CN113502274A - 一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白l2的重组流感病毒株及其制备方法与应用 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
本发明提供了一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株及其制备方法与应用,所述表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202134。本发明由人乳头瘤病毒抗原优势表位整合入流感病毒基因组NS片段中组成的重组流感病毒,首次以流感病毒为载体表达人乳头瘤病毒抗原;本发明的表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒可以在宿主细胞或鸡胚中稳定传代,可以用于人乳头瘤病毒疫苗的开发、相关药物的开发以及利用细胞或鸡胚作为生物反应器生产人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株及其制备方法与应用。
背景技术
流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),正粘病毒科是一种含有片段RNA基因组的包膜病毒,可感染包括人类在内的鸟类和哺乳动物物种。流感病毒根据其抗原性可分为四种类型:A型、B型、C型和D型。其中,甲型流感病毒对人类的致病性最强,宿主范围广。甲型流感病毒(IAV)包含一个由八个单链负义RNA片段组成的基因组,它们分别是PB1,PB2,PA,HA,NP,NA,M,NS。在病毒颗粒内部,所有八个vRNA片段都与NP和流感病毒RNA聚合酶结合形成核糖核蛋白(RNP)复合物。因此,vRNP复合物由八个负义、单链RNA、核蛋白和RNA聚合酶组成,它们是流感病毒复制的基本单位。流感病毒NS基因编码两种不同的病毒蛋白:非结构蛋白1(NS1)和核输出蛋白(NEP),前者是天然免疫逃避所必需的,后者是病毒核糖核蛋白核输出和病毒生命周期计时所必需的。病毒已经发展出精确的调控机制,利用宿主剪接体在整个感染过程中表达特定的剪接流感病毒产物。对于甲型流感病毒NS基因来说,通过将NS中的RNA剪接位点进行突变并将其开放阅读框通过连接肽连接也可以表达相应的蛋白,拯救出的重组流感病毒在适宜条件下可以正常的复制。
在构建重组流感病毒的过程中,反向遗传学技术的使用必不可少。病毒的反向遗传学通常被称为病毒拯救,通过构建病毒的感染性克隆,并在DNA水平上对其进行体外操作,以研究病毒的结构和功能。Hofmann等人于2000年进一步建立了流感病毒反向遗传操作技术的8质粒系统。该系统进一步完善了RNA聚合酶I系统,发明了“双向载体”,即编码流感病毒基因片段的cDNA正向插入RNA聚合酶II启动子和poly-A信号子之间,然后RNA 聚合酶I启动子和终止子序列反向插入到RNA聚合酶II两端。这种安排使病毒RNA复制和蛋白质表达在同一模板上,且允许从一个病毒cDNA模板同时合成负义病毒RNA和正义 mRNA。其中RNA聚合酶I负责转录阴性病毒RNA,RNA聚合酶II负责合成阳性链mRNA。这种产生甲型流感病毒的系统仅由八个质粒的构建和转染组成,每个质粒含有一个病毒 cDNA拷贝。这种反向遗传学系统减少了恢复甲型流感病毒所需的质粒数量。
人类乳头瘤病毒(HPV)是含有一个大小约8kb的环状双链病毒DNA,也是已知的多种上皮细胞病变的病原体。HPV感染是最常见的性传播疾病之一,患病率超过50%。
已知目前世界上有超过200种不同类型的人乳头状瘤病毒。目前针对人乳头瘤病毒感染的治疗手段主要分为三类:破坏性治疗、细胞毒性药物和免疫疗法。但是绝大多数宫颈癌死亡发生在世界上妇女得不到宫颈癌治疗的地区,同时筛查项目费用高昂,而且需要大量医务人员。因此,需要从源头解决宫颈癌问题,即进行预防措施。因此,广谱性高且成本低的人乳头瘤病毒疫苗制备成为了很多国家对人乳头瘤病毒研究的重点。
发明内容
为了解决所述技术问题,本发明提供了一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株及其制备方法与应用,本发明首次以流感病毒为载体表达人乳头瘤病毒抗原,广谱性高且成本低。
在本发明的第一方面,提供了一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株,所述重组流感病毒株为表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的流感病毒载体通过反向遗传系统在细胞中拯救出的表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒;
所述编码人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的基因位于改造过的甲型流感病毒NS片段的开放阅读框内;编码所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的核心抗原表位的氨基酸序列如SEQ IDNO: 1所示;所述改造过的甲型流感病毒NS片段的剪接位点进行了同义突变:将 525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530;
