CN114921481B - 一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114921481B
CN114921481B CN202210180202.3A CN202210180202A CN114921481B CN 114921481 B CN114921481 B CN 114921481B CN 202210180202 A CN202210180202 A CN 202210180202A CN 114921481 B CN114921481 B CN 114921481B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
rabies virus
mrna
vaccine
trimer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210180202.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114921481A (zh
Inventor
张梦玲
胡洋洋
金侠
范铁炯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Serum Bio-Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Serum Bio-Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Serum Bio-Technology Co ltd filed Critical Shanghai Serum Bio-Technology Co ltd
Priority to CN202210180202.3A priority Critical patent/CN114921481B/zh
Publication of CN114921481A publication Critical patent/CN114921481A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114921481B publication Critical patent/CN114921481B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法。一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗，其特征在于：所述的疫苗包括：用于表达狂犬病病毒优化的免疫原mRNA，所述的免疫原为G蛋白、G△TM蛋白、Gtrimer蛋白、M蛋白、Gtrimer蛋白和M蛋白的抗原组合；疫苗载体，所述的疫苗载体为可被mRNA利用的脂质体纳米颗粒。本发明的主要优点在于：（1）首次选择狂犬病病毒的G蛋白胞外域、G蛋白三聚体结构作为抗原研发由脂质体纳米颗粒包裹的修饰性mRNA疫苗；（2）首次研发基于表达M蛋白和G蛋白的mRNA疫苗联合免疫的狂犬病病毒疫苗；（3）研发的四种狂犬病病毒mRNA疫苗均有效诱导高效的中和抗体反应。

Description

一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法。
背景技术
狂犬病是一种由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)传播的人畜共患病，人患狂犬病主要由被患病的狗咬伤或抓伤所致，发病后死亡率高达100％，是病死率最高的传染病之一。全球每年有5.9-6.1万人死于狂犬病，涉及到150多个国家，每年全球因为狂犬病造成的直接和间接经济损失高达近86亿美元(约合544亿人民币)，给人类公共卫生带来了很大的负担。
狂犬病毒一般通过携带狂犬病毒的动物(犬类为主)进行传播，病毒从动物的唾液通过咬伤的伤口感染宿主。该病毒具有高度嗜神经性，可直接进入中枢神经，潜伏期5天到1年之间。在出现临床症状之前无可靠有效的手段检测是否被感染狂犬病毒。感染者早期会感到伤口发热和刺痛，随着病程的进展，患者会出现异常躁动、意识障碍和痉挛等行为，数天后死亡。
目前尚无特异性药物治疗狂犬病，只能借助于疫苗进行预防和控制。狂犬疫苗研究历史悠久。现有的狂犬疫苗研发平台有多种，灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒的载体类疫苗以及病毒样颗粒疫苗。人用狂犬神经组织疫苗是利用感染狂犬病兔子的脊髓制备而成，因为无法保证灭活的一致性和致敏性等问题，这种神经源性疫苗在使用了近一个世纪后被替代。狂犬鸡胚疫苗培养条件苛刻，容易发生病毒污染影响大规模生产。利用细胞培养狂犬疫苗，如人二倍体细胞和Vero细胞等，尽管比较安全和有效，但是灭活疫苗多次接种、生产周期较长以及费用高等因素限制了该类疫苗的使用，因此需要更加经济、安全、高效的狂犬疫苗来替代当前使用的疫苗。
狂犬病病毒(Rabies virus,RV)是属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)的一类包膜病毒，包含一条12kb长的单股负链RNA基因组，编码5个结构蛋白：核蛋白(nucleoprotein，N)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基质蛋白(matrix protein，M)、表面糖蛋白(glycoprotein，G)和RNA多聚酶(RNA polymerase，L)。狂犬病病毒颗粒类似子弹形状，表面分布着G蛋白的三聚体结构，N、P和L蛋白结合在基因组RNA上，参与RNA的复制和翻译。G蛋白是一个65KDa的糖蛋白，是病毒表面蛋白的主要成员，具有诱导细胞免疫和体液免疫的抗原决定簇，是诱导中和抗体的最主要分子靶点。针对G蛋白的单克隆抗体和疫苗能够为宿主提供有效保护，被广泛应用于疫苗的研发中。选择恰当的免疫原和表达系统是疫苗研发中的两个重要技术难点。
综上所述，本领域迫切需要开发新型、高效狂犬病疫苗，它们可以诱导产生针对狂犬病毒的保护性抗体。
发明内容
本发明为克服现有技术的不足，提供一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法，不但具有安全性高、免疫原性强以及易于生产等特点，而且具有技术先进性。
为实现上述目的，设计一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗，其特征在于：所述的疫苗包括：
(1)用于表达狂犬病病毒优化的免疫原mRNA，所述的免疫原为G蛋白、G△TM蛋白、Gtrimer蛋白、M蛋白、Gtrimer蛋白和M蛋白的抗原组合；
(2)疫苗载体，所述的疫苗载体为可被mRNA利用的脂质体纳米颗粒。
所述的G蛋白为糖蛋白全长；GΔTM蛋白为糖蛋白的膜外部分；Gtrimer蛋白为糖蛋白三聚体；M蛋白为膜蛋白。
所述的狂犬病病毒选自以下组：PV株、Flury株、SAD株、aG株、CTN株及它们的衍生株或其多种组合。
所述的优化的mRNA序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5所示。
所述的mRNA序列，具有下面结构：A1-A2-A3-A4-A5-A6：
A1为5’帽子结构，优选为Cap1结构；
