CN110981968B

CN110981968B - 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗

Info

Publication number: CN110981968B
Application number: CN201911305236.5A
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 张国庆; 潘毅平; 饶婷婷; 李健友; 张子墨
Original assignee: Tiankang Pharmaceutical Suzhou Co ltd
Current assignee: Tiankang Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN110981968A

Abstract

本发明提供了一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗，涉及生物技术领域。该融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段；狂犬病病毒G蛋白片段不含有狂犬病病毒G蛋白的跨膜区；GCN4片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该融合蛋白能够形成三聚体，结构接近天然狂犬病病毒G蛋白，免疫原性好。

Description

含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)引起的传染病，所有温血动物都能感染狂犬病病毒，人多因被患病的动物咬伤而感染，临床表现为特有的恐水、怕风、咽肌痉挛等。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，单股RNA病毒，动物通过互相间的撕咬而传播病毒。我国的狂犬病主要由犬传播，家犬可以成为无症状携带者，所以表面“健康”的犬对人的健康危害很大。对于狂犬病尚缺乏有效的治疗手段，人患狂犬病后的病死率几近100％，患者一般于3～6日内死于呼吸或循环衰竭，故应加强预防措施。国外的狂犬病防控经验表明，犬狂犬病疫苗免疫覆盖率达到75％，狂犬病的发病率即可得到有效控制。

狂犬病疫苗目前包括传统灭活疫苗、弱毒活疫苗和重组活病毒载体疫苗，目前弱毒活疫苗和重组活载体疫苗仅用于野生动物免疫。灭活狂犬病疫苗按照应用不同细胞培养工艺分为Vero细胞狂犬苗、地鼠肾细胞狂犬苗、二倍体细胞狂犬苗和鸡胚细胞狂犬苗。

目前国内上市销售的人用狂犬病疫苗均为灭活疫苗，其中90％左右市场份额是Vero细胞狂犬苗。DNA残留量是Vero细胞特有的质控标准。Vero细胞几乎可以无限繁殖，可能具有致癌性，由于Vero细胞成分属于杂质，需要对Vero细胞疫苗设定杂质残留量标准。欧洲和世卫组织规定，Vero细胞狂苗DNA残留量≤10ng/剂，我国从2010版药典起规定，所有Vero细胞疫苗DNA残留量≤100pg/剂(1000pg＝1ng)，比欧洲和世卫组织的标准严格100倍。按照现有的技术水平，生产合格狂犬病灭活疫苗，对病毒培养和疫苗纯化要求高，企业生产成本高。由于2010版药典的严苛DNA残量标准，导致每年均有多批次Vero细胞狂犬苗不予签发。狂犬病弱毒活疫苗由于安全性问题，仅用于野生动物免疫。二倍体细胞狂犬苗和鸡胚细胞狂犬苗培养工艺很难实现规模化生产，产能不容易扩大，疫苗价格高，而且不同批间次的差异有时也会影响疫苗的质量。

国内动物用狂犬病灭活疫苗由于种毒、培养工艺等原因，疫苗的成本对于大规模应用群体免疫，有一定的经济压力。国内宠物狂犬病疫苗份额常年被进口疫苗垄断，一方面是过去国内动物狂犬病疫苗品质差，得不到用户信任；另一方面进口疫苗附加值高，宠物店利润高。因此一种改进的狂犬病疫苗是目前市场需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，该融合蛋白呈三聚体结构，具有较好的免疫原性。

本发明的第二目的在于提供一种上述融合蛋白的制备方法，该方法操作简单，适合大规模生产。

本发明的第三目的在于提供一种疫苗，该疫苗包含上述融合蛋白、编码该融合蛋白的基因和与融合蛋白相关的生物材料中的至少一种。

为解决所述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，该融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于所述狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段；所述狂犬病病毒G蛋白片段不含有跨膜区；所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了编码所述融合蛋白的基因。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达所述融合蛋白和/或含有编码所述融合蛋白的基因。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法，该制备方法包括在宿主中表达编码所述融合蛋白的基因。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述融合蛋白、编码所述融合蛋白的基因、所述生物材料或所述制备方法在如下(x1)～(x4)中至少一种的应用：

(x1)制备狂犬病疫苗；

(x2)制备狂犬病病毒G蛋白抗体；

(x3)制备狂犬病病毒G蛋白抗原检测试剂盒；

(x4)制备狂犬病病毒G蛋白抗体检测试剂盒。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含所述融合蛋白、编码所述融合蛋白的基因和所述生物材料中的至少一种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于所述狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段，狂犬病病毒G蛋白片段不含有跨膜区，通过在去除跨膜区的狂犬病病毒G蛋白片段的羧基端融合具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的GCN4片段，使去除了跨膜区的狂犬病病毒G蛋白片段形成三聚体，结构接近天然狂犬病病毒G蛋白结构，与天然狂犬病病毒G蛋白相似，增强融合蛋白的免疫原性。以含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白作为免疫原能够有效刺激机体产生中和抗体，从而抵抗狂犬病病毒感染。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的融合蛋白的示意图；

图2为本发明实施例提供的融合蛋白SDS-PAGE电泳结果；

图3为本发明效果例中小鼠免疫后的体重变化；

图4为本发明效果例中小鼠免疫后血清中VNA抗体含量的变化。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。所述试剂，如未特别说明，均为商业化或是已公开的试剂材料。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白。该融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于所述狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段；所述狂犬病病毒G蛋白片段不含有狂犬病病毒G蛋白的跨膜区；所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

狂犬病病毒糖蛋白G由524个氨基酸组成，是够诱导机体产生中和抗体的结构蛋白，免疫动物可以保护机体抵抗病毒的感染，是构建新型基因工程亚单位疫苗的首选靶蛋白。天然的狂犬病病毒糖蛋白G是以三聚体形式存在的跨膜蛋白，完整结构的三聚体狂犬病病毒糖蛋白能够有效诱导机体产生中和抗体，但是跨膜区的存在会导致蛋白沉淀，降低收率，而去除跨膜区的可溶性狂犬病病毒糖蛋白单体免疫原性会显著降低。本发明通过狂犬病病毒G蛋白片段的羧基端融合GCN4片段，使去除跨膜区的狂犬病病毒G蛋白片段能够形成三聚体结构，接近天然蛋白的构象，维持狂犬病病毒G蛋白的免疫原性。GCN4片段是一种亮氨酸拉链，亮氨酸拉链有利于与其融合的蛋白片段形成聚合体，可以使蛋白更有效地形成三聚体结构。

在一些优选的实施方式中，狂犬病病毒G蛋白片段的核苷酸序列为如SEQ ID NO.2所示序列，或为以SEQ ID NO.2所示序列为基础经密码子优化的序列。

本发明所述的融合于所述狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段，可以为和狂犬病病毒G蛋白片段直接连接，也可以之间相隔若干个氨基酸残基，本发明对此不作限制。狂犬病病毒G蛋白片段和GCN4片段优选通过Linker连接，Linker可以提高融合蛋白的稳定性、表达量和生物活性。Linker优选具有SEQ ID NO.3所示氨基酸序列。

在一些优选的实施方式中，为了便于融合蛋白的分离和纯化，融合蛋白中还含有标签，标签可选择本领域常规的蛋白标签，标签可以添加在融合蛋白的氨基端和/或羧基端，本发明对此不作限制。优选在融合蛋白的羧基端融合Strep-Tag标签，能够在不破坏融合蛋白的三聚体结构，维持蛋白的活性的同时，获得较好的纯化效果。

由于哺乳动物细胞表达的蛋白经翻译加工后，其结构与生物学特性更接近于天然蛋白，因此优选使用哺乳动物表达系统表达融合蛋白。使用哺乳动物表达系统表达融合蛋白时，优选将狂犬病病毒G蛋白的信号肽替换为哺乳动物分泌信号肽，使融合蛋白更容易在哺乳动物细胞中分泌表达。哺乳动物分泌信号肽优选包括VSV-G分泌信号肽，VSV-G分泌信号肽增强蛋白的分泌表达的作用较佳。

在一些优选的实施方式中，融合蛋白由CHO细胞表达。CHO细胞表达系统(Chinesehamster ovary cell system,CHO)用于表达重组蛋白，具有很多优势，重组蛋白在CHO细胞表达系统中具有准确的转录后修饰功能，其分子结构、理化性质和生物学功能等方面更接近于天然蛋白分子，并且能够分泌表达，有利于后期蛋白的纯化。因此用CHO表达系统表达融合蛋白有利于蛋白后期的纯化。此外，相对于其他哺乳动物细胞表达体系，CHO细胞的转染机制更为明确，可以高效的稳定转染；可以在染色体活跃位点整合较长的DNA片段，同时还具有长而稳定的基因表达期。CHO细胞系优选CHO细胞的亚克隆CHO-K1细胞系，CHO-K1能够使目的蛋白发生转录后糖基化修饰，提高生物学活性。

在一些优选的实施方式中，融合蛋白由氨基端至羧基端依次为VSV-G分泌信号肽、狂犬病病毒G蛋白片段、Linker、GCN4片段和Strep-Tag标签，具有该结构的融合蛋白能够形成三聚体，与天然狂犬病病毒G蛋白相似，具有较佳的免疫原性；同时在哺乳动物表达系统中具有较高的表达量，容易纯化。具有上述结构的融合蛋白的氨基酸序列优选为SEQ IDNO.4所示序列，核苷酸序列优选为SEQ ID NO.5所示序列。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了编码上述融合蛋白的基因。所述基因优选为如SEQ ID NO.5所示序列，或为和SEQ ID NO.5所示序列90％以上同源性的序列。其中“同源性”指的是核苷酸序列与SEQ ID NO.5所示序列的相似性。通过核苷酸的缺失、突变、减少或增加导致序列与SEQ ID NO.5所示序列有一定的差异，但是至少90％以上相似，具有相同功能的核酸序列，为和SEQ ID NO.5所示序列90％以上同源性的序列。所述同源性例如可以为但不限于为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料能够表达融合蛋白，和/或含有上述编码融合蛋白的基因。即所述生物材料可以含有上述编码融合蛋白的基因并表达所述融合蛋白；也可以只含有上述编码融合蛋白的基因。

在一些可选的实施方式，所述生物材料包括含有上述编码融合蛋白的基因的表达盒，表达盒指的是由调控元件和编码融合蛋白基因的核酸序列组成的核酸构建体，其中调控元件包括但不限于为启动子、终止子、增强子、核糖体结合位点以及其他调控元件。

在一些可选的实施方式中，所述生物材料包括含有编码融合蛋白的基因的载体，“载体”指的是能够使上述基因在宿主中进行复制或者表达，或者能够将上述基因整合进入宿主细胞中的介质，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。优选使用真核表达载体UCOE，该载体能够有效防止基因沉默，持续稳定、高水平地表达目的基因，进而提高融合蛋白在宿主中的表达量。

在一些可选的实施方式中，所述生物材料包括重组微生物，所述重组微生物中含有编码融合蛋白的基因的载体，所述基因能够在微生物中克隆，以增加基因的拷贝量。

在一些可选的实施方式中，所述生物材料包括细胞系，所述细胞系中含有编码融合蛋白的基因的表达载体，所述细胞系能够表达融合蛋白。所述细胞系优选CHO细胞系，更优选CHO-K1细胞系。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法，该制备方法包括在宿主中表达编码所述融合蛋白的基因。该方法操作简单，适合大规模生产融合蛋白。为了使融合蛋白的结构更接近天然蛋白，优选使用哺乳动物表达系统表达蛋白。

在一些优选的实施方式中，将含有编码所述融合蛋白基因的表达载体导入宿主细胞中，然后对宿主细胞进行处理，得到表达述融合蛋白的宿主细胞；所述处理包括加压筛选、单克隆化和悬浮驯化中的至少一种。加压筛选能够促进宿主细胞更多的表达外源蛋白，提高融合蛋白的表达量。单克隆化是分离单个细胞，使其增殖产生的后代都是来源于同一个细胞的技术手段。单克隆化能够筛选出高效表达融合蛋白的细胞，并只增殖能够高效表达融合蛋白的细胞，单克隆化能够提高目的蛋白的产量。悬浮驯化能够使贴壁的宿主细胞悬浮培养，悬浮培养能够使细胞的比表面积更高，提高生物反应器中的传质和传热的效率和生物反应器空间使用效率，降低生产成本。根据宿主细胞的特性，加压筛选、单克隆化和悬浮驯化可以择一使用，也可以同时应用多种处理方式，例如将表达载体导入宿主细胞后，经加压筛选和单克隆化处理后，得到表达融合蛋白的宿主细胞。宿主优选使用CHO细胞表达，CHO表达系统具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物的分离纯化等优点。

在一些优选的实施方式中，使用CHO-K1细胞制备融合蛋白，优选按照如下方法制备：

(a)提供含编码所述融合蛋白基因的表达载体，表达载体优选真核表达载体UCOE，含有UCOE转录调控元件的真核双表达载体UCOE，能够有效防止目的基因沉默，极大地提高了哺乳动物细胞中蛋白表达量，减少筛选工作量，节省人力物力。

(b)将含有编码狂犬病病毒G蛋白基因序列的重组质粒线性化，进而转染CHO-K1贴壁细胞。

(c)通过细胞培养、加压筛选、单克隆化、悬浮驯化步骤，得到高效稳定表达融合蛋白的CHO-RVGt悬浮细胞株。

(d)发酵培养并工艺放大步骤(c)中CHO-RVGt悬浮细胞株，纯化后得到融合蛋白。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述融合蛋白、所述编码融合蛋白的基因、所述生物材料或所述制备方法在如下(x1)～(x4)中至少一种的应用：(x1)制备狂犬病疫苗，融合蛋白及编码其的基因，和与其相关的生物材料可以作为狂犬病疫苗的活性成分，使机体产生免疫应答，保护机体免受狂犬病的侵害。(x2)制备狂犬病病毒G蛋白抗体，融合蛋白可以作为抗原，用于生产狂犬病病毒G蛋白抗体。(x3)制备狂犬病病毒G蛋白抗原检测试剂盒：(x2)中制备得到的抗体可以进一步用于制备狂犬病病毒G蛋白抗原检测试剂盒，本发明提供的融合蛋白也可以作为抗原检测试剂盒中的质控品和对照品。(x4)制备狂犬病病毒G蛋白抗体检测试剂盒：本发明提供的融合蛋白可以作为抗体检测试剂盒中的反应抗原；(x2)中制备得到的抗体可以用于作为抗体检测试剂盒中的质控品和阳性对照。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含上述融合蛋白、编码融合蛋白的基因和上述生物材料中的至少一种。可选地，所述疫苗为亚单位疫苗，所述疫苗以融合蛋白为主要活性物质；可选地，所述疫苗为DNA疫苗，所述疫苗以编码融合蛋白的基因为主要活性物质，DNA疫苗的活性物质可以包含编码融合蛋白的基因的质粒。在一些可选的实施方式中，疫苗可以为多联疫苗，除含有上述融合蛋白、编码融合蛋白的基因和上述生物材料中的至少一种，还可以含有其他致病性微生物的抗原，或者能够表达其他致病性微生物的抗原的物质等。本发明提供的疫苗还可以包括本领域的常规辅料，例如免疫佐剂、稳定剂和保护剂等，本发明对此不作限制。

在一些优选的实施方式中，疫苗是以融合蛋白作为主要活性物质的亚单位疫苗，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受狂犬病病毒的攻击。亚单位疫苗优选以氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的融合蛋白作为主要活性物质，并更优选以CHO细胞表达的融合蛋白作为主要活性物质。该亚单位疫苗缓解了目前亚单位疫苗普遍存在的生产成本高、免疫原性不及弱毒疫苗及灭活疫苗的缺陷，提高了狂犬病疫苗的免疫效力，减少了免疫次数和免疫剂量，缓解了免疫后的各种不良反应等问题。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例中的试剂及药品的来源列单如下：

CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；

细胞培养基购自美国HyClone公司；

细胞培养血清购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；

真核表达载体UCOE购自Merck公司，货号为Cat#.5.04867.001；

Lipofectamine 3000试剂购自美国Invitrogen公司；

嘌呤霉素、潮霉素均购自美国Gibco公司。

实施例1

(一)表达含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白的重组表达载体的构建：

将N端信号肽19个氨基酸对应的57个核苷酸序列缺失，替代为VSV-G信号肽48个核苷酸序列，与狂犬病病毒G蛋白片段基因序列融合，C端再通过Linker融合GCN4片段，如图1所示。经偏嗜性密码子优化后，在基因两端插入酶切位点Nhe I和Sal I，送往公司进行基因合成。将这个序列亚克隆入载体UCOE中，获得重组质粒UCOE-Puro-RVGt和UCOE-H-RVGt。

(二)融合蛋白在CHO-K1细胞中的表达检测：

2.1CHO-K1贴壁细胞转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DME/F-12(含2.5％血清)、DME/F-12(含10％血清)与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(T25细胞培养瓶)，用5mL移液管吸弃细胞上清，取5mL预热的PBS轻轻润洗细胞一次，并弃去PBS。

(3)每个T25细胞培养瓶中加入500μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，间隙变大，并呈单个细胞，吸弃胰酶，每个T25细胞培养瓶中加入5mL含有10％FBS的DME/F-12培养基终止消化反应，并用移液管吹散细胞。

(4)取适量细胞悬液与台盼蓝染液按照1:1比例混合，计数和观察。

(5)待细胞活力≥90％时，稀释细胞至1.5×10⁵/mL，接种2mL至6孔细胞培养板中，6孔板置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。

(6)从细胞培养箱中取出6孔板，显微镜下观察细胞状态，当细胞汇合率达到50％左右时即可开始转染，转染前将细胞培养基更换成含有2.5％FBS的DME/F-12，1.5mL/孔。

(7)按照Lipofectamine 3000使用说明书配制DNA-Lip3000混合物，进行转染。

(8)将6孔板置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

2.2加压筛选

转染48h后对转染细胞进行加压处理，从37℃培养箱中取出6孔板细胞，弃去细胞培养上清，6孔板中每孔加入2mL DME/F-12(含10％FBS，2μg/mL Puromycin，200μg/mLHygromycin B)，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养，待细胞铺满单层，将细胞传代至T25细胞培养瓶中。

2.3单克隆筛选

(1)加压细胞传代2-3次，至阴性对照无细胞存活时，利用有限稀释法进行单克隆筛选。

(2)吸弃培养上清，每个T25细胞培养瓶中加入500μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，间隙变大，并呈单个细胞，吸弃胰酶，每个T25细胞培养瓶中加入5mL DME/F-12(含10％FBS，2μg/mL Puromycin，200μg/mL HygromycinB)培养基终止消化反应，并用移液管吹散细胞。

(3)取适量细胞悬液与台盼蓝染液按照1:1比例混合，计数和观察。

(4)待细胞活力≥90％时，按照每孔1个细胞的量配制细胞悬液，取200μL细胞悬液加入至96孔板中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

(5)记录单个细胞的孔。

(6)待细胞汇合率≥90％时，取单克隆细胞上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存，同时收获上清进行ELISA检测。

(三)阳性单克隆细胞株悬浮驯化

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DME/F-12(含10％血清)、Hycell(含8mMGlutaMAX)与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。

取细胞培养基DME/F-12(含10％血清)300mL和Hycell(含8mM GlutaMAX)100mL按照3:1的比例配置400mL细胞驯化用培养基。

取细胞培养基DME/F-12(含10％血清)300mL和Hycell(含8mM GlutaMAX)100mL按照1:1的比例配置400mL细胞驯化用培养基。

取细胞培养基DME/F-12(含10％血清)300mL和Hycell(含8mM GlutaMAX)100mL按照1:3的比例配置400mL细胞驯化用培养基。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(T75细胞培养瓶)，用10mL移液管吸弃细胞上清，取10mL预热的PBS轻轻润洗细胞一次，并弃去PBS。

(3)每个T75细胞培养瓶中加入1mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，间隙变大，并呈单个细胞，吸弃胰酶，每个T75细胞培养瓶中加入15mL含有10％FBS的DME/F-12培养基终止消化反应，并用移液管轻轻吹散细胞。

(5)待细胞活力≥90％时，稀释细胞至5×10⁵/mL，接种20mL至一个125mL摇瓶中，摇瓶置于振荡摇床培养箱中培养，培养参数：37℃，5％CO₂，100rpm。

(6)每隔24h计数细胞密度及活力。

(7)按照Hycell(含8mM GlutaMAX)细胞悬浮驯化的说明书驯化细胞。

(四)狂犬病病毒G蛋白纯化与鉴定

4.1融合蛋白纯化

(1)收获细胞培养上清，4℃，10000rpm离心10min，去细胞碎片。

(2)使用Ni+亲和层析柱进行纯化，纯化蛋白用生理盐水进行透析。

(3)使用SDS-PAGE和Western Blot对其进行鉴定。鉴定结果表明：纯化产物经SDS-PAGE电泳后，目的蛋白片段与预期大小相符，见图2。

4.2SDS-PAGE和免疫印迹

(1)蛋白质凝胶电泳：SDS-PAGE胶为上层5％浓缩胶和下层10％分离胶，以100V电压、400mA条件电泳10min，然后以150V电压、400mA电泳1h。

(2)免疫印迹：将样品经SDS-PAGE凝胶分离后在转膜缓冲液中转至PDVF膜中，转膜条件为100V电压、400mA电流1h，PDVF膜经封闭和孵育RVGt蛋白的单克隆抗体作用4h后，加入HRP标记二抗稀释液，室温孵育2h，经PBST清洗三次，每次10min，最后利用DAB显色液进行显色检测。

实施例2

融合蛋白亚单位疫苗的制备：

将实施例1中纯化得到的蛋白使用PBS溶液稀释，将稀释后的蛋白溶液与SEPPIC201佐剂按1：1比例混合在一起，按照现行版中国兽药典附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于4℃备用。

效果例

1.1动物实验设计

确定了本实验中的免疫剂量，将6周龄的雌性Balb/c小鼠随机分组，Balb/c小鼠免疫融合蛋白亚单位疫苗分组情况见表1。每组5只，编号为1～5组，其中第5组为空白对照组，不进行疫苗注射，1～4组为实验组，分别注射2种疫苗(RV-Gt为含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，RV-G为杆状病毒表达的狂犬病病毒单体蛋白)，剂量为0.2mL/只(抗原蛋白含量10μg)。免疫前两天眼眶取血，作为免疫前对照。取血方法为眼眶取血。取得的血置于1.5mL EP管中，于37℃水浴放置1h，4℃放置2h，3000rpm，4℃离心3min，分离上清，分装后放于-20℃保存。首免后21天，采血，分离血清；然后进行二次免疫，免疫剂量0.2mL/只(抗原蛋白含量10μg)。二免后14天，采血，分离血清，方法同上。

表1Balb/c小鼠免疫融合蛋白亚单位疫苗分组情况

1.2小鼠免疫后体重变化

免疫全程，每日观察并记录小鼠体重变化，检验亚单位疫苗的安全性，结果见图3。实验组小鼠仅在免疫后2-3日，体重稍有减少，之后恢复体重并很快与未免疫对照组体重相当。表明本实施例2提供的亚单位疫苗用于疫苗免疫，安全性较好。

1.3小鼠免疫后VNA抗体水平(CVS-eGFP方法检测)。

材料及处理方法：

(1)CVS-eGFP病毒，TCID₅₀为10^5.8/ml，试验需要100个TCID₅₀/50μl，该病毒需要稀释200倍用，稀释方法15ml MEM中加入75μl病毒。

(2)BHK细胞，试验需要细胞液浓度为4×10⁵-5×10⁵个/ml。

(3)阳性血清，狂犬病病毒抗体效价为10.26IU/ml，-30℃保存，需要稀释到0.5IU/ml，稀释20倍使用。

(4)待检血清。处理方法：56℃灭活30分钟，加入10％体积的沙星4℃过夜，-30℃保存。

(5)2％MEM培养液。

试验步骤：

(1)将血清进行3倍梯度稀释。每孔先加入100μl MEM，第一列每孔加入50μl血清，3倍稀释至第6列(抗体效价高的可增加几个梯度)，做4个重复。

(2)每孔加入50μl稀释好的CVS-eGFP。(病毒对照中每孔加入150μl MEM，第一列每孔加50μl稀释好的病毒做4倍梯度稀释，稀释至第6列，做4个重复。细胞对照中不加病毒。)

(3)37℃，5％CO₂温箱中感作1小时。

(4)感作后每孔加入50μl消化稀释好的BHK细胞。

(5)37℃，5％CO₂温箱中感作48小时。

(6)荧光显微镜下观察。

(7)计算抗体效价。

试验结果：

首免后21天，免疫组小鼠，收集血清，进行VNA抗体检测，RV-Gt组比RV-G组抗体水平稍高，RV-G蛋白免疫后21天，小鼠血清中VNA抗体滴度>2IU。首免后21天，RV-Gt和RV-G组分别有一组小鼠进行2次免疫，二免后14天，采集小鼠血清，进行VNA抗体检测，结果见图4。二免后14天，两次免疫组RV-Gt组较RV-G组VNA抗体滴度高，且差异极显著；免疫后第35天，一次免疫组RV-Gt组较RV-G组VNA抗体滴度高，且差异显著。综上，本发明提供的含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白RV-Gt，具有更好的免疫原性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康生物(上海)有限公司

天康生物股份有限公司

<120> 含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr

1 5 10 15

His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg

20 25 30

<210> 2

<211> 1320

<212> DNA

<213> 狂犬病病毒（Rabies Virus）

<400> 2

atgaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagtcc gattgacata 60

catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac caacctgtca 120

gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatcttag ccataaaagt gaacgggttc 180

acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta acttcgttgg ttatgtcaca 240

accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc cgcgtacaac 300

tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta ccctgactac 360

cgctggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc tccaagtgtg 420

gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctag cgggaagtgc 480

tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac catttggatg 540

cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta cctccagtag agggaagaga 600

gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata taagtcttta 660

aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat ggatggaaca 720

tgggtctcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccgataa gttggtgaac 780

ctgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt ggtcaggaag 840

agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt gagtttcaga 900

cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac catattcaac 960

aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtcg aaacttggaa tgagatcctc 1020

ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa cggggtgttt 1080

ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat gcaatcatcc 1140

ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt gcaccccctg 1200

gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt tgaagttcac 1260

cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa ctgggggaag 1320

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 4

<211> 516

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys

1 5 10 15

Met Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser

20 25 30

Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu

35 40 45

Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys

50 55 60

Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly

65 70 75 80

Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr

85 90 95

Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg

100 105 110

Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser

115 120 125

Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val Lys Thr

130 135 140

Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp Leu Asp

145 150 155 160

Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly Lys Cys

165 170 175

Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr

180 185 190

Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys Asp Ile

195 200 205

Phe Thr Ser Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu Thr Cys

210 215 220

Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys

225 230 235 240

Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr

245 250 255

Trp Val Ser Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp

260 265 270

Lys Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu

275 280 285

Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu

290 295 300

Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His

305 310 315 320

Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn

325 330 335

Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Glu Thr Trp

340 345 350

Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly Arg Cys

355 360 365

His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro

370 375 380

Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln

385 390 395 400

His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His Pro Leu

405 410 415

Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe

420 425 430

Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly Val Asp

435 440 445

Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Gln Ile

465 470 475 480

Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn

485 490 495

Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg Trp Ser His Pro

500 505 510

Gln Phe Glu Lys

515

<210> 5

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaagtgcc tgctgtacct ggccttcctg ttcatcggcg tgaactgcat gaagttcccc 60

atctacacca tccccgacaa gctgggcccc tggagcccca tcgacatcca ccacctgagc 120

tgccccaaca acctggtggt ggaggacgag ggctgcacca acctgagcgg cttcagctac 180

atggagctga aggtgggcta catcctggcc atcaaggtga acggcttcac ctgcaccggc 240

gtggtgaccg aggccgagac ctacaccaac ttcgtgggct acgtgaccac caccttcaag 300

aggaagcact tcaggcccac ccccgacgcc tgcagggccg cctacaactg gaagatggcc 360

ggcgacccca ggtacgagga gagcctgcac aacccctacc ccgactacag gtggctgagg 420

accgtgaaga ccaccaagga gagcctggtg atcatcagcc ccagcgtggc cgacctggac 480

ccctacgaca ggagcctgca cagcagggtg ttccccagcg gcaagtgcag cggcgtggcc 540

gtgagcagca cctactgcag caccaaccac gactacacca tctggatgcc cgagaacccc 600

aggctgggca tgagctgcga catcttcacc agcagcaggg gcaagagggc cagcaagggc 660

agcgagacct gcggcttcgt ggacgagagg ggcctgtaca agagcctgaa gggcgcctgc 720

aagctgaagc tgtgcggcgt gctgggcctg aggctgatgg acggcacctg ggtgagcatg 780

cagaccagca acgagaccaa gtggtgcccc cccgacaagc tggtgaacct gcacgacttc 840

aggagcgacg agatcgagca cctggtggtg gaggagctgg tgaggaagag ggaggagtgc 900

ctggacgccc tggagagcat catgaccacc aagagcgtga gcttcaggag gctgagccac 960

ctgaggaagc tggtgcccgg cttcggcaag gcctacacca tcttcaacaa gaccctgatg 1020

gaggccgacg cccactacaa gagcgtggag acctggaacg agatcctgcc cagcaagggc 1080

tgcctgaggg tgggcggcag gtgccacccc cacgtgaacg gcgtgttctt caacggcatc 1140

atcctgggcc ccgacggcaa cgtgctgatc cccgagatgc agagcagcct gctgcagcag 1200

cacatggagc tgctggagag cagcgtgatc cccctggtgc accccctggc cgaccccagc 1260

accgtgttca aggacggcga cgaggccgag gacttcgtgg aggtgcacct gcccgacgtg 1320

cacaaccagg tgagcggcgt ggacctgggc ctgcccaact ggggcaaggg cggcggcggc 1380

agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcat gaagcagatc 1440

gaggacaaga tcgaggagat cctgagcaag atctaccaca tcgagaacga gatcgccagg 1500

atcaagaagc tgatcggcga gaggtggagc cacccccagt tcgagaag 1548

Claims

1.一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于所述狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段；所述狂犬病病毒G蛋白片段不含有跨膜区；所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述狂犬病病毒G蛋白片段和GCN4片段通过Linker连接；

所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述融合蛋白由哺乳动物表达系统表达；

所述融合蛋白的信号肽为哺乳动物分泌信号肽；

所述哺乳动物分泌信号肽包括VSV-G分泌信号肽；

所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述狂犬病病毒G蛋白片段的核苷酸序列为如SEQ ID NO.2所示序列，或为以SEQ ID NO.2所示序列为基础经密码子优化的序列。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还含有标签。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述标签包括Strep-Tag。

5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的羧基端含有Strep-Tag标签。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由CHO细胞表达。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由CHO-K1细胞表达。

8.根据权利要求3-7任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由氨基端至羧基端依次为VSV-G分泌信号肽、狂犬病病毒G蛋白片段、Linker、GCN4片段和Strep-Tag标签。

9.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

10.编码权利要求1-9任一项所述融合蛋白的基因。

11.根据权利要求10所述的基因，其特征在于，编码所述融合蛋白的基因为如SEQ IDNO.5所示序列。

12.生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达权利要求1-9任一项所述融合蛋白和/或含有权利要求10或11所述的基因。

13.根据权利要求12所述的生物材料，其特征在于，所述载体包括真核表达载体UCOE；

所述细胞系包括CHO细胞。

14.根据权利要求13所述的生物材料，其特征在于，所述细胞系包括CHO-K1细胞。

15.权利要求1-9任一项所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括在宿主中表达编码所述融合蛋白的基因。

16.根据权利要求15所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，使用哺乳动物表达系统表达所述融合蛋白。

17.根据权利要求15所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，提供包含编码所述融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入宿主细胞，然后对宿主细胞进行处理，得到表达所述融合蛋白的宿主细胞；所述处理包括加压筛选、单克隆化和悬浮驯化中的至少一种。

18.根据权利要求15所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，使用CHO细胞表达所述融合蛋白。

19.根据权利要求15所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，使用UCOE载体表达所述融合蛋白。

20.根据权利要求15所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，使用CHO-K1细胞表达融合蛋白，提供包含编码所述融合蛋白基因的表达载体，将所述表达载体导入CHO-K1细胞中，对CHO-K1细胞依次进行加压筛选、单克隆化和悬浮驯化，得到表达所述融合蛋白的CHO-K1细胞。

21.权利要求1-9任一项所述融合蛋白、权利要求10或11所述的基因、权利要求12-14任一项所述的生物材料或权利要求15-20任一项所述的制备方法在如下（x1）~（x4）中至少一种的应用：

（x1）制备狂犬病疫苗；

（x2）制备狂犬病病毒G蛋白抗体；

（x3）制备狂犬病病毒G蛋白抗原检测试剂盒；

（x4）制备狂犬病病毒G蛋白抗体检测试剂盒。

22.疫苗，其特征在于，包含权利要求1-9任一项所述融合蛋白、权利要求10或11所述的基因和权利要求12-14任一项所述的生物材料中的至少一种。

23.根据权利要求22所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括所述融合蛋白。

24.根据权利要求22所述的疫苗，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

25.根据权利要求22所述的疫苗，其特征在于，所述融合蛋白包括CHO细胞表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的融合蛋白。