所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的基因片段的5’端通过P2A连接子与甲型流感病毒NS1片段3端’连接;人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的基因片段的3’端通过T2A连接子与甲型流感病毒NEP片段5’端连接。
进一步地,所述流感病毒载体包括A型流感病毒A/WSN/33或A/PR/8/34中的一种。
进一步地,所述流感病毒载体为A型流感病毒A/WSN/33,所述表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202134。
上述技术方案中,人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的基因来源为一段串联基因(串联高度保守区HPV31 L2 aa 20-31和HPV16 L2 aa 17-31);其基因序列如SEQ ID NO:1所示。串联的两段基因间用GSG连接子连接可以有助于保持目的蛋白的活性,这样的串联肽可以交叉保护/中和高风险型HPV类型,来实现对更多HPV类型的更广泛保护。
所述重组流感病毒可以在MDCK细胞、A549细胞、VERO细胞或鸡胚中进行传代和扩增;
在本发明的第二方面,所述的表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株在制备人乳头瘤病毒疫苗中的应用以及在利用鸡胚或细胞作为生物反应器生产人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2中的应用。
在本发明的第三方面,提供了一种人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒疫苗,包括所述的表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株,所述疫苗包括病毒载体疫苗、亚单位疫苗和蛋白疫苗中的一种。
所述人乳头瘤病毒疫苗以重组流感病毒的形式感染宿主后能产生抗人乳头瘤病毒抗体,并可以中和加入了成熟步骤的假病毒(PsV);
所述人乳头瘤病毒疫苗为单基因、多价嵌合疫苗;所述重组流感病毒可用通用技术加工可供临床用的制剂;
所述制剂包括液体制剂、冻干制剂、胶囊制剂、片剂或丸剂中的任一种。
作为优选方案,所述疫苗的接种途径包括肌肉注射、皮下注射、口服,还可以在粘膜部位进行无针注射,包括鼻腔、口腔、肛门和阴道粘膜途径。
本发明中的重组流感病毒可以用作单基因、多价嵌合疫苗,可用通用技术加工可供临床用的各种制剂,所述的制剂选自液体制剂、冻干制剂、胶囊制剂、片剂、丸剂中的一种,优选剂型是液体剂型、动干剂型、胶囊剂型,更有选液体剂型和冻干剂型,最优选液体剂型。
本发明用作疫苗时其接种途径包括肌肉注射、皮下注射、口服,还可以在粘膜部位进行无针注射,包括鼻腔、口腔、肛门和阴道粘膜途径。
在本发明的第四方面,提供了一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株的制备方法,所述方法包括:
将甲型流感病毒NS片段中RNA剪接位点进行同义点突变,将525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530;
获得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示人乳头瘤病毒衣壳蛋白的串联基因;
将所述串联基因通过自剪接肽段连接于甲型流感病毒的NS1片段和NS2片段之间,获得5’-3’方向分别为NS1、自剪接肽段、人乳头瘤病毒衣壳蛋白串联基因、自剪接肽段、NS2的重组NS质粒;
将所述重组NS质粒和WSN的其他七个质粒共转染宿主细胞,获得表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株。
上述技术方案中,将NS片段525-530位的6个碱基CCAGGA同义突变为CCCGGG 从而破坏了NS片段上剪接受体位点,使NS无法自然发生可变剪接。
在本发明的第四方面,提供了一种人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2,所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2为串联高度保守区HPV31 L2 aa 20-31和HPV16 L2 aa 17-31之间用GSG连接子连接而得,编码所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
串联的两段基因间用GSG连接子连接可以有助于保持目的蛋白的活性。这样的串联肽可以交叉保护/中和高风险型HPV类型,来实现对更多HPV类型的更广泛保护。
所述表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒可以利用鸡胚作为生物反应器生产人乳头瘤病毒衣壳蛋白。上述重组病毒可以在9-11日龄鸡胚、MDCK、Vero、A549细胞中稳定传代。
在本发明的第五方面,提供了一种编码所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的核酸分子,所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的第六方面,提供了一种表达载体,包含有所述的核酸分子。
进一步地,所述表达载体包括原核表达载体和病毒载体中的一种。
在本发明的第七方面,提供了一种包含所述表达载体的细胞系或重组菌,所述细胞系包括MDCK、A549和VERO细胞系中的一种。。
本发明实施例中的一个或多个技术方案,至少具有如下技术效果或优点:
1、本发明提供的一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株及其制备方法与应用,首次以流感病毒为载体表达人乳头瘤病毒抗原,目前国内外还无相关文献报道。开创了人乳头瘤病毒疫苗的先河。
2、本发明中表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白的重组流感病毒可以同时作为人乳头瘤病毒和流感病毒疫苗使用,具有两种疫苗的功效。作为疫苗时可采用喷鼻免,疫是简单、有效适合广大人群使用的免疫方式。相比于目前的治疗人乳头瘤病毒的手段,利用重组流感病毒进行免疫方法更为便捷。
3、本发明所述表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白的重组流感病毒可以用作(1)人乳头瘤病毒疫苗的制备;(2)人乳头瘤病毒衣壳蛋白的功能研究;(3)利用鸡胚作为生物反应器生产人乳头瘤病毒衣壳蛋白。
本发明的表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株的保藏日期为2021年5月 25日,保藏编号为CCTCC NO:V202134。其分类命名为重组甲型流感病毒IAV-consL2,保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心,地址为中国湖北省武汉市武汉大学,邮编:430072。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为基因组示意图;其中,图1左图为流感病毒基因组示意图;图1右图为改造后重组流感病毒的基因组示意图;
图2为A型流感病毒基因组中NS发生可变剪接从而产生两种mRNA,分别是NS1和NEP;
图3为通过将NS片段进行改造,将两种自剪接多肽插入NS1和NS2的开放阅读框中之后将外源片段插入到两种自剪接多肽片段中构建全新表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白的流感病毒NS片段;
图4为改造NS的具体实施方案。SD为剪接供体位点,SA为剪接受体位点;在NS1 开放阅读框后连接自剪接多肽片段,NEP片段前引入P2A片段并将外源片段插入自剪接多肽之间并使NS1、自剪接多肽1、外源片段、自剪接多肽2处在同一开放阅读框内;
图5为含有人乳头瘤病毒衣壳蛋白片段的重组流感病毒和野生型病毒感染MDCK后,提取RNA经过RT-PCR检测流感病毒NP的电泳图;
图6为含有乳头瘤病毒衣壳蛋白片段的重组流感病毒和野生型病毒感染MDCK后,提取RNA经过RT-PCR检测流感病毒NS的电泳图;
图7为以WSN野生型流感病毒的生长曲作为对照制作的重组病毒ConsL2的病毒生长曲线;
图8为小鼠经感染21天后血清中外源蛋白L2的表达;免疫前血清(A)无抗体产生;免疫后血清(B、C)有抗体产生;
图9为小鼠经感染21天后血清中针对HPV16和HPV18的抗体中和效价。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等,均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。如无特殊提及,以下方案中提到的分子克隆方法、蛋白表达纯化方法、细胞培养方法及各种检测方法等均为传统实验方法,可通过查询文献获得;用到的相关试剂可从对应试剂商处购买获得。
实施例1、重组NS片段的构建
1、利用常规分子生物学手段对NS片段中RNA剪接位点进行同义点突变, 525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530。在构建重组质粒的时候,将NS片段525-530 位的6个碱基CCAGGA同义突变为CCCGGG从而破坏了NS片段上剪接受体位点,使NS 无法自然发生可变剪接。
2、人乳头瘤病毒衣壳蛋白基因由基因合成手段合成获得,核苷酸序列如SEQ IDNO: 1所示。
3、将突变后的NS片段根据NS1和NS2的开放阅读框通过自剪接多肽与外源人乳头瘤病毒衣壳蛋白基因连接得到重组NS片段,如图4所示。在NS1开放阅读框后连接自剪接多肽片段,NEP片段前引入P2A片段并将外源片段插入自剪接多肽之间并使NS1、自剪接多肽1、外源片段、自剪接多肽2处在同一开放阅读框内。具体来说,我们选择在NS1和 NEP片段中间插入合成的表达HPV次要衣壳蛋白L2的基因,两段用T2A和P2A这两种自剪接连接子连接。所以,该重组基因片段在细胞内表达时也会发生剪接现象,从而表达不同大小的蛋白(NS1、ConsL2、NEP、NS1-ConsL2、ConsL2-NEP、NS1-ConsL2-NEP)。
具体操作步骤为:
(1)取一个新的PCR管,加入49μl的ddH2O,再加入1μl的逆转录反应产物,从而将逆转录反应产物稀释50倍。
(2)在另外一个PCR管中混合PCR反应所需要的试剂。25μl的PCR反应试剂体系为:T3/A9混合液(混合液中包含了dNTP、酶等反应底物)10μl;正向引物1μl;反向引物1μl;稀释了50倍的逆转录产物3μl;ddH2O 5μl。
【注】鉴定重组病毒需要鉴定其NP和NS片段。
表1-引物
盖上管盖,用振荡器混匀管内混合液,再用离心仪将液体离心至管底。
将PCR管放置于PCR仪,设置如下程序进行逆转录:
表2-聚合酶链式反应程序设定
Cycle 1×30,From 02to 04
第三步的温度取决于引物的Tm值,时间取决于NP/NS片段长度。
具体操作步骤为:
(1)将NS连同PHW2000克隆下来,呈线性,引物为:
NEP-F:gagactgatggagaacgccagaatgccactgaaatcagag(SEQ ID NO:2所示);
NS1-R:agatccttcattactcatgtcaaaggagggcacgatcggg(SEQ ID NO:3所示);
退火温度为58℃,延伸50s,跑胶,进行胶回收。
(2)将T2Alinker、人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2、P2Alinker(整个片段均采用基因合成手段合成)克隆下来。引物为:
P2A-F:gctactaacttcagcctgctgaagcaggct(SEQ ID NO:4所示);
T2A-R:agggccgggattctcctccacgtca(SEQ ID NO:5所示);
退火温度为58℃,延伸10s,跑胶,进行胶回收。
(3)将两个回收片段用同源重组酶进行同源重组,转化,提质粒。
4、构建好的重组质粒经测序鉴定,片段大小与预期完全一致,并且无基因突变。
实施例2、重组流感病毒的拯救
将流感病毒野生型PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M以及实施例1获得的重组质粒共转染293T细胞,也可以转染293T与MDCK的共培养细胞系,6h后换成含有TPCK胰酶的DMEM培养基。TPCK胰酶终浓度1ug/ml。在37℃,5%C02环境下,培养48h,收集上清。收集的上清经过澄清感染MDCK细胞。48-72h后收集上清进行空斑纯化,三轮空斑纯化后在MDCK中扩增病毒最后获得表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白的流感病毒疫苗株。
实施例3、空斑纯化流感病毒
在1.5ml的EP管里用DMEM培养基对不同感染时间点所收集到的病毒上清进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3……10-6)。用PBS洗一遍细胞,将稀释好的病毒加至提前铺好MDCK 细胞的24孔板中,200ul一个孔,每个梯度设置3个副孔,在培养箱中吸附感染1-2h。提前加热低熔点琼脂糖使之融化。吸去病毒液,再用PBS洗一遍。待低熔点琼脂糖冷却至37℃时,与2×DMEM进行1:1混合,每孔加入400ul混合液。细胞培养板置于常温下静置20-30min 左右,使琼脂糖凝固,便可放回培养箱培养。每日观察培养板,直到显微镜下可以观察到细胞出现了明显的致细胞病变现象(CPE)和空斑。将培养板拿出来,每孔加入200ul的 0.2%的结晶紫染料,染色20-30min后用自来水冲洗掉琼脂糖。
实施例4、重组流感病毒的鉴定
用移液枪吸去细胞上清并用PBS洗两遍。将适量的Trizol加入六孔板,破碎细胞。细胞中RNA的提取参照说明书进行操作。提取的RNA用通用引物和随机引物做引物进行逆转录。对获得的cDNA进行PCR鉴定。用不同的引物分别鉴定重组病毒的NP、NS。结果如图5、6所示。由图5-图6可知,本发明实施例的重组流感病毒包装成功。
同时也在不同感染时间点收集病毒上清完成空斑试验,制备病毒生长曲线。结果如7 所示。由图7可知,重组病毒的生长曲线与野生型甲型流感病毒WSN的生长曲线相近似,符合预期。
实施例5、重组病毒作为人乳头瘤病毒疫苗的应用
6周龄SPF级C57BL/6小鼠分为两组:对照组、实验组,每组5只小鼠。小鼠在接下来两周内通过滴鼻的方式感染病毒。对照组通过PBS替代重组病毒。结束滴鼻三周后对每组中的小鼠进行断尾取血检测是否感染成功以及是否有抗体产生。通过蛋白印迹实验检测外源蛋白的表达,结果如图8所示。
由图8可知,免疫前,小鼠血清中是没有相应抗体的。免疫后,抗体产生了,蛋白大小为44KD。此外,由于ConsL2两端连接的是自剪切连接子,所以在蛋白表达过程中,可能出现多种蛋白片段的表达(NS1、ConsL2、NEP、NS1-ConsL2、ConsL2-NEP、NS1-ConsL2-NEP)。所以,蛋白片段大小为18KD的ConsL2-NEP也被检测到了。图中的 C2为重组病毒ConsL2的缩写。
用血清稀释液与假病毒稀释液混合孵育,血清的中和能力可以从对荧光值的抑制看出来,从而可以计算出中和滴度。结果如图9所示。
由图9可知,该抗体针对两种典型的高风险型的HPV假病毒(PsV16和PsV18)的中和效价大约都在103左右。
最后,还需要说明的是,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株及其制备方法与应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaacatgta aagcagcagg tacttgtcca tcagacggaa gcggacaact ttataaaaca 60
tgcaaacagg caggtacatg tccacctgac 90
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagactgatg gagaacgcca gaatgccact gaaatcagag 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatccttca ttactcatgt caaaggaggg cacgatcggg 40
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct 30
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agggccggga ttctcctcca cgtca 25
Claims (10)
1.一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株,其特征在于,
所述重组流感病毒株为表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的流感病毒载体通过反向遗传系统在细胞中拯救出的表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒;
所述编码人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的基因位于改造过的甲型流感病毒NS片段的开放阅读框内;编码所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的核心抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述改造过的甲型流感病毒NS片段的剪接位点进行了同义突变:将525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530;
所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的基因片段的5’端通过P2A连接子与甲型流感病毒NS1片段3端’连接;人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的基因片段的3’端通过T2A连接子与甲型流感病毒NEP片段5’端连接。
2.根据权利要求1所述的表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株,其特征在于,所述流感病毒载体包括A型流感病毒A/WSN/33或A/PR/8/34中的一种。
3.根据权利要求2所述的表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株,其特征在于,所述流感病毒载体为A型流感病毒A/WSN/33,所述表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202134。
4.权利要求1-3任一所述的表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株在制备人乳头瘤病毒疫苗中的应用以及在利用鸡胚或细胞作为生物反应器生产人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2中的应用。
5.一种人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒疫苗,其特征在于,包括权利要求1-3任一项所述的表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株,所述疫苗包括病毒载体疫苗、亚单位疫苗和蛋白疫苗中的一种。
6.一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
将甲型流感病毒NS片段中RNA剪接位点进行同义点突变,将525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530;
获得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示人乳头瘤病毒衣壳蛋白的串联基因;
将所述串联基因通过自剪接肽段连接于所述甲型流感病毒的NS1片段和NS2片段之间,获得5’-3’方向分别为NS1、自剪接肽段、人乳头瘤病毒衣壳蛋白串联基因、自剪接肽段、NS2的重组NS质粒;
将所述重组NS质粒和WSN的其他七个质粒共转染宿主细胞,获得表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的重组流感病毒株。
7.一种人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2,其特征在于,所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2为串联高度保守区HPV31 L2 aa 20-31和HPV16 L2 aa 17-31之间用GSG连接子连接而得,编码所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
8.一种编码权利要求7所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
9.一种表达载体,其特征在于,包含有权利要求8所述的核酸分子。
10.一种生物材料,其特征在于,所述生物材料为包含所述表达载体的细胞系或重组菌,所述细胞系包括MDCK、A549和VERO细胞系中的一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110684589.1A CN113502274A (zh) | 2021-06-21 | 2021-06-21 | 一种表达人乳头瘤病毒衣壳蛋白l2的重组流感病毒株及其制备方法与应用 |
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