A2为5’UTR元件；
A3为信号肽编码序列，优选为IgE信号肽编码序列；
A4为狂犬病病毒抗原编码序列，其中狂犬病病毒抗原选择G蛋白、G△TM蛋白、Gtrimer蛋白和M蛋白；
A5为3’UTR元件
A6为poly(A)尾巴结构，优选为101个A。
所述的脂质体纳米颗粒包括PEG修饰的阳离子脂质、中性脂质、阳离子脂质和胆固醇或者胆固醇类似物。
所述的脂质体纳米颗粒平均粒径在10-500nm范围内，优选范围为50-120nm。
所述的脂质体纳米颗粒与优化的mRNA质量比为10-30:1。
所述的阳离子脂质包括但不限于Dlin-MC3-DMA、DODMA、DODAP、ALC-0315或SM102。
所述的G蛋白和M蛋白的组合比例为1-3:1。
一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗的制备方法，具体流程如下：
S1，以人为宿主对抗原基因序列进行密码子优化，合成相应的抗原表达基因，得到G蛋白、G△TM蛋白、Gtrimer蛋白和M蛋白四种狂犬病病毒抗原表达基因；
S2，将四种狂犬病病毒抗原表达基因分别克隆入质粒载体5′UTR-IgE-3’UTR-pok12上，获得四个对应的重组质粒；
S3，制备四种mRNA；
S4，分别将四种mRNA转染至293T细胞中；
S5，Western-Blot检测蛋白表达；
S6，利用乙醇分别将D-Lin-MC3-DMA、DSPC、cholesterol和14:0PEG2000 PE四种纸质溶解；
S7，以一定的摩尔比例进行混合，制得脂质混合物，所述的D-Lin-MC3-DMA:
DSPC:cholesterol:(14:0PEG2000 PE)＝50:10:38.5:1.5；
S8，将脂质混合物和溶有mRNA的柠檬酸盐缓冲液分别加入到NanoAssemblrTM机器的两个入口通道中，收集mRNA-LNP混合物，获得疫苗。
步骤S3中制备四种mRNA的具体流程：
S31，利用PCR扩增目的片段作为体外转录模板，使用NEB公司的体外转录试剂盒进行体外转录，同时将UTP完全替换成修饰性核苷酸；
S32，反应结束后，利用DNA酶消化以去除反应中DNA；
S33，利用LiCL沉淀RNA的方法去除RNA中的蛋白和盐等杂质；
S34，利用NEB公司的Cap1加帽试剂盒和加尾试剂盒分别进行加帽和加尾，获得相应的mRNA。
修饰性核苷酸为假尿苷三磷酸；加帽试剂盒为mRNA Cap2′-O-Methyltransferase和Vaccinia Capping System试剂盒；加尾试剂盒为E.coli Poly(A)Polymerase。
步骤S4中转染四种mRNA至293T细胞中的具体流程：
S41，将293T细胞复苏，待其达到90-100％密度时，接种细胞于6孔板中；
S42，待12小时后细胞长到90％的密度，将培养基换成无血清的培养基通过转染试剂盒Lipofectamine转染mRNA到293T细胞中；
S43，用10％ FBSDMEM培养基培养细胞，转染24小时后开始收取细胞；
S44，通过Western-blot染色技术分析mRNA表达蛋白的水平，未转染的细胞作为阴性对照。
步骤S5中Western-Blot检测蛋白表达的具体流程：
S51，转染后24小时后，收集细胞，加入1×SDS-PAGE上样缓冲液，样本置于100℃金属浴中变性10min；
S52，将加热变性后的样本加入到制备成型的SDS-PAGE胶中，在120V条件下电泳80min；
S53，电泳结束后，100V转膜1h；5％牛奶作为封闭液，室温封闭1h，TBST洗脱液洗涤三次；抗6*His标签抗体作为一抗(1:10000)，室温缓慢震荡2h，TBST洗脱液洗涤三次；碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG(1:10000)作为二抗，室温缓慢震荡1h，TBST洗脱液洗涤三次；加入底物染色液，反应终止后对膜进行拍照。
一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗的用途，其特征在于：
(1)预防狂犬病病毒感染；
(2)在施用对象体内诱导产生针对狂犬病病毒的特异性免疫反应。
本发明的主要优点在于：(1)首次选择狂犬病病毒的G蛋白胞外域、G蛋白三聚体结构作为抗原研发由脂质体纳米颗粒包裹的修饰性mRNA疫苗；(2)首次研发基于表达M蛋白和G蛋白的mRNA疫苗联合免疫的狂犬病病毒疫苗；(3)研发的四种狂犬病病毒mRNA疫苗均有效诱导高效的中和抗体反应。
附图说明
图1为狂犬病病毒抗原重组质粒鉴定图。如图，PCR产物的凝胶电泳图从左到右依次是RABV-G、RABV-G△TM、DNA marker、RABV-Gtrimer和RABV-M。
图2为RABV-mRNA在293T细胞中蛋白表达量显示图。如图，利用转染试剂转染制备的mRNA到293T细胞中表达目的蛋白，用6*His抗体染色，Western-Blot条带从左到右依次是从左到右依次是RABV-G、RABV-G△TM、DNA marker、RABV-Gtrimer和RABV-M。
图3为RABV mRNA-LNP疫苗粒径分析曲线图。利用Zetasizer Lab仪器测量脂质体纳米颗粒的粒径分布。
图4为RABV mRNA疫苗在小鼠中诱导的结合抗体水平显示图。
图5为RABV mRNA疫苗在小鼠中诱导的中和抗体水平显示图。
具体实施方式
下面根据附图对本发明做进一步的说明。
1.细胞、病毒和抗体：
293T细胞和BHK21细胞，用含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO)进行培养。选择的狂犬病病毒毒株为PV株。
鼠抗6*His标签单克隆抗体购自proteintech公司。
2.构建重组质粒：
本发明基于狂犬病病毒毒株抗原序列设计mRNA疫苗。首先以人为宿主对抗原基因序列进行密码子优化，在金斯瑞生物公司合成相应的抗原表达基因(四种蛋白的制备)；然后利用同源重组试剂盒将上述合成的四种狂犬病病毒抗原表达基因分别克隆入质粒载体5’UTR-IgE-3’UTR-pok12上，获得四个对应的重组质粒。
3.mRNA制备和表达蛋白鉴定：
利用PCR扩增目的片段作为体外转录模板，使用NEB公司的体外转录试剂盒进行体外转录，同时将UTP完全替换成修饰性核苷酸(假尿苷三磷酸)。反应结束后，利用DNA酶消化以去除反应中DNA；利用LiCL沉淀RNA的方法去除RNA中的蛋白和盐等杂质。然后，利用NEB公司的Cap1加帽试剂盒(mRNA Cap2ˊ-O-Methyltransferase和Vaccinia Capping System试剂盒)和加尾试剂盒(E.coli Poly(A)Polymerase)分别进行加帽和加尾，制备相应的mRNA。
4.转染HEK-293T细胞表达蛋白：
将293T细胞复苏，待其达到90-100％密度时，接种细胞于6孔板中，待12小时后细胞长到90％的密度，将培养基换成无血清的培养基通过商业化转染试剂盒Lipofectamine转染mRNA到293T细胞中，用10％ FBSDMEM培养基培养细胞，转染24小时后开始收取细胞，通过Western-blot染色技术分析mRNA表达蛋白的水平，未转染的细胞作为阴性对照(Mock组)。
5.Western-Blot检测蛋白表达：
利用Western-Blot方法检测目的蛋白的表达，具体方法如下：
转染后24小时后，收集细胞，加入1×SDS-PAGE上样缓冲液，样本置于100℃金属浴中变性10min；随后，将加热变性后的样本加入到制备成型的SDS-PAGE胶中，在120V条件下电泳80min。电泳结束后，100V转膜1h；5％牛奶作为封闭液，室温封闭1h，TBST洗脱液洗涤三次；抗6*His标签抗体作为一抗(1:10000)，室温缓慢震荡2h，TBST洗脱液洗涤三次；碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG(1:10000)作为二抗，室温缓慢震荡1h，TBST洗脱液洗涤三次；加入底物染色液，反应终止后对膜进行拍照。
6.脂质体纳米颗粒包裹mRNA：
首先分别用乙醇将这四种脂质(D-Lin-MC3-DMA、DSPC、cholesterol和14:0PEG2000 PE)溶解，并以一定的摩尔比例进行混合(D-Lin-MC3-DMA:DSPC:cholesterol:(14:0PEG2000 PE)＝50:10:38.5:1.5)；然后将脂质混合物和溶有mRNA的柠檬酸盐缓冲液分别加入到NanoAssemblrTM机器的两个入口通道中，收集mRNA-LNP混合物，所收集的mRNA-LNP经过超滤和过滤之后用于动物免疫。
7.LNP-mRNA性状和包裹率检测：
利用Quant-it RiboGreen RNA assay kit对mRNA的包裹率进行检测。取两个PCR管：A管和B管。A管中加入无变性剂的TAE和mRNA-LNP，B管中加入含有1％Triton-X100的TAE和mRNA-LNP；将A管和B管放置在室温孵育10min；将上述两个PCR管中的溶液分别加入到96孔板中，加入含有RiboGreen染料的TAE溶液。将96孔板放到多功能酶标仪中，选择荧光值(激发波长485nm,激发波长530nm)选项进行检测进行包裹率。
8.利用ELISA检测结合抗体水平：
本实验中使用Balb/c小鼠。分别在0周和2周通过肌肉注射的方式给小鼠接种两剂疫苗，每只小鼠50μl的剂量。末次接种后2周取血，分离血清用于检测疫苗诱导的体液免疫。包被抗原为灭活的狂犬抗原(狂犬病病毒固定毒aGV株，宁波荣安公司)。向96孔酶标板中每孔分别加入200倍稀释的狂犬抗原，4℃过夜孵育；用含有5％脱脂奶粉的PBST溶液对ELISA进行封闭，37℃中放置2h；以3倍梯度稀释灭活血清，弃除ELISA板中上清，向ELISA板中加入稀释好的血清，37℃中放置1h；弃除上清，使用1×PBST清洗板子3遍，加入HRP偶联的抗鼠IgG抗体，37℃中放置1h；弃除上清，使用1×PBST清洗板子3遍，加入TMB底物显色5min，然后用2M的HCL终止显色反应。利用酶标仪读取每个孔对应的OD450数值，统计数据并计算每个血清的终点稀释度。
9.利用荧光抗体病毒中和试验检测中和抗体水平：
将3倍等比稀释的灭活正常血清和狂犬标准血清(0.5IU/ml)分别与等量的狂犬病病毒CVS11置于37度孵育1h；随后每孔中加入1-2万个BHK21细胞；培养48小时后，取出细胞培养板，去除培养上清，用80％丙酮固定细胞，进行荧光免疫染色。使用FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体染色1小时，去除上清，用PBST洗板3次，加入50ul 80％的甘油溶液，在倒置荧光显微镜下进行荧光染色检测，培养孔内有1个以上的荧光细胞记为“+”，无荧光信号的细胞记为“—”，其中中和效价计算参考Spearman-karber公式。
修饰性狂犬病病毒mRNA疫苗的设计和蛋白表达：G蛋白是RABV中唯一糖基化的结构蛋白，也是已知唯一诱导中和抗体的抗原，位于病毒颗粒表面。G蛋白包含三个部分，膜外区、跨膜区和胞质域。本发明选择的四种狂犬抗原分别为：(1)狂犬病病毒膜蛋白(M蛋白)和糖蛋白(G蛋白)全长组成的亚病毒颗粒；(2)G蛋白全长；第三种免疫原：(3)GΔTM，截短的G蛋白(G蛋白的胞外域)；(4)G蛋白三聚体(GTrimer)，通过对G蛋白序列进行改造和修饰，G蛋白三聚体可以模拟病毒表面G蛋白天然构象，有益于诱导高中和滴度的抗体反应。以人为宿主对抗原基因序列进行密码子优化，合成相应的抗原表达基因(金斯瑞生物公司)，分别命名为RABV-M，RABV-G，GΔTM，GTrimer。利用同源重组试剂盒将合成的抗原序列分别插入质粒载体5’UTR-IgE-3’UTR-pok12上，获得四个重组质粒。
如图1所示，结果显示，将四种抗原的基因表达序列成功插入到具有mRNA翻译元件的质粒中获得重组重组质粒，利用PCR方法扩增出目的条带，与预期大小一致。
狂犬病病毒mRNA疫苗的制备：利用测序成功的质粒制备线性化DNA模板，将制备成功的4种mRNA分别转染HEK-293T细胞，并用未转染mRNA的细胞作为阴性对照(Mock组)。利用Western-blot实验对表达的狂犬蛋白进行鉴定，收集转染后24h的细胞裂解液，使用狂犬病毒G蛋白抗体作为一抗进行Western blot检测。如图2所示，结果显示，制备的四种狂犬mRNA在293T细胞中均表达了特异性蛋白，且表达量都比较高。
选择阳离子脂质(D-Lin-MC3-DMA)、中性脂质(DSPC)、胆固醇和PEG脂质(14:0PEG2000 PE)四种脂质作为LNP的基本组分，LNP中四种脂质以一定的摩尔比例进行组装(D-Lin-MC3-DMA:DSPC:cholesterol:(14:0PEG2000 PE)＝50:10:38.5:1.5)。分别将M和G、G、G△TM、Gtrimer狂犬mRNA以及无核酸的水溶液用LNP包裹，命名为V1(M+G)、V2(G)、V3(G△TM)、V4(Gtrimer)、V5(Empty-LNP)。制备成功的mRNA-LNP在免疫小鼠前需要经过透析、浓缩和过滤等步骤，并通过马尔文纳米粒度分析仪(Malvern Zetasizer Nano ZS)检测LNP的粒径分布。如图3所示，几种mRNA-LNP的平均粒径均在50-80nm之间，其中V5(Empty-LNP)的脂质体纳米颗粒粒径是最小的，可能是因为没有包裹核苷酸的原因；V1(M+G)、V2(G)、V3(G△TM)、V4(Gtrimer)、V5(Empty-LNP)的平均粒径分别为80nm、80nm、78nm、75nm、50nm。
狂犬病病毒mRNA疫苗诱导出结合抗体：每只小鼠免疫10μg疫苗，一共免疫两针，分别在末次免疫后2周采集血清，检测疫苗诱导的抗体反应，如图4A所示。将收集的血清进行梯度稀释，以狂犬抗原包被ELISA板，通过ELSIA实验检测血清中抗体对不同的抗原组分以及病毒的结合程度。实验结果表明，四组免疫原组在均诱导出强烈的IgG抗体水平，即便稀释到20万倍依旧有结合强度，如图4B所示；在同样的血清稀释度1/2700，V1(M+G)免疫组血清对应的OD450明显高于V3(G△TM)和V4(RABV-Gtrimer)组OD450，如图4C所示。
狂犬病病毒mRNA疫苗诱导出高滴度中和抗体：基于体外细胞的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测狂犬病毒中和抗体滴度，如图5所示，结果显示，四种狂犬病病毒mRNA疫苗免疫组血清在二次免疫两周后均诱导产生中和抗体，抗体滴度分别为630IU/ml、210IU/ml、122IU/ml和259IU/ml，其中V1(M+G)疫苗组血清中抗体滴度最高，Empty-LNP对照组血清中无中和狂犬病病毒的抗体。
总之，四种狂犬病病毒mRNA疫苗均可以诱导产生特异性的中和抗体，效价优于现有疫苗。(1)成功制备了针对狂犬病病毒的mRNA疫苗，显示该类疫苗具有很好的免疫原性，可以诱导高水平的中和抗体；(2)M-mRNA和G-mRNA疫苗的联合免疫增强了免疫反应。
序列信息：
/>
/>
/>
序列表
<110> 上海赛伦生物技术股份有限公司
<120> 一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法
<130> 赛伦发明3-方
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1760
<212> DNA
<213> 根据狂犬病病毒G蛋白抗原设计的mRNA-RABV-G核苷酸序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc 60
caccatggac tggacctgga ttctgttcct cgtggccgcc gctactcgtg tgcactctaa 120
attccctatt tacacgatac cagacaagct tggtccctgg agcccgattg acatacatca 180
cctcagctgc ccaaacaatt tggtagtgga ggacgaagga tgcaccaacc tgtcagggtt 240
ctcctacatg gaacttaaag ttggatacat ctcagccata aaaatgaacg ggttcacttg 300
cacaggcgtt gtgacggagg ctgaaaccta cactaacttc gttggttatg tcacaaccac 360
gttcaaaaga aagcatttcc gcccaacacc agatgcatgt agagccgcgt acaactggaa 420
gatggccggt gaccccagat atgaagagtc tctacacaat ccgtaccctg actaccactg 480
gcttcgaact gtaaaaacca ccaaggagtc tctcgttatc atatctccaa gtgtggcaga 540
tttggaccca tatgacagat cccttcactc gagggtcttc cctggcggga attgctcagg 600
agtagcggtg tcttctacct actgctccac taaccacgat tacaccattt ggatgcccga 660
gaatccgaga ctagggatgt cttgtgacat ttttaccaat agtagaggga agagagcatc 720
caaagggagt gagacttgcg gctttgtaga tgaaagaggc ctatataagt ctttaaaagg 780
agcatgcaaa ctcaagttat gtggagttct aggacttaga cttatggatg gaacatgggt 840
cgcgatgcaa acatcaaatg aaaccaaatg gtgccctccc ggtcagttgg tgaatttgca 900
cgactttcgc tcagacgaaa ttgagcacct tgttgtagag gagttggtca agaagagaga 960
ggagtgtctg gatgcactag agtccatcat gaccaccaag tcagtgagtt tcagacgtct 1020
cagtcattta agaaaacttg tccctgggtt tggaaaagca tataccatat tcaacaagac 1080
cttgatggaa gccgatgctc actacaagtc agtcagaact tggaatgaga tcatcccttc 1140
aaaagggtgt ttaagagttg gggggaggtg tcatcctcat gtaaacgggg tatttttcaa 1200
tggtataata ttaggacctg acggcaatgt cttaatccca gagatgcaat catccctcct 1260
ccagcaacat atggagttgt tggtatcctc ggttatcccc cttatgcacc ccctggcaga 1320
cccgtctacc gttttcaaga acggtgacga ggctgaggat tttgttgaag ttcaccttcc 1380
cgatgtgcac gaacggatct caggagttga cttgggtctc ccgaactggg ggaagtatgt 1440
attactgagt gcaggggccc tgactgcctt gatgttgata attttcctga tgacatgctg 1500
gagaagagtc aatcgatcgg aacctacaca acacaatctc agagggacag ggagggaggt 1560
gtcagtcact ccccaaagcg ggaagatcat atcttcatgg gaatcataca agagcggggg 1620
tgagaccgga ctgcatcacc atcaccatca ctgataatag gctggagcct cggtggccat 1680
gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc ttcctgcacc cgtacccccg 1740
tggtctttga ataaagtctg 1760
<210> 2
<211> 1559
<212> DNA
<213> 根据狂犬病病毒G△TM蛋白抗原设计的mRNA-RABV- G△TM核苷酸序列(2Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc 60
caccatggac tggacctgga ttctgttcct cgtggccgcc gctactcgtg tgcactctaa 120
attccctatt tacacgatac cagacaagct tggtccctgg agcccgattg acatacatca 180
cctcagctgc ccaaacaatt tggtagtgga ggacgaagga tgcaccaacc tgtcagggtt 240
ctcctacatg gaacttaaag ttggatacat ctcagccata aaaatgaacg ggttcacttg 300
cacaggcgtt gtgacggagg ctgaaaccta cactaacttc gttggttatg tcacaaccac 360
gttcaaaaga aagcatttcc gcccaacacc agatgcatgt agagccgcgt acaactggaa 420
gatggccggt gaccccagat atgaagagtc tctacacaat ccgtaccctg actaccactg 480
gcttcgaact gtaaaaacca ccaaggagtc tctcgttatc atatctccaa gtgtggcaga 540
tttggaccca tatgacagat cccttcactc gagggtcttc cctggcggga attgctcagg 600
agtagcggtg tcttctacct actgctccac taaccacgat tacaccattt ggatgcccga 660
gaatccgaga ctagggatgt cttgtgacat ttttaccaat agtagaggga agagagcatc 720
caaagggagt gagacttgcg gctttgtaga tgaaagaggc ctatataagt ctttaaaagg 780
agcatgcaaa ctcaagttat gtggagttct aggacttaga cttatggatg gaacatgggt 840
cgcgatgcaa acatcaaatg aaaccaaatg gtgccctccc ggtcagttgg tgaatttgca 900
cgactttcgc tcagacgaaa ttgagcacct tgttgtagag gagttggtca agaagagaga 960
ggagtgtctg gatgcactag agtccatcat gaccaccaag tcagtgagtt tcagacgtct 1020
cagtcattta agaaaacttg tccctgggtt tggaaaagca tataccatat tcaacaagac 1080
cttgatggaa gccgatgctc actacaagtc agtcagaact tggaatgaga tcatcccttc 1140
aaaagggtgt ttaagagttg gggggaggtg tcatcctcat gtaaacgggg tatttttcaa 1200
tggtataata ttaggacctg acggcaatgt cttaatccca gagatgcaat catccctcct 1260
ccagcaacat atggagttgt tggtatcctc ggttatcccc cttatgcacc ccctggcaga 1320
cccgtctacc gttttcaaga acggtgacga ggctgaggat tttgttgaag ttcaccttcc 1380
cgatgtgcac gaacggatct caggagttga cttgggtctc ccgaactggg ggcatcacca 1440
tcaccatcac tgataatagg ctggagcctc ggtggccatg cttcttgccc cttgggcctc 1500
cccccagccc ctcctcccct tcctgcaccc gtacccccgt ggtctttgaa taaagtctg 1559
<210> 3
<211> 1649
<212> DNA
<213> 根据狂犬病病毒Gtrimer蛋白抗原设计的mRNA-RABV- Gtrimer 核苷酸序列(2Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc 60
caccatggac tggacctgga ttctgttcct cgtggccgcc gctactcgtg tgcactctaa 120
attccctatt tacacgatac cagacaagct tggtccctgg agcccgattg acatacatca 180
cctcagctgc ccaaacaatt tggtagtgga ggacgaagga tgcaccaacc tgtcagggtt 240
ctcctacatg gaacttaaag ttggatacat ctcagccata aaaatgaacg ggttcacttg 300
cacaggcgtt gtgacggagg ctgaaaccta cactaacttc gttggttatg tcacaaccac 360
gttcaaaaga aagcatttcc gcccaacacc agatgcatgt agagccgcgt acaactggaa 420
gatggccggt gaccccagat atgaagagtc tctacacaat ccgtaccctg actaccactg 480
gcttcgaact gtaaaaacca ccaaggagtc tctcgttatc atatctccaa gtgtggcaga 540
tttggaccca tatgacagat cccttcactc gagggtcttc cctggcggga attgctcagg 600
agtagcggtg tcttctacct actgctccac taaccacgat tacaccattt ggatgcccga 660
gaatccgaga ctagggatgt cttgtgacat ttttaccaat agtagaggga agagagcatc 720
caaagggagt gagacttgcg gctttgtaga tgaaagaggc ctatataagt ctttaaaagg 780
agcatgcaaa ctcaagttat gtggagttct aggacttaga cttatggatg gaacatgggt 840
cgcgatgcaa acatcaaatg aaaccaaatg gtgccctccc ggtcagttgg tgaatttgca 900
cgactttcgc tcagacgaaa ttgagcacct tgttgtagag gagttggtca agaagagaga 960
ggagtgtctg gatgcactag agtccatcat gaccaccaag tcagtgagtt tcagacgtct 1020
cagtcattta agaaaacttg tccctgggtt tggaaaagca tataccatat tcaacaagac 1080
cttgatggaa gccgatgctc actacaagtc agtcagaact tggaatgaga tcatcccttc 1140
aaaagggtgt ttaagagttg gggggaggtg tcatcctcat gtaaacgggg tatttttcaa 1200
tggtataata ttaggacctg acggcaatgt cttaatccca gagatgcaat catccctcct 1260
ccagcaacat atggagttgt tggtatcctc ggttatcccc cttatgcacc ccctggcaga 1320
cccgtctacc gttttcaaga acggtgacga ggctgaggat tttgttgaag ttcaccttcc 1380
cgatgtgcac gaacggatct caggagttga cttgggtctc ccgaactggg ggggcagcgg 1440
cggctacatc cccgaggccc cccgcgacgg ccaggcctac gtgcgcaagg acggcgagtg 1500
ggtgctgctg agcaccttcc tgcatcacca tcaccatcac tgataatagg ctggagcctc 1560
ggtggccatg cttcttgccc cttgggcctc cccccagccc ctcctcccct tcctgcaccc 1620
gtacccccgt ggtctttgaa taaagtctg 1649
<210> 4
<211> 851
<212> DNA
<213> 根据狂犬病病毒M蛋白抗原设计的mRNA-RABV- M核苷酸序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc 60
caccatggac tggacctgga ttctgttcct cgtggccgcc gctactcgtg tgcactctat 120
gaactttcta cgtaagatag tgaaaaattg cagggacgag gacactcaaa aaccctctcc 180
cgtgtcagcc cctctggatg acgatgactt gtggcttcca ccccctgaat acgtcccgct 240
aaaagaactt acaagcaaga agaacaggag gaacttttgt atcaacggag gggttaaagt 300
gtgtagcccg aatggttact cgttcgggat cctgcggcac attctgagat cattcgacga 360
gatatattct gggaatcata ggatggtcgg gttagtcaaa gtagttattg gactggcttt 420
gtcaggagct ccagtccctg agggcatgaa ctgggtatac aagttgagga gaacccttat 480
cttccagtgg gctgattcca ggggccctct tgaaggggag gagttggaat actctcagga 540
gatcacttgg gatgataata ctgagttcgt cggattgcaa ataagagtga gtgcaaaaca 600
gtgtcatatc cggggcagaa tctggtgtat caacatgaac tcgagagcag gtcaactatg 660
gtctgacatg tctcttcaga cacaaaggtc cgaagaggac aaagattcct ctctgcttct 720
agaacatcac catcaccatc actgataata ggctggagcc tcggtggcca tgcttcttgc 780
cccttgggcc tccccccagc ccctcctccc cttcctgcac ccgtaccccc gtggtctttg 840
aataaagtct g 851
<210> 5
<211> 2571
<212> DNA
<213> 根据狂犬病病毒M蛋白+G蛋白抗原设计的mRNA-RABV- M+G核苷酸序列(2Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc caccatggac tggacctgga 60
ttctgttcct cgtggccgcc gctactcgtg tgcactctaa attccctatt tacacgatac 120
cagacaagct tggtccctgg agcccgattg acatacatca cctcagctgc ccaaacaatt 180
tggtagtgga ggacgaagga tgcaccaacc tgtcagggtt ctcctacatg gaacttaaag 240
ttggatacat ctcagccata aaaatgaacg ggttcacttg cacaggcgtt gtgacggagg 300
ctgaaaccta cactaacttc gttggttatg tcacaaccac gttcaaaaga aagcatttcc 360
gcccaacacc agatgcatgt agagccgcgt acaactggaa gatggccggt gaccccagat 420
atgaagagtc tctacacaat ccgtaccctg actaccactg gcttcgaact gtaaaaacca 480
ccaaggagtc tctcgttatc atatctccaa gtgtggcaga tttggaccca tatgacagat 540
cccttcactc gagggtcttc cctggcggga attgctcagg agtagcggtg tcttctacct 600
actgctccac taaccacgat tacaccattt ggatgcccga gaatccgaga ctagggatgt 660
cttgtgacat ttttaccaat agtagaggga agagagcatc caaagggagt gagacttgcg 720
gctttgtaga tgaaagaggc ctatataagt ctttaaaagg agcatgcaaa ctcaagttat 780
gtggagttct aggacttaga cttatggatg gaacatgggt cgcgatgcaa acatcaaatg 840
aaaccaaatg gtgccctccc ggtcagttgg tgaatttgca cgactttcgc tcagacgaaa 900
ttgagcacct tgttgtagag gagttggtca agaagagaga ggagtgtctg gatgcactag 960
agtccatcat gaccaccaag tcagtgagtt tcagacgtct cagtcattta agaaaacttg 1020
tccctgggtt tggaaaagca tataccatat tcaacaagac cttgatggaa gccgatgctc 1080
actacaagtc agtcagaact tggaatgaga tcatcccttc aaaagggtgt ttaagagttg 1140
gggggaggtg tcatcctcat gtaaacgggg tatttttcaa tggtataata ttaggacctg 1200
acggcaatgt cttaatccca gagatgcaat catccctcct ccagcaacat atggagttgt 1260
tggtatcctc ggttatcccc cttatgcacc ccctggcaga cccgtctacc gttttcaaga 1320
acggtgacga ggctgaggat tttgttgaag ttcaccttcc cgatgtgcac gaacggatct 1380
caggagttga cttgggtctc ccgaactggg ggaagtatgt attactgagt gcaggggccc 1440
tgactgcctt gatgttgata attttcctga tgacatgctg gagaagagtc aatcgatcgg 1500
aacctacaca acacaatctc agagggacag ggagggaggt gtcagtcact ccccaaagcg 1560
ggaagatcat atcttcatgg gaatcataca agagcggggg tgagaccgga ctgcatcacc 1620
atcaccatca ctgataatag gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct 1680
ccccccagcc cctcctcccc ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg 1740
aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc caccatggac tggacctgga 1800
ttctgttcct cgtggccgcc gctactcgtg tgcactctat gaactttcta cgtaagatag 1860
tgaaaaattg cagggacgag gacactcaaa aaccctctcc cgtgtcagcc cctctggatg 1920
acgatgactt gtggcttcca ccccctgaat acgtcccgct aaaagaactt acaagcaaga 1980
agaacaggag gaacttttgt atcaacggag gggttaaagt gtgtagcccg aatggttact 2040
cgttcgggat cctgcggcac attctgagat cattcgacga gatatattct gggaatcata 2100
ggatggtcgg gttagtcaaa gtagttattg gactggcttt gtcaggagct ccagtccctg 2160
agggcatgaa ctgggtatac aagttgagga gaacccttat cttccagtgg gctgattcca 2220
ggggccctct tgaaggggag gagttggaat actctcagga gatcacttgg gatgataata 2280
ctgagttcgt cggattgcaa ataagagtga gtgcaaaaca gtgtcatatc cggggcagaa 2340
tctggtgtat caacatgaac tcgagagcag gtcaactatg gtctgacatg tctcttcaga 2400
cacaaaggtc cgaagaggac aaagattcct ctctgcttct agaacatcac catcaccatc 2460
actgataata ggctggagcc tcggtggcca tgcttcttgc cccttgggcc tccccccagc 2520
ccctcctccc cttcctgcac ccgtaccccc gtggtctttg aataaagtct g 2571

Claims (10)

1.一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗，其特征在于：所述的疫苗包括：
用于表达狂犬病病毒优化的免疫原mRNA，所述的免疫原为G蛋白或者G△TM蛋白或者Gtrimer蛋白，
根据狂犬病病毒G蛋白抗原设计的mRNA-RABV-G核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、根据狂犬病病毒G△TM蛋白抗原设计的mRNA-RABV-G△TM核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、
根据狂犬病病毒Gtrimer蛋白抗原设计的mRNA-RABV-Gtrimer核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
疫苗载体，所述的疫苗载体为可被mRNA利用的脂质体纳米颗粒；
所述的G蛋白为糖蛋白全长；G△TM蛋白为糖蛋白的膜外部分；Gtrimer蛋白为糖蛋白三聚体。
2.根据权利要求1所述的一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗，其特征在于：所述的狂犬病病毒选自以下组：PV株、Flury株、SAD株、aG株、CTN株及它们的衍生株或其多种组合。
3.根据权利要求1所述的一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗，其特征在于：所述的mRNA序列，具有下面结构：A1-A2-A3-A4-A5-A6：
A1为5’帽子结构；
A2为5’UTR元件；
A3为信号肽编码序列；
A4为狂犬病病毒抗原编码序列，其中狂犬病病毒抗原选择G蛋白、G△TM蛋白、Gtrimer蛋白；
A5为3’UTR元件；
A6为poly(A)尾巴结构。
4.根据权利要求1所述的一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗，其特征在于：所述的脂质体纳米颗粒包括PEG修饰的阳离子脂质、中性脂质、阳离子脂质和胆固醇。
5.根据权利要求1或4所述的一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗，其特征在于：所述的脂质体纳米颗粒平均粒径范围在10-500nm内。
6.根据权利要求1或4所述的一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗，其特征在于：所述的脂质体纳米颗粒与优化的mRNA质量比为10-30:1。
7.根据权利要求4所述的一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗，其特征在于：所述的阳离子脂质包括但不限于Dlin-MC3-DMA、DODMA、DODAP、ALC-0315或SM102。
8.一种如权利要求1所述的狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗的制备方法，其特征在于：具体流程如下：
(1)以人为宿主对抗原基因序列进行密码子优化，合成相应的抗原表达基因，得到G蛋白、G△TM蛋白、Gtrimer蛋白三种狂犬病病毒抗原表达基因；
(2)将三种狂犬病病毒抗原表达基因分别克隆入质粒载体5′UTR-IgE-3’
UTR-pok12上，获得三个对应的重组质粒；
(3)制备三种mRNA；
(4)利用乙醇分别将D-Lin-MC3-DMA、DSPC、cholesterol和14:0PEG2000 PE四种脂质溶解；
(5)以一定的摩尔比例进行混合，制得脂质混合物，所述的D-Lin-MC3-DMA:DSPC:
cholesterol:(14:0PEG2000 PE)＝50:10:38.5:1.5；
(6)将脂质混合物和溶有mRNA的柠檬酸盐缓冲液分别加入到NanoAssemblrTM机器的两个入口通道中，收集mRNA-LNP混合物；
(7)分别将G、G△TM、Gtrimer狂犬mRNA以及无核酸的水溶液用LNP包裹，命名为V2(G)、V3(G△TM)、V4(Gtrimer)；
(8)将V2-V4对小鼠进行免疫，之后分离血清用于检测疫苗诱导的体液免疫，利用ELISA检测结合抗体水平。
9.根据权利要求8所述的一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中制备三种mRNA的具体流程：
I，利用PCR扩增目的片段作为体外转录模板，使用NEB公司的体外转录试剂盒进行体外转录，同时将UTP完全替换成修饰性核苷酸；
II，反应结束后，利用DNA酶消化以去除反应中DNA；
III，利用LiCL沉淀RNA的方法去除RNA中的蛋白和盐等杂质；
IV，利用NEB公司的Cap1加帽试剂盒和加尾试剂盒分别进行加帽和加尾，获得相应的mRNA。
10.根据权利要求9所述的一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗的制备方法，其特征在于：所述的修饰性核苷酸为假尿苷三磷酸；加帽试剂盒为mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase和Vaccinia Capping System试剂盒；加尾试剂盒为E.
coli Poly(A)Polymerase。
CN202210180202.3A 2022-02-25 2022-02-25 一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法 Active CN114921481B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210180202.3A CN114921481B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210180202.3A CN114921481B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114921481A CN114921481A (zh) 2022-08-19
CN114921481B true CN114921481B (zh) 2024-01-30

Family

ID=82804998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210180202.3A Active CN114921481B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114921481B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023143591A1 (zh) * 2022-01-30 2023-08-03 康希诺生物股份公司 一种用于核酸递送的新型可电离脂质及其lnp组合物和疫苗
WO2024055273A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 复旦大学附属中山医院 一种狂犬病mRNA疫苗、其制备及应用
CN116510001B (zh) * 2023-06-26 2023-11-24 西北农林科技大学深圳研究院 一种水产养殖用mRNA疫苗及其制备方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005065596A (ja) * 2003-08-25 2005-03-17 Japan Science & Technology Agency 増殖能欠損狂犬病ウイルス
CN102533680A (zh) * 2011-06-24 2012-07-04 武汉生物制品研究所有限责任公司 狂犬病毒病毒样颗粒及其制备方法
CN109022375A (zh) * 2018-08-21 2018-12-18 山东大学 一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用
CN109970852A (zh) * 2019-04-01 2019-07-05 浙江大学 分泌抗狂犬病毒m蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用
CN110714015A (zh) * 2019-10-29 2020-01-21 珠海丽凡达生物技术有限公司 一种mRNA狂犬病疫苗
CN110893234A (zh) * 2019-12-06 2020-03-20 江苏省农业科学院 一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗
CN110951699A (zh) * 2019-12-17 2020-04-03 长春西诺生物科技有限公司 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN110981968A (zh) * 2019-12-17 2020-04-10 天康生物(上海)有限公司 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN111944769A (zh) * 2020-08-10 2020-11-17 塔里木大学 一种狂犬病毒g蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法
CN113174392A (zh) * 2021-04-09 2021-07-27 华南生物医药研究院 一种狂犬病毒的重组基因、重组假病毒及其构建方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110352071A (zh) * 2016-10-26 2019-10-18 库瑞瓦格股份公司 脂质纳米颗粒mRNA疫苗

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005065596A (ja) * 2003-08-25 2005-03-17 Japan Science & Technology Agency 増殖能欠損狂犬病ウイルス
CN102533680A (zh) * 2011-06-24 2012-07-04 武汉生物制品研究所有限责任公司 狂犬病毒病毒样颗粒及其制备方法
CN109022375A (zh) * 2018-08-21 2018-12-18 山东大学 一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用
CN109970852A (zh) * 2019-04-01 2019-07-05 浙江大学 分泌抗狂犬病毒m蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用
CN110714015A (zh) * 2019-10-29 2020-01-21 珠海丽凡达生物技术有限公司 一种mRNA狂犬病疫苗
CN110893234A (zh) * 2019-12-06 2020-03-20 江苏省农业科学院 一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗
CN110951699A (zh) * 2019-12-17 2020-04-03 长春西诺生物科技有限公司 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN110981968A (zh) * 2019-12-17 2020-04-10 天康生物(上海)有限公司 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN111944769A (zh) * 2020-08-10 2020-11-17 塔里木大学 一种狂犬病毒g蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法
CN113174392A (zh) * 2021-04-09 2021-07-27 华南生物医药研究院 一种狂犬病毒的重组基因、重组假病毒及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Phenotypic Consequences In vivo and In vitro of Rearranging the P Gene of RABV HEP-Flury;Mingzhu Mei et al.;《Frontiers in Microbiology》;第8卷;1-12 *
狂犬病新型基因工程疫苗研究进展;柴本杰等;《华中农业大学学报》;第40卷(第3期);75-84 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114921481A (zh) 2022-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114921481B (zh) 一种狂犬病病毒修饰性mRNA疫苗及其制备方法
WO2021254327A1 (zh) 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
CN111560354B (zh) 重组新型冠状病毒及其制备方法和应用
US10086065B2 (en) Rabies glycoprotein virus-like particles (VLPS)
KR101691574B1 (ko) 변형 ｒｓｖ ｆ 단백질 및 이들의 사용 방법
US20110008838A1 (en) Chimeric varicella zoster virus virus-like particles
KR20140021530A (ko) 변형 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 및 이의 용도
CN110951699A (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN110981968B (zh) 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN110951778B (zh) 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用
CN109022375A (zh) 一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用
CN113817753B (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
CN115666633A (zh) CpG-佐剂的SARS-CoV-2病毒疫苗
CN116024237A (zh) 一种用于预防裂谷热的mRNA疫苗及其制备方法
CN102816741A (zh) 犬瘟热弱毒疫苗株f和h基因重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及其应用
CN114395017A (zh) SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法及其应用
CN114807195A (zh) 一种提高狂犬病病毒耐热稳定性和免疫效果的融合基因、重组狂犬病病毒及其应用
US11111275B2 (en) Compositions and methods for making and using virus-like particles (VLPs)
CN113801206A (zh) 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法
CN111518776A (zh) 一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法
WO2024055273A1 (zh) 一种狂犬病mRNA疫苗、其制备及应用
CN109985235A (zh) 鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗
US11033616B2 (en) Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom
CN113502274A (zh) 一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白l2的重组流感病毒株及其制备方法与应用
RU2575800C2 (ru) Вирусоподобные частицы (vlp) из гликопротеина вируса бешенства

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant