CN105567648B - 用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗,更具体而言,本发明涉及用于水禽免疫接种的疫苗,所述疫苗基于活的重组马立克氏病病毒(在后文中称为rMDV)、更具体为火鸡重组疱疹病毒(在后文中称为rHVT病毒),其包含编码并表达水禽病原体的抗原性肽的至少一种核苷酸序列。还提供了免疫接种的方法。
Description
本申请为国际申请日2010年4月15日、国际申请号PCT/EP2010/054991于2011年10月17日进入中国国家阶段、申请号201080017170.0、发明名称“用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗”的分案申请。
技术领域
总的来说,本发明涉及免疫学和疫苗技术领域。具体来说,本发明涉及用于水禽免疫接种的疫苗,所述疫苗基于活的重组马立克氏病病毒(在后文中称为rMDV)、更具体为火鸡重组疱疹病毒(在后文中称为rHVT病毒),其包含编码并表达水禽病原体的抗原性肽的至少一种核苷酸序列。还提供了免疫接种的方法。
背景技术
马立克氏病病毒(MDV)是鸡的常见淋巴细胞增生性疾病——马立克氏病的病原体。在世界范围内,马立克氏病(MD)是鸡群中高度接触传染的疾病。已经鉴定到马立克氏病病毒(MDV)是MD的病原体。MDV在鸡中感染法氏囊来源和胸腺来源的淋巴细胞,并可能随后诱导胸腺来源淋巴细胞的淋巴瘤。MDV是一类禽疱疹病毒的名称。例如,MDV(MDV1)是鸡中的疱疹病毒强毒株,SB-1(MDV2)是鸡中天然减毒的疱疹病毒毒株,HVT(MDV3)是通常在火鸡中发现的非致病性疱疹病毒。
对于宿主范围来说,只报道了鸡和火鸡被MDV和HVT自然感染。而到目前为止,发现其他鸟类对疾病或感染具有抵抗力。
许多水禽鸟类例如鸭和鹅,由于被饲养以获取肉、蛋和羽毛,在经济上是重要的。因此,对这些鸟类进行针对常见病原体的免疫接种,是提高这些家禽的质量的必要条件。此外,作为所有已知甲型流感病毒的天然宿主的野生水禽,是在家禽中引起高致命性疾病散在爆发的病毒的来源。最近在家禽中出现并随后在东南亚向人类传播的高致病性禽流感(HPAI)毒株,其在家禽中的频繁爆发导致数以亿计动物的破坏,已经引起了关于致命疾病可能大流行蔓延的顾虑。为了限制病原体的这种传播,重要的是对天然宿主即水禽进行免疫接种。
本申请人令人吃惊地发现,马立克氏病病毒(MDV)能够感染水禽物种,并能以潜伏感染或持续感染的状态在被感染的水禽宿主中复制、维持和存活,从而提供了有效的免疫接种手段。
因此,本发明的疫苗能够实现水禽的有效免疫接种,并具有优越的免疫接种性质,因为它们能够引起被免疫水禽宿主的长期持续的免疫。因此,有利情况下,通过给药其中插入了外来抗原基因的重组HVT或MDV,为水禽宿主提供了足够的免疫接种效果。
发明内容
本发明提供了用于对水禽物种进行免疫接种的重组马立克氏病病毒(rMDV),具体为火鸡重组疱疹病毒(rHVT),其包含引入到病毒基因组中的一种或多种异源或同源核苷酸序列,所述核苷酸序列能够在水禽物种细胞中编码并表达病原体的至少一种抗原性肽,并且还能够诱导针对在水禽中引起感染的病原体的稳定并长期持续的免疫应答。
本发明还涉及用于对水禽物种进行免疫接种的疫苗,所述疫苗包含免疫接种有效量的rHVT或rMDV,其任选用溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂、防腐剂和其他赋形剂配制。
本发明还涉及对水禽物种进行免疫接种的方法和免疫接种试剂盒。
附图说明
图1HVT特异性PCR的结果(样品在免疫接种后4周收集)。使用的缩写:CA-用细胞结合的HVT疫苗免疫接种的鸭;FD-用冷冻干燥的HVT疫苗免疫接种的鸭。样品被鉴定为疫苗缩写/取样器官。
图2A-2D对应于同源质粒p45CMVH5HUNMod4999的核苷酸序列和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图3A显示了火鸡疱疹病毒(HVT)基因组的示意图,并标出了长独特序列(UniqueLong)(UL)44、UL 45和UL 46基因的位置。供体基因被插入到HVT基因组中UL 45与UL 46之间通过PCR产生的SfiI位点中。
图3B显示了UL 44的一部分、完整UL 45、和UL 46的一部分,其可以在HVT基因组的1.9千碱基(kb)的EcoRV-XhoI片段上分离到。加框部分显示了在Southern印迹中,被设计与插入位点两侧的序列结合的探针(插入位点探针或45/46探针)与1.0-kb PvuI-PvuI片段退火的位置。
图3C显示了分离插入位点序列的策略。
图4A显示了在由8个单链负股RNA区段构成的禽流感病毒H5亚型基因组中分离红细胞凝集素(HA)基因。还显示了从每个区段表达的蛋白和这些蛋白的功能。
图4B显示了使用分别向5’和3’末端添加BamHI和SalI限制性酶位点的正向引物和反向引物,通过反转录酶-聚合酶链反应从禽流感病毒RNA基因组扩增的HA基因。HA基因的切割位点被改变成低致病性禽流感病毒毒株的典型的切割位点序列。切割位点的修饰通过聚合酶链反应来进行。
图5显示了中间质粒pGICMVpA的构建。将巨细胞病毒立即早期启动子(CMV启动子)和SV40polyA信号序列插入到pUC18载体中。
图6显示了同源质粒p45CMVH5HUNMod4999的构建。
图7显示了受调控的禽流感-马立克氏病疫苗H5亚型血清型3型活马立克氏病载体的制备。
图8显示了受调控的禽流感-马立克氏病疫苗H5亚型血清型3型活马立克氏病载体的生产。
图9显示了当用H5N1高致病性禽流感病毒进化枝2A/Duck/Hungary/1180/2006激惹时,从重组rHVT-AI/H5疫苗在番鸭中与未免疫接种的对照鸟类相比的效能测试获得的对比结果。
定义
在本发明中,术语“重组”是指重组DNA技术,也称基因克隆或分子克隆,是指将DNA从一种生物体转移到另一种生物体的技术。
在本文中,术语“火鸡重组疱疹病毒”(rHVT)和/或“重组马立克氏病病毒”(rMDV)是指现有的火鸡疱疹病毒,其基因组已通过插入至少一种异源核酸序列进行修饰,所述异源核酸序列是指对应于与HVT或MDV中天然存在的基因的核酸序列不一致的基因或其一部分的DNA。可选地,rHVT或rMDV可以通过在病毒基因组中引入同源核酸序列进行遗传修饰,所述同源核酸序列是指对应于与HVT或MDV中天然存在的基因同一的基因或其一部分的DNA。应该理解,得到的重组HVT(rHVT)和/或重组MDV(rMDV)可以通过各种方法来制造,并且一旦制成后,可以不使用其他重组DNA技术来繁殖。因此,“火鸡重组疱疹病毒”的结构根据DNA插入片段来描述。
根据本发明,“水禽”物种打算是指适应于游泳、漂浮在水表面上并且在某些情况下在浅水中潜泳的鸟类。更准确来说,水禽物种包含雁形目鸭科的鸟类,例如鸭、鹅和天鹅,并属于鸭亚科、雁亚科、斑鸭亚科、麻鸭亚科或树鸭亚科。例如,雁形目包含约170种鸟类物种,分成三个科:叫鸭科(叫鸭)、鹊雁科(鹊鹅)和包括超过160种水禽的鸭科。该目中的所有物种都高度适应于在水表面处的水栖生活方式。全都在脚趾间有蹼,用于高效游泳(尽管一些物种随后已变成主要陆生)。本发明的范围被扩展到这些宽泛的科下所覆盖的所有鸟类。
术语“佐剂”被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。佐剂是非特异性增加对特定抗原的免疫应答,从而减少在任何给定疫苗中所需的抗原量和/或为了产生针对目标抗原的足够的免疫应答所需的给药频率的药剂。在本文中,佐剂被用于增强对本发明的疫苗的免疫应答。佐剂可以在疫苗给药之前、与疫苗联合或在疫苗给药之后给药于目标动物。
当在本文中使用时,单词“致病的”是指由疾病或病害的生物因子对其宿主、在本发明的情况下具体为水禽宿主造成的。
当在本文中使用时,术语“非翻译区”是指不具有ORF或不定义通过翻译进行表达的蛋白的氨基酸序列的核苷酸区域,以及其中ORF不参与任何转录、翻译或蛋白表达的核苷酸区域。该区域中包含的核苷酸序列可能是具有碱基取代、缺失或添加的核苷酸序列,除非它们包含ORF。
具体实施方式
因此,本发明提供了用于免疫接种水禽物种的重组马立克氏病病毒(rMDV)、具体为火鸡重组疱疹病毒(rHVT),其包含插入到病毒基因组中,能够编码并在水禽物种细胞中表达病原体的至少一种抗原性肽,并且还能在水禽中诱导针对引起感染的病原体的稳定和长期持续的免疫应答的一种或多种异源或同源的核苷酸序列。
只要对水禽是非致病的,任何马立克氏病病毒(MDV)(例如血清型1、2、3型、CVI988、SB1等)或具体的火鸡疱疹病毒(HVT)都可以使用在本发明中。因此,用于本发明的MDV和HVT可以包括但不限于天然存在的或可以从保藏中心例如ATCC、CNCM等获得的,例如FC126(ATCC VR-584B)、PB-THV1、H-2、YT-7、WTHV-1或EPRS-26毒株适合用作骨架病毒。其中,由于在禽类中使用安全,FC126最优选用于本发明中。
用于插入到HVT或MDV基因组中的目标基因,可以是从能够在水禽物种中引起感染的任何致病性生物体获得的同源或异源核苷酸序列。典型情况下,目标基因可以源自于引起对家禽工业具有经济影响的疾病的病原体。目标基因也可以源自于在水禽中维持并通过水禽宿主传播到其他家禽和非家禽物种的病原体。基因还可以源自于已存在现有疫苗,但是由于载体化技术的新优势而使源自HVT或MDV的疫苗对其更优越的生物体。此外,目标基因可以源自于目前还不存在针对其的疫苗,但是为了控制疾病而存在需求的病原体。典型情况下,目标基因编码病原体的免疫原性肽,并且优选为表面蛋白、分泌蛋白和结构蛋白。
因此,用于插入到MDV或HVT基因组中的同源或异源核苷酸序列可以是编码水禽病原体的抗原性肽的任何序列。本发明的核酸序列可以源自于任何来源,例如病毒、原核生物、真核生物或合成来源。所述核酸序列可以源自于在插入到病毒基因组中之后能够稳定表达以诱导针对水禽疾病的免疫力的病原体,优选为水禽物种的病原体。
异源或同源核苷酸序列可以编码例如源自下列物种的抗原性肽:禽流感病毒、1型禽副粘病毒(新城疫病毒,NDV)、禽偏肺病毒、马立克氏病病毒、禽肾病病毒(传染性法氏囊病病毒:IBDV)、鹅和番鸭细小病毒、鸭病毒性肠炎疱疹病毒、鹅疱疹病毒、鸭甲型、乙型和丙型肝炎病毒、鹅出血性多瘤病毒、鸭和鹅腺病毒、鹅和鸭圆环病毒、西尼罗病毒、鹅和番鸭呼肠孤病毒、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)物种、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、感染水禽物种的支原体微生物或球虫。
在第一个实施方案中,这样的异源或同源核苷酸序列可以是例如流感病毒的表面蛋白红细胞凝集素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)、马立克氏病病毒的蛋白、特别是gB、gC、gD、gH和/或gL蛋白、新城疫病毒的F和/或HN蛋白、鹅和番鸭细小病毒的VP1、VP2和/或VP3蛋白、鹅和番鸭呼肠孤病毒的任何结构蛋白、鹅出血性多瘤病毒的VP1蛋白、鹅和番鸭病毒性肠炎疱疹病毒的抗原、鸭和鹅腺病毒的抗原、圆环病毒的衣壳蛋白或IBDV的VP2蛋白。
在另一个具体实施方案中,这样的异源或同源核苷酸可以编码US6,936,707中所述的未糖基化的NXB氨基酸序列,其中N是天冬酰胺,X是脯氨酸之外的任何氨基酸,B是苏氨酸,并且其能够表现出高免疫原性。
在另一个实施方案中,异源或同源核苷酸序列也可以是融合蛋白,其包含具有鸡毒支原体的抗原性的肽和源自于疱疹病毒外膜蛋白的肽,如US 7,348,422中所述。
在另一个优选实施方案中,rHVT或rMDV还可以包含第二个异源核苷酸序列,其编码第二种抗原或免疫调节剂例如淋巴因子、干扰素或禽类细胞因子。
为了构建本发明的重组MDV或HVT病毒,首先将上述病毒在适合的宿主细胞中繁殖,然后获得基因组DNA。用于繁殖病毒的宿主和条件根据需要来选择。作为宿主细胞,源自于鸡的细胞是优选的,并且可以使用CEF(鸡胚成纤维细胞)、鸡肾细胞等。它可以在培养基例如Eagle's MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中,在约37℃下培养3至4天。
按照常规方法从如上培养的病毒感染的细胞中提取DNA。因此,将单层生长的细胞刮下,然后离心以收获上清液。在将蛋白在裂解缓冲液中变性并移除后,使用苯酚和乙醇提取DNA。
基因克隆和质粒构建对于本领域的普通专业人员来说是公知的,并可以基本上通过标准的分子生物学技术来进行(《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual.)第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Woodbury,N.Y.2001)。用于插入到病毒中的序列可以源自于任何适合的质粒、粘粒或噬菌体,质粒是最优选的,并且含有至少一种异源或同源核酸序列,其如果需要,与启动子可操作连接。
所使用的启动子可以是合成或天然的、内源或异源的启动子,对此没有限制,只要它能够在用rHVT或rMDV感染的水禽细胞中有效发挥作用即可。因此,启动子的选择扩展到被重组HVT或MDV感染的水禽细胞中指导基因转录的任何真核、原核或病毒启动子。可以使用各种启动子,例如鸡β-肌动蛋白启动子、US 6,866,852中所述的修改的鸡β-肌动蛋白启动子、CMV(巨细胞病毒)立即早期启动子、SV40早期启动子、假狂犬病病毒立即早期启动子(PRV IE)、胸苷激酶(TK)或糖蛋白X(gX)启动子、单纯性疱疹病毒α-4启动子、马立克氏病病毒的gB蛋白启动子、源自于RSV病毒(劳斯肉瘤病毒)LTR序列的启动子和MDV或HVT启动子例如gB、gC、TK、RR2的启动子,或其保留启动子活性的任何片段。在所提到的启动子中,优选的启动子是强启动子,例如已显示出一定程度的效能的鸡β-肌动蛋白启动子、CMV(巨细胞病毒)立即早期启动子和SV40早期启动子,以及属于马立克氏病病毒、特别是血清型3型的一些基因的启动子。
因此,编码所述水禽疾病的目标抗原的同源或异源核苷酸序列,可以与上述启动子可操作连接,并进一步插入到病毒基因组的插入区中。插入区具体来说被理解为是指对于基因间区域来说没有缺失或具有几个碱基缺失,并且对于ORF来说具有完全或部分缺失或没有缺失的插入。
可以将同源或异源核苷酸和启动子序列插入到例如TK区域中,如Ross L.等Gen.Virol.,74:371-377(1993)所述。优选情况下,将核苷酸和启动子序列插入到病毒基因组的非翻译区中。一般来说,对基因组DNA的非翻译区进行鉴定,然后将上述的同源或异源核苷酸序列插入到区域中。
插入位点的实例选自UL44与UL45之间、UL45与UL46之间、UL41与UL42之间、UL40与UL41之间、位于gB基因下游的区域、UL53与UL54之间或UL36与UL37之间。在第16次疱疹病毒研讨会会议录(Proceedings of the 16th Herpes Virus Workshop)(1991年7月7-12日在美国加利福尼亚的Pacific Grove举办)中,它们被描述用于HSV-1。其中,由于同源性,优选的位点在UL45与UL46之间和位于gB基因下游的区域中,更优选在UL45与UL46之间。
将所述核酸序列和启动子导入到基因组HVT或MDV DNA片段中,所述片段含有亚克隆在重组DNA分子中的本文中所定义的插入区序列。位于异源或同源核酸序列两侧的插入区序列一般具有适合的长度,以允许与病毒基因组进行体内同源重组。如果需要,可以制造含有例如源自于相同或不同病原体的两个或多个不同异源或同源核酸序列的构建物,所述序列两侧带有本文中所定义的HVT或MDV的插入区序列。这样的重组DNA分子可用于生产表达两种或多种不同抗原性肽的重组HVT或MDV,以提供多价疫苗。其次,可以在含有两侧带有适合的HVT序列的异源或同源核酸序列的重组DNA分子存在下,将细胞用病毒DNA进行转染,由此在重组DNA分子的插入区序列与HVT中的插入区序列之间发生重组。通过用含有两侧带有适合的侧翼插入区序列的异源或同源核酸序列而没有重组DNA分子序列的核酸序列转染被感染的细胞,也可以产生重组。
为了在HVT或MDV的非翻译区中插入外来基因,需要将含有非翻译区的序列事先克隆到载体中,但是对质粒没有限制。例如,可以提到的质粒是例如pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8和pUC9,以及噬菌体例如λ噬菌体和M13噬菌体,和粘粒例如pHC79。
将如上所述获得的非翻译区按照常规方法整合到这些质粒中。为了将一种或多种异源或同源核苷酸序列插入到如上整合的非翻译区中,可以在如上所述克隆到质粒中的非翻译区的特定位点处进行突变,以制造新的限制性酶切割位点,然后将外来基因插入到位点中。执行突变的方法可以是常规方法,并且可以使用本领域的专业技术人员公知的方法例如体外诱变和PCR。因此,在PCR方法中,在PCR引物中进行突变,例如1至2个核苷酸的缺失、取代或添加,然后将引物用于产生突变。
将如上所述获得的已将一种或多种异源或同源核苷酸序列插入到HVT或MDV非翻译区中的质粒,使用电穿孔、磷酸钙、基于lipofectin的方法、基因枪方法等导入到HVT感染的细胞中。因为导入效率高,电穿孔或使用lipofectin的方法是优选的。当待导入的质粒的量在0.1至1000μg范围内时,细胞中通过HVT-DNA与质粒的同源区之间的重组而产生重组病毒的效率变高。
然后在细胞培养物中产生重组病毒后代,并可以使用已知的筛选技术对其进行基因型或表型上的筛选,例如通过杂交,检测与异源或同源核酸序列一起共整合的基因所编码的酶活性,或免疫学检测由重组HVT或MDV表达的抗原性肽。可以将所选的重组HVT或MDV在细胞培养物中大规模培养,随后可以收集含有肽的重组HVT或MDV。
为了能够筛选rHVT或rMDV,可以将几种标志物整合在质粒的非翻译区中。这样的酶基因的实例包括β-半乳糖苷酶基因。因此,通过将用整合有这种基因的病毒感染的细胞在增补有特定底物的培养基中进行培养,能够筛选病毒感染的细胞。通过重复这个程序,可以纯化重组病毒。
得到的本发明的重组病毒,可以在所述重组病毒能够繁殖和生长的细胞培养基中繁殖。在获得所需的病毒生长之后,使用刮刀或用胰蛋白酶将细胞与孔分开,并通过离心将被感染的细胞与上清液分离开。
在本发明的优选实施方案中,可以使用CEF、孵化卵、鸡肾细胞等作为繁殖rHVT或rMDV的宿主细胞。可以将本发明的重组病毒在培养基例如Eagle's MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中,在约37℃下培养3至4天。将由此获得的被感染细胞悬浮在含有10%二甲基亚砜(DMSO)的培养基中,并在液氮下冷冻保存。
为了用作疫苗,可以在使用前将上述冷冻制品溶解在100倍体积的磷酸盐缓冲液中。对于用于在液氮下储存所述被感染细胞的稳定剂和其他组分没有限制,只要它们能够允许病毒感染的细胞稳定生长并且它们是可药用的即可。
本发明还提供了用于对水禽物种进行免疫接种的疫苗,所述疫苗包含有效量的重组MDV或HVT,其在基因组中带有编码并在水禽物种细胞中表达至少一种上述抗原性蛋白的至少一种异源或同源核苷酸序列。
本发明的重组HVT或MDV优选可以用作活疫苗,尽管其他可选方案例如灭活疫苗或减毒疫苗也在本技术领域的专业人员的技术范围之内。
正如本申请人所证实的,rHVT或rMDV载体引发了针对水禽疾病的长期持续的保护性免疫力。具体来说,正如在实施例中所证实的,重组病毒载体能够在法氏囊、脾脏、胸腺和羽囊中的水禽细胞中感染和复制。具体来说,rHVT或rMDV具有在被免疫接种的水禽体内以潜伏感染状态永久存活的性质,因此在免疫接种的水禽的整个生命期内产生长期持续的保护作用。
本发明的重组HVT或MDV可以含有并表达一种或多种不同异源肽或蛋白,可以用作单价或多价疫苗。它们也可以与其他病毒或细菌混合,以便构成多价免疫原性制剂或多价疫苗。病毒或细菌选自待免疫接种的水禽物种特征性的禽病原体。本发明还进一步涉及多价疫苗,其作为混合物或待混合物包含至少两种如上所定义的活rHVT疫苗,所述疫苗包含不同的插入序列,特别是来自不同病原体的插入序列。例如,本发明的疫苗可以引入源自于一种以上水禽病原体的一种以上的抗原,例如源自于禽流感(AI)病毒和源自于新城疫病毒的抗原。或者,多价疫苗可以包含rHVT或rMDV载体,其携带例如在双向启动子控制之下的编码抗原性肽或蛋白的一种以上异源或同源核苷酸序列。
本发明的疫苗还可以包含适合的溶剂,例如水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。优选情况下,疫苗还包含佐剂。本发明的佐剂可以从多种来源的任一种获得,包括来自天然来源、重组来源和/或通过化学合成等。佐剂的实例包括增强免疫系统对抗原的应答的化学和多肽免疫刺激剂。这样的佐剂可以包括例如弗氏完全佐剂或不完全佐剂、无机凝胶、铝化合物例如氢氧化铝、磷酸铝和明矾;表面活性剂,例如十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、二甲基双十八烷基溴化铵、N,N-双十八烷基-N′,N′-双(2-羟甲基)丙二胺、甲氧基十六基甘油和pluronic多元醇;聚阴离子,例如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸;肽类,例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和促吞噬素(tuftsin);以及油乳液、植物和动物油以及矿物油、油包水乳液、细菌毒素、几丁质衍生物和壳聚糖、聚合物、ISCOM's(免疫刺激复合物)、维生素和矿物质(包括但不限于:维生素E、维生素A、硒和维生素B12)、Quil A(皂草苷类)、与聚烯基醚或二乙烯基二醇交联的丙烯酸聚合物、细菌和真菌细胞壁组分(例如脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽、β-1,3/1,6-葡聚糖)、源自植物的各种复合糖类(例如聚糖、乙酰化甘露聚糖(acemannan))、源自于动物的各种蛋白和肽类(例如激素、细胞因子、辅助刺激因子)以及源自于病毒和其他来源的新型核酸(例如双链RNA、CpG)等,其可以与疫苗一起以足以增强免疫应答的量给药。本发明的优选佐剂是壳聚糖。此外,上面提到的物质的任何数量的组合可以提供佐剂效果,因此可以形成本发明的佐剂。
本发明的疫苗还可以与一种或多种其他添加剂一起配制,以维持等渗性、生理pH和稳定性,例如缓冲剂如生理盐水(0.85%)、磷酸缓冲盐水(PBS)、柠檬酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、Tris缓冲盐水等,和/或防腐剂例如硫柳汞、福尔马林、戊二醛,或抗生素例如新霉素或链霉素等。
给药方法可以由专业技术人员进行选择。本发明的水禽疫苗容易通过任何途径给药,包括口腔、眼(例如通过滴眼液)、使用气溶胶的眼-鼻给药、鼻内、泄殖腔、饲料中、饮水中、或通过喷雾、卵内、局部或通过注射(例如静脉内、皮下、肌肉内、眼框内、眼内、真皮内和/或腹膜内)免疫接种。专业技术人员将会认识到,疫苗组合物优选被适合地配制以用于每种类型的给药途径。例如,疫苗组合物可以通过饮用水、喷雾或滴眼液给药于孵化后的幼鸟(几日至几周龄)。本文中也考虑到了卵内给药。例如,胚胎可以在孵化前的适合时间接种。
每种疫苗药剂可以含有足以在水禽物种中引发保护性免疫应答的适合剂量。这种剂量的优化在本技术领域中是公知的。每种药剂的抗原量可以通过已知方法,使用抗原/抗体反应例如通过ELISA方法来确定。
用于免疫或接种水禽的程序具体来说可以包含向水禽一次或两次给药。也可以提供加强给药。本技术领域的专业人员具备精确确定用于每种免疫接种方案的每种疫苗的注射次数和剂量所需的能力。
本发明的疫苗的另一个优点,在于通过以没有任何副作用的非常低的剂量对小至1日龄的鸟进行免疫接种,它们可用于确保为水禽提供针对各种疾病的完全保护。
更具体来说,疫苗在免疫接种2周后,赋予水禽物种针对传染病激惹的至少20%至30%的保护作用,并且在免疫接种5至6周后,赋予水禽物种针对传染病激惹的至少50%至60%的保护作用。优选情况下,本发明的疫苗在免疫接种5至6周后,赋予水禽物种针对传染病激惹的高达80%至100%的保护作用。
上述的针对特定病原体的主动免疫接种方案,可以适用于在水禽物种中引发保护性免疫力。此外,已经被特定病原体感染的水禽也可以用包含抗体的抗血清治疗,所述抗体由本发明的携带编码致病抗原的异源或同源基因的重组HVT或MDV引发。可以通过用有效量的所述重组HVT对水禽进行免疫接种以便引发适当的免疫应答,来制备针对本发明的重组HVT或MDV的抗血清。然后从动物取血,并且可以制备抗血清。因此,本发明包含了将可以通过用有效量的rHVT或rMDV对水禽进行免疫接种并通过从水禽取血而获得的针对rHVT或rMDV的抗血清,用作兽药。
在本发明的优选实施方案中,rHVT或rMDV携带并表达在内源或异源启动子控制之下的编码禽流感病毒的红细胞凝集素(HA)糖蛋白的核苷酸序列。因此,这种含有编码HA的异源核苷酸序列的rHVT或rMDV,对于用作兽药保护水禽对抗流感来说特别有用。
感染鸟类的流感病毒被称为禽流感病毒或甲型流感病毒。只有甲型流感病毒感染鸟类,并且甲型流感病毒的所有已知亚型都能感染鸟类。禽流感病毒在全世界鸟类中流通。某些鸟类、特别是水禽,通过在肠道中携带病毒并排泄它而作为流感病毒的宿主。被感染的鸟类在唾液、鼻分泌物和粪便中排泄病毒。易感鸟类当与来自被感染鸟类的污染的鼻、呼吸道或粪便物质接触时,可以被禽流感病毒感染。粪-口传播是鸟类之间最常见的传播方式。最通常情况下,作为病毒宿主的野生鸟类不患病,但是它们能够将流感传播给其他鸟类。某些甲型禽流感病毒(例如某些H5和H7毒株)感染可能在某些驯养鸟类物种中引起大面积疾病和死亡。驯养鸟类通过与被感染水禽或其他被感染家禽的直接接触,或通过与被病毒污染的表面(例如污物或笼子)或物质(例如水或饲料)接触,可能被禽流感病毒感染。人、运输工具和其他无生命物体例如笼子,可能是流感病毒从一个农场传播到另一个农场的媒介。当发生这种情况时,可能在家禽中出现禽流感爆发。甲型流感病毒也能感染人类以及其他宿主,例如猪、鲸、马、海豹等。
禽流感病毒分类在正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、甲型流感病毒属中。禽流感病毒的基因组由8区段单链负股RNA构成。病毒基因组编码10种蛋白,其中8种蛋白是结构蛋白,包括HA和神经氨酸酶(NA),两种蛋白是非结构蛋白。甲型流感病毒根据HA和NA蛋白的抗原性分成不同亚型。已识别到16种HA抗原和9种NA抗原。HA被认为是能够在鸟类中引发保护性抗体的主要抗原。
禽甲型流感病毒根据其致病性分成两种致病型:高致病性禽流感(HPAI)病毒和低致病性禽流感(LPAI)病毒。大多数禽流感病毒具有低毒力,但是几种H5和H7亚型能够引起导致高死亡率的严重系统性疾病。
红细胞凝集素基因可以从禽流感病毒的任何亚型或任何毒株获得。优选情况下,HA基因从H5亚型的禽流感病毒获得。更优选情况下,HA基因从H5N1亚型的禽流感病毒获得。最优选情况下,HA基因从流感病毒H5N1(swan/Hungary/4999/2006)毒株获得。核苷酸和相应的氨基酸序列提供在图2C中。
或者,HA基因从禽流感病毒A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)毒株获得。来自A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)毒株的HA基因的核苷酸序列描述在美国专利申请2008/0241188中。该序列与已发表的A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)毒株的HA基因的核苷酸序列(M.Garcia等,1997,Virus Res.51:115-124,GenBank登记号U79456)有几个碱基的差别。
根据本发明的这个优选实施方案,在病毒基因组中启动子与HA基因可操作连接,典型位于HA基因的5’区域,以控制HA基因的表达和HA蛋白的产生。优选情况下,HA基因在巨细胞病毒立即早期启动子(CMV启动子)、鸡β-肌动蛋白启动子(T.A.Kost等,1983,NucleicAcids Res.11:8287-8301)或修饰的鸡β-肌动蛋白启动子(U.S.Pat.No.6,866,852)的控制之下。CMV启动子的核苷酸序列描述在文献中(M.Boshart等,1985,Cell 41:521-530,GenBank登记号K03104)。或者,CMV启动子可以具有如US 2008/0241188中所示的从原始序列略微修饰的序列。
此外,如上所述,插入区域可以是病毒基因组中对于病毒生长来说非必需的区域。换句话说,非必需区域可以被定义为其中修饰或插入外来基因不阻止病毒在体外或体内成功复制的区域。已经报道了HVT基因组中几个非必需区域。如上所述,HA基因和CMV启动子可以插入到例如但不限于UL43(WO 89/01040)、US2(WO 93/25665)或UL44与UL46之间的ORF间区域(WO 99/18215)中。最优选情况下,HA基因和CMV启动子被插入到UL45与UL46之间的OFR间区域中。
因为HA蛋白是禽流感病毒的保护性抗原,并且骨架HVT是活马立克氏病疫苗,因此含有本发明的HA基因的重组HVT可以用作对抗禽流感和马立克氏病的双价疫苗,或作为对抗禽流感的单价疫苗。此外,本发明的疫苗可以使用在与任何重组或非重组病毒例如MDV血清型1型或血清型2型疫苗毒株的混合物中。
本发明的表达特定病原体的一种或多种不同的异源或同源肽的重组HVT或MDV以及疫苗,对于免疫接种对这些病原体易感的上述水禽物种、特别是雁形目包括鸭科的水禽物种例如鸭、鹅和天鹅,以及鸭亚科、麻鸭亚科或树鸭亚科的水禽物种来说,特别有用。
正如在下面的实施例中所证实的,使用这样的活载体疫苗免疫接种后,重组HVT在被接种的宿主内复制,在水禽细胞中体内表达异源或同源肽或蛋白。然后,异源或同源免疫原性肽或蛋白引发稳定的、长期持续的免疫应答。如果源自于特定病原体的抗原性肽或蛋白能够刺激保护性免疫应答,那么用本发明的重组HVT接种的水禽将对随后该病原体的感染以及MDV的感染免疫。因此,本发明的引入到HVT基因组插入区中的异源或同源核酸序列可以在体内连续表达,提供了对病原体的稳定、安全和长期持续的免疫力。
本发明还涉及上述疫苗在免疫接种水禽物种中的应用,以及通过给药免疫有效量的本发明的疫苗对水禽物种进行免疫接种的方法。疫苗可以通过真皮内、皮下、肌肉内、口腔、卵内、通过粘膜给药或经眼-鼻给药,有利地给药于水禽物种。
最后,本发明涉及用于免疫接种水禽物种的免疫接种试剂盒,所述试剂盒包含有效量的如上所述的rHVT或MDV疫苗,以及用于将所述组分给药于所述物种的工具。这样的试剂盒可以包含装填有本发明的rHVT或rMDV疫苗的注射装置,以及用于真皮内、皮下、肌肉内或卵内注射的说明书。可选地,试剂盒包含装填有本发明的rHVT或rMDV疫苗的喷雾剂/气溶胶或滴眼液装置,以及用于眼-鼻、口腔或粘膜给药的说明书。
下面的实施例详细描述了本发明的说明性方法和技术。
实施例
实施例1:HVT疫苗
测试了两种可商购HVT(火鸡疱疹病毒,MDV血清型3型)疫苗:细胞结合的HVT疫苗(Marek HVT血清型3型活病毒,Wineland)和冷冻干燥的HVT疫苗(Bio Marek HVT,Fatro)。
实施例2:动物和实验组
在实验中使用32日龄雄性鸭(无菌的,北京鸭与番鸭的属间杂交)。将16只鸭用细胞结合疫苗免疫接种,另外16只鸭用冷冻干燥疫苗免疫接种。两种疫苗都在第1日皮下给药。
实施例3:通过PCR检测HVT病毒
每周取样来自每个组的四只鸭(在免疫接种后第7、14、21和28日)。在每个日期收集法氏囊、脾脏、胸腺和羽尖样品(羽尖只从免疫接种后第14日起收集),并测试HVT疫苗病毒的存在。将器官样品在无菌PBS中匀浆,以获得10m/v%悬液。使用DNA小提试剂盒(QIAGEN,Hilden,德国)按照制造商的说明书纯化DNA。使用特异性针对HVT病毒的引物进行PCR。按照Handberg等(Avian pathol.(2001)pp 243-249)描述的方法,扩增505个核苷酸长的US3基因区段(第4245-4227位)。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上在溴化乙锭染色后进行分析。在所有试验中包含了HVT阴性和阳性对照样品。
实施例4:水禽物种的预防接种
从接种后第7日(内部器官)或第14日(羽毛)起,从使用细胞结合或冷冻干燥疫苗免疫接种的所有鸟类检测疫苗病毒。结果概述在下表中并显示在图1中。
表1:在用细胞结合疫苗免疫接种后的鸭的不同器官中通过PCR检测HVT疫苗病毒
表2:在用冷冻干燥疫苗免疫接种后的鸭的不同器官中通过PCR检测HVT疫苗病毒
实施例5:HVT-DNA的制备
HVT-DNA基本上按照Lee等(J.of Virol.,7:289-294(1971))的方法制备。将HVT(FC-126毒株)感染的细胞(5×107个细胞)在Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1)混合培养基中,在直径16cm培养皿中,在37℃下培养4天。在温育完成后,用刮刀刮下细胞,然后将其以低速离心(2,000rpm,5分钟)。在舍弃上清液后,以10倍于沉淀的被感染细胞的量加入裂解缓冲液(0.15M NaCl,0.1M EDTA,1%SDS,100μg/ml蛋白酶K)。在37℃温育过夜后,加入等量的苯酚以变性蛋白,并将该过程重复两次用于提取HVT-DNA。通过乙醇沉淀收集提取的DNA。
实施例6:pNZ45/46Sfi的构建
根据MDV血清型1型的gCh基因(Coussens等,J.Virol.,62:2373-2379(1988))和BamHI-B片段的侧翼EcoRI-BamHI片段(日本未经审查的专利出版物(Kokai)No.6-292583)的信息,设计了合成的DNA(引物1至4)以在ORF之间引入SfiI位点。Coussens等的上述文章描述了UL44和45,而日本未经审查的专利出版物(Kokai)No.6-292583描述了UL46。使用下面描述的引物执行PCR,并将扩增的产物克隆到pUC18中。
通过实施例5的方法,从HVT-FC126感染的CEF收获DNA,并使用100ng DNA作为模板。此外,使用由引物1(CCCCGAATTC ATGGAAGAAA TTTCC;SEQ ID NO:2)与引物2(CGCGCGCCTT ATTGGCCAAA ACACACCTCT AACGGTTACT;SEQ ID NO:3)构成的“引物组A”(各50pmol)和由引物3(GCGCGGCCAA TAAGGCCAA ACACAGTAAC CGTTAGAGGT;SEQ ID NO:4)与引物4(CCCCAAGCTT TCAAGTGATA CTGCGTGA;SEQ ID NO:5)构成的“引物组B”(各50pmol),通过常规方法执行PCR。反应在第30个循环处停止,获得了约1μg每种扩增产物。
使用这两种PCR产物的混合物(混合比例1:1,将每种100ng混合)作为模板,使用引物1和引物4执行30个PCR循环(一个循环包含45℃1分钟,60℃2分钟和73℃3分钟),由此将SfiI位点引入到UL45h与UL46h的ORF之间。将由此获得的扩增产物用EcoRI和HindIII切割,并使用4单位T4连接酶,通过在16℃温育30分钟将片段插入到pUC18的EcoRI-HindIII位点中,以构建pNZ45/46Sfi。
实施例7:pNZ44/45sfi的构建
与实施例6中相同,使用从HVT-FC126毒株感染的CEF获得的DNA(10ng)作为模板,并使用由引物1与引物5(GCGCGGCCAA TAAGGCCAAC ATCGGGACGT ACATCAT;SEQ ID NO:6)构成的“引物组C”(各50pmol)和由引物6(GCGCGGCCTT ATTGGCCTTA AATACCGCGT TTGGAGTAAA;SEQ ID NO:7)与引物4构成的“引物组D”(各50pmol),如实施例6中所示执行PCR。获得了每种扩增产物约10μg。
使用这两种PCR产物的混合物(混合比例1:1,将每种100ng混合)作为模板,与实施例6中相同使用引物1(50pmol)和引物4(50pmol)执行PCR,由此将Sfi位点引入到UL44h(HSV-1的gCh或MDV1的gCh(gA))与UL45h的ORF之间。
将产物用EcoRI和HindIII切割,并与实施例6中相同将获得的片段插入到pUC18的EcoRI-HindIII位点中,以构建pNZ44/45Sfi。
实施例8:pG1MCSpolyASfi的构建
(1)供体质粒pGTPs的构建
将合成的DNA(5'-AGCTGCCCCCCCCGGCAAGCTTGCA-3'(SEQ ID NO:8))插入到pUC18的HindIII-PstI位点中,然后使用DNA聚合酶将该部分修复成双链。进一步将合成的DNA(5'-TCGACATTTTTATGTAC-3';SEQ ID NO:9)插入到获得的质粒的SalI-KpnI位点中,类似使用DNA聚合酶将其修复成双链。此外,将两种合成的DNA:5'-AATTCGGCCGGGGGGGCAGCT-3'(SEQ ID NO:10)与5'-GCCCCCCCGGCCG-3'(SEQ ID NO:11)的退火产物导入到质粒的SacI-EcoRI位点中。最后,将通过用HindIII和SacI消化质粒pNZ1729R(Yanagida等,J.Virol.,66:1402-1408(1992))获得的约140bp DNA片段插入到该质粒的HindIII-SacI位点中,以构建质粒pGTPs。
(2)pGIMCSpolyASfi的构建
将pUC18用DraI切开,并与实施例6中相同将XhoI连接物(由Takara Shuzo制造)插入到其中,以构建其中导入了XhoI位点的pUC18X。
将该pUC18X用HindIII和PstI切开,将合成的DNA 1(AGCTTGCCAATAAGGCTGCA;SEQID NO:12)和合成的DNA 2(ATGGCCCGCC GGCTGACCGC;SEQ ID NO:13)与其退火以产生片段。使用T4连接酶(由Takara Shuzo制造)将它插入到上述XhoI位点中,以构建pU18XG。
为了将poly A添加信号和SfiI位点导入到pU18XG的KpnI-EcoRI位点中,使用T4连接酶插入通过合成的DNA 3(GCGGTCAGCC GGCGGGCCAT;SEQ ID NO:14)与合成的DNA 4(GGTAAACTGC AGACTTGGCA GT;SEQ ID NO:15)的退火而制备的片段,以构建pUCpolyASfi。在该pUCpolyASfi的RpnI-BamHI位点中,插入在实施例4(1)中描述的pGTPs的36bp KpnI-BamHI片段,以构建pMCSpolyASfi。在该pMCSpolyASfi的HindIII-PstI位点中,与实施例6中相同插入合成的DNA 5(ACTGCCAAGT CTGCAGTTTA CC;SEQ ID NO:16),以构建pGIMCSpolyASfi。
实施例9:pRSV和pCMV的构建
将通过NsiI和NheI双消化从pBK-RSV切下的含有RSV启动子的约600bp NsiI-NheI片段,如实施例6中所述插入到在实施例8中获得的PGIMCSpolyASfi的PstI-XbaI位点中,以构建pRSV。
类似地,切下pBK-CMV的含有CMV启动子的NsiI-NheI片段,并如实施例6中所述导入到在实施例8中获得的pGIMCSpolyASfi的PstI-XbaI位点中,以构建pCMV。
实施例10:pCMV-HN的构建
(1)从pCMV的CMV启动子中删除BglI位点
因为在pCMV的CMV启动子中存在3个BglI位点,因此如下所述执行PCR来引入突变,以便删除BglI位点。突变以下述方式进行。
使用在实施例9中构建的pCMV(100ng)作为模板,在与实施例6中相同的条件下,使用由引物7与引物8构成的引物组E和由M13P7引物(由Toyoboseki Co.,Ltd.制造)与引物9构成的引物组F进行PCR。获得了约10μg的每种扩增产物。
将使用上述两个引物组获得的扩增产物(每种100ng)以1:1的混合比例混合。使用该混合物作为模板,使用M13P7引物和引物8如实施例2中所述进行PCR,获得约10μg PCR产物(1)。
类似地,以pCMV(100ng)为模板,使用由引物10与引物11(GGCATAATGC ATGGCGGGCCAT;SEQ ID NO:17)构成的引物组E和引物12(ATGGCCCGCC ATGCATTATGCC;SEQ ID NO:18)与M13P7引物(由Toyoboseki Co.,Ltd.制造),如实施例2中所述进行PCR。
类似地,使用这两个引物组的产物各100ng的1:1混合物作为模板进行PCR,这次使用引物10和M13P8引物,以获得约10μg PCR产物(2)。
此外,将PCR产物(1)与PCR产物(2)混合。然后使用M13P7引物和M13P8引物如实施例6中所述进行PCR,以获得其中BglI位点被删除的CMV启动子。
(2)pUCCMV的构建
此外,如实施例6中所述将pBK-CMV的含有CMV启动子的约600bp NsiI-NheI片段插入到pUC19的PstI-XbaI位点中,以构建pUCCMV。
(3)pNZ87的构建
(3-1)其中β-半乳糖苷酶基因与7.5K启动子相连的质粒(pNZ76)的构建
在用BamHI消化10μg pMA001(Shirakawa等,Gene.28:127-(1984))后,将其用苯酚:氯仿(1:1)提取,然后进行乙醇沉淀,以收集β-半乳糖苷酶基因(约3.3kb)。
另一方面,在用BamHI消化0.3μg pUC19后,将其用苯酚:氯仿提取,然后进行乙醇沉淀。将产物与如上所述制备的β-半乳糖苷酶基因连接,以产生杂交质粒pNZ66。
将40μg pUWP-1(含有编码痘苗病毒WR株7.5KDa肽的DNA的启动子的质粒)用HpaII和EcoRI消化,进行1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳(70V,6小时)以分离含有7.5K启动子的约0.26kb片段,然后将其用苯酚:氯仿(1:1)提取,并用乙醇沉淀以收集DNA。使用DNA聚合酶将DNA片段的粘性末端平端化。在用HincII消化0.3μg pNZ66后,将其用苯酚:氯仿提取,然后进行乙醇沉淀以收集片段,将其与上面提到的约0.26kb的7.5K启动子基因连接,并将获得的杂交质粒命名为pNZ76。
(4)杂交质粒pNZ87的构建
将其中来自杂交噬菌体mp10-HN180的启动子和NDV的HN基因的DNA已被连接到启动子pNZ76的控制之下的载体用BamHI消化,然后对其进行0.8%琼脂糖凝胶电泳,以收集不含β-半乳糖苷酶基因的约2.9kb片段。
另一方面,在用BglII和BamHI消化杂交噬菌体mp10-HN180后,从0.8%琼脂糖凝胶收集约1.8kb的NH基因的DNA片段。通过连接酶将两个片段连接。将获得的质粒用于转化大肠杆菌YG-1菌株感受态细胞,并使用常规方法提取质粒。检测到含有HN基因的杂交质粒,其被命名为pNZ87。
(5)pNZ87CMV的构建
然后,从(3)中构建的pNZ87切下含有NOV的HN基因的约1.8kb BamHI-SacI片段。如实施例6中所述将该片段插入到pUCCMV的BamHI-SacI位点中,以构建pNZ87CMV。
因为pNZ87CMV在启动子区中具有BglI位点,将含有CMV启动子的HindIII-BamHI片段用(1)中描述的PCR构建的不含BglI位点的CMV启动子的HindIII-BamHI片段替换,以构建pCMV-HN(BglI-)。
实施例11:RSV-F的构建
(1)pUCRSV-pA的构建
将含有pBK-RSV(STRATAGENE)的RSV启动子的约600bp的NsiI-NheI片段如实施例6中所述插入到pUC19的PstI-XbaI位点中,以构建pUCRSV。单独地,以pBK-RSV(STRATAGENE,100ng)为模板,如实施例2中所述使用引物13(CGGGAGCTCT AATTGTTTGT G;SEQ ID NO:19)和引物14(CGGGAATTCG CTTACAATTT;SEQ ID NO:20)(各50pmol)进行PCR,以获得具有包含在pBK-RSV中的SV40启动子的pA添加信号的片段。将PCR扩增的片段用SacI和EcoRI双消化,并如实施例6中所述插入到pUCRSV的SacI-EcoRI位点中,以构建pUCRSV-pA。
(2)pNZ98的构建
使用了含有NDV的F基因和HN基因的质粒XLIII-10H(Virus Research,7:214-255(1987))。
将4μg质粒XLIII-10H用XbaI消化,并且在将得到的粘性末端用DNA聚合酶平端化后,将其用苯酚:氯仿(1:1)进行提取,并通过乙醇沉淀来收集。将收集到的DNA用BamHI消化,进行0.8%琼脂糖凝胶电泳,以收集含有约2.1kb的完整F基因的片段。
另一方面,将如上产生的pNZ76用BamHI和SmaI双消化,以收集缺少lacZ基因部分的约3.0kb BamHI-SmaI片段。将收集的片段与含有约2.1kb完整F基因的片段通过连接酶进行连接,转化大肠杆菌TG1菌株感受态细胞。
通过与上述相似的步骤,从在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上生长的菌落制备质粒。将质粒用限制性酶(BamHI和SmaI)切开,所需克隆得到验证,并命名为pNZ98'。该pNZ98'含有全长F基因和NH基因的约300bp 5'-末端。为了移除这一部分,将pNZ98'用SmaI和KpnI双消化,并通过0.8%琼脂糖凝胶电泳收集约4,150bp SmaI-KpnI片段。也将pNZ98'用SmaI和AvaII双消化,并通过1.5%琼脂糖凝胶电泳收集约650bp SmaI-AvaII片段。
将这两种片段混合,并使用DNA聚合酶将得到的粘性末端平端化。然后使用产物转化大肠杆菌TG1以获得转化子。转化子生长在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。从形成的菌落如上所述获得质粒。将质粒再次用SmaI消化,并选择切开的质粒以获得pNZ98。
(3)从上述(2)中构建的pNZ98切下含有NDV的F基因的约1.8kb BamHI-SacI片段,然后如实施例6中所述将其插入到pUCRSV-pA的BamHI-SacI位点中,以构建pNZ98RSV3。还将pNZ98用PstI切开并用BamHI部分消化以获得125bp片段。用收集到的片段代替pNZ98RSV3'中包含的75bp PstI-BamHI片段,以构建pNZ98RSVpA。将在实施例5中构建的pRSV的2,892bpMluI-SacI切割片段与pNZ98RSvpA的NDV的F基因的2,262bp MluI-SacI切割片段连接,以构建pRSV-F。
实施例12:pCMV-VP2S的构建
(1)pCMV/MCS的构建
在实施例10中构建的pCMV-HN(BglI-)的BamHI-KpnI位点中,插入pBluescript SK+的62bp的BamHI-KpnI片段,以构建pCMV/MCS。
(2)pCMV/MCSpA的构建
独立地,以pBK-RSV(STRATAGENE)为模板,使用引物15(CCGGGGCCCT AATTGTTTGTG;SEQ ID NO:21)和引物16(CGGGGTACCG CTTACAATTT;SEQ ID NO:22),如实施例6中所述进行PCR,以获得具有SV40的pA添加信号的片段。
将PCR扩增的片段用ApaI和KpnI进行双消化,并如实施例6中所述插入到pCMV/MCS的ApaI-KpnI位点中,以构建pCMV/MCSpA。
(3)pCMV-VP2S的构建
此外,按照常规方法从IBDV野外分离的Okayama毒株提取RNA。使用反转录酶和cDNA合成试剂盒(由Takara Shuzo制造),使用RNA产生cDNA。
以该cDNA为模板,根据与日本未经审查的专利出版物(Kokai)No.62-503006中提出的基因序列的VP2对应的区域,设计了引物17(GCAAGCTTGC GATGACGAAC CTGC;SEQ IDNO:23)和引物18(GCGTCGACTC ACCTCCTTAG GGCCC;SEQ ID NO:24)。
使用这两种引物,按照实施例6中所述进行PCR,以获得对应于IBDV的VP2的区域。独立地,将pCMV/MCSpA用HindIII部分消化,然后用SalI部分消化,以获得3,687bp片段。将通过上述PCR获得的IBDV片段用HindIII和SalI双消化,然后如实施例6中所述插入到3,687bp片段中,以构建pCMV-VP2S。
实施例13:pUC18Xlac的构建
如实施例6中所述,将lacZ的BamHI-SacI片段(Yanagida等,J.Virol.,66:1402-1408(1992))插入到在实施例8中构建的pU18XG的BamHI-SmaI位点中,以构建pUC18Xlac。
实施例14:pNZ45/46RSVlac和pNZ44/45RSVlac的构建
(1)pNZ45/46RSVlac的构建
在实施例6中构建的pNZ45/46Sfi的SfiI位点中,插入在实施例9中构建的含有RSV启动子的pRSV的BglI片段中,以构建pNZ45/46RSV。在pNZ45/46RSV的Sfi位点中,插入在实施例13中构建的含有lacZ的pUC18Xlac的BglI片段,以构建pNZ45/46RSVlac。
(2)pNZ44/45RSVlac的构建
类似地,在实施例7中构建的pNZ44/45Sfi的SfiI位点中,插入在实施例9中构建的含有RSV启动子的pRSV的BglI片段,以构建pNZ45/46RSV。在pNZ44/45RSV的SfiI位点中,插入在实施例13中构建的含有lacZ的pUC18Xlac的BglI片段,以构建pNZ44/45RSVlac。
实施例15:pNZ45/46VP2S和pNZ44/45VP2S的构建
(1)pNZ45/46VP2S的构建
在实施例14中构建的pNZ45/46RSVlac的SfiI位点中,如实施例6中所述插入在实施例12中构建的含有IBDV的VP2基因的pCMV-VP2S(Okayama)的BglI片段,以构建pNZ45/46VP2S。
(2)pNZ44/45VP2S的构建
类似地,在实施例14中构建的pNZ44/45RSVlac的SfiI位点中,如实施例6中所述插入在实施例12中构建的含有IBDV的VP2基因的pCMV-VP2S(Okayama)的BglI片段,以构建pNZ44/45VP2S。
实施例16:pNZ45/46HNF和pNZ44/45HNF的构建
(1)pNZ45/46HNF的构建
在实施例14中构建的pNZ45/46RSVlac的SfiI位点中,如实施例6中所述插入在实施例10中构建的含有NDV的HN基因的pCMV-HN(BglI-)的BglI片段,以构建pNZ45/46HN。此外,在pNZ45/46HN的SfiI位点中,插入在实施例11中构建的含有NDV的F基因的pRSV-F的BglI片段,以构建pNZ45/46HNF。
(2)pNZ44/45HNF的构建
类似地,在实施例14中构建的pNZ45/45RSVlac的SfiI位点中,插入在实施例10中构建的含有NDV的HN基因的pCMV-SN(BglI-)的BglI片段,以构建pNZ44/45HN。此外,在pNZ44/45HN的SfiI位点中,插入在实施例11中构建的含有NDV的F基因的pRSV-F的BglI片段,以构建pNZ44/45HNF。
实施例17:pNZ45/46HNF-VP25和pNZ44/45VP2S-HNF的构建
(1)pNZ45/46HNF-VP2S的构建
在实施例16中构建的pNZ45/46HNF的SfiI位点中,插入在实施例12中构建的含有IBDV的VP2基因的pCMV-VP2S的BglI片段,以构建pNZ45/46HNF-VP2S。
(2)pNZ44/45VP2S-HNF的构建
在实施例15中构建的pNZ44/45VP2S的SfiI位点中,插入在实施例10中构建的含有NDV的RN基因的pCMV-HN(BglI-)的BglI片段,以构建pNZ44/45VP2S-HN。此外,在pNZ44/45VP2S-HN的SfiI位点中,插入在实施例11中构建的含有NDV的F基因的pRSV-F的BglI片段,以构建pNZ44/45VP2S-HNF。
实施例18:重组HVT的纯化
将用胰蛋白酶分离的CEF单层悬浮在盐水G(0.14M氯化钠,0.5mM氯化钾,1.1mM磷酸氢二钠,1.5mM磷酸二氢钠和0.5mM六水氯化镁,0.011%葡萄糖)中,以制备细胞悬液。将细胞悬液(2×107个细胞)与40μg每种重组质粒pNZ44/45VP2S、pNZ44/45HNF、pNZ45/46VP2S、pNZ45/46HNF、pNZ44/45VP2S-HNF和pNZ45/46HNF-VP2S,以及100μg在实施例9中制备的每种HVT的DNA混合。
在将溶液在室温静置10分钟后,使用3.0KVcm-1、0.4msec和25℃的条件下,使用室温对其进行电穿孔。将其中导入了质粒和HVT的DNA的细胞在直径9cm的培养皿(Falcon)上铺板,然后在37℃下培养约4至5天,直至形成HVT独有的噬斑。将形成噬斑的细胞用1%胰蛋白酶刮下,并与类似使用胰蛋白酶刮下的CEF细胞(2×107个细胞)混合,将其在10个96孔平底多孔培养板(由Falcon制造)中进行有限稀释。将这些板在37℃继续培养4至5天,直到在每个孔中形成HVT独有的噬斑。然后,向每块板中一半的孔加入100μl/孔的CEF培养基,所述培养基含有100μg/mlβ-半乳糖苷酶产色底物Bluogal(由Gibco制造)和0.8%琼脂,并将板在37℃温育约4小时。然后,计数每个孔中蓝色噬斑的数量。选择具有最大蓝色噬斑数量的板,向其加入1%胰蛋白酶以收集含有重组HVT感染的细胞的CEF。将CEF与1×106个细胞混合,然后将其铺于96孔平底多孔培养板上。重复筛选步骤(一个筛选步骤包含一次从96孔平底多孔培养板向96孔平底多孔培养板传代的步骤),直到所有孔都显示出蓝色噬斑,并且重复步骤直到当添加Bluogel时所有噬斑转为蓝色,由此纯化了病毒。纯化一般通过约5至10次筛选获得。在将被感染的细胞在直径9cm的培养皿上生长后,将被感染细胞进一步在直径16cm的培养皿上生长。当测定重组HVT的滴度时,发现重组HVT的滴度为1至6×103TCID50。
实施例19:抗原在rHVT感染的水禽细胞中的表达的验证
在用于组织培养的腔室培养玻片上,将上述重组HVT感染的细胞与CEF一起在37℃下进行培养直至噬斑形成,然后将其在冷丙酮中固定。为了检测表达的抗原,使用下列抗体作为第一抗体。对于β-半乳糖苷酶的检测来说,使用抗β-半乳糖苷酶兔抗血清(多克隆抗体:由Organon Teknica H.V.制造),为了检测NDV-NH蛋白和F蛋白,使用NDV疫苗免疫的鸡血清,它们各自在PBS中稀释500倍。为了检测IBDV-VP2蛋白,使用在PBS中稀释100倍的VP-2单克隆抗体GK-5(Yamaguchi T.等,Avian Dis.,40:501-509(1996))。作为标记抗体,将FITC标记的抗鸡IgG抗体、FITC标记的抗小鼠IgG抗体和FITC标记的抗兔IgG抗体(都由Harlan Sera-Lab Ltd.制造),在使用前各自在PBS中稀释100倍。
将含有上述抗体的每种溶液与固定在腔室培养玻片上的冷丙酮中的细胞相接触,允许其在室温下、在100%湿度下静置约1小时,然后在PBS中清洗三次。然后,将每种溶液与FITC标记的抗鸡免疫球蛋白抗体或抗小鼠IgG抗体的稀释液一起,在室温下反应约1小时。然后将每种溶液在PBS中清洗三次,并通过将其在显微镜下、在荧光激发波长(493.5nm)下进行检测来调查反应性。作为对照病毒,用HVT亲代毒株FC-126进行感染,并将用该亲代毒株感染的细胞用作对照细胞。掺入NDV抗原基因的重组HVT与抗NDV单克隆抗体反应,而掺入IBDV-VP2基因的重组HVT与抗VP2单克隆抗体反应。结果证实了每种重组HVT表达由被插入基因编码的蛋白。
实施例20:从禽流感病毒分离红细胞凝集素基因
来自报道的A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)序列的HA的氨基酸序列是公知的(M.Garcia等,1997,Virus Res.51:115-124,GenBank登记号U79456)。
HA氨基酸序列可以源自于禽流感病毒A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)毒株。因此,将该毒株在无特定病原体的孵化卵的尿囊中进行繁殖。使用RNEASY小提试剂盒(QIAGEN)提取来自A/Turkey/Wisconsin/68病毒的总基因组RNA。使用用于RT-PCR的SUPERSCRIPT第一链系统(Invitrogen)合成第一链cDNA。使用得到的cDNA作为模板,使用PFUULTRA高保真DNA聚合酶(STRATAGENE)和PCR引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增HA基因。
实施例21:质粒的构建
优选情况下,使用CMV启动子、鸡β-肌动蛋白启动子(Bac启动子)和修改的鸡β-肌动蛋白启动子(Pec启动子)控制AI病毒的HA基因的表达。首先,构建了带有HA基因和启动子之一的同源质粒,然后使用同源质粒产生重组火鸡疱疹病毒。
(1)质粒pGICMVpA的构建
CMV启动子从pBK-CMV(STRATAGENE)获得。将CMV启动子中的三个BglI限制性酶位点破坏,以便于使用四对引物通过PCR体外诱变的质粒构建过程。将CMV启动子片段用PstI和XbaI消化,并插入到PstI和XbaI消化的pUC18polyASfi(U.S.Pat.No.6,866,852)中,产生pGICMV(-)。SV40polyA信号也被插入。
(2)同源质粒p45CMVH5Wis68的构建
通过BglI从pGICMVpA切下CMV启动子和SV40polyA信号(940bp),并连接到SfiI消化的p45/46Sfi(U.S.Pat.No.6,866,852)中,产生p45/46CMVpA。然后,使用SalI和BamHI将来自于A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)的HA基因从pCR2.1-H5Wis68上切下。将1701bp的HA基因插入到用SalI和BamHI消化的p45/46CMVpA中,产生p45CMVH5Wis68。将质粒p45CMVH5Wis68作为同源质粒,用于产生重组火鸡疱疹病毒。
(3)质粒pGIBacpA2nd的构建
使用CEF细胞的细胞DNA作为模板,通过PCR获得了Bac启动子。PrBac1和PrBac2′是用于PCR的引物组。将获得的1.5千碱基的DNA片段用PstI和XbaI消化,并插入到PstI和XbaI消化的pUC18polyASfi中,产生pGIBac2。然后,将使用引物PolyA-SalKpn和PolyA-SfiF2通过PCR获得的SV40polyA信号用SalI和SfiI消化,并与SalI和SfiI消化的pGIBac2连接,得到pGIBacpA2nd。
(4)同源质粒p45BaCH5Wis68的构建
用BglI从pGIBacpA2nd切下Bac启动子和SV40polyA信号(1866bp)并连接到SfiI消化的p45/46Sfi中,产生p45/46BacpA2nd。然后,将使用SalI和BamHI从pCR2.1-H5Wis68切下的A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)的HA基因插入到用SalI和BamHI消化的p45/46BacpA2nd中,得到p45BaCH5Wis68。
(5)同源质粒p45PeCH5Wis68的构建
Pec启动子的构建描述在U.S.Pat.No.6,866,852中。Pec启动子通过将鸡β-肌动蛋白启动子的一部分与CMV启动子的增强子区融合来合成。使用PstI和BamHI将Pec启动子从pGIPec(U.S.Pat.No.6,866,852)切下,并插入到PstI和BamHI消化的p45/46BacpA2nd中,产生p45/46PecpA2nd。然后,将使用SalI和BamHI从pCR2.1-H5Wis68切下的A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)的HA基因插入到用SalI和BamHI消化的p45/46PecpA2nd中,得到p45PeCH5Wis68。
实施例22:重组火鸡疱疹病毒的产生和分离
按照Morgan等(Avian Diseases,1990,34:345-351)所述制备HVT FC126毒株的病毒DNA。将107个二次传代的鸡胚成纤维细胞(CEF)悬浮在盐水G(0.14M NaCl,0.5mM KCl,1.1mM Na2HPO4,1.5mM NaH2PO4,0.5mM MgCl2和0.011%葡萄糖)中,并通过电穿孔用HVT病毒DNA和5至25μg同源质粒p45CMVH5Wis68、p45BaCH5Wis68或p45PeCH5Wis68共转染。电穿孔使用BIO-RAD GENE PULSER执行。将被转染的细胞在室温下温育10分钟,并转移到96孔板的孔中。在4-5%CO2中、在37℃下温育7天后或直到噬斑变得可见,通过胰蛋白酶处理将细胞从板上脱离,同等地转移到两块具有二次传代CEF的96孔板中,并温育3至4天,直到观察到噬斑。通过只染色表达HA蛋白的噬斑的黑噬斑测定法进行筛选。简单来说,将两块板中的一块用甲醇:丙酮混合物(1:2)固定,并与鸡抗HA抗血清温育。接下来,与生物素标记的抗鸡IgG抗体(VECTOR LABORATORIES,目录号BA-9010)温育,然后与VECTASTAIN ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories,目录号AK-5000)温育,通过加入BCIP/NBT溶液(BIO-RADLABORATORIES,目录号170-6539和170-6532)对表达HA蛋白的噬斑进行染色。鉴定含有染色的重组噬斑的孔,并将来自另一块96孔板上相应孔的细胞用胰蛋白酶处理。然后将细胞在新鲜的二次传代CEF细胞中稀释,并转移到96孔板中以完成第一轮纯化。
重复纯化程序直到所有噬斑在黑噬斑测定法中阳性染色。将具有CMV启动子控制下的HA基因的纯化的重组病毒命名为rHVT/CMVH5Wis68。具有Bac启动子或Pec启动子的重组病毒分别被命名为rHVT/BaCH5Wis68和rHVT/PeCH5Wis68。
实施例23:rHVT(血清型3型)载体化的禽流感病毒(H5亚型)疫苗的制备
被命名为rHVT/AI-H5的rHVT(血清型3型)载体化的禽流感病毒(H5亚型)疫苗含有火鸡疱疹病毒(HVT)血清型3型骨架或载体组分,并表达禽流感病毒(AIV)H5亚型的红细胞凝集素(HA)蛋白。HVT亲本毒株FC126已在商业上用于免疫接种鸭。HVT被分类在生物安全1级类别中。
在孵育的第18天卵内接种至胚胎,在出生后通过皮下接种。
AIV H5亚型的HA基因在HVT基因组中被置于两个开放阅读框之间。HVT疫苗株的弱化还没有被观察到。
图3-8提供了完整流程图。聚合酶链反应(PCR)在长独特序列(UL)45与UL 46的终止密码子之间产生SfiI位点(图3)。插入位点两侧的区域是HVT基因组的UL 45与UL 46之间的非编码区。UL 45和UL 46具有典型的真核启动子和聚腺苷化信号。该插入位点以前被用于两种我们的HVT重组产品中:(1)法氏囊病-马立克氏病疫苗,血清型3型,活马立克氏病载体,以及(2)马立克氏病-新城疫疫苗,血清型3型,活马立克氏病载体。
一部分UL 44、整个UL 45和一部分UL 46已被分离在HVT基因组的1.9-千碱基(kb)EcoRV-XhoI片段上(图3B)。在Southern印迹中,被设计成与插入位点两侧序列结合的探针与HVT基因组的1.0-kb PvuI-PvuI片段退火(图3B)。
每种供体病原体的描述显示在图4-6中。控制供体基因表达的启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子(Boshart M.等,1985Cell.41:521-530)。将SV40聚腺苷化信号(Griffin,《DNA肿瘤病毒》(DNA Tumor viruses),J.Tooze主编,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.pp.843-913)添加到插入的供体DNA序列的3’端。多克隆位点源自于pUC18。
插入的供体DNA序列是通过反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)从AIV H5亚型毒株的单链负股RNA基因组扩增的片段(图4)。插入序列的大小为1695碱基对(bp)。
HA基因从甲型流感病毒H5亚型毒株A/swan/Hungary/4999/2006(H5N1)分离。A/swan/Hungary/4999/2006(H5N1)是在匈牙利从天鹅分离到的高致病性毒株。该分离株以前没有已知的应用。克隆的HA基因根据美国兽医许可号(United States Veterinary PermitNumber)101039从匈牙利获得。来自A/swan/Hungary/4999/2006(H5N1)的HA基因的切割位点被改变成低致病性禽流感病毒的典型切割位点序列。AIV HA基因被使用在USDA批准的疫苗中,其是禽痘病毒载体化的禽流感疫苗。
供体基因是AIV(H5血清型)的HA基因。该基因通过将AIV的单链负股RNA基因组使用反转录酶转变成互补DNA(cDNA),从cDNA中分离到(图4)。使用正向和反向PCR引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增HA基因,产生1.7-kb片段(图4)。这些PCR引物与HA基因的起始和终止序列退火,并且每条引物还在5’末端含有用于限制性酶BamHI或SalI的序列。切割位点的修改使用带有所需序列的PCR引物,通过PCR来进行。
(1)rHVT/AI-H5的构建和性质研究
如下所述,提供了用于构建受管制病原体的图解。
HVT(骨架病原体)基因组显示在图3中。AIV(供体病原体)基因组和HA基因显示在图4中。用于构建rHVT/AI-H5的质粒描述在图3至6中。大肠杆菌TOP10、TG-1或JM109被用于转化和扩增质粒。鸡胚成纤维细胞(CEF)被用作同源质粒和HVT基因组DNA重组的宿主细胞。
在转染后,通过有限稀释法分离在CEF中成功生长的病毒。将含有噬斑的孔扩增两份平行样,并筛选HA基因的表达。将重组病毒传代7次来分离rHVT/AI-H5克隆,并传代5次以扩增被命名为主种子病毒(MSV)的克隆。
通过如上所述的遗传检测对基因插入进行表征。使用针对AIV的HA蛋白的抗体,通过对rHVT/AI-H5感染的CEF进行Western印迹,来检测AIV HA产物。
(2)rHVT/AI-H5的物理表征
进行了重要区域的Southern印迹分析和PCR以及测序,以表征RBA的物理图谱。在图8中提供了两种Southern印迹分析方案,以及扩增三个区域的三种PCR方案。分析了这些PCR产物的序列。
2.3-kb的PvuI-EcoRI片段和1.3-kb的EcoRI-PvuI片段定义了插入片段和插入位点两侧的HVT序列。在一个Southern印迹分析中,被设计成与HA基因杂交的探针与2.3-kbPvuI-EcoRI片段退火(图8)。在第二个Southern印迹分析中,被称为插入位点探针的被设计成与插入位点两侧的序列杂交的探针,与2.3-kb PvuI-EcoRI片段和1.3-kb EcoRI-PvuI片段两者都退火(图8)。插入位点探针,其也被称为45/46探针,与HVT亲本基因组中的1.0-kbPvuI-PvuI片段退火(图3B)。在图8中描述的两个Southern印迹分析和三个PCR方案,被用于测试MSV n和n+5。
因为HA基因不向HVT骨架提供任何新的毒力因子,并且预期rHVT/AI-H5在生物学上与亲本病毒相同,因此推荐的NIH/CDC生物安全级别与亲本病毒相同(生物安全1级)。遗传基序是CMV启动子和SV40聚腺苷化信号。CMV启动子和SV40poly A添加位点已被广泛用于生产安全的表达载体。细菌质粒组分源自于定义明确的基于pUC的载体。载体(例如pUC)和宿主菌株(例如大肠杆菌TOP10、TG-1和JM109)被认为是生物安全1级的病原体。
(3)rHVT/AI-H5的表型特征
UL 45与UL 46之间的克隆位点被认为对于HVT复制来说是非必需的,因为RBA在体外和体内的复制与HVT亲本毒株相似。该插入位点以前已被用于两种HVT重组产品中:(1)法氏囊病-马立克氏病疫苗,血清型3型,活马立克氏病载体,以及(2)马立克氏病-新城疫疫苗,血清型3型,活马立克氏病载体。
rHVT/AI-H5表达AIV的HA基因。使用抗HA抗体,通过黑噬斑测定法和western印记分析证实了HA蛋白的表达。
实施例24:水禽rHVT免疫接种抗NDV和禽流感病毒的效果
进行了关于免疫接种效果的实验,以便确定在实施例18中获得的重组HVT疫苗的效果。将每组10只测试鸭和10只测试鹅用本发明的重组HVT(rHVT-ND或rHVTAI)接种。将商用灭活联合ND+AI疫苗接种阳性对照组(测试鸭和鹅的同批孵化动物),而阴性对照鸟不进行免疫接种。
当测试鸭和鹅孵出时,使用26G针头将每种重组HVT皮下接种到鸭和鹅的颈部背侧,以提供5x103PFU50。用于阳性对照的商用灭活疫苗通过皮下途径接种到同批孵化的鹅或鸭中。
在免疫接种后从第2至第6周,以1周的时间间隔从每只鸟获取血样,并对来自所述血样的血清进行测试,以检测相关的抑制NDV和AIV的血细胞凝集活性(血细胞凝集抑制,HI)的抗体。HI抗体的测定按照内部公认的测试方法来进行。
在独立的试验中,使用26G针头对20只测试鸭在颈部背侧进行接种,以提供5x103EID50的重组HVT-AI疫苗。在接种后第4周时,将测试鸭以及10只未免疫接种的对照鸭用高致病性禽流感(HPAI)H5N1亚型病毒毒株,通过口-鼻途径以106EID50的剂量向其给药来进行激惹。在2周的观察期中,记录表明HPAI病毒感染的临床征兆和鸭的死亡率,使用存活率作为指标确定效果。在用HPAI H5N1病毒激惹鸭之前,从每只鸭抽取血液,并对从其获得的血清进行测试,以检测抑制同源的H5N1禽流感病毒HA抗原的血细胞凝集活性的抗体。
实施例25:重组rHVT-AI/H5疫苗在番鸭中抵抗H5N1高致病性禽流感进化枝2A/Duck/Hungary/1180/2006激惹的效能
进行了实验,以评估由给药到日龄商用番鸭(仅有雌性)的重组rHVT-AI/H5疫苗所提供的针对高致病性H5N1AI进化枝2匈牙利病毒毒株A/Duck/Hungary/1180/2006的保护作用。该试验的第I组由测试鸟构成,其在孵出当天(第0日)用rHVT-cH5疫苗(“rHVT-cH5(Hun06)mod.细胞结合冷冻”疫苗)通过皮下(在颈部)以每只鸭3000PFU在0.2ml中的剂量进行接种。第II组是对照的未免疫接种组。两组都置于独立的BSL3隔离间中。然后在32日龄时,将来自两组的鸭通过口-鼻途径用106EID50的H5N1进化枝2A/Duck/1180/2006HPAI病毒毒株激惹。在激惹前(第29日),从两个组的每只动物获取用于血清学分析的血样。血样在两个时间点从免疫接种和未免疫接种的组获取:激惹前,以及实验结束时(激惹后2周)。按照标准程序执行血细胞凝集抑制试验。滴度>23被认为是阳性的。在激惹后,每日观察每个组中动物的临床症状。在第46天将鸭处死之前,获取从激惹中存活的鸭的血样。
表3
结果显示在图9中。在对照组中,从接种后第2天,从两只鸭(-B和-YY)开始观察到临床症状。在接种后第2天开始死亡,到接种后第8天,11只鸭中的9只死亡。一只鸟在实验结束时死亡,而一只鸭恢复。同时在测试组中,临床症状最初在接种后第4天在两只鸭(WW和N)上观察到,它们在接种后第6和8天死亡。两只鸭在实验结束时患病(BB和R),但是只有一只死亡(R)。
对免疫接种的免疫应答的结果提供在下面的表4和5中。
表4
N.T.=由于在阴性组中没有足够数据(只有一只鸭从激惹存活)而没有试验。
表5
在用H5N2进化枝2A/Swan/Hungary/4571/2006HA抗原激惹后,在4周龄(激惹前)所有未免疫接种的鸭都是HI阴性的,而在rHVT-cH5免疫接种的动物中,除了1只鸟之外,其他所有动物都发展出针对这种抗原的HI抗体。在激惹后两周,两个组中的所有动物都是阳性的。观察到了由于激惹引起的增强效应,并且该效应在免疫接种的组中达到显著水平(P<0.05)(阴性组没有进行统计学分析,因为只有一只动物从激惹中存活)。
因此,当在32日龄时用H5N1进化枝2A/Duck/Hungary/1180/2006毒株激惹时,未免疫接种的鸭在2周内显示出100%的发病率和91%的死亡率。在该组中,18%的鸭在接种后第2天显示出临床征兆,并且在接种后第3天所有鸭患病。在接种后第3天观察到第一只死亡的动物,并注意到死亡的高峰出现在接种后第4至第7天之间。在观察期结束时,9%的患病的未免疫接种的鸭恢复。当在接种后4周激惹时,在孵出时用rHVT-cH5细胞结合的冷冻疫苗免疫接种的鸭中有72%存活,其中在接种后第6天看到第一只死亡的鸟。在免疫接种组中,18%的鸟在接种后第6至第8天之间死亡,9%的鸟在接种后第14天死亡。从接种后第4天起在较早死亡的动物上观察到临床征兆,而对于在接种后第14天死亡的动物来说,只是在观察期结束时才观察到临床征兆。
这些结果证实了皮下给药到1日龄鸭的重组“rHVT-cH5(Hun06)mod.细胞结合的冷冻”疫苗,对抗由HPAI H5N1进化枝2病毒激惹引起的临床症状和死亡的优越效能。
此外,使用从向重组疫苗提供插入片段的AIV毒株(A/Swan/Hungary/4571/2006)制备的HA抗原,测量到的针对免疫接种的血清学响应相当高(6.36±1.91log2)。在用H5N1进化枝2A/Duck/Hungary/1180/2006毒株激惹后,观察到了增强效应。
Claims (20)
1.马立克氏病病毒血清型3型火鸡重组疱疹病毒(rHVT)在制造用于免疫或接种鸭或鹅的组合物中的应用,所述病毒包含插入到病毒基因组中、编码至少一种来自禽类病毒的抗原性肽的核苷酸序列。
2.权利要求1的应用,其中核苷酸序列编码来自:禽流感病毒、1型禽副粘病毒(新城疫病毒,NDV)、禽偏肺病毒、马立克氏病病毒、禽肾病病毒(传染性法氏囊病病毒:IBDV)、鹅或番鸭细小病毒、鸭病毒性肠炎疱疹病毒、鹅疱疹病毒、鸭甲型、乙型或丙型肝炎病毒、鹅出血性多瘤病毒、鸭或鹅腺病毒、鹅或鸭圆环病毒、西尼罗病毒、或者鹅或番鸭呼肠孤病毒的抗原性肽。
3.权利要求1的应用,其中核苷酸序列编码病毒蛋白的抗原性肽,所述病毒蛋白选自:禽流感病毒的神经氨酸酶(NA)、马立克氏病病毒的gB、gC、gD、gH和/或gL蛋白、新城疫病毒的F和/或HN蛋白、鹅或番鸭细小病毒的VP1、VP2和/或VP3蛋白、鹅或番鸭呼肠孤病毒的结构蛋白、鹅出血性多瘤病毒的VP1蛋白、圆环病毒的衣壳蛋白或IBDV的VP2蛋白。
4.权利要求1的应用,用于接种鸭,其中所述核苷酸序列编码来自禽流感病毒的HA抗原。
5.权利要求1的应用,其中rHVT还包含一种或多种其他同源或异源核苷酸序列。
6.权利要求1的应用,其中核苷酸序列被插入到病毒基因组的非编码区或ORF之间的区域中。
7.权利要求1的应用,其中核苷酸序列被插入到HVT病毒基因组的非翻译区中。
8.权利要求6或7的应用,其中核苷酸序列被插入到位于UL44与UL45之间、UL45与UL46之间、UL41与UL42之间、UL40与UL41之间的非翻译区、位于gB基因下游、位于UL53与UL54之间或UL36与UL37之间的的区域。
9.权利要求6的应用,其中核苷酸序列被插入到位于病毒基因组的UL45与UL46之间的非编码区中。
10.权利要求1的应用,其中核苷酸序列在内源或异源启动子的控制之下。
11.权利要求10的应用,其中启动子是鸡β-肌动蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子或SV40启动子。
12.权利要求1的应用,其中所述鸭或鹅在至少1日龄时免疫接种。
13.权利要求1的应用,其中所述组合物通过真皮内注射、皮下注射、肌肉内注射、卵内注射、口腔给药、粘膜给药或经眼-鼻给药来给药。
14.权利要求1的应用,其中所述组合物还包含适合的溶剂。
15.权利要求14的应用,其中适合的溶剂包含水性缓冲液。
16.权利要求14的应用,其中适合的溶剂包含磷酸盐缓冲液。
17.权利要求1的应用,其中所述组合物还包含佐剂。
18.权利要求17的应用,其中佐剂是壳聚糖。
19.权利要求1的应用,其中所述组合物包含至少两种疫苗的混合物,所述至少两种疫苗之一是权利要求1中限定的重组HVT疫苗。
20.权利要求1的应用,其中所述组合物是多价疫苗,其包含表达单一或不同免疫接种蛋白抗原的两种或更多种重组HVT。
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