CN112011521A - 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112011521A
CN112011521A CN202010542477.8A CN202010542477A CN112011521A CN 112011521 A CN112011521 A CN 112011521A CN 202010542477 A CN202010542477 A CN 202010542477A CN 112011521 A CN112011521 A CN 112011521A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
disease virus
newcastle disease
strain
coronavirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010542477.8A
Other languages
English (en)
Inventor
宋家升
余飞
毛水花
周孟云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Difu Runsi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Difu Runsi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Difu Runsi Biotechnology Co ltd filed Critical Zhejiang Difu Runsi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010542477.8A priority Critical patent/CN112011521A/zh
Publication of CN112011521A publication Critical patent/CN112011521A/zh
Priority to PCT/CN2021/087976 priority patent/WO2021253962A1/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用，属于基因工程疫苗技术领域。本发明所述疫苗候选株以新城疫病毒LaSota株为载体，所述新城疫病毒LaSota株的P基因和M基因之间插入突变(C3756T，去除BamHI位点)的新型冠状病毒S基因；所述突变的新型冠状病毒S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了安全有效，生产成本低而且可以通过鼻腔接种，刺激机体产生粘膜免疫的重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株，具有重要的应用价值和突出的公共卫生安全意义。

Description

一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建 方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒，也称SARS-CoV-2，以下简称新冠，是一种可导致呼吸系统疾病的病毒。此病毒可引起炎症及肺部气道内粘液和体液积聚(肺炎)。全面普及接种新冠疫苗，可能是终止流行的唯一可行途径。自然医学，MIT和哈佛团队均报道，鼻子或是新冠病毒感染的第一站和毒库。鼻杯状细胞和纤毛细胞能高表达新冠病毒感染所需的两个关键蛋白，并且通过杯状细胞的持续分泌作用传播病毒。研发通过鼻腔接种的疫苗和药物对于预防病毒感染至关重要。
目前，在研的新冠疫苗主要分为以下几个种类：mRNA类，全病毒灭活疫苗，腺病毒载体疫苗。一方面，这些疫苗大部分侧重刺激机体产生高水平的循环抗体(血液抗体)，使免疫者即使接触到了病毒也可以在很大程度得到保护。但是这些疫苗刺激机体产生局部粘膜免疫的效果微弱，使病毒仍可能在初始感染部位(如上呼吸道等)复制而造成局部感染，并存在持续向外界环境排毒的风险。另一方面，这些疫苗也都有各自的优势和劣势。mRNA疫苗目前还没有获批的产品，免疫效果及产业化工艺等效果均有待验证；灭活疫苗需要P3级安全等级的工厂培养活病毒，生产风险，产能及成本将可能是大规模普及的障碍；腺病毒载体疫苗可能需要考虑载体的抗体干扰和强载体效应。因此，综合考虑疫苗有效性，安全性，工艺成熟，成本可控，适合大规模普及接种的新型疫苗仍然是急需的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组新城疫病毒(NDV)载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用。本发明提供了安全有效，生产成本低而且可以通过鼻腔接种，刺激机体产生粘膜免疫的重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株，具有重要的应用价值和突出的公共卫生安全意义。
本发明提供了一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株，所述疫苗候选株以新城疫病毒LaSota株为载体，所述新城疫病毒LaSota株的P基因和M基因之间插入突变的新型冠状病毒S基因；所述突变的新型冠状病毒S基因含有沉默突变C3756T，去除了BamHI位点，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株的构建方法，包括以下步骤：
1)将突变的新型冠状病毒S基因以同源重组的方式克隆到新城疫病毒LaSota株的P基因和M基因之间，得到含S基因的载体；
2)将步骤1)得到的含S基因的载体与病毒拯救辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BHK21-T7细胞，拯救得到重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株。
本发明还提供了上述技术方案所述重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株或上述技术方案所述构建方法得到的重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株在制备预防或治疗新型冠状病毒感染疾病的试剂中的应用。
本发明提供了一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株。本发明提供的是一种表达新冠S抗原的重组NDV活载体新冠疫苗候选株，生长特性好，具有免疫效果。以NDV弱毒株LaSota株作为载体背景，在P基因和M基因插入SARS-CoV-2病毒的S基因(完整ORF)，并且在S基因的保守区引入C3756T的沉默突变，从而去除BamHI位点，形成特异性标记。试验结果表明，本发明疫苗候选株(NDV_SARS-CoV-2_S)可以在感染细胞表达完整S蛋白，并展示在细胞膜上；NDV_SARS-CoV-2_S疫苗候选株在鸡胚上生长特性良好，其血凝效价可达8-11log2；小鼠试验证明NDV_SARS-CoV-2_S疫苗候选株可以刺激小鼠产生针对S蛋白的特性免疫反应。本发明提供的疫苗候选株安全有效，生产成本低而且可以通过鼻腔接种，刺激机体产生粘膜免疫，具有重要的应用价值和突出的公共卫生安全意义。
附图说明
图1为本发明提供的将SARS-COV-2S基因完整的ORF插入到新城疫病毒基因组示意图；
图2为本发明提供的NDV_SARS-COV-2_S重组疫苗候选株的基因鉴定图；
图3为本发明提供的NDV_SARS-COV-2_S感染细胞BHK21，24h后检测新冠S蛋白，NDV载体蛋白的表达情况；
图4为本发明提供的NDV_SARS-COV-2_S新冠疫苗候选株鼻腔免疫4周龄BALB/c小鼠，血清特异性IgG抗体变化情况。
具体实施方式
本发明提供了了一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株，所述疫苗候选株以新城疫病毒LaSota株为载体，所述新城疫病毒LaSota株的P基因和M基因之间插入突变的新型冠状病毒S基因；所述突变的新型冠状病毒S基因为在保守区引入C3756T沉默突变的新型冠状病毒S基因，所述突变的新型冠状病毒S基因含有沉默突变C3756T，去除了BamHI位点，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacTcgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacCcgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctcggcgggcacgtagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactggaatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagagacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgctattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgacaaagttgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagtatataaaatggccatggtacatttggctaggttttatagctggcttgattgccatagtaatggtgacaattatgctttgctgtatgaccagttgctgtagttgtctcaagggctgttgttcttgtggatcTtgctgcaaatttgatgaagacgactctgagccagtgctcaaaggagtcaaattacattacacataa)。本发明所述新型冠状病毒S基因源自Genebank公布Wuhan-Hu-1毒株全基因序列(MN908947)。本发明在保守区引入C3756T沉默突变可以去除S基因的末端保守区BamHI位点，产生特殊的基因标记。本发明对所述基因的合成方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的基因合成公司进行人工合成即可。本发明对所述沉默突变的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规点突变方法即可。本发明将新城疫病毒载体用于新冠疫苗有很多优势，鼻腔接种方式对于呼吸道病毒的防控非常有优势，本发明所述疫苗候选株通过鼻腔接种的方式，不仅免疫方便，而且可以刺激粘膜产生分泌型IgA，阻止病毒感染初始部位，预防新冠病毒入侵，构建呼吸道第一道防线。另外，无需注射的接种方式有利于疫苗的大范围普及。在哺乳动物，新城疫病毒载体只会在呼吸道自限性复制，而不会扩散到其他器官，疫苗安全性得到保障。新城疫病毒载体载体疫苗株可以在多种细胞扩增，生产成本低，工艺成熟稳定，适合大规模普及和工业化生产。与其它现有相关疫苗联合使用，可以达到最佳的免疫效果。
本发明还提供了上述技术方案所述重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株的构建方法，包括以下步骤：
1)将突变的新型冠状病毒S基因以同源重组的方式克隆到新城疫病毒LaSota株的P基因和M基因之间，得到含S基因的载体；
2)将步骤1)得到的含S基因的载体与病毒拯救辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BHK21-T7细胞，拯救得到重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株。
本发明将突变的新型冠状病毒S基因以同源重组的方式克隆到新城疫病毒LaSota株的P基因和M基因之间，得到含S基因的载体。本发明对所述沉默突变的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规点突变方法即可。本发明对所述同源重组的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规同源重组方法即可，如使用商品化的试剂盒：
Figure BDA0002539376840000061
HD Cloning Kit(Clontech)进行操作。
得到含S基因的载体后，本发明将含S基因的载体与病毒拯救辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BHK21-T7细胞，拯救得到重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株。本发明对所述转染和拯救方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规转染和拯救方法即可。
本发明还提供了上述技术方案所述重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株或上述技术方案所述构建方法得到的重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株在制备预防或治疗新型冠状病毒感染疾病的试剂中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
一.合成新冠病毒全长S基因
根据Genebank公布Wuhan-Hu-1毒株全基因序列(MN908947)，在S基因的阅读框(ORF)中引入C3756T沉默突变。新冠病毒完整S基因ORF由南京擎科生物科技有限公司合成。合成基因序列如SEQ ID NO.1所示。
二.将新冠S基因插入NDV基因组
采用可表达NDV-LaSota全长RNA的基于人工染色体的病毒反向遗传载体(图1中的A)，将新冠病毒的S基因通过常规的同源重组的方式克隆到新城疫病毒基因组P-M之间，成功构建含新冠病毒S基因的重组新城疫病毒载体(图1中的B)。同源重组使用商品化的试剂盒：
Figure BDA0002539376840000062
HD Cloning Kit(Clontech)。
图1为将SARS-COV-2S基因完整的ORF插入到新城疫病毒基因组示意图。其中，(A)为表达全长NDV-LaSota株的反向遗传病毒载体；(B)为插入基因盒(SEQ ID NO.2)示意图；GE，IG，GS(下划线)分别为：NDV转录终止序列，间隔序列，转录起始序列；Kozak(斜体字)为：真核表达增强序列；S-ORF(加粗)为：S基因完整ORF；PmeI位点。
三.重组NDV载体新冠疫苗候选株的拯救
提取含新冠病毒S基因的重组新城疫病毒载体，和病毒拯救辅助pCI-NP，pCI-P和pCI-L的质粒，经Nano drop测定质粒浓度后，转染BHK21-T7细胞。
1.转染方法：
(1)于6孔板中培养BHK21-T7细胞，待细胞生长至80％～90％时，无菌PBS洗3次；
(2)取500μL Opti-MEM于1.5mL离心管中，随后按照1:1:1:1的比例分别加入含新冠病毒S基因的重组新城疫病毒载体，pCI-NP，pCI-P和pCI-L质粒，每管质粒总量为4μg，供1个孔使用；
(3)向上述溶液中加入3μL Plus reagent，室温作用5min；
(4)加入9μL Lipofectamine LTX，轻轻混匀；室温作用30min；
(5)加入上述转染复合物，再加入2mL Opti-MEM，37℃二氧化碳培养箱孵育18～48h。
2.在转染24h后，加入终浓度为0.5μg/μL的TPCK胰酶以便使弱毒株能够成功拯救。待转染72h后，反复冻融细胞3次，并将混合物接种9日龄SPF鸡胚，0.5mL/胚。弃去24h内的死胚，收获24～120h内所有死亡和存活的鸡胚尿囊液，逐个测定血凝效价。所获得的具有HA活性的胚液，每1份均单独测定其S基因序列，确定分子标签C3756T是否存在。所获得的拯救病毒命名为NDV_SARS-COV-2_S。
四.重组NDV载体新冠疫苗候选株的体外实验评价
1.病毒生长特性
按照常规微量法进行鸡红细胞血凝(HA)实验测定病毒的生长滴度。初始拯救病毒的HA效价5-6log2，经过传代适应后，病毒效价可显著提高，其效价可达到8-11log2。
2.重组病毒PCR鉴定及测序分析
拯救的重组NDV_SARS-COV-2_S经过RT-PCR和测序鉴定，表明完整的S基因成功插入到NDV基因组中，并且含有人工引入的基因标记C3756T的沉默突变(图2，NDV_SARS-COV-2_S重组疫苗候选株的基因鉴定图；(A)为将S基因和部分NDV基因分为三个基因片段，用RT-PCR特异性扩增；(B)为特异性扩增片段进行进一步测序鉴定；(C)为重组疫苗株含有特异性基因标记(S基因沉默突变C3756T，去除BamHI位点))。
3.重组病毒新冠S抗原的体外表达
采用间接免疫荧光方法检测重组NDV载体新冠疫苗候选株是否在感染细胞表达新冠S抗原。用NDV空载体作为对照。结果表明全长S蛋白可以明显大量表达在BHK21细胞膜上，这一特点和S蛋白是病毒的囊膜蛋白相符。此外本发明使用的是针对受体结合区的人源单抗，该抗体可以和S蛋白发生特异性结合反应，提示表达在细胞膜表面的S蛋白呈现出其天然构象。此特性为该疫苗株成功诱导特异性保护性免疫反应打下坚实基础。
免疫荧光操作方法如下：
(1)12孔板BHK21在大约85％的密度时接毒，用PBS洗1次，每孔加入500微升终浓度含0.5μg/μL TPCK胰酶的opti-MEM培养液。接毒孔加入100微升的10倍稀释病毒液。
(2)感染24小时后，弃去细胞上清，细胞用4％多聚甲醛固定，室温放置20min，用PBS洗3次，每次3min，最后一遍吸尽液体。
(3)加入0.2％Triton 100微升，室温放置10min，用PBS洗3次，每次3min。
(4)加入5％BSA，37℃孵育1h，用PBS洗3次，每次3min。
(5)加入1:100稀释的一抗，一抗包含两种抗体，一种是NDV鸡血清，一种是针对新冠S蛋白受体结合区(三优生物，AHA003)人源单抗(0.5mg/mL)。加入一抗后37℃孵育1h，用PBS洗3次，每次3min。
(6)加入稀释的二抗，二抗含有两种抗体，一种是1:1000稀释的红光标记驴抗鸡IgY，一种是1:500稀释的绿光标记的羊抗鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Inc)。加入二抗后37℃孵育0.5h，用PBS洗3次，每次3min。
(7)加入1:100稀释的DAPI(5mg/mL)染料染核，用PBS洗3次，每次3min。
(8)最后加适量PBS，在荧光显微镜下观察结果。
结果如图3所示，图3为NDV_SARS-COV-2_S感染细胞BHK21，24h后检测新冠S蛋白，NDV载体蛋白的表达情况。用针对RBD区的人源单抗进行免疫荧光染色，从S蛋白这一列可见重组NDV载体转染的细胞中，S蛋白清晰表达在细胞膜上(绿色荧光)，而NDV空载体和空白对照则观察不到荧光。
五.重组NDV载体新冠疫苗在小鼠中初步评价
图4为NDV_SARS-COV-2_S新冠疫苗候选株鼻腔免疫4周龄BALB/c小鼠，血清特异性IgG抗体变化情况；其中，(A)为免疫程序和血清收集时间示意图；(B)为血清IgG抗体(针对S1蛋白)14，21，28天的动态变化。将5只4周龄BALB/c按照图4中的A所示，进行两次鼻腔接种105.0EID50。免疫后14，21，28天检测血清中针对S1蛋白的特异性IgG抗体。将小鼠采集血清20倍稀释后，用间接ELISA试剂盒(鼠新型冠状病毒抗体检测试剂盒，北京派迪畅科技发展有限公司)，检测针对S1的IgG抗体。结果表明OD450值在免疫14天后高于免疫前的基础背景值，提示免疫14天后开始产生特异性IgG抗体；21天抗体有明显提高，但是抗体滴度离散度较大，提示不同动物的免疫反应并不同步；免疫后28天，抗体滴度进一步提高，而且抗体滴度整齐，提示特异性免疫反应已经逐步建立并完善(图4中的B)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江迪福润丝生物科技有限公司
<120> 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcactc gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacccgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480
tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcttgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822
<210> 2
<211> 3891
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtttaaactt agaaaaaata cgggtagaag tgccgccacc atgtttgttt ttcttgtttt 60
attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc agaactcaat taccccctgc 120
atacactaat tctttcactc gtggtgttta ttaccctgac aaagttttca gatcctcagt 180
tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc aatgttactt ggttccatgc 240
tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat aaccctgtcc taccatttaa 300
tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata ataagaggct ggatttttgg 360
tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt aataacgcta ctaatgttgt 420
tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt ttgggtgttt attaccacaa 480
aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat tctagtgcga ataattgcac 540
ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa ggaaaacagg gtaatttcaa 600
aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat tttaaaatat attctaagca 660
cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt tcggctttag aaccattggt 720
agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact ttacttgctt tacatagaag 780
ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct ggtgctgcag cttattatgt 840
gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat gaaaatggaa ccattacaga 900
tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag tgtacgttga aatccttcac 960
tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc caaccaacag aatctattgt 1020
tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa gtttttaacg ccaccagatt 1080
tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac tgtgttgctg attattctgt 1140
cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat ggagtgtctc ctactaaatt 1200
aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt gtaattagag gtgatgaagt 1260
cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat tataattata aattaccaga 1320
tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat cttgattcta aggttggtgg 1380
taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat ctcaaacctt ttgagagaga 1440
tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt aatggtgttg aaggttttaa 1500
ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact aatggtgttg gttaccaacc 1560
atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca ccagcaactg tttgtggacc 1620
taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat ttcaacttca atggtttaac 1680
aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg cctttccaac aatttggcag 1740
agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag acacttgaga ttcttgacat 1800
tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca ggaacaaata cttctaacca 1860
ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc cctgttgcta ttcatgcaga 1920
tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct aatgtttttc aaacccgtgc 1980
aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat gagtgtgaca tacccattgg 2040
tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct cctcggcggg cacgtagtgt 2100
agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt gcagaaaatt cagttgctta 2160
ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt agtgttacca cagaaattct 2220
accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg tacatttgtg gtgattcaac 2280
tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt acacaattaa accgtgcttt 2340
aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa gtttttgcac aagtcaaaca 2400
aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt aatttttcac aaatattacc 2460
agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat ctacttttca acaaagtgac 2520
acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc cttggtgata ttgctgctag 2580
agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt ttgccacctt tgctcacaga 2640
tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt acaatcactt ctggttggac 2700
ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg caaatggctt ataggtttaa 2760
tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa aaattgattg ccaaccaatt 2820
taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc acagcaagtg cacttggaaa 2880
acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac acgcttgtta aacaacttag 2940
ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc ctttcacgtc ttgacaaagt 3000
tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga cttcaaagtt tgcagacata 3060
tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct tctgctaatc ttgctgctac 3120
taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt gatttttgtg gaaagggcta 3180
tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta gtcttcttgc atgtgactta 3240
tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc atttgtcatg atggaaaagc 3300
acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca cactggtttg taacacaaag 3360
gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca tttgtgtctg gtaactgtga 3420
tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct ttgcaacctg aattagactc 3480
attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca tcaccagatg ttgatttagg 3540
tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa aaagaaattg accgcctcaa 3600
tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc caagaacttg gaaagtatga 3660
gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt atagctggct tgattgccat 3720
agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc tgtagttgtc tcaagggctg 3780
ttgttcttgt ggatcttgct gcaaatttga tgaagacgac tctgagccag tgctcaaagg 3840
agtcaaatta cattacacat aagtttaaac ttagaaaaaa tacgggtaga a 3891

Claims (3)

1.一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株，其特征在于，所述疫苗候选株以新城疫病毒LaSota株为载体，所述新城疫病毒LaSota株的P基因和M基因之间插入突变的新型冠状病毒S基因；所述突变的新型冠状病毒S基因含有沉默突变C3756T，去除了BamHI位点，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株的构建方法，包括以下步骤：
1)将突变的新型冠状病毒S基因以同源重组的方式克隆到新城疫病毒LaSota株的P基因和M基因之间，得到含S基因的载体；
2)将步骤1)得到的含S基因的载体与病毒拯救辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BHK21-T7细胞，拯救得到重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株。
3.权利要求1所述重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株或权利要求2所述构建方法得到的重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株在制备预防或治疗新型冠状病毒感染疾病的试剂中的应用。
CN202010542477.8A 2020-06-15 2020-06-15 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用 Pending CN112011521A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010542477.8A CN112011521A (zh) 2020-06-15 2020-06-15 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
PCT/CN2021/087976 WO2021253962A1 (zh) 2020-06-15 2021-04-19 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010542477.8A CN112011521A (zh) 2020-06-15 2020-06-15 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112011521A true CN112011521A (zh) 2020-12-01

Family

ID=73506763

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010542477.8A Pending CN112011521A (zh) 2020-06-15 2020-06-15 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112011521A (zh)
WO (1) WO2021253962A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021229311A1 (es) * 2020-05-13 2021-11-18 Laboratorio Avi-Mex, S.A. De C.V. Vacuna recombinante contra covid-19 en vector viral de paramixovirus
WO2021253962A1 (zh) * 2020-06-15 2021-12-23 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
CN113881704A (zh) * 2021-11-17 2022-01-04 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和疫苗
CN114196701A (zh) * 2021-11-17 2022-03-18 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种sars-cov-2的二价重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和制备方法
WO2022149058A1 (es) * 2021-01-08 2022-07-14 Farmacologicos Veterinarios Sac Composición inmunogénica viva recombinante que comprende el virus de la enfermedad de newcastle (ndv) que expresa la subunidad s1 y el rbd de la proteína spike del sars-cov-2
US11484588B1 (en) 2021-04-02 2022-11-01 Qingdao Harwars Biology Group Ltd. Paramyxovirus vaccine strain for novel coronavirus pneumonia and construction method thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117004579A (zh) * 2023-06-29 2023-11-07 苏州恩立维生物科技有限公司 重组溶瘤牛痘病毒及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101351557A (zh) * 2005-10-28 2009-01-21 生物载体株式会社 利用以rna病毒或dna病毒的刺突蛋白质假型化的慢病毒载体将基因导入呼吸道上皮干细胞
CN105251000A (zh) * 2014-09-30 2016-01-20 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒疫苗组合物及其制备方法和应用
US20190046634A1 (en) * 2017-08-09 2019-02-14 Auburn University Recombinant spike ectodomain proteins, compositions, vectors, kits, and methods for immunizing against avian infectious bronchitis virus
US20190358316A1 (en) * 2017-02-06 2019-11-28 University Of Maryland, College Park Infectious bronchitis virus vaccine using newcastle disease viral vector

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112011521A (zh) * 2020-06-15 2020-12-01 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101351557A (zh) * 2005-10-28 2009-01-21 生物载体株式会社 利用以rna病毒或dna病毒的刺突蛋白质假型化的慢病毒载体将基因导入呼吸道上皮干细胞
CN105251000A (zh) * 2014-09-30 2016-01-20 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒疫苗组合物及其制备方法和应用
US20190358316A1 (en) * 2017-02-06 2019-11-28 University Of Maryland, College Park Infectious bronchitis virus vaccine using newcastle disease viral vector
US20190046634A1 (en) * 2017-08-09 2019-02-14 Auburn University Recombinant spike ectodomain proteins, compositions, vectors, kits, and methods for immunizing against avian infectious bronchitis virus

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEI ZHAO 等: "P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression", J GEN VIROL ., pages 40 - 45 *
半夏: "全球首个重组新城疫病毒 (NDV)载体新冠疫苗候选株构建成功", pages 1, Retrieved from the Internet <URL:https://ibook.antpedia.com/x/444649.html> *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021229311A1 (es) * 2020-05-13 2021-11-18 Laboratorio Avi-Mex, S.A. De C.V. Vacuna recombinante contra covid-19 en vector viral de paramixovirus
WO2021253962A1 (zh) * 2020-06-15 2021-12-23 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
WO2022149058A1 (es) * 2021-01-08 2022-07-14 Farmacologicos Veterinarios Sac Composición inmunogénica viva recombinante que comprende el virus de la enfermedad de newcastle (ndv) que expresa la subunidad s1 y el rbd de la proteína spike del sars-cov-2
US11484588B1 (en) 2021-04-02 2022-11-01 Qingdao Harwars Biology Group Ltd. Paramyxovirus vaccine strain for novel coronavirus pneumonia and construction method thereof
CN113881704A (zh) * 2021-11-17 2022-01-04 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和疫苗
CN114196701A (zh) * 2021-11-17 2022-03-18 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种sars-cov-2的二价重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和制备方法
WO2023087532A1 (zh) * 2021-11-17 2023-05-25 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和疫苗
CN114196701B (zh) * 2021-11-17 2023-10-10 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种sars-cov-2的二价重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和制备方法
CN113881704B (zh) * 2021-11-17 2024-02-13 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021253962A1 (zh) 2021-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112011521A (zh) 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
WO2021254327A1 (zh) 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
CN111575247B (zh) 一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用
CN111560354A (zh) 重组新型冠状病毒及其制备方法和应用
US10918710B2 (en) Temperature-sensitive attenuated FMDV strains, construction method and application thereof
CN111019910B (zh) F基因型腮腺炎病毒减毒株及构建方法和应用
CN113201507B (zh) 一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗组合物
US20230285540A1 (en) Polynucleotides encoding sars-cov-2 antigens and use thereof in the medical field as vaccines
CN110951699B (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN110218706B (zh) 表达h7n9亚型高致病性禽流感病毒ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用
CN107201346B (zh) 3b蛋白优势表位缺失的口蹄疫标记疫苗株及其构建方法和应用
CN113174392A (zh) 一种狂犬病毒的重组基因、重组假病毒及其构建方法和应用
CN115785284A (zh) 一种融合蛋白hn-rbd、编码基因、重组ndv病毒载体、重组ndv病毒及其应用
CN113817753B (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
CN112111503B (zh) 同时预防禽流感h5和h9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法
CN114292823A (zh) 携带基因VII型新城疫病毒F和HN基因的重组LaSota疫苗株及其构建方法和应用
CN116144612B (zh) 重组乙型流感病毒及其制备方法与应用
CN115975953A (zh) 编码禽流感h5n1 ha的新城疫病毒及其在制备生物佐剂二联疫苗中的应用
CN112029735B (zh) 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3b优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用
CN101768575B (zh) 双表达g基因的重组狂犬病病毒的构建及其生物学特性分析
CN111647610B (zh) 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用
CA3195621A1 (en) Recombinant hvt and uses thereof
CN110042084A (zh) 一种活病毒流感疫苗的生产方法以及制剂
US20220323571A1 (en) Paramyxovirus vaccine strain for novel coronavirus pneumonia and construction method thereof
CN111254123B (zh) 一种表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination