CN109136264B

CN109136264B - 马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白、重组载体和真核细胞株及其制备方法和疫苗

Info

Publication number: CN109136264B
Application number: CN201811104820.XA
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 任立松; 李延涛; 陈泽良; 任郭子君
Original assignee: Tiankang Pharmaceutical Suzhou Co ltd
Current assignee: Tiankang Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2038-09-19
Also published as: CN109136264A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种马疱疹病毒1型gB‑gD融合蛋白、重组载体和真核细胞株及其制备方法和疫苗。本发明提供一种马疱疹病毒1型gB‑gD融合蛋白重组载体，包括真核表达载体片段和马疱疹病毒1型gB‑gD基因片段。该重组载体可以实现马疱疹病毒1型糖蛋白gB和gD同时在外源系统中的随时表达。本发明提供的构建方法，包括将含有上述重组载体的CHO细胞进行筛选，得到稳定表达马疱疹病毒1型gB‑gD融合蛋白的CHO细胞株。该构建方法简便，易操作，可以成功筛选出稳定、高表达马疱疹病毒1型gB‑gD融合蛋白的真核细胞株，为后续的各项研究包括制备疫苗等应用提供了可行的技术方案。

Description

马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白、重组载体和真核细胞株及其制备方法和疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白、重组载体和真核细胞株及其制备方法和疫苗。

背景技术

马鼻肺炎是由2个亲缘关系密切的马疱疹病毒引起的马属动物传染病，即马疱疹病毒1型(EHV-1)和马疱疹病毒4型(EHV-4)。马疱疹病毒属于水痘病毒属，具有很强的传染性。糖蛋白包括gB，gC，gD，gE，gG，gI，gK，gM，gH和gL。其中，gB和gD已被证实可以诱发被感染的宿主产生中和抗体。

EHV-l比EHV-4具有更广泛的宿主。EHV-l能够通过gD结合各种细胞受体，从而进入宿主细胞，产生的宿主范围非常广泛。另一方面，EHV-4的gD只可以结合固定受体，因此，限制了病毒的宿主范围。

马鼻肺炎感染马属动物，给马产业经济带来不可估量的经济损失，目前，已成为马病中重要的防控疾病之一，严重制约了养马业的发展。该病易引起呼吸道疾病，病毒会在呼吸道上皮滋生，还可继发感染，引起孕马的流产和马驹的死亡并给种马、赛马或娱乐马带来精神障碍的后遗症。但是，目前还没有可以预防马鼻肺炎的亚单位疫苗。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体，以缓解现有技术中没有可以直接外源表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的重组载体的问题。

本发明的第二目的在于提供一种上述马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体的制备方法，提供一种可以快速高效地制备可以外源表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体的制备方法。

本发明的第三目的在于提供一种表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株的构建方法，本发明的第四目的在于提供上述构建方法得到的表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株，以缓解现有技术中缺少一种可以在真核细胞中表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的问题。

本发明的第五目的在于提供上述真核细胞株表达纯化得到的马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白，以缓解现有技术中缺少一种具有高效免疫原性的可以诱发被感染宿主产生中和抗体的蛋白。

本发明的第六目的在于提供一种预防马鼻肺炎的疫苗，以缓解现有技术中缺少一种高效，安全预防马鼻肺炎的亚单位疫苗的技术问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供一种马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体，包括真核表达载体片段和马疱疹病毒1型gB-gD基因片段。

进一步地，所述真核表达载体片段包括pcDNA3.1片段、pEE6.4片段或pEE12.4片段，优选为pcDNA3.1片段；

优选地，所述马疱疹病毒1型gB-gD基因片段为gB基因序列和gD基因序列连接的重组片段；

优选地，所述马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述真核表达载体片段的5’端和所述马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的3’端具有相同的双酶切位点，所述真核表达载体片段的3’端和所述马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的5’端具有相同的双酶切位点；

优选地，所述真核表达载体片段的3’端具有HindⅢ酶切位点，5’端具有XbaⅠ酶切位点；

优选地，所述马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的5’端具有HindⅢ酶切位点，3’端具有XbaⅠ酶切位点。

本发明提供一种上述马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体的制备方法，包括以下步骤：将马疱疹病毒1型gB-gD基因片段，插入到真核表达载体片段中，重组构建得到马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体。

进一步地，包括以下步骤：将马疱疹病毒1型gB-gD基因片段和真核表达载体片段分别处理得到粘性末端，再进行酶连接得到马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体；

优选地，所述马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的5’端具有HindⅢ酶切位点，3’端具有XbaⅠ酶切位点；

优选地，所述处理包括HindⅢ和XbaⅠ双酶切。

本发明提供一种表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株的构建方法，包括以下步骤：对含有上述马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体的CHO细胞进行筛选，得到稳定表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的CHO细胞株。

进一步地，将马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体转染CHO细胞，得到含有马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体的CHO细胞；

优选地，所述筛选包括加压筛选和单克隆筛选；

优选地，筛选得到的CHO细胞株表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白量为0.5-0.8g/L；

优选地，所述构建方法还包括将稳定表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的CHO细胞株驯化为悬浮培养的步骤。

本发明提供由上述构建方法构建得到的表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株。

本发明提供由上述真核细胞株表达纯化得到的马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白。

本发明最后提供一种预防马鼻肺炎的疫苗，包括上述马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供一种马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体，该重组载体可以在真核宿主中表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白，实现马疱疹病毒1型糖蛋白gB和gD同时在外源系统中的随时表达，高效，便捷。该马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体稳定性好，可以实现实时转染宿主和蛋白表达。本发明接着提供了一种上述重组载体的制备方法，该方法简洁易操作，重组效果好，准确性和成功率高。

本发明又提供了一种表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株的构建方法，包括将含有上述重组载体的CHO细胞进行筛选，得到稳定表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的CHO细胞株。该构建方法简便，易操作，可以成功筛选出稳定、高表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株，为后续的利用得到的真核细胞株做各项研究包括制备疫苗等应用提供了可行的技术方案，打下了良好的基础。

本发明又提供了利用上述构建方法筛选得到的真核细胞株，该真核细胞株稳定性好，可以高表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白，方便培养并大量提纯得到马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白，得到的融合蛋白具有较强的免疫原性。

本发明最后提供了一种由上述马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白制备得到的疫苗，该疫苗容易生产，稳定性强，较安全，不易引起敏感反应。该疫苗显著提高了马的保护效率，提高马对马疱疹病毒1型的免疫力，有效地控制病毒的传播和流行，可以显著地预防马鼻肺炎的发生，繁荣畜牧业具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1为本发明中实施例1中pcDNA3.1-gB-gD重组质粒的结构示意图；

图2为本发明中实施例1中pcDNA3.1-gB-gD重组质粒PCR鉴定结果示意图；

图3为本发明中实施例4中马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白表达量WesternBlotting结果示意图；

图4为本发明实施例6中BALB/c小鼠免疫马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白制备的疫苗后体内抗体水平变化示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

该重组载体可以在真核宿主中表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白，实现马疱疹病毒1型糖蛋白gB和gD同时在外源系统中的随时表达，高效，便捷。该马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体稳定性好，可以实现实时转染宿主和蛋白表达。

在本发明一个优选地实施方式中，真核表达载体片段包括pcDNA3.1片段、pEE6.4片段或pEE12.4片段，优选为pcDNA3.1片段。

在本发明一个优选地实施方式中，马疱疹病毒1型gB-gD基因片段为gB基因序列和gD基因序列连接的重组片段。gB和gD糖蛋白可以诱导宿主产生中和抗体，将编码两个糖蛋白的基因序列同时在一个载体上表达，得到带有两个糖蛋白的融合蛋白，这样的融合蛋白具有更多的抗原表位，更强的免疫原性。

在本发明一个优选地实施方式中，马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的序列如SEQ IDNO.1所示。将gB和gD基因序列中的抗原表位序列和保守序列优化连接成gB-gD基因片段作为目标片段可以有效提高生物利用率，减少关联性低的片段参与改造，减小目标片段的长度，有利于基因工程的操作和重组载体的成功构建。需要说明的是，SEQ ID NO.1中按照5’到3’方向的顺序，依次为gB、gD的基因片段，两个基因片段中间用5’-ggaggaggaggatctggaggaggaggatct-3’连接。

在本发明一个优选地实施方式中，真核表达载体片段的5’端和马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的3’端具有相同的双酶切位点，真核表达载体片段的3’端和马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的5’端具有相同的双酶切位点。

在本发明一个优选地实施方式中，真核表达载体片段的3’端具有HindⅢ酶切位点，5’端具有XbaⅠ酶切位点。真核表达载体片段带有双酶切位点有利于与目标片段的重组。

在本发明一个优选地实施方式中，马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的5’端具有HindⅢ酶切位点，3’端具有XbaⅠ酶切位点。马疱疹病毒1型gB-gD基因片段带有双酶切位点有利于与载体的重组连接。

真核表达载体片段和马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的两端的双酶切位点是相同的，相互对应的，即经过双酶切处理后，两个片段两端分别对应有相同的末端序列，便于后期两个片段的重组连接。其中，双酶切位点可以为但不限定为HindⅢ和XbaⅠ酶切位点。

该方法简洁易操作，重组效果好，准确性和成功率高。

在本发明一个优选地实施方式中，制备方法包括以下步骤：将马疱疹病毒1型gB-gD基因片段和真核表达载体片段分别处理得到粘性末端，再进行酶连接得到马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体。真核表达载体片段和马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的两端的双酶切位点是相同的，相互对应的，即经过双酶切处理后，两个片段两端分别对应有相同的末端序列，便于后期两个片段的重组连接。其中，双酶切位点可以为但不限定为HindⅢ和XbaⅠ酶切位点。

在本发明一个优选地实施方式中，马疱疹病毒1型gB-gD基因片段的5’端具有HindⅢ酶切位点，3’端具有XbaⅠ酶切位点。

在本发明一个优选地实施方式中，真核表达载体片段的3’端具有HindⅢ酶切位点，5’端具有XbaⅠ酶切位点。

在本发明一个优选地实施方式中，处理包括HindⅢ和XbaⅠ双酶切。

本发明又提供一种表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株的构建方法，包括以下步骤：对含有上述马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体的CHO细胞进行筛选，得到稳定表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的CHO细胞株。

该构建方法简便，易操作，可以成功筛选出稳定、高表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株，为后续的利用得到的真核细胞株做各项研究包括制备疫苗等应用提供了可行的技术方案，打下了良好的基础。

在本发明一个优选地实施方式中，先将马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体转染CHO细胞，得到含有马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体的CHO细胞；

在本发明一个优选地实施方式中，转染的步骤包括：向预处理过的CHO细胞中加入马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体，37℃，5％CO₂的条件下培养4-6h；

在本发明一个优选地实施方式中，转染的步骤还包括培养4-6h后更换培养基DMEM/F12(含10％血清，1％青链霉素双抗)，在37℃，5％CO₂条件下继续培养的步骤。

在本发明一个优选地实施方式中，预处理包括：消化和重悬CHO细胞，孵育培养，细胞交汇度达到80％-90％时将培养基换为无血清和青链霉素双抗的DMEM/F12。

在本发明一个优选地实施方式中，转染加入的马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体的溶液包括：OPTI-MEM、Lipofectamine LTX、plus和马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体；

在本发明一个优选地实施方式中，筛选的条件包括加压筛选和单克隆筛选。

在本发明一个优选地实施方式中，加压筛选包括：转染24h后，更换培养基为DMEM-F12(含10％血清+25μM MSX)，加压筛选7d。

在本发明一个优选地实施方式中，单克隆筛选包括：将加压筛选得到的阳性细胞进行单细胞培养。

在本发明一个优选地实施方式中，筛选得到的CHO细胞株表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白量为0.5-0.8g/L。

在本发明一个优选地实施方式中，构建方法还包括将稳定表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的CHO细胞株驯化为悬浮培养的步骤。CHO一般条件下为贴壁生长，这样限制了细胞量的增长和融合蛋白的表达，将贴壁细胞驯化为可悬浮培养的细胞株可以有效地解决这一问题，增加融合蛋白表达量，减少疫苗成本。

在本发明一个优选地实施方式中，驯化包括：将经过消化处理的CHO细胞株摇瓶培养第一代，培养基中加入Ex-cell 302和嘌呤霉素后继续摇瓶培养传代，细胞存活率一直达到95％以上，同时7周后，细胞接种3天繁殖三代，密度达到1×10⁶个/mL，得到悬浮培养的表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的CHO细胞株。其中，Ex-cell 302和嘌呤霉素可以加速建立稳定的细胞系。

本发明提供由上述构建方法构建得到的表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株。该真核细胞株稳定性好，可以高表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白，方便培养并大量提纯得到马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白，得到的融合蛋白具有较强的免疫原性。

本发明也提供由上述真核细胞株表达纯化得到的马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白。取细胞培养液的上清液作为待纯化样本，对带纯化样本进行分离纯化和透析，得到马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白。

该融合蛋白免疫原性强，生物利用度高，安全性和稳定性好，可以广泛地应用于各种工业产品。

该疫苗容易生产，稳定性强，较安全，不易引起敏感反应。该疫苗显著提高了马的保护效率，提高马对马疱疹病毒1型的免疫力，有效地控制病毒的传播和流行，可以显著地预防马鼻肺炎的发生，繁荣畜牧业具有重要的理论意义和应用价值。

为了便于理解本发明提供的技术方案，下面结合实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。

在下述实施例中用到的部分产品信息如下：

中华仓鼠卵巢细胞(CHO)购自美国ATCC公司，具体为CHO-K1细胞；

细胞培养基和血清均购自美国gibcom公司；

真核表达载体pcDNA3.1购自美国Thermo Fisher公司；

Lipofectamine LTX购自北京索莱宝科技有限公司；

氨甲基喋呤(mnethotrexate MTX)购自Sigma公司；

甲硫氨酸亚砜亚铵(L-methioninesulfoximine MSX)购于Sigma公司；

BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；

ISA201VG购自法国赛比克公司；

其他产品为本领域常用的常规试剂。

实施例1 pcDNA3.1-gB-gD重组质粒的构建

pcDNA3.1-gB-gD重组质粒谱图示意图如图1所示。

1.1 gB基因(GeneID:1487545)经优化后，设计长度720bp，gD基因(GeneID:2948561)经优化后设计长度747bp，gB和gD基因的片段间用序列5’-ggaggaggaggatctggaggaggaggatct-3’连接得到目标片段gB-gD基因，目标片段的全长为1497bp。上游和下游分别设计酶切位点：HindⅢ、XbaⅠ。目标片段序列如图SEQ ID NO.1所示。

带有酶切位点的目标片段的合成委托上海生工生物公司完成。

1.2 gB-gD基因和载体分别进行双酶切反应

1.2.1构建50μL反应体系：10×buffer 5μL、DNA样品2μg、HindⅢ2.5μL、XbaⅠ2.5μL、dd H20 40μL。加到1.5mL EP管中，混匀。37℃水浴2h。

1.2.2酶切目的DNA片段回收：将酶切后产物，进行琼脂糖凝胶电泳，回收其中的目标片段。采用DNA凝胶回收试剂盒(购自北京莱宝科技有限公司)，步骤如下：

1)琼脂糖凝胶电泳后，将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的1.5mL EP管中，称取重量。

2)加入3倍体积溶胶液，50-55℃水浴10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

4)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

5)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

6)12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置2min。

7)将吸附柱放入1.5mL EP管中，向吸附膜中央悬空滴加适量经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min。得到纯化后的目标DNA片段。

1.3连接反应

构建10μL反应体系：10×T4buffer 1μL、目标gB-gD片段6μL、pcDNA3.1载体2μL、T4连接酶1μL，依次加到1.5mL EP管中；

反应体系在16℃冷水浴10-16h，65℃水浴15min，4℃保存。

1.4转化反应

1)将10μL连接反应液加入到100μL DH5α感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃水浴100s，再冰浴2min；

2)取出样品管，加入600μL LB培养液，置于37℃恒温摇床，240rpm培养1h；

3)取出样品管，室温8,000rpm离心2min，吸除500μl上清液，重悬吹匀菌体，将重悬的菌液滴到转化平板上，用涂菌棒将菌液均匀铺开；

4)将转化平板置于恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h至单菌落长出，观察转化结果。

1.5质粒抽提、PCR和双酶切鉴定

1.5.1质粒提取：(美国OMEGA公司产品)

1)挑取1.4中的转化板中的单个菌落至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，240rpm过夜；

2)取菌液1.5mL至EP管中，室温10,000rpm离心1min，弃上清；

3)加250μL溶液I，振荡混匀；

4)加250μL溶液II，温和颠倒离心管4-6次，室温静置2min，至澄清；

5)加入350μL溶液III，立即温和颠倒离心管4-6次，至出现白色絮状沉淀；

6)室温13,000rpm离心10min；

7)小心吸取上清溶液，并移至吸附柱中心，室温10,000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；

8)加500μL Buffer HB，10,000rpm离心1min，弃滤液；

9)加700μL Wash Buffer，10,000rpm离心1min，弃滤液；重复1次；

10)室温离心空吸附柱，13,000rpm，2min；

11)将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，加30μL去离子水在滤膜上，室温静置5min，13,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。

1.5.2 PCR鉴定

利用如下引物对对1.5.1中提取的质粒进行PCR鉴定，结果如图2所示，成功得到1497bp大小目标片段。

上游引物：5’-ccaagcttctcagactggctgtgcgcg-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物：5’-gctctagatgttttattttatgtaatctccga-3’(SEQ ID NO.3)

1.5.3双酶切鉴定

1)20μL反应体系：10×buffer 2μL、DNA样品1μg、HindⅢ1μL、XbaⅠ1μL、补ddH₂0至20μL；

2)37℃水浴2h；

3)凝胶电泳检测，并将插入DNA片段送公司测序。

1.6 pcDNA3.1-gB-gD重组质粒的富集提取(采用去内毒素质粒大量提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司)

1)将PCR、双酶切和测序鉴定正确的克隆接种至100mL含氨苄抗性的LB培养基中，240rpm，37℃恒温培养15h；

2)取50mL细菌培养物至50mL离心管中，11,000rpm离心1min，吸除上清；

3)加4mL溶液P1，振荡器悬浮细菌细胞沉淀；

4)加4mL溶液P2，温和颠倒6-8次使菌体充分裂解；

5)加4mL溶液P3，立即温颠倒6-8次，充分混匀，至出现白色絮状沉淀；

6)11,000rpm离心10min，将上清移到另一个干净的离心管中；

7)加上清1/5体积的冰上预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，冰浴2min至溶液变清亮；

8)37℃水浴5min，不时振荡；

9)11,000rpm室温离心5min，溶液分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油相含内毒素；

10)将含质粒DNA的上层水相转移至新管，弃下层油相；重复三次；

11)加入12mL的结合液，充分混匀后加入吸附柱中，室温放置2min，11,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

12)加入8ml漂洗液，11,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；

13)加入6mL漂洗液，11,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；

14)11,000rpm离心3min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置4-5min；

15)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜滴2m,经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，11,000rpm离心2min，-20℃保存。

实施例2转染CHO细胞和筛选单克隆表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株

2.1转染CHO-K1细胞

1)取出细胞，弃去上清培养基，用预温的8mL PBS洗一次，弃去PBS；

2)每个培养皿加入2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min，镜下观察细胞变圆，呈单个细胞；

3)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，用移液器将细胞吹散；

4)转移至15mL离心管中，200rpm离心5min；

5)DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数；

6)稀释细胞至2×10⁵个/mL，取2mL混匀的细胞加入到六孔培养皿，置37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育过夜；

7)观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时开始转染，转染前将培养基换DMEM/F12(无血清无双抗)，2mL/孔；

8)用OPTI-MEM稀释质粒，125μL OPTI-MEM中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μLplus，混匀，室温静置5min；

9)稀释Lipofectamine LTX：125μL OPTI-MEM中加入9μL Lipofectamine LTX，然后加入2.5μL plus，轻轻混匀，室温静置5min；

10)将稀释质粒和稀释Lipofectamine LTX混合混匀，室温放置5min，然后逐滴加入六孔培养皿中均匀分布；

11)将六孔培养皿置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养4-6h；

12)换液：弃掉上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养；

2.2加压筛选

转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔培养皿，弃去上清，加入2ml DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7d，期间镜下观察，死细胞多换液。

2.3单克隆筛选

1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，开始单克隆筛选；

2)取出六孔培养皿，弃培养基，用PBS洗一次，加入300μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min，加2ml DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，用移液器将细胞吹散；

3)将细胞转移至15ml离心管中，200rpm离心5min；

4)DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数；

5)稀释细胞至5个/mL，取200μL加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4-6h；

6)标记单个细胞的孔；

7)96孔板中单个细胞的孔长满时，弃培养基，PBS洗一次，加入100μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min，加入2ml DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止反应，用移液器将细胞吹散；

8)将细胞液转移至12孔板，细胞长满时，取上清，ELISA检测，高效表达的继续培养、冻存；

9)经过筛选，共收获3株细胞株，编号为23株、49株、112株。

实施例3驯化表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的真核细胞株成悬浮培养

1)从37℃培养箱中取出细胞培养皿，弃去上清，用8mL PBS洗细胞一次，并弃去PBS；

2)细胞培养皿加入2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min，镜下观察细胞由皱变圆，呈单个细胞；

3)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)终止消化反应，用移液器将细胞吹散；

4)将细胞液转移至15mL离心管中，200rpm离心5min；

5)100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)悬浮细胞，计数；

6)稀释细胞至5×10⁵个/mL，接种30mL培养基于125mL摇瓶中；置37℃、5％CO₂细胞培养箱中的轨道式振荡器上130rpm孵育过夜；

7)每隔24h计数1次，观察细胞密度及活力；

8)当第一代细胞培养一次后细胞活率达到94％-97％时，进行第二代培养；

9)转移细胞至50mL离心管中，200rpm离心5min；

10)将DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)和Ex-cell 302按1:1混合同时加入对应浓度嘌呤霉素后混匀，重新悬浮细胞，计数；

11)稀释细胞至5×10⁵个/ml，接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中；置37℃、5％CO₂细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm孵育过夜。

12)每隔24h计数1次，观察细胞密度及活力；

13)当第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％；7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×10⁶个/mL，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养；接种密度降低到3×10⁵个/mL；

14)经驯化，49株、112株满足要求，表明2株驯化成功。

实施例4马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白表达量检测

1)配制培养基：60％的CD-CHO+40％的Ex-cell 302置于37℃水浴锅中预热；

2)从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，计数；

3)稀释细胞至3.0×10⁵个/mL，接种30mL培养基于125mL摇瓶中；置37℃、5％CO₂恒温摇床中，100rpm过夜；

4)每隔24h细胞计数，观察密度及活力；监测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品上清，检测蛋白表达情况；

5)补料：约第4天，70g/L CB5，添加基础培养基的10％；

6)第5天，将CO₂培养箱温度调整至32℃；

7)第9天，补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％；

8)第12天，收获细胞；

9)经Western Blotting检测，实施例2中得到的3个细胞株中，112株表达量最高。结果如图3所示，其中，泳道1为maker，泳道2为112细胞株，泳道3为49细胞株，泳道4为23细胞株。

实施例5蛋白纯化

1)收集细胞培养液，4℃，10,000rpm，30min，取上清，过滤膜(0.45μm)，准备上样；

2)柱平衡：用超纯水平衡3个柱体积，排出乙醇保存液；加入BufferA(20mMNaH₂PO₄，500mM NaCl)4-8mL/min，平衡3个柱体积；

3)上样：用5mL预装柱，1mL/min进行上样(根据预装柱体积调节上样流速，保留时间5min)，收集Flow through(FT)；

4)洗涤：4％bufferB(20mM NaH₂PO₄、500mM NaCl、100mM imidazole)洗柱，流速为4mL/min，至OD₂₈₀nm基线平稳为止；

5)洗脱：50％bufferB(20mM NaH₂PO₄、500mM NaCl、100mM imidazole)洗脱目的蛋白，至基线洗平；2ml/min，收集5mL/管；

6)洗涤：100％bufferB(20mM NaH₂PO₄、500mM NaCl、500mM imidazole)4mL/min，冲洗2-3个柱体积，至UV基线洗平；超纯水平衡3柱体积；

7)透析：Millipore 10KD PBS(7.4)4℃透析，每次换液咪唑稀释2倍，换液7－8次；

8)除菌过滤：用0.22μm滤器过滤，蛋白样品溶液-80℃冰箱保存。

9)蛋白浓度和纯度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，其中112株蛋白得率为800mg/L，其他在500mg/L左右；采用HPLC方法检测纯度，纯度都能达到95％以上。

实施例6制备疫苗与接种疫苗

1)疫苗制备：将表达的马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白与ISA201VG佐剂按体积比40:60混合，乳化，蛋白终浓度为1mg/mL；

2)疫苗免疫及抗体检测：选取6周龄BALB/c小鼠进行免疫接种，每次免疫马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白100μg，首免2周后，进行第二次免疫；首免前、二免前、二免后14天取血检测抗体水平，以PBS组作为对照组。抗体水平变化如图4所示。

实施例7马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白免疫小鼠淋巴细胞增殖的MTT检测

7.1小鼠脾脏淋巴细胞分离步骤：(北京索莱宝公司脾脏淋巴细胞分离液试剂盒)

1)无菌取小鼠脾脏，放入平皿，加入少量F液及20％胎牛血清；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入5mL F液及20％胎牛血清；用吸管不断吸取进行组织匀浆，用100目不锈钢滤网过滤到试管内；

2)1500rpm离心3min；

3)用细胞清洗液清洗3次，每次以500rpm短时低速离心除去细胞碎片；

4)取一支15mL离心管，加入与脾脏组织单细胞悬液等量的分离液；

5)用吸管小心吸取脾脏组织单细胞悬液加于分离液液面上，400rpm离心30min；

6)离心管中由上至下细胞分四层；

7)用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15mL离心管中，向离心管中加入10mL清洗液，混匀细胞；

8)250rpm离心10min；弃上清；

9)取5mL清洗液重悬所的细胞；

10)250rpm离心10min；弃上清；

11)重复上述清洗步骤3次后，加入后续实验所需液体量重悬细胞。

7.2MTT检测

1)取7.1中淋巴细胞悬液于96孔细胞培养板中；

2)加入终浓度为10μg/mL ConA；

3)37℃、5％CO₂培养48h后，加入MTT(5mg/mL)15μL；

4)培养4h，弃上清；

5)加入DMSO 100μL；酶标仪测OD₅₇₀nm值，计算其SI值。结果下表所示(p＜0.01)：

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康生物股份有限公司

<120> 马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白、重组载体和真核细胞株及其制备方法和疫苗

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctcagactgg ctgtgcgcga gtccggtata ctcgctgagg atggagactt ttacacctgc 60

ccaccgccta ccggatccac cgtcgtacgc atcgaaccac ctagaacttg ccccaagttt 120

gaccttggga gaaacttcac ggaggggatt gctgttattt ttaaggaaaa catcgctccc 180

tacaaattca gggcaaacgt atactacaag gacatcgttg taacacgtgt gtggaaagga 240

tacagccata cgtccctgtc cgacagatac aatgacaggg ttccggtttc ggtggaggag 300

atcttcggtc tcatcgacag taagggaaaa tgttcgtcaa aggccgagta cctcagagat 360

aacatcatgc accacgcgta ccacgacgac gaggacgagg tggagcttga tttggtgccg 420

tccaagtttg caactccggg ggccagagcc tggcagacca ccaacgatac tacgtcttac 480

gtggggtgga tgccatggag gcactacacg tcaacgtctg tcaactgcat cgtcgaggag 540

gtggaggcgc ggtccgtcta cccctacgac tccttcgccc tgtccaccgg tgatattgtg 600

tacgcgtctc cgttttacgg cctgagggct gccgctcgca tagagcacaa tagctacgcg 660

caggagcgtt tcaggcaagt tgaagggtac aggccccgcg acttagacag taaactacaa 720

ggaggaggag gatctggagg aggaggatct cgctataact atacaatttt aacaagatac 780

aacgcgactg cgctagcatc accgtttatt aacgaccaag taaaaaatgt tgacttgcgg 840

attgttactg ctacgcgccc atgtgaaatg atagcgctga tcgctaagac aaacatagac 900

tcaatcctga aggagctggc cgctgcccaa aaaacttatt ccgccagact cacctggttt 960

aaaattatgc caacgtgtgc aacgcctata cacgatgtta gttatatgaa atgcaacccg 1020

aagctatcat ttgcaatgtg tgatgagaga tcagacatac tatggcaagc tagtttaatt 1080

actatggctg ctgaaactga cgatgaactt ggacttgtac tggcagcccc tgcacattct 1140

gcctcgggac tgtatcgccg tgttatagaa atcgacggaa ggcgaattta cacggacttt 1200

tctgtaacta ttcccagtga acggtgtccg attgcctttg agcaaaactt tggcaatccg 1260

gatcggtgta aaactccaga gcagtactcg cggggagaag tttttacacg tcggtttctt 1320

ggtgaattca acttcccaca aggagagcat atgacatggt tgaagttctg gttcgtctac 1380

gatggtggaa acctaccagt gcagttttat gaagcccagg cattcgcaag acccgtgcct 1440

ccggataacc accctggatt tgattctgtt gagtcggaga ttacacaaaa taaaaca 1497

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccaagcttct cagactggct gtgcgcg 27

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctctagatg ttttatttta tgtaatctcc ga 32

Claims

1.一种马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白，其特征在于，所述马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：对含有权利要求1所述马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白重组载体的CHO细胞进行加压筛选和单克隆筛选，得到稳定表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的CHO细胞株，驯化为悬浮培养后进行培养，纯化得到马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白。

3.由权利要求2所述马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的制备方法构建得到的表达马疱疹病毒1型gB-gD融合蛋白的CHO细胞株。

4.一种预防马鼻肺炎的疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的融合蛋白。