CN117417904A - 表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 - Google Patents
表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117417904A CN117417904A CN202311406529.9A CN202311406529A CN117417904A CN 117417904 A CN117417904 A CN 117417904A CN 202311406529 A CN202311406529 A CN 202311406529A CN 117417904 A CN117417904 A CN 117417904A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- newcastle disease
- disease virus
- ndv
- ampv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 title claims abstract description 104
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 49
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 title claims abstract description 12
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 23
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 78
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 26
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 claims description 24
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 claims description 20
- 241000272834 Cairina moschata Species 0.000 claims description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 17
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 13
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 11
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 11
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 10
- 241001519465 Avian metapneumovirus Species 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 claims description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 5
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 claims description 2
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 abstract description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001018 virulence Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 abstract description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 abstract description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 abstract description 2
- 241000351643 Metapneumovirus Species 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 12
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 12
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000711955 Turkey rhinotracheitis virus Species 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 210000003026 hypopharynx Anatomy 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 2
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003555 cloaca Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 2
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101500001532 Avian infectious bursal disease virus Capsid protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010086541 Human Immunodeficiency Virus gag Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 206010023644 Lacrimation increased Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 208000023406 head swelling Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004317 lacrimation Effects 0.000 description 1
- 201000009837 laryngotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/18143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2760/18162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
- C12N2760/18322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
- C12N2760/18334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用，属于兽用疫苗株技术领域。本发明构建的NDV载体疫苗株用于水禽C型偏肺病毒的防控，解决了当前市场没有aMPV疫苗的困境。新城疫病毒作为宿主载体经过基因改造，毒力经过致弱，安全性性好，对鸭没有致病性，并且载体疫苗解决了aMPV弱毒活疫苗在田间容易毒力返强的安全风险；该载体疫苗免疫效果好，既能诱导机体产生体液免疫，又能诱导机体产生细胞免疫和粘膜免疫，全方位的保护免疫动物，对aMPV‑C野毒株和NDV‑VII野毒株均可提供完全的保护作用；生产成本低，对生产设备要求不高，免疫方式简单灵活，有利于市场大规模的推广使用。
Description
技术领域
本发明属于兽用疫苗株技术领域，尤其涉及到一种表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用。
背景技术
禽偏肺病是由禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus，aMPV)引起家禽上呼吸道感染的急性高度传染性疾病之一，aMPV又称为火鸡鼻气管炎病毒(Turkey rhinotracheitisvirus，TRTV)或禽肺炎病毒(Avian pneumovirus，APV)，主要通过空气传播，该病是除禽流感之外对火鸡影响最大的呼吸道疾病，可对世界范围内的养殖业造成严重的经济损失。1980年南非首先报道了aMPV的发生，随后在法国和英国报道本病的发生，此后世界上大部分国家和地区相继报道了aMPV。我国于1998年首次分离并报道了该病毒，近年来我国陆续报道了各地aMPV的感染情况，aMPV在我国家禽中广泛流行。aMPV主要通过空气传播，感染鸡、火鸡、鸭及野生禽类，并和鸡的“肿头综合症(Swollen head syndrome，SHS)”有关。该病主要引起急性上呼吸道疾病，还可影响蛋的品质，导致产蛋量快速下降。禽偏肺病毒感染家禽后，常伴随着细菌的继发性感染，可使死亡率增加25％-40％，对养殖业造成严重的经济损失。根据aMPV编码G蛋白的核苷酸序列，可将其分为A、B、C、D四个亚型。经过系统的序列分析比对发现，aMPV A型、B型和D型的同源性更为接近，它们与aMPV C型的同源性较远，而aMPV C型与人偏肺病毒的基因组相似。2013年我国首次在鸡上报道aMPV-C的感染；2014年我国首次在番鸭上分离到aMPV-C，并证实aMPV-C可引起番鸭产蛋下降，造成呼吸道和卵巢-输卵管的症状。
疫苗接种和严格的生物安全手段是控制aMPV疾病的主要措施。用于火鸡和鸡的aMPV灭活疫苗和弱毒活疫苗已经商品化。有研究表明aMPV-A和aMPV-B疫苗之间会有良好的交叉保护性，并可对C亚型aMPV也产生部分免疫保护作用。但是aMPV-C疫苗对A、B亚型没有免疫保护性。aMPV-A和a MPV-B亚型的细胞培养减毒活疫苗已经在全世界范围内广泛应用，但aMPV-C亚型疫苗仅在美国应用。aMPV灭活疫苗可以诱导机体产生高效持久的抗体，但是需要跟弱毒活疫苗联合使用，单独使用灭活疫苗的效果并不理想，不能提供完全保护。弱毒活疫苗可以刺激机体产生全身免疫以及呼吸道局部免疫。初次免疫aMPV活疫苗，火鸡产生的体液免疫应答非常弱，这种现象在鸡中表现的更加明显，但是仍然可以通过呼吸道产生的细胞免疫对机体产生保护作用。虽然弱毒活疫苗有比较好的保护效果，但仍然存在许多问题：免疫持续期短，需要反复接种，造成弱毒株的扩散传播，接种疫苗的区域经常会发生感染的现象；aMPV活疫苗存在一些免疫抑制，有可能造成细菌继发感染和其它病毒感染；长期使用aMPV弱毒活疫苗，可能会造成毒力返强的现象。
新城疫病毒(Newcastledisease,NDV)作为副黏病毒科的成员之一，已成为备受青睐的病毒性疫苗载体。大量研究表明，重组NDV载体疫苗比常规疫苗能诱导更快更好的体液和黏膜免疫应答。近年来重组NDV成功表达的外源蛋白包括：鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白、H5亚型禽流感病毒HA蛋白、人类免疫缺陷病毒Gag蛋白、鸡传染性喉气管炎gB/gD蛋白、狂犬病G糖蛋白、新型冠状病毒S蛋白等。NDV作为载体疫苗有极大的优势：NDV是一种源自禽类的RNA病毒，由于宿主范围的严格限制，在人类和其它动物中高度减毒，在哺乳动物上使用是安全的；病毒基因组相对较小，可以人为修饰，技术相对成熟；NDV病毒的复制只在细胞质中进行，不会与宿主基因组接触，减少了与宿主基因组重组的风险，载体稳定性好；病毒可以在鸡胚和许多细胞系中高滴度生长，降低生产成本；NDV基因组小，只编码少量的蛋白，利于外源蛋白的表达展示；NDV可通过呼吸道途径自然感染，因此不仅可以诱导机体的体液免疫和细胞免疫，还可以诱导粘膜免疫；新城疫病毒可以通过饮水或喷雾的方式接种，节省了大量的人力、物力，有利于载体疫苗的推广使用。但是新城疫病毒的基因组比较小，插入的外源基因过长会影响病毒的增殖以及外源基因的稳定性和表达效果，限制了新城疫病毒载体疫苗的推广使用。
发明内容
本发明提供了一种表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用，该载体疫苗免疫效果好，既能诱导机体产生体液免疫，又能诱导机体产生细胞免疫和粘膜免疫，全方位的保护免疫动物，对aMPV-C野毒株和NDV-VII野毒株均可提供完全的保护作用；生产成本低，对生产设备要求不高，免疫方式简单灵活，有利于市场大规模的推广使用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株，以基因VII型新城疫病毒rNDV株为宿主构建NDV的感染性克隆质粒，并对其进行遗传拯救获得，其中，所述感染性克隆质粒的NDV的不同位置处分别插入F基因、G基因或串联的F基因和G基因的核苷酸序列；
所述基因VII型新城疫病毒rNDV株于2023年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202391。
作为优选，在NDV的P/M基因之间插入串联的F基因和G基因的核苷酸序列，或在NDV的P/M基因之间插入F基因以及在M/F或F/HN基因之间插入G基因的核苷酸序列。
本发明在实施过程中发现，在NDV的P/M基因之间插入F基因以及在M/F基因之间插入G基因，拯救的病毒显示出极低的生长滴度，不能作为疫苗候选株使用，因此本发明选择P/M基因之间以及F/HN之间分别插入F基因和G基因，以克服现有技术的不足或缺点；而使用原始的未经修饰的G基因作为外源蛋白表达基因时，G蛋白几乎不能表达出来或表达的量太低不能达到能检测到的水平，为了克服上述缺陷，本发明中将编码G蛋白N端胞内区和跨膜区的核苷酸序列替换为NDV载体中编码HN蛋白N端胞内区和跨膜区的核苷酸序列，即将G蛋白氨基端的54个氨基酸(G基因1-162nt)替换为NDV HN蛋白氨基端的45个氨基酸(HN基因1-135nt)，G蛋白的表达量显著提升，达到了载体疫苗预期的效果和要求。
可以理解的是，本发明中所述的G基因均是经过上述修饰改造过的基因，所述的载体疫苗中的G蛋白均是经过修饰改造过的G基因表达的蛋白。
作为优选，F基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，G基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；基因VII型新城疫病毒rNDV株的全基因序列如SEQ ID NO：3所示。
作为优选，所述F基因和G基因通过IRES基因串联，IRES基因的序列如SEQ ID NO：4所示。
作为优选，所述新城疫病毒载体疫苗株为rNDV-F-G或rNDV-F/IRES/G，二者同时提供对aMPV-C和基因VII型新城疫病毒的完全保护。
作为优选，所述新城疫病毒载体疫苗株为弱毒活疫苗。
本发明还提供了一种根据任一项技术方案所述的新城疫病毒载体疫苗株在预防或治疗由禽偏肺病毒所引起的高度传染性禽偏肺病中的应用。
作为优选，所述禽类选自如鸡、火鸡、鸭的家禽以及野生禽类，优选为番鸭、半番鸭或樱桃谷鸭。
作为优选，采用点眼方式进行接种；
所述疫苗株快速诱导中和抗体产生的免疫剂量为107.0TCID50，rNDV-F-G株或rNDV-F/IRES/G(P/M)株首次免疫后第28天中和抗体水平为分别为28.6和28.0。
本发明还提供了一种商品化aMPV疫苗，采用上述任一项技术方案所述的新城疫病毒载体疫苗株制备得到。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明提供的新城疫病毒载体疫苗株可填补aMPV疫苗在国内市场的空白。
2、本发明提供的新城疫病毒载体疫苗株可解决aMPV疫苗的安全性问题。aMPV灭活疫苗或亚单位疫苗需要佐剂的辅助，并且需要接种很大的剂量或多次免疫才能达到理想的免疫效果，容易对免疫的动物产生应激或副反应。aMPV弱毒活疫苗在田间使用容易发生毒力返强的现象，而且可能会产生免疫抑制，影响其它疫苗的免疫效果，容易产生安全隐患。新城疫病毒载体经过基因的遗传改造，通过验证表明为低毒力的毒株，而且基因组比较稳定，不会发生毒力返强的现象。而且可以通过喷雾等方式进行免疫，减少因为抓取免疫动物而造成的应激反应。
3、本发明提供的新城疫病毒载体疫苗株可解决aMPV疫苗的效力问题。aMPV灭活疫苗或亚单位疫苗等免疫效力有限，单独使用不能对强毒株提供完全保护。新城疫载体疫苗集佐剂与疫苗作用于一身，可以刺激机体产生体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，全方位的保护机体免受aMPV强毒株的侵害，而且免疫效力持久，对不同的异源毒株也能产生很好的防护作用。并且基因Ⅶ型NDV与常规的NDV弱毒活疫苗LaSota株、Clone 30株、VGGA株等相比，对细胞和组织的侵袭能力更强，在保证安全的情况下能够激活更强的全身性免疫反应。
4、本发明基于新城疫病毒载体疫苗株可解决插入的外源基因对新城疫病毒增殖和外源基因的表达产生影响的问题。通过不断优化方案，最大限度的降低外源基因对新城疫病毒增殖的影响，提高外源基因表达的稳定性。
5、本发明研制的是基于新城疫病毒载体疫苗株的双联疫苗株，可同时提供对aMPV-C和NDV-VII野毒株的完全保护。
附图说明
图1为本发明实施例提供的rNDV-aMPV重组病毒PCR鉴定结果，其中，依次为：1.200bp DNA Ladder Marker；2.rNDV-F株F基因扩增；3.rNDV-G株G基因扩增；3.rNDV-F/IRES/G(P/M)株F-IRES-G基因扩增；4.rNDV-F/IRES/G(F/HN)株F-IRES-G基因扩增；5.rNDV-F-G株F基因扩增；6.rNDV-F-G株G基因扩增；
图2为本发明实施例提供的重组病毒的鸡胚内生长动力学比较；
图3为本发明实施例提供的免疫荧光试验鉴定外源基因表达情况；
图4为本发明实施例提供的番鸭血清中和抗体检测结果；
图5为本发明实施例提供的番鸭NDV抗体检测结果(HI)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1表达番鸭C型禽偏肺病毒的F基因和G基因的重组新城疫病毒载体疫苗的构建
通过基因重组技术，将aMPV的F基因、经过修饰的G基因(以下均简称为G基因)以及IRES序列克隆至载体pBluescript II KS(+)，构建质粒pBlu-F-IRES-G；分别将F基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)、G基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)或F-IRES-G基因插入基因VII型新城疫病毒rNDV株(其全基因序列如SEQ ID NO：3所示)的P/M基因之间或F/HN基因之间，构建NDV的感染性克隆质粒，并拯救重组病毒。
根据实验室分离保存的C型禽偏肺病毒的F基因和G基因序列、基因VII型新城疫病毒rNDV株全基因组序列以及合成的IRES基因序列(其序列如SEQ ID NO：4所示)设计引物，构建5个感染性克隆质粒。引物和基因合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列见表1。
表1新城疫病毒载体疫苗感染性克隆构建用引物序列
下面就具体的步骤进行描述。
1.1aMPV F-IRES-G串联表达盒的构建
以aMPV的cDNA以及经过修饰的G基因为模板，分别用引物NDV-F/G-LF/NDV-F/G-LR、NDV-F/G-RF/NDV-F/G-RR扩增F基因和G基因；以合成的IRES序列为模板，用引物NDV-F/G-MF/NDV-F/G-MR扩增IRES序列。载体质粒pBluescript II KS(+)用EcoR I/Xho I双酶切后，与上述PCR扩增的3个片段一起进行凝胶电泳、回收。回收的4个基因片段产物按1:1:1:1(各2.5ul)的比例混合，根据高保真DNA组装预混液的说明加入10ulHiFi DNA Assembly Master Mix，混匀后50℃作用1h后转化大肠杆菌感受态细胞JM109。阳性克隆测序正确后保存，构建的质粒命名为pBlue-F/IRES/G。
1.2含aMPV F基因或G基因的新城疫病毒感染性克隆的构建
以aMPV的cDNA为模板，用引物NDV-FF/NDV-FR扩增F基因；质粒PBRT-NDV-pme I(P/M)用pme I单酶切。凝胶电泳后回收阳性条带，根据高保真DNA组装预混液的说明进行片段组装，构建获得质粒PBRT-NDV-F。
以经过修饰的G基因为模板，用引物NDV-GF/NDV-GR扩增G基因；质粒PBRT-NDV-pmeI(P/M)用pme I单酶切。凝胶电泳后回收阳性条带，根据高保真DNA组装预混液的说明进行片段组装，构建获得质粒PBRT-NDV-G。
以质粒pBlue-F/IRES/G为模板，用引物NDV-F/G-AF/NDV-F/G-AR扩增F/G串联基因；质粒PBRT-NDV-pme I(P/M)用pme I单酶切。凝胶电泳后回收阳性条带，根据高保真DNA组装预混液的说明进行片段组装，构建获得质粒PBRT-NDV-F/G(P/M)。
以质粒pBlue-F/IRES/G为模板，用引物NDV-F/G-AF-2/NDV-F/G-AR-2扩增F/G串联基因；质粒PBRT-NDV-pme I(F/HN)用pme I单酶切。凝胶电泳后回收阳性条带，根据高保真DNA组装预混液的说明进行片段组装，构建获得质粒PBRT-NDV-F/G(F/HN)。
以aMPV的cDNA为模板，用引物NDV-FF-2/NDV-FR-2扩增F基因；质粒PBRT-NDV-pacI/pme I用pac I单酶切。凝胶电泳后回收阳性条带，根据高保真DNA组装预混液的说明进行片段组装，构建获得质粒PBRT-NDV-F-pme I。以经过修饰的G基因为模板，用引物NDV-GF-2/NDV-GR-2扩增G基因，质粒PBRT-NDV-F-pme I用pme I酶切，同样的方法将G基因克隆至F/HN基因之间，最终获得质粒PBRT-F-G。
1.3转染获得重组新城疫病毒
BSR细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞生长至80％时进行转染。分别取5ug感染性克隆质粒PBRT-NDV-F、PBRT-NDV-G、PBRT-NDV-F/G(P/M)、PBRT-NDV-F/G(F/HN)以及PBRT-F-G，与3个辅助质粒(PCI-NP 2.5ug、PCI-P 1.25ug、PCI-L 1.25ug)混合后进行共转染，按照磷酸钙转染试剂盒说明书进行操作。转染后48h冻融转染的细胞，离心取上清接种9日龄SPF鸡胚，培养120h后收取鸡胚尿囊液，测定HA效价。HA效价阳性样品进行冻存；HA阴性样品继续盲传3代。将拯救获得的表达aMPV抗原基因的重组NDV毒株分别命名为rNDV-F、rNDV-G、rNDV-F/IRES/G(P/M)、rNDV-F/IRES/G(F/HN)、rNDV-F-G，其PCR鉴定结果如图1所示。
接胚后120h收取的鸡胚尿囊液，HA效价为24-28。尿囊液稀释后继续接种鸡胚，HA效价稳定在28-211。继续传代至15代，每隔5代取一次病毒尿囊液样品，提取RNA并反转录成cDNA。分别对上述5株重组病毒的插入基因进行测序，其中引物P/M-J1/P/M-J2扩增P基因与M基因之间插入序列，引物F/HN-J1/F/HN-J2扩增F基因与HN基因之间插入的序列。结果显示，插入的aMPV基因没有任何缺失或突变。表明拯救的NDV载体疫苗毒株可以稳定遗传。
实施例2重组新城疫病毒的鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉致病指数(IVPI)的测定
MDT、ICPI以及IVPI的数值可以直接反映新城疫病毒的致病力，因此对构建的5株重组新城疫病毒载体疫苗株以及亲本毒株rNDV株进行上述3个指数的测定，并根据OIE标准判定NDV的毒力。结果见表2所示。
表2 NDV载体疫苗株致病指数的测定
注：rNDV为未插入外源基因的亲本株。
结果表明，5株重组NDV载体疫苗株与亲本株均为低毒力的毒株，符合弱毒活疫苗的使用标准。
实施例3重组NDV载体疫苗株鸡胚内生长动力学评价
将收取的亲本株rNDV株与5株重组载体疫苗株的尿囊液按105.0EID50/胚/0.1ml接种SPF鸡胚尿囊腔。分别在接种后24h、48h、72h和96h收获鸡胚尿囊液，每一时间点随机收取6枚SPF鸡胚尿囊液，并检测6株病毒的每毫升尿囊液病毒的EID50，绘制生长曲线，如图2所示。
如图2所示，rNDV-F、rNDV-G、与rNDV-F-G株与亲本株rNDV的生长特性相似，表明aMPV的抗原基因插入后，没有影响NDV的生长速度，仍然保持高滴度的生长特性；而rNDV-F/IRES/G(P/M)与rNDV-F/IRES/G(F/HN)株增殖速度有小幅度下降，表明F与G基因串联后插入NDV的基因组，对NDV的增殖速度有轻微的影响。推测aMPV和NDV均是禽源病毒，因此它们基因之间的兼容性比较好，aMPV的基因插入新城疫病毒基因组后，对新城疫病毒的复制影响较小。
实施例4间接免疫荧光试验鉴定aMPV外源基因的表达情况
96孔板内CEF细胞生长至90％密度时，弃掉培养液，每孔加入100ul重组病毒(重组病毒1:100稀释)。37℃温箱孵育2h后，补加100ul含4％ FBS的DMEM培养基，培养48h后进行间接免疫荧光鉴定。弃掉培养液，用PBS洗涤3次，每孔加入100ul的冷无水乙醇固定，4℃冰箱固定2h；弃掉固定液，用PBST洗3次，每孔加入100ul的一抗(NDV多抗血清、aMPV免疫鸭子多抗血清，1:100稀释)，室温孵育1h后，用PBST洗涤3次，每孔加入100ul FITC标记的二抗(兔抗鸡、山羊抗鸭子，1:500稀释)；室温避光孵育30min，弃去液体，用PBST洗涤3次，荧光显微镜下观察蛋白表达情况，如图3所示。
由图3所示，阴性对照没有可见荧光；rNDV组只有孵育NDV抗体孔出现绿色荧光，aMPV抗体孔无荧光；5株重组病毒组中，NDV抗体和aMPV抗体孵育孔均出现绿色荧光。所有组别中除阴性对照外，NDV抗体孵育孔荧光最亮；aMPV抗体孵育孔中，单基因表达组rNDV-F和rNDV-G与双基因表达组rNDV-F/IRES/G(P/M)、rNDV-F/IRES/G(F/HN)、rNDV-F-G相比有相似的荧光强毒，表明NDV基因组中无论是插入单个F基因或G基因还是同时插入双基因，外源基因均可表达。考虑到插入双基因表达外源蛋白诱导的抗体范围更广，保护效果可能会更好，因此选择rNDV-F/IRES/G(P/M)、rNDV-F/IRES/G(F/HN)和rNDV-F-G这3株重组病毒进行进一步的动物实验验证。
实施例5重组NDV载体疫苗在雏番鸭的免疫效果评价
1日龄雏番鸭随机分为6组，每组10只，免疫前分别测定NDV和aMPV的抗原、抗体情况，均是阴性。7日龄时分别通过点眼的方式接种0.1ml的重组病毒rNDV-F/IRES/G(P/M)、rNDV-F/IRES/G(F/HN)、rNDV-F-G以及亲本株rNDV株；另外2组中，其中1组通过肌肉注射的方式免疫1羽份(0.5ml)的aMPV-C灭活疫苗(青岛易邦生物工程有限公司研发中心实验室自制，灭活前每羽份病毒含量105.0TCID50)，1组通过点眼的方式接种相同剂量的PBS作为阴性对照。隔离饲养，一免后14天按相同的免疫方式和剂量加强免疫一次。分别在一免后7天、14天、21天和28天采血，颈部静脉采血，分离血清，测定针对aMPV的中和抗体水平以及针对NDV的HI抗体水平。首次免疫28天采血后攻毒，每只番鸭通过点眼的方式分别接种aMPV-C野毒株或NDV-VII野毒株，攻毒后观察14天。分别在攻毒后第3天、5天和7天采集喉咽拭子以及泄殖腔拭子，用荧光定量PCR的方法分别测定aMPV-C和NDV-VII的排毒情况，统计结果。
aMPV-C中和抗体的测定方法如下：采集的血清放置于56℃金属浴中灭活30min后再进行检测。96孔细胞培养板每孔加入50ul的无血清DMEM，对血清样品进行2倍的倍比稀释，直至稀释至1:2048，每个稀释度重复4个孔。除阴性对照孔外，每孔加入50ul的aMPV-C病毒(含200TCID50的病毒)，37℃温箱中孵育1h。每孔加入100ul的vero细胞(6x104.0cells)，37℃温箱中继续孵育5-7天，每天观察每孔细胞状态，记录病变细胞孔数，根据Spearman-Karber法计算中和抗体效价，取平均值绘制中和抗体曲线图。NDV HI抗体水平的测定按常规方法进行。
动物实验具体分组和免疫情况见表3所示。
表3雏番鸭免疫及攻毒分组情况
中和抗体检测结果显示，3组重组NDV载体疫苗免疫组均可诱导产生针对aMPV-C的中和抗体(图4)，且中和抗体在一免后28天的数值最高，rNDV-F-G组诱导的中和抗体水平最高，平均中和抗体水平为28.6，其次是rNDV-F/IRES/G(P/M)组，平均中和抗体水平为28.0，而rNDV-F/IRES/G(F/HN)免疫组诱导的中和抗体水平最低，平均中和抗体水平为27.4。并且rNDV-F-G、rNDV-F/IRES/G(P/M)以及rNDV-F/IRES/G(F/HN)免疫雏番鸭后均可以快速诱导中和抗体的产生，免疫后7天即可检测到低水平的中和抗体，而rNDV免疫组和PBS免疫组没有中和抗体的产生。aMPV-C灭活疫苗免疫组也可以产生中和抗体，但产生的较慢，在首免后14天才能检测到低水平的中和抗体，在28天时中和抗体水平显著低于本发明中3组重组新城疫病毒载体疫苗诱导的中和抗体水平。PBS免疫组和rNDV免疫组没有针对aMPV-C的中和抗体产生。
NDV HI测定结果显示，rNDV-F/IRES/G(P/M)、rNDV-F/IRES/G(F/HN)、rNDV-F-G以及rNDV免疫组均可诱导产生针对NDV的HI抗体，首次免疫后7天即可测到效价，28天时HI效价数值最高，抗体水平呈现持续上升趋势，且各组之间无明显差异；PBS免疫组和aMPV-C灭活疫苗免疫组没有HI抗体的产生(图5)。
攻毒结果显示，在攻毒后的14天观察期内，不管是攻毒aMPV-C还是攻毒NDV-VII野毒株，番鸭均没有发生死亡的现象，可能跟番鸭日龄有关，但是有番鸭发病。其中aMPV攻毒组中，发病的鸭出现咳嗽，流鼻涕，气管啰音等症状，一般在攻毒后5天发病，10天左右逐渐恢复。攻毒后3天、5天和7天的拭子检测结果显示，3株重组NDV载体疫苗免疫组中，rNDV-F-G和rNDV-F/IRES/G(P/M)免疫组均没有检测到排毒现象，而rNDV-F/IRES/G(F/HN)免疫组在攻毒后第3天1只鸭喉咽拭子检测到排毒现象，第5天2只鸭喉咽拭子检测到排毒现象；aMPV-C灭活疫苗免疫组，在攻毒后第第3天2只鸭喉咽拭子检测到排毒现象，第5天3只鸭的喉咽拭子和2只鸭的泄殖腔拭子中检测到排毒现象。rNDV免疫组和PBS免疫组，在攻毒后3天、5天和7天均能检测到排毒现象。
NDV-VII攻毒组中，发病鸭表现为精神委顿，拉黄白色、白色或黄绿色稀粪，流鼻涕或流泪，一般在攻毒后3天开始发病，7天左右逐渐恢复。攻毒后3天、5天和7天的拭子检测结果显示，3株重组NDV载体疫苗以及rNDV免疫组中均没有检测到排毒现象，表明这4株病毒对NDV-VII的攻击能够提供完全保护，NDV基因组中插入外源基因没有影响NDV的免疫效果；而aMPV-C灭活疫苗免疫组和PBS免疫组均出现排毒现象。
表4试验鸭攻毒后发病及排毒检测情况
综上所述，rNDV-F-G以及rNDV-F/IRES/G(P/M)载体疫苗株在鸡胚上的增殖效率较好，免疫动物后诱导的中和抗体水平较高，攻毒后免疫保护效果最好，可以同时提供对aMPV-C和NDV-VII的完全保护，适合作为疫苗候选株使用。
Claims (10)
1.表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株，其特征在于，以基因VII型新城疫病毒rNDV株为宿主构建NDV的感染性克隆质粒，并对其进行遗传拯救获得，其中，所述感染性克隆质粒的NDV的不同位置处分别插入F基因、G基因或串联的F基因和G基因的核苷酸序列；
所述基因VII型新城疫病毒rNDV株于2023年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202391。
2.根据权利要求1所述的新城疫病毒载体疫苗株，其特征在于，在NDV的P/M基因之间插入串联的F基因和G基因的核苷酸序列，或在NDV的P/M基因之间插入F基因以及在M/F或F/HN基因之间插入G基因的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的新城疫病毒载体疫苗株，其特征在于，F基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，G基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；基因VII型新城疫病毒rNDV株的全基因序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求2所述的新城疫病毒载体疫苗株，其特征在于，所述F基因和G基因通过IRES基因串联，IRES基因的序列如SEQ ID NO：4所示。
5.根据权利要求2-4任一项所述的新城疫病毒载体疫苗株，其特征在于，所述新城疫病毒载体疫苗株为rNDV-F-G或rNDV-F/IRES/G(P/M)，二者同时提供对aMPV-C和基因VII型新城疫病毒的完全保护。
6.根据权利要求1-5任一项所述的新城疫病毒载体疫苗株，其特征在于，所述新城疫病毒载体疫苗株为弱毒活疫苗。
7.根据权利要求1-6任一项所述的新城疫病毒载体疫苗株在预防或治疗由禽偏肺病毒所引起的高度传染性禽偏肺病中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述禽类选自如鸡、火鸡、鸭的家禽以及野生禽类，优选为番鸭、半番鸭或樱桃谷鸭。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用点眼方式进行接种；
所述疫苗株快速诱导中和抗体产生的免疫剂量为107.0TCID50，rNDV-F-G株或rNDV-F/IRES/G(P/M)株首次免疫后第28天中和抗体水平分别为28.6和28.0。
10.商品化aMPV疫苗，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的新城疫病毒载体疫苗株制备得到。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311406529.9A CN117417904A (zh) | 2023-10-27 | 2023-10-27 | 表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311406529.9A CN117417904A (zh) | 2023-10-27 | 2023-10-27 | 表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117417904A true CN117417904A (zh) | 2024-01-19 |
Family
ID=89524328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311406529.9A Pending CN117417904A (zh) | 2023-10-27 | 2023-10-27 | 表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117417904A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117625689A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-01 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 表达ibdv vp2蛋白的b亚型禽偏肺病毒疫苗株 |
| CN117625688A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-01 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用 |
-
2023
- 2023-10-27 CN CN202311406529.9A patent/CN117417904A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117625689A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-01 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 表达ibdv vp2蛋白的b亚型禽偏肺病毒疫苗株 |
| CN117625688A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-01 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用 |
| CN117625688B (zh) * | 2024-01-26 | 2024-04-30 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用 |
| CN117625689B (zh) * | 2024-01-26 | 2024-04-30 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 表达ibdv vp2蛋白的b亚型禽偏肺病毒疫苗株 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102428099B (zh) | 运载新城疫病毒的禽疫苗 | |
| CN105567648B (zh) | 用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗 | |
| CN109439634B (zh) | 伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其应用 | |
| CN117417904A (zh) | 表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 | |
| JP2020517307A (ja) | 異種鳥類病原菌抗原をコードする遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ワクチン | |
| CN110218706B (zh) | 表达h7n9亚型高致病性禽流感病毒ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用 | |
| CN111575247A (zh) | 一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用 | |
| US20220054626A1 (en) | Heat-resistant recombinant newcastle disease virus vaccine strain capable of expressing truncated fiber 2 protein of fowl adenovirus serotype 4, preparation method and application thereof | |
| CN110607285A (zh) | 一种耐热的血清4型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 | |
| CN104195116B (zh) | 一种表达鹅细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒及其构建方法 | |
| CN114828882A (zh) | 多价hvt载体疫苗 | |
| CN106085970B (zh) | 表达信号肽替换的h5亚型禽流感ha蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法 | |
| US20220062411A1 (en) | Recombinant viruses and the uses thereof | |
| CN110499296A (zh) | 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 | |
| CN107058244B (zh) | 一种p蛋白突变构建的基因vii型新城疫病毒弱毒株 | |
| CN106011087B (zh) | S1基因和tm-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用 | |
| CN111647610B (zh) | 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用 | |
| CN108060141B (zh) | Vp2基因和np基因重组腺病毒及其应用 | |
| CN109439687B (zh) | 一种表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的新城疫病毒载体疫苗株 | |
| KR20210035675A (ko) | 뉴캐슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신 | |
| KR20210035676A (ko) | 뉴캐슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신 | |
| CN113897376B (zh) | 一种hn蛋白突变的基因vii型新城疫病毒重组疫苗株 | |
| CN117343150A (zh) | 表达prrsv gp5蛋白和gp3蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 | |
| CN117568288B (zh) | 一种高效拯救禽冠状病毒的方法及其应用 | |
| CN116731982B (zh) | 一种鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |