通过“自发性”的聚合作用自行组装而成的蛋白质颗粒。VLPs是不含病毒核酸的空心颗粒，具有安全性高、免疫原性强、稳定性好、不易失活、可塑性强的特点，而且能够刺激机体产生有效的免疫应答。VLPs作为一种新型亚单位疫苗，具有良好的安全性和免疫原性，是目前最有发展前景的候选基因工程疫苗。如今，VLPs技术已被广泛应用于疫苗研究领域，可以作为有效的独立疫苗，也被作为疫苗研究的重要平台。虽然已经报道有100多种病毒VLPs被成功构建，但是已经商品化的兽用VLPs疫苗却寥寥无几，目前市面上还没有对于IB的VLPs疫苗，构建VLPs疫苗具有巨大的商业价值和开发潜力
因此，如何提供一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒并将其应用于疫苗制备中是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒SME-VLPs，其具有更高的免疫原性，可应用于制备疫苗中，具有巨大的开发潜力。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由IBV-S、IBV-M、IBV-E基因分别转入到杆状病毒表达系统中，获得3种重组杆粒，再分别将3种重组杆粒转染到昆虫细胞中，获得重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E，然后通过共感染的形式，初步构建得到。
以上技术方案达到的技术效果是：本发明制备的病毒样颗粒由IBV-S、IBV-M、IBV-E蛋白组装而成，能够穿透细胞和组织，是一种高安全性的候选疫苗。而且，这些稳定的SME-VLPs呈现出用于抗体产生的高密度B细胞表位和细胞内T细胞表位，可分别刺激机体产生有效的特异性体液免疫和细胞免疫应答，同时也可刺激机体产生很好的固有免疫和粘膜免疫应答，所以SME-VLPs可以用于制备疫苗，有较好的免疫效果。
一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒的制备方法，包括下述步骤：
1)抽提GX-YL5鸡胚尿囊液总RNA，反转录、PCR、回收、纯化，获得GX-YL5株的S、M和E基因；
2)将GX-YL5株的S、M和E基因分别与转座载体pFastBacTM/HBM-T OPO进行平末端连接，并分别转化DH5α感受态细胞，培养，鉴定，抽提得到pFastBacTM/HBM-TOPO-S、pFastBacTM/HBM-TOPO-M和pFastBacTM/HBM-TOPO-E重组转座载体；
3)将步骤2)获得的pFastBacTM/HBM-TOPO-S、pFastBacTM/HBM-TOPO-M和pFastBacTM/HBM-TOPO-E重组转座载体分别转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，培养，鉴定，纯化、提取，得到rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E重组杆粒；
4)将步骤3)得到的rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E重组杆粒脂质体法转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E；
5)将步骤4)获得的重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E共感染悬浮培养的昆虫细胞，收获细胞悬液、超声破碎、鉴定，得SME-VLPs。
本发明先将目的基因转化DH5α感受态细胞，再转化DH10 Bac感受态细胞，由于DH5α在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。菌株中很多重组酶、修饰酶等缺失，防止质粒的重组、修饰，能够保持携带质粒的稳定性，本底蛋白表达较低，便于提取高纯度质粒；而DH10 Bac是一种比较特殊的感受态细胞，在昆虫-杆状病毒真核表达系统专门用于生产重组杆状病毒。细胞内含有Bacmid和辅助质粒。连有目的基因的pfastBac系列载体转入细胞后，会在helper的帮助下与Bacmid发生重组，产生重组杆状病毒，提取出来后可直接用于昆虫细胞的转染，生产目的蛋白。
作为本发明优选的技术方案，所述昆虫细胞为Sf9细胞。
上述制备方法制备得到的SME-VLPs在制备疫苗中的应用。
以上技术方案达到的技术效果是：制备得到的SME-VLPs应用于制备疫苗中，相比其它亚单位疫苗，SME-VLPs显示出有效的佐剂活性，低剂量即可引起保护性免疫反应，也能诱导机体产生较高滴度的中和抗体。因此，无论从安全性、有效性和可行性来说，SME-VLPs疫苗都有望代替传统疫苗，是当前一种理想的疫苗形式；本发明中的SME-VLPs制备疫苗后，可用于预防鸡传染性支气管炎的感染，可以产生与灭活苗相当的中和抗体水平，与弱毒苗相当的细胞免疫和黏膜免疫水平，并提供较强的免疫保护作用，制备的SME-VLPs疫苗可作为鸡传染性支气管炎亚单位疫苗使用。本发明针对目前全国优势血清型和基因型流行毒株的有效疫苗，完全解决了因血清型差异而造成免疫效果不佳的难题，是首个针对国内优势血清型和基因型IBV病毒样颗粒疫苗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为S、M、E基因的扩增电泳图，图中：(A)为S基因扩增电泳图；(B)为M基因扩增电泳图；(C)为E基因扩增电泳图；M1为DL10000DNA Marker；M2和M3为DL 2000DNAMarker；1为S基因扩增结果；3为M基因扩增结果；5为E基因扩增结果；2、4、6为阴性对照扩增结果；
图2附图为重组转座载体的构建与鉴定电泳图，图中：(A)为pFastBacTM/HBM-TOPO-S酶切鉴定及特异性引物菌液PCR电泳图；(B)为pFastBacTM/HBM-TOPO-M酶切鉴定及特异性引物菌液PCR电泳图；(C)为pFast BacTM/HBM-TOPO-E酶切鉴定及特异性引物菌液PCR电泳图；M1、M2和M4为1Kb DNA Ladder；M3和M5为Trans 2K TM 2000DNA Marker；1为pFastBacTM/HBM-TOPO-S双酶切鉴定；2为pFastBacTM/HBM-TOPO-S单酶切鉴定；3为S基因特异性引物菌液PCR电泳图；4为pFastBacTM/HBM-TOPO-M单酶切电泳图；5为pFastBacTM/HBM-TOPO-M双酶切鉴定；6为M基因特异性引物菌液PCR电泳图；7为pFastBacTM/HBM-TOPO-E单酶切鉴定；8为pFastBacTM/HBM-TOPO-E双酶切电泳图；9为E基因特异性引物菌液PCR电泳图；
图3附图为重组杆粒的获取与纯化电泳图：图中：(A)为rHBM-S的PCR电泳图；(B)为rHBM-M的PCR电泳图；(C)为rHBM-E的PCR电泳图；M1为1Kb DNA Ladder；M2为Trans 2K TM2000DNA Marker；M3和M4为DL 10000DNA Marker；1为纯化的rHBM-S PCR产物电泳图；2为未纯化的rHBM-S PCR产物电泳图；4为纯化的rHBM-M PCR产物电泳图；5为未纯化的rHBM-MPCR产物电泳图；7为纯化的rHBM-E PCR产物电泳图；8为未纯化的rHBM-E PCR产物电泳图；3、6和9为空杆粒PCR产物电泳图；
图4附图为重组杆状病毒的形成与鉴定电泳图，图中：(A)为重组杆状病毒rHBM-SPCR电泳图；(B)为重组杆状病毒rHBM-M PCR电泳图；(C)为重组杆状病毒rHBM-E PCR电泳图；M1、M2和M3为DL10000 DNA M arker；1为M13引物鉴定rHBM-S；2为特异性引物鉴定rHBM-S；5为特异性引物鉴定rHBM-M；6为M13引物鉴定rHBM-M；9为特异性引物鉴定rH BM-E；10为M13引物鉴定rHBM-E；3、7和11为M13引物鉴定空载体；4、8和12为细胞对照；
图5附图为重组蛋白IFA鉴定图，图中：A为感染rHBM-S的细胞；B为感染rHBM-M的细胞；C为感染rHBM-E的细胞；D为空载体对照；E为细胞对照；
图6附图为重组蛋白Western blot鉴定图，图中：(A)为重组S蛋白鉴定；(B)为重组M蛋白鉴定；(C)为重组E蛋白鉴定；M为蛋白质分子量标准(10-180KDa)；1为感染细胞培养上清；2为感染细胞沉淀；3为空载体对照；4为细胞对照；
图7附图为蔗糖梯度离心后的SME-VLPs的分层情况图；
图8附图为SME-VLPs的Western blot鉴定图，图中：M为蛋白质分子量标准(10-250KDa)；1为纯化的SME-VLPs；2为空载体对照；
图9附图为透射电镜观察SME-VLPs的形成图；
图10附图为免疫电镜观察SME-VLPs的形成图；
图11附图为免疫鸡的中和抗体水平图；
图12附图为免疫鸡外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞含量图，图中：(A)为CD4+T淋巴细胞含量图；(B)为CD8+T淋巴细胞含量图；
图13附图为免疫鸡血清中的IL-4和IFN-γ含量图，图中：(A)为IL-4含量图；(B)为IFN-γ含量图；
图14附图为免疫鸡泪拭子和咽拭子中的sIgA含量图，图中：(A)为泪拭子中sIgA含量图；(B)为咽拭子中sIgA含量图；
图15附图为攻毒鸡气管和肾脏的病毒载量图，图中：(A)为气管的病毒载量图；(B)为肾脏的病毒载量图；
图16附图为攻毒鸡泪拭子和咽拭子的病毒载量图，(A)为泪拭子的病毒载量图；(B)为咽拭子的病毒载量图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1重组S、M、E蛋白的制备与鉴定
pFastBacTM/HBM-TOPO转座载体和DH10BacTM感受态细胞购自Invitrogen公司；Sf9昆虫细胞、IBV GX-YL5毒株为广西大学养禽与禽病学研究所保存。
1)引物设计与合成
参照NCBI GenBank上收录的IBV GX-YL5全基因序列(GenBank序列号：HQ848267.1)，找出相应的S、M和E基因序列，并用SignalP4.1 Server在线软件分别对3个基因进行信号肽预测，去除信号肽序列、起始密码和终止密码后(载体上有起始密码和终止密码)，设计3个基因对应的引物及后期用于重组杆粒PCR鉴定及转染后PCR鉴定的M13载体通用引物，交由北京华大基因公司合成，引物序列信息见表1。
表1引物序列
Figure BDA0002898786060000071
2)S、M和E基因的扩增
按照北京全式金生物公司的RNA抽提试剂盒说明书(产品目录号：ER501)抽提GX-YL5 SPF鸡胚尿囊液总RNA后进行反转录，利用
Figure BDA0002898786060000084
Taq DNA PolymeraseHighFidelity PCR扩增目的片段。
利用所设计的S、M和E基因的特异性引物及
Figure BDA0002898786060000085
Taq DNA PolymeraseHigh Fidelity扩增GX-YL5株S、M和E基因的反应体系及反应条件如下：
PCR反应体系为：
Figure BDA0002898786060000081
S基因PCR反应条件为：
Figure BDA0002898786060000082
PCR反应结束后，制备1％的琼脂糖凝胶，取7μL的PCR产物上样后进行电泳鉴定，对S基因进行回收纯化。
M基因PCR反应条件为：
Figure BDA0002898786060000083
Figure BDA0002898786060000091
PCR反应结束后，制备1％的琼脂糖凝胶，取7μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经电泳鉴定确定阳性后，对M基因进行回收纯化。
E基因PCR反应条件为：
Figure BDA0002898786060000092
PCR反应结束后，制备1％的琼脂糖凝胶，取7μL的PCR产物经电泳鉴定确定阳性后，对E基因进行回收纯化。
用设计的S、M和E基因的特异性引物分别扩增出预期大小为3453bp的S基因、675bp的M基因和324bp的E基因(见图1)。
3)S、M和E基因的克隆鉴定
分别将1μL的S、M和E基因回收纯化产物、1μL的pEasy-T1克隆载体和3μL的ddH2O加入到EP管中，轻轻混匀后于室温(20～37℃)静置15～20min，之后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃孵育1h后继续培养12～16h后，LB平板上出现白色菌落，随机挑取3个白色菌落于300μL含有100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃225r/min振摇培养1～2h，进行菌液PCR鉴定，取10μL的阳性菌液加入到5mL含有100μg/mL Amp的LB培养基中过夜培养并抽提质粒，送北京华大基因公司测序。
4)重组转座载体的构建与鉴定
对以上鉴定正确的S、M和E基因阳性质粒进行PCR扩增，并对PCR产物进行回收纯化。将获得的IBV GX-YL5株的S、M和E基因片段的纯化后产物分别与pFastBacTM/HBM-TOPO利用拓扑反应进行平末端连接，具体连接体系如下：
Figure BDA0002898786060000101
按照上述体系加入管中后，轻轻混匀，室温孵育1h连接后，将连接产物冰上放置，以备转化DH 5α大肠杆菌感受态细胞。
5)重组转座载体的获取
从-80℃冰箱取出3管100μL的DH5α大肠杆菌感受态细胞，1管对应1个基因并做好标记，冰上融化5min；每管DH5α大肠杆菌感受态细胞加入6μL在获得的连接产物后，轻轻混匀，冰上孵育30min；42℃，热激90s(此过程不能晃动)，立即将其转移至冰上，孵育5min；每管加入750μL预热至室温的LB液体培养基，轻轻盖上盖子后，37℃，225r/min，摇菌2h；每个转化取100μL均匀的涂至提前预热的加有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，37℃孵育12～16h，分别挑取3～5个白色的单克隆菌落至对应的新的含有100μg/mL氨苄青霉素的500μL LB液体培养基，37℃，225r/min，增殖摇菌3.5h。
6)重组转座载体的鉴定
应用菌液PCR、酶切鉴定及测序方法对重组转座载体进行鉴定。特异性引物菌液PCR获得目的大小片段，酶切鉴定结果符合预期(见图2)，测序连接方向正确且序列完全正确，则证明构建成功。
应用天根公司的Taq PCR MasterMix，取各基因挑取的转化菌菌液作为模板，进行菌液PCR鉴定，反应体系及反应条件如下：
菌液PCR的反应体系为：
Figure BDA0002898786060000102
Figure BDA0002898786060000111
pFastBacTM/HBM-TOPO-S转化菌菌液PCR的反应条件为：
Figure BDA0002898786060000112
pFastBacTM/HBM-TOPO-S转化菌菌液PCR产物取7μL于1％的琼脂糖凝胶上样后，进行电泳鉴定。
pFastBacTM/HBM-TOPO-M转化菌的菌液PCR的反应条件为：
Figure BDA0002898786060000113
pFastBacTM/HBM-TOPO-M转化菌的菌液PCR产物取7μL，进行电泳鉴定。
pFastBacTM/HBM-TOPO-E转化菌菌液PCR的反应条件为：
Figure BDA0002898786060000114
/>
Figure BDA0002898786060000121
pFastBacTM/HBM-TOPO-E转化菌的菌液PCR产物取7μL，进行电泳鉴定。
酶切鉴定：所选择的限制性内切酶为载体上目的片段插入部位两侧含有的常用限制性内切酶位点，pFastBacTM/HBM-TOPO-S双酶切选择的是BamHI和HindIII，单酶切选择的是BamHI。单酶切pFastBacTM/HBM-TOPO-M所选的限制性快切酶为HindIII，而单酶切pFastBacTM/HBM-TOPO-E所选的限制性酶为BamHI。具体方法为：经菌液PCR鉴定为阳性的克隆，经扩大培养后，用质粒小量抽提试剂盒并参见其说明书进行质粒抽提后，进行酶切鉴定。
酶切体系如下(单酶切只加1μL限制性快切酶I，ddH2O加24μL)：
Figure BDA0002898786060000122
体系中各成分加入后，轻轻混匀，37℃水浴锅酶切30min后，进行琼脂糖凝胶电泳并观察切出的片段大小。经菌液PCR和双酶切鉴定后为阳性的转化菌单克隆菌液，送往北京华大基因公司进行测序鉴定。
7)重组杆粒的获取及纯化
分别应用天根公司的小量质粒抽提试剂盒对扩大培养后的经鉴定完全正确的阳性单克隆菌液进行质粒抽提，获得重组转座载体pFastBacTM/HBM-TOP O-S、pFastBacTM/HBM-TOPO-M和pFastBacTM/HBM-TOPO-E，然后分别转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞(MAX
Figure BDA0002898786060000123
DH10Bac TM Competent E.Coli Cells)，转化具体步骤如下：
(1)MAX
Figure BDA0002898786060000131
DH10Bac TM competent E.coli Cells自-80℃取出后冰上融化5～10min；
(2)加10μL重组转座载体质粒于100μL MAX
Figure BDA0002898786060000132
DH10Bac TMcompetentE.coli Cells，轻轻混匀后，冰上孵育30min；
(3)混合物迅速放入42℃恒温水浴锅中热激1min；
(4)迅速转移至冰上，冷激5min；
(5)加入850μL S.O.C.培养基，轻轻地混匀；
(6)37℃，225r/min恒温摇床摇菌4h；
(7)用S.O.C培养基以10为梯度进行倍比稀释菌液(10-1，10-2，10-3)，每个梯度取100μL涂板(所用的固体培养基为：含50μg/mL kanamycin，7μg/mL gentamicin，10μg/mLtetracycline，100μg/mL X-gal和40μg/mL IPTG的LB固体培养基)；
(8)置于37℃恒温培养箱孵育48h。
由于重组杆粒-Bacmid DNA较大(大于135kb)，所以不能使用酶切法对其进行鉴定，较常用的鉴定方法是PCR法。在黑色背景下，用无菌牙签挑取8个白色菌落，分别吹打于100μL的ddH2O中，用M13载体通用引物及EX
Figure BDA0002898786060000133
进行菌落PCR鉴定，反应体系为：
Figure BDA0002898786060000134
重组杆粒菌落PCR反应条件为：
Figure BDA0002898786060000135
Figure BDA0002898786060000141
重组杆粒菌落PCR反应完成后，取6μL产物进行琼脂糖凝胶电泳以分析判断结果。
条带大小均符合预期(见图3)，表明纯化的rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E重组杆粒构建成功。
阳性菌落重新在新鲜的包含50μg/mL kanamycin，7μg/mL gentamicin，10μg/mLtetracycline，100μg/mL X-gal和40μg/mL IPTG的LB固体培养基上划线后，37℃，恒温培养箱中孵育过夜。第二天重新挑取白色单菌落，接种于300μL含50μg/mL kanamycin，7μg/mLgentamicin，10μg/mL tetracycline LB液体培养基，37℃，225r/min恒温摇床摇菌2.5h后，用同样的方法进行菌液PCR鉴定，如此反复划线进行纯化(一般在3次以上)，直至PCR结果中不含300bp条带而只含有单一条带为止。
本实验采用传统的碱裂解法以提取高纯度的Bacmid重组杆粒DNA，相应的操作步骤如下：
(1)将纯化后的含重组杆粒的菌液重新扩大培养后，14000r/min离心10min后，弃去上清，置于冰上；
(2)加入350μL的Solution I后，轻轻吹打以充分重悬菌体，冰上静置2min；
(3)加入350μL的Solution II，然后轻柔地上下反转5～7次，冰上放置3～4min；
(4)继续加入400μL的Solution III，缓慢上下颠倒6～8次，冰上放置2min后，14000r/min离心15min；
(5)将上清移入新的1.5mL EP管中后，加入等体积的氯仿和苯酚混合液(氯仿和苯酚按等比例混合)，轻轻混匀后，14000r/min离心15min；
(6)最上层透明液体移至新的1.5mL EP管中后，加入等体积的异丙醇，轻柔地混匀后，-20℃放置40min；
(7)14000r/min离心25min后，弃去上清液体；
(8)加入预冷的70％的乙醇溶液洗涤沉淀，14000r/min离心5min，弃上清后，于超净台内风干；
(9)每个EP管中加入20μL的ddH2O溶解后，即获得纯度较高的重组杆状病毒质粒DNA。
8)重组蛋白的形成与鉴定
转染前要确保Sf9细胞处于对数生长期(即细胞密度为1.5×106～2.5×106cells/mL)且细胞活力最好大于90％，转染操作步骤如下：
(1)将生长对数期的细胞在转染前1h以8×105cells/mL的密度接种于6孔细胞板上；
(2)取7μL
Figure BDA0002898786060000151
II与100μL培养基(不加抗生素及血清的Sf-900TMII SFM培养基)涡旋混匀，室温放置30min；
(3)取约3μL的重组杆粒DNA(约1μg)与100μL培养基(不加抗生素及血清的Sf-900TMII SFM培养基)，轻轻混匀；
(4)轻轻混匀(2)及(3)中的溶液，室温孵育30min，即得到转染复合物；
(5)将转染复合物添加850μL培养基(不加抗生素及血清的Sf-900TMII SFM培养基)轻轻混匀后，逐滴加到细胞6孔板((1)中接种的已除去上清液的细胞板)上对应的孔中，27℃培养箱中孵育3～5h。
(6)移除细胞6孔板中转染混合物后，用Sf-900TMII SFM培养基轻轻洗3遍后，每孔添加2mL培养基(加抗生素及血清的Sf-900TMII SFM培养基)；
(7)27℃培养箱，孵育细胞72h以上。
同时设立空载体野毒转染及细胞对照，其转染步骤同上所述。
当转染细胞出现感染迹象时，收集每孔的培养上清约2mL，500g离心5min后，转移上清于1.5mL新的离心管，即得到第一代(P1代)重组杆状病毒，并于4℃避光储存。分别取250μL各基因的P1代重组病毒，采用全式金公司的病毒DNA抽提试剂盒(产品目录号：ER201-01)对重组杆状病毒基因组DNA进行提取，并用各基因的特异性引物及M13通用引物对其进行PCR鉴定，PCR完成后进行琼脂糖凝胶电泳，并分析电泳结果。PCR鉴定结果表明rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E转染成功，且已形成重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E(见图4)。
将收获的P1代病毒重新感染2×106cells/mL，细胞活力>90％的生长对数期Sf9昆虫细胞，并增殖至P3代，收获P3代重组杆状病毒。
IFA鉴定重组蛋白
(1)接种细胞：按1×106cells/mL的密度接种细胞活力>90％的Sf9昆虫细胞于细胞培养12孔板中，1mL/孔，27℃培养1h至细胞贴壁；
(2)上毒：将P4代重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E分别接种至12孔板中，继续在恒温箱中培养，同时设野毒感染和正常Sf9细胞对照；
(3)清洗细胞：72h后细胞出现细胞病变，弃去细胞培养上清保留板底贴壁的细胞，用PBST将细胞轻轻洗涤3次，2min/次；
(4)细胞固定：各孔细胞用预冷的4％组织细胞固定液在室温下固定15min，然后弃去固定液，然后用PBST轻轻洗涤3次，2min/次；
(5)封闭：各孔细胞用5％脱脂奶粉溶液于37℃湿盒中封闭30min，然后弃去封闭液，用PBST轻轻洗涤3次，2min/次；
(6)孵育一抗：将抗GX-YL5毒株的鸡多抗血清作1:200稀释，分别加入到感染了重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E对应的细胞孔中，于37℃湿盒中孵育2h；
(7)孵育二抗：弃去稀释的一抗，用PBST轻轻洗涤3次，2min/次，将FITC标记的羊抗鸡IgG抗体作1:400稀释，分别加入到感染了重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E对应的细胞孔中，于37℃湿盒中孵育1h；
(8)观察结果：弃去稀释的二抗，用PBST轻轻洗涤3次，2min/次，然后在倒置荧光显微镜下观察并拍照。
IFA结果显示感染了重组杆状病毒的细胞在细胞膜表面呈现明显的特异性黄绿色荧光，空载体感染的细胞以及正常细胞均无特异性荧光出现。表明重组蛋白在Sf9细胞中成功表达(见图5)。
Western blot鉴定重组蛋白
蛋白样品处理：接种细胞活力>90％的生长对数期Sf9昆虫细胞于细胞培养板中，分别感染P4代重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E，培养72h后待出现细胞病变分开收集细胞培养上清和细胞沉淀。细胞上清液和5×SDS-PAGE Loading Buffer按1:5稀释，混匀后微离心将管壁上液体离心至管底，99℃煮沸10min，恢复至室温备用。细胞沉淀按每1×106cells加入100μL RIPA细胞裂解液置于冰上裂解20min，期间混匀几次以充分裂解细胞。裂解完成后于4℃12000r/min离心10min，取离心后上清同上处理。
Westernblot具体操作步骤如下：
(1)SDS-PAGE电泳：制备SDS-PAGE蛋白凝胶，加入1×蛋白电泳液，按每孔加入样品20μL，同时加入5μL蛋白质预染Marker便以观察蛋白分子量和样品移动的位置。以80V电压进行电泳，待蛋白Marker移动至浓缩胶和分离胶的分界面出现条带分离时，调整电压为120V，一直到该条带移动至电泳槽的最下端时关闭电源；
(2)转膜：根据重组蛋白目的条带所在位置切好蛋白凝胶，放入蛋白质转膜液中，按凝胶大小剪好对应大小的PVDF膜和滤纸。PVDF膜先在甲醇中活化1～2min，然后和滤纸一起转入转膜液中浸泡3～5min。按“负极-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-正极”的顺序依次放在半干转膜仪上，按1～2mA/cm2凝胶面积大小调整电流进行转膜；
(3)封闭：转膜完成后取出PVDF膜置于甲醇中30s以固定蛋白质，稍作晾干后将PVDF膜放入5％的脱脂奶粉溶液中室温摇床封闭1h；
(4)孵育一抗：弃去封闭液，用TBST洗涤3次，5min/次，然后用TBST将抗GX-YL5毒株的鸡多抗血清作1:2000稀释用于检测重组S蛋白和M蛋白，用TBST将抗GX-YL5毒株的鸡多抗血清作1:500稀释用于检测重组E蛋白，于室温摇床孵育3h，然后再置于4℃过夜孵育；
(5)孵育二抗：弃去稀释的一抗，用TBST洗涤3次，5min/次，然后用TBST将HRP标记的羊抗鸡IgY作1:5000稀释，于室温摇床孵育1h；
(6)ECL法检测：弃去稀释的二抗，用TBST洗涤3次，5min/次，使用eECL高灵敏度化学发光检测试剂盒进行检测。
Werstenblot结果显示重组S、M、E蛋白分别在细胞沉淀中检测到了大小约为190kDa、90kDa、16kDa的特异性蛋白条带(见图6)，表明重组蛋白已成功获得表达。
实施例2SME-VLPs的制备与鉴定
1)SME-VLPs的制备
在摸索的最优条件下，按2×106cells/mL接种Sf9细胞(活力>90％)于细胞悬浮培养瓶中，于27℃恒温培养箱中悬浮培养12h后，细胞生长稳定，按重组杆状病毒以相同MOI(S:M:E＝3:3:3)共感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞，并在84h收获细胞悬液。
2)SME-VLPs的蔗糖密度梯度离心纯化
将以上收获细胞悬液4℃，2000r/min离心20min，弃上清收集细胞沉淀加入预冷的PBS进行重悬，随后置于-80℃反复冻融3次，然后在冰上进行超声破碎(工作5s，间歇5s)以充分释放病毒粒子，超声至不再粘稠即为破碎完成。4℃，5000r/min离心30min以去除细胞碎片，收集此步骤离心后的上清进行纯化。分别提前配制好60％、40％、20％三种不连续的蔗糖梯度溶液，并在4℃过夜预冷，收集离心后的上清置于4℃，80000g离心2h，保留沉淀并用预冷的PBS进行重悬，在超速离心管中由下至上按60％～40％～20％的顺序铺好蔗糖溶液梯度，将重悬的含有SME-VLPs的PBS混悬液加在离心管的最上层，4℃，80000g离心3h，VLPs经蔗糖密度梯度离心后，在离心产物中均可在20％～40％和40％～60％之间观察到一条乳白色条带(见图7)。吸取乳白色条带并用预冷的PBS重悬，4℃，80000g离心2h以去除蔗糖，保留沉淀再次用预冷的PBS重新悬浮，4℃过夜溶解，然后分装至-80℃保存。
3)SME-VLPs的鉴定
纯化SME-VLPs的Westernblot鉴定
取纯化的SME-VLPs进行Westernblot鉴定，1:2000稀释的抗His标签鼠单克隆抗体作为一抗，1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，其它步骤同上进行。Western blot结果显示能够检测到对应的特异性蛋白条带(S蛋白190KDa，M蛋白26kDa，E蛋白16kDa)的存在，表明SME-VLPs构建成功(见图8)。
透射电镜鉴定
分别取10μL纯化的SME-VLPs于200目碳包被的铜网上，室温静置5min，用干净的滤纸吸取铜网边缘多余的液体，然后吸取10μL 2％磷钨酸(PH＝6.5)于铜网上负染2min，用干净的滤纸吸取多余的染液，晾干后于透射电镜下观察。通过透射电镜直接对负染的VLPs样品进行观察，SME-VLPs在视野下均可见到直径约为80nm～120nm不等的圆形或多边形粒子，表明SME-VLPs构建成功(见图9)。
免疫电镜鉴定
分别取10μL纯化的SME-VLPs于200目碳包被的铜网上，室温静置5min，用干净的滤纸吸取铜网边缘多余的液体，将本研究制备的抗GX-YL5 S蛋白的兔多抗血清1:20倍稀释，充分混匀后吸取10μL稀释的抗体加在铜网上，室温孵育1h，一抗孵育完成后并用滤纸吸干多余的液体，然后用过滤的PBS洗涤3次，10s/次。将纳米金颗粒标记的羊抗兔IgG(10nm)用PBS作1:25倍稀释，充分混匀后吸取10μL稀释的抗体加在铜网上，室温孵育1h，二抗孵育完成后，用滤纸吸干多余的液体后用PBS洗涤3次，10s/次。最后用10μL 2％磷钨酸(PH＝6.5)负染2min，用干净的滤纸吸取多余的染液，晾干后于透射电镜下观察。能够观察到在直径约为80nm～120nm不等的圆形或多边形粒子的周围聚集了黑色的金颗粒。说明S蛋白成功包装在SME-VLPs的表面，且能够和抗IBV S蛋白的抗体结合，表明SME-VLPs构建成功(见图10)。
实施例3SME-VLPs的免疫原性和免疫保护研究
油乳苗的制备
(1)将灭活的GX-YL5尿囊液按含2μg S蛋白/羽体积比，病毒液：高压灭菌的Tween-80＝96：4制成水相，10号白油:司本-80＝10:1混匀，高压灭菌后制成油相。将水相逐滴加入油相(水相:油相＝2:3)，充分振荡均匀，制成油包水性质的灭活油乳剂苗；
(2)将SME-VLPs按含2μg S蛋白/羽，与等量弗氏完全佐剂完全乳化混匀，制备成一免用油乳苗。按同等剂量与弗氏不完全佐剂完全乳化混匀，制备成二免用油乳苗。
油乳苗的检测
(1)无菌检验：将疫苗接种于普通肉汤和营养琼脂培养基，37℃培养72h，观察是否有菌落出现；
(2)乳化检测：取少量样品于EP管中，3000g/min离心15min，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水中，第1滴分散属正常现象，以后各滴若均不出现分散现象即为乳化成功；
(3)稳定性检验：室温条件下，将疫苗3000r/min离心15min，观察分层情况；
(4)黏度测定：在25℃左右的室温条件下，用1mL的吸管，出口内径1.2mm，吸取疫苗1mL，令其垂直流出，记录流出0.4mL所需的时间，3次平均值时间应在8s以内。
(5)疫苗的安全性检测：
①一次超剂量接种安全试验，取研制的油乳苗产品三瓶，充分摇匀后，每瓶取10mL加入1个空瓶子中充分混匀，在振荡器上振荡均匀作为检品。选取5～9日龄的非免健康易感雏鸡10只，颈背部皮下注射1mL(使用剂量的2倍)，同时设置未免疫的对照鸡10只与免疫鸡同条件饲养，观察14d后剖杀。结果判定：不出现因注射疫苗而引起的局部和全身不良反应即为合格。
②单剂量重复接种安全试验，取研制的油乳苗产品三瓶，充分摇匀后，每瓶取10mL加入1个空瓶子中充分混匀，在振荡器上振荡均匀作为检品。选取5～9日龄的非免健康易感雏鸡10只，颈背部皮下注射0.5mL，观察并记录临床反应和注射疫苗局部反应，14d后相同剂量重复接种一次，同时设置未免疫的对照鸡10只与免疫鸡同条件饲养，观察14d后剖杀。结果判定：不出现因注射疫苗而引起的局部和全身不良反应即为合格。
动物免疫与攻毒试验
80只10日龄SPF鸡随机分为4组，20只/组。10日龄首次免疫，24日龄(首免后2周)加强免疫，38日龄(加强免疫后2周)，分别用1×106TOC-ID50/0.2mL IBV分离株GX-YL5尿囊液攻毒，滴鼻点眼，0.2mL/只。每组随机选择10只鸡在43日龄(攻毒后5天)全部剖杀，其余观察至57日龄(攻毒后14天)。
体液免疫应答的检测
对各组首免后0d，14d，28d所有鸡翅下静脉采血，分离血清，参照本课题组方法，取18～20日龄健康鸡胚的气管制备气管环进行中和试验检测血清中和抗体水平。
采用固定病毒稀释血清法，在24孔板上进行气管环中和试验。滴定终点的判定，是以使气管环停止运动和上皮细胞脱落的血清最高稀释倍数为该血清的中和滴度。先将血清样品于56℃灭活30min，用PBS作倍比稀释成1:2、1:4、1:8、1:16直至1:1024。取各稀释度的血清0.5mL与200TOC-ID50/mL的相应等量病毒液混匀，在37℃含5％CO2环境下孵育1h，然后将培养好的气管环放入24孔板，每孔2个环，每个稀释度设2个孔，37℃作用30min，弃去病毒血清混合物，放入1mL的培养液，同时设接种200TOC-ID50病毒液对照，血清对照和PBS空白对照，培养观察144h，并记录结果。结果表明，免疫组中和抗体水平与PBS对照组相比差异显著，SME-VLPs可以产生与GX-YL5灭活苗相当的中和抗体水平，且显著高于H120弱毒疫苗(见图11)。
鸡外周血特异性T淋巴细胞含量的检测
首免后0d，7d，14d，21d，28d采集鸡抗凝血，用外周淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，应用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T淋巴细胞含量。结果表明，免疫组CD4+和CD8+T淋巴细胞含量与PBS对照组相比差异显著，H120组和SME-VLPs组的CD4+和CD8+T淋巴细胞含量相当且显著高于GX-YL5组(见图12)。
IL-4和IFN-γ的检测
在首免后0d，14d，28d采集鸡血，分离血清，应用商品ELISA试剂盒检测IL-4和IFN-γ含量。结果表明，免疫组IL-4和IFN-γ含量与PBS对照组相比差异显著，H120组和SME-VLPs组的IL-4和IFN-γ含量相当，显著高于GX-YL5组(见图13)。
黏膜免疫应答的检测
首免后0d，7d，14d，21d，28d，各组所有鸡采集泪拭子和咽拭子，分别置于10％甘油保存液中，用商品ELISA试剂盒检测分泌型IgA(sIgA)含量。结果表明，免疫组泪拭子和咽拭子中的sIgA抗体水平与PBS对照组相比差异显著，H120组和SME-VLPs组泪拭子和咽拭子中的sIgA抗体水平相当，显著高于GX-YL5组(见图14)。
攻毒鸡组织和拭子中的病毒检测
攻毒后5d每组随机选择10只鸡安乐死后，无菌采集气管和肾脏。其余10只鸡观察至攻毒后14d，分别采集攻毒后2d，4d，6d，8d，10d，12d，14d泪拭子和咽拭子，置于10％甘油保存液中。将采集的样品处理后抽提RNA，用本课题组建立的real-time PCR方法检测样品中的病毒载量。结果表明，PBS对照组气管、肾脏泪拭子和咽拭子的病毒载量均显著高于免疫组，SME-VLPs组气管病毒载量显著低于H120和GX-YL5组，这三组肾脏病毒载量差异不显著(见图15)。SME-VLPs和GX-YL5组泪拭子和咽拭子病毒载量显著低于H120组(见图16)。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由GX-YL5毒株的IBV-S、IBV-M、IBV-E基因分别转入到杆状病毒表达系统中，获得3种重组杆粒，再分别将3种重组杆粒转染到昆虫细胞中，获得重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E，然后通过共感染的形式，构建得到。
2.根据权利要求1所述的一种禽传染性支气管炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1) 抽提包含GX-YL5毒株的鸡胚尿囊液总RNA，反转录、PCR、回收、纯化，获得GX-YL5株的S、M和E基因；
2) 将GX-YL5株的S、M和E基因分别与转座载体pFastBacTM/HBM-
TOPO进行平末端连接，并分别转化DH5α感受态细胞，培养，鉴定，抽提得到pFastBacTM/HBM-TOPO-S、pFastBacTM/HBM-TOPO-M和pFastBacTM/HBM-TOPO-E重组转座载体；
将步骤2)获得的pFastBacTM/HBM-TOPO-S、pFastBacTM/HBM-TOPO-M和pFastBacTM/HBM-TOPO-E重组转座载体分别转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，培养，鉴定，纯化、提取，得到rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E重组杆粒；
4) 将步骤3)得到的rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E重组杆粒脂质体法转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E；
5) 将步骤4)获得的重组杆状病毒rHBM-S、rHBM-M和rHBM-E共感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞，收获细胞悬液、超声破碎、鉴定，得SME-VLPs。
3.根据权利要求2所述的制备方法制备得到的SME-VLPs在制备VLPs疫苗中的应用。
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