CN111363727B

CN111363727B - 携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111363727B
Application number: CN202010065408.2A
Authority: CN
Inventors: 朱应; 聂龙宇; 佘应龙; 刘实
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: CN111363727A

Abstract

本发明公开了一种携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用。本发明由幽门螺杆菌抗原或抗原优势表位整合入流感病毒基因组NS片段中组成的重组流感病毒。本发明的携带幽门螺杆菌的重组流感病毒可以在宿主细胞或鸡胚中稳定传代，可以用于幽门螺杆菌疫苗开发、相关药物的开发以及利用鸡胚或细胞作为生物反应器生产幽门螺杆菌蛋白。

Description

携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是指一种携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用。

背景技术

A型流感病毒(influenzaAvirus),属于正粘病毒科，其基因组由8个负极性RNA片段(vRNA)组成。在流感病毒中其基因组的8个RNA片段与三种聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)以及核蛋白(NP)结合形成了具有活性的核糖核蛋白聚合体(RNPs)(Eisfeld A J,Neumann G,Kawaoka Y.At the centre:influenza A virus ribonucleoproteins[J].NatureReviews Microbiology,2015,13(1):28-41.)。A型流感病毒感染宿主细胞时，血细胞凝集素(HA)介导病毒颗粒与宿主细胞上唾液酸受体结合。在流感病毒以膜融合的方式进入细胞后，病毒会释放出RNPs，RNPs进入细胞核后开始病毒基因组的复制与转录，8种RNA片段分别转录出信使RNA(mRNA)和互补RNA(cRNA)，mRNA经翻译合成病毒蛋白，cRNA通过复制产生vRNA，之后经过组装产生子代流感病毒(Hutchinson E C,Fodor E.Transport of theinfluenza virus genome from nucleus to nucleus[J].Viruses,2013,5(10):2424-2446.)。

甲型流感病毒的基因组包含8个片段。其中病毒片段聚合酶(PB2)、血细胞凝集素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)的mRNA是单顺反子。很多研究发现聚合酶PB1包含多个翻译起始位点。聚合酶(PA)则可以通过核糖体移框和多个翻译起始位点编码多种蛋白。基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)则会发生RNA的剪接产生多种mRNA(Dubois J,Terrier O,Rosa-Calatrava M.Influenza viruses and mRNA splicing:doing more with less[J].MBio,2014,5(3):e00070-14.)。通过将M和NS中的RNA剪接位点突变并将其开放阅读框通过连接肽连接也可以表达相应的蛋白，拯救出的重组流感病毒在适宜条件下可以正常的复制。

流感病毒反向遗传系统目前主要包括8质粒系统和12质粒系统。目前国际上常用的为8质粒系统，因为12质粒系统所需质粒较多并且对转染效率要求更高。通过将流感病毒基因组8个vRNA的cDNA以克隆的方式正向插入到polⅡ启动子(从人巨细胞瘤病毒CMV启动子衍化而来)和终止序列(牛生长激素poly(A)信号bGH)之间，并在此表达盒之间还反向插入了人polⅠ启动子和鼠polⅠ终止序列从而形成了一个双向表达系统。将这套系统质粒转染真核细胞，就可以实现在同一个模板上由polⅠ控制合成负链vRNA，由polⅡ控制合成正链mRNA并表达蛋白质，之后通过组装产生流感病毒从而完成流感病毒的拯救(Hoffmann E,Neumann G,Kawaoka Y,et al.A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids[J].Proceedings of the National AcademyofSciences,2000,97(11):6108-6113.)。因为流感病毒反向遗传系统的开发，使得通过对流感病毒基因组改造拯救出携带有外源片段的重组流感病毒变成了可能。

近年，多种来源的2A肽的多基因载体构建策略受到广泛关注(Ryan M D,King A MQ,Thomas G P.Cleavage of foot-and-mouth disease virus polyprotein is mediatedby residues located within a 19amino acid sequence[J].Journal of GeneralVirology,1991,72(11):2727-2732.)。该策略规避了多基因表达时蛋白活性不高或下游基因表达量低等缺点，具备明显的优势，是目前较为理想的多基因表达策略。在流感病毒改造中利用2A多肽也越来越常见(Pan W,Dong Z,Li F,et al.Visualizing influenza virusinfection in living mice[J].Nature communications,2013,4:2369.)(ManicassamyB,Manicassamy S,Belicha-VillanuevaA,et al.Analysis of in vivo dynamics ofinfluenza virus infection in mice using a GFP reporter virus[J].Proceedingsofthe NationalAcademy ofSciences,2010,107(25):11531-11536.)。

幽门螺杆菌是一种微需氧的革兰氏阴性菌。幽门螺杆菌目前已经感染了世界上超过一半的人口并且与引起胃部疾病如胃炎、胃和十二指肠溃疡以及胃癌有密切的联系(Eurogast Study Group.An international association between Helicobacterpylori infection and gastric cancer[J].The Lancet,1993,341(8857):1359-1363.)。因此幽门螺杆菌被世界卫生组织定义为一级致癌物质。目前国际上广泛使用的疗法为多种抗生素联合质子泵抑制剂(PPI)共同治疗(JI W.Anonymous.NIH ConsensusConference.Helicobacter pylori in peptic ulcer disease.NIH ConsensusDevelopment Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease[J].JAMA,1994,272:65-69.)。这种治疗方法可以清除胃中90％以上的幽门螺杆菌。但是这种疗法只能清除胃中的幽门螺杆菌并不能对人进行预防幽门螺杆菌的感染，并且在世界上的很多国家均出现了幽门螺杆菌对克拉霉素、甲硝唑等抗生素的耐药性。因此，保护性和治疗性的幽门螺杆菌疫苗制备成为了很多国家对幽门螺杆菌研究的重点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的提供一种携携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒，其特征在于：

所述重组流感病毒为甲型流感病毒；

所述重组流感病毒的载体为A型流感病毒A/WSN/33或A/PR/8/34；

所述重组流感病毒可以通过流感病毒反向遗传系统在细胞中拯救出携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒；所述重组流感病毒可以在MDCK细胞、A549细胞、VERO细胞或鸡胚中进行传代和扩增；

所述幽门螺杆菌基因片段位于经改造甲型流感病毒NS片段上；所述重组流感病毒中幽门螺杆菌基因来源为幽门螺杆菌鼠适应株。

作为一种优选方案，所述幽门螺杆菌基因为UreA/B亚单位优势抗原表位，其编码基因序列如SEQ ID NO：1所示，已于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO:V202011。(保藏单位代码：CCTCC；保藏日期：2019年12月24日；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；分类命名：甲型流感病毒IAV-HP-1；存活)

作为另一种优选方案，所述幽门螺杆菌基因为UreA/B亚单位、NapA、Lpp20、HpaA联合优势抗原表位，其编码基因序列如SEQ ID NO：2所示，已于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO:V202012。(保藏单位代码：CCTCC；保藏日期：2019年12月24日；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；分类命名：甲型流感病毒IAV-HP-2；存活)

第二方面，本发明提供一种上述携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为293T、COS细胞或293T和MDCK、COS和MDCK共培养细胞系；所述重组流感病毒可以在9-11日龄鸡胚、MDCK、Vero、A549细胞中稳定传代。

第三方面，本发明提供一种上述携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：

(1)将甲型流感病毒NS片段中RNA剪接位点进行同义点突变；在此基础上通过基因合成手段合成NS1和NS2两端序列；将幽门螺杆菌基因通过自剪接肽段连接于NS1片段后，NS2片段前，形成了5’-3’方向分别为NS1、自剪接肽段、幽门螺杆菌基因、自剪接肽段、NS2的重组NS质粒；其中每段基因的的开放阅读框均保持一致；

(2)将步骤(1)中的重组NS质粒与剩余野生型质粒转染宿主细胞进行拯救重组病毒；

所述外源片段可以为幽门螺杆菌的保护性抗原及优势表位；或者所述外源片段可以是尿素酶A和B的全基因或优势表位、或NapA的全基因或优势表位、或Lpp20的全基因或优势表位、或HpaA的全基因或优势表位；或者也可以是以上多种蛋白的优势表位。

第四方面，本发明提供一种上述携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，其特征在于：所述幽门螺杆菌疫苗为单基因、多价嵌合疫苗；所述重组流感病毒可用通用技术加工可供临床用的制剂，所述制剂包括液体制剂、冻干制剂、胶囊制剂、片剂或丸剂中的任一种。

作为优选方案，所述疫苗的接种途径包括肌肉注射、皮下注射、口服，还包括鼻腔、口腔、肛门和阴道粘膜途径。

第五方面，本发明提供一种上述携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒在利用鸡胚作为生物反应器生产幽门螺杆菌蛋白中的应用。

上述重组病毒可以在9-11日龄鸡胚、MDCK、Vero、A549细胞中稳定传代。

本发明中的重组流感病毒可以用作单基因、多价嵌合疫苗，可用通用技术加工可供临床用的各种制剂，所述的制剂选自液体制剂、冻干制剂、胶囊制剂、片剂、丸剂中的一种，优选剂型是液体剂型、动干剂型、胶囊剂型，更有选液体剂型和冻干剂型，最优选液体剂型。

本发明用作疫苗时其接种途径包括肌肉注射、皮下注射、口服，还包括鼻腔、口腔、肛门、阴道粘膜途径。

本发明所述携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒可以用作(一)幽门螺杆菌疫苗的制备。(二)幽门螺杆菌蛋白的功能研究(三)利用鸡胚作为生物反应器生产幽门螺杆菌蛋白。

本发明的优点及有益效果如下：

1、本发明首次以流感病毒为载体表达幽门螺杆菌抗原，目前国内外还无相关文献报道。开创了幽门螺杆菌疫苗的先河。

2、喷鼻免疫是简单、有效适合广大人群使用的免疫方式。相比于目前的治疗幽门螺杆菌的手段，利用重组流感病毒进行免疫方法更为便捷。

3、本发明中携带幽门螺杆菌的重组流感病毒可以同时作为幽门螺杆菌和流感病毒疫苗使用，具有两种疫苗的功效。

4、利用鸡胚作为生物反应器生产幽门螺杆菌蛋白。

附图说明

图1左图为A型流感病毒基因组示意图。右图为改造NS片段之后的重组病毒基因组示意图。

图2所示A型流感病毒基因组中NS发生可变剪接从而产生两种mRNA，分别是NS1和NEP。

图3所示通过将NS片段进行改造，将两种自剪接多肽插入NS1和NS2的开放阅读框中之后将外源片段插入到两种自剪接多肽片段中构建全新携带有幽门螺杆菌基因的流感病毒NS片段。

图4为改造NS的具体实施方案。

SD为剪接供体位点，SA为剪接受体位点。将NS片段525-530位的6个碱基CCAGGA同义突变为CCCGGG从而破坏了NS片段上剪接受体位点，使NS无法自然发生可变剪接。在NS1开放阅读框后连接自剪接多肽片段，NEP片段前引入P2A片段并将外源片段插入自剪接多肽之间并使NS1、自剪接多肽1、外源片段、自剪接多肽2处在同一开放阅读框内。

图5为含有幽门螺杆菌片段的重组流感病毒和野生型病毒感染MDCK后，提取RNA经过RT-PCR检测流感病毒NP的电泳图。

图6为含有幽门螺杆菌片段的重组流感病毒和野生型病毒感染MDCK后，提取RNA经过RT-PCR检测流感病毒NS的电泳图。

图7为含有幽门螺杆菌片段的重组流感病毒和野生型病毒感染MDCK后，提取RNA经过RT-PCR检测流感病毒中幽门螺杆菌基因的电泳图。

图8为重组流感病毒免疫小鼠的说明图。

图9为实验组和对照组小鼠经感染12周后血清中IgA的含量。

图10为实验组和对照组小鼠经感染12周后血清中IgG的含量。

图11为实验组和对照组小鼠经感染12周后胃中幽门螺杆菌的数量。

具体实施方式

为了使本发明更好理解，下面通过几种优化方案对本发明进行阐述。

实施例1：重组NS片段的构建

1.利用分子生物学手段对NS片段中RNA剪接位点进行同义点突变，525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530。

2.幽门螺杆菌基因由基因合成手段合成获得。

3.将突变后的NS片段根据NS1和NS2的开放阅读框通过自剪接多肽与外源幽门螺杆菌基因连接得到重组NS片段，如图4所示。构建好的重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变。

实施例2：重组流感病毒的拯救

将流感病毒野生型PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M以及重组质粒共转染293T或COS细胞，也可以转染293T或COS与MDCK的共培养细胞系，6h后换成含有TPCK胰酶的DMEM培养基。TPCK胰酶终浓度1ug/ml。在37℃，5％C0₂环境下，培养48h，收集上清。收集的上清经过澄清感染MDCK细胞。48-72h后收集上清进行空斑纯化，三轮空斑纯化后在MDCK中扩增病毒最后获得携带幽门螺杆菌基因的流感病毒疫苗株。

实施例3：空斑纯化流感病毒

病毒吸附前，消化MDCK细胞，将其铺入6孔板中，每孔细胞数为10⁶。MDCK贴壁后并长成单层细胞后吸去培养基用PBS洗两遍。用含有0.3％BSA的PBS溶液对收集到的含有病毒的上清进行10倍稀释并按照每孔400ul的量加入六孔板中，每个梯度应适量设置副孔。吸附时间为1h，吸附结束后用PBS洗去残留上清。将2×DMEM与已经融化好的低熔点琼脂糖1:1混合并加入TPCK胰酶，终浓度1ug/ml。每孔中加入2ml混合物，待其冷却凝固后放入37℃培养箱中培养3天。3天后观察空斑生长情况。

实施例4：重组流感病毒的鉴定

用移液枪吸去细胞上清并用PBS洗两遍。将适量的RNAiso Plus加入六孔板，溶解细胞。细胞中RNA的提取参照说明书进行操作。提取的RNA用通用引物和随机引物做引物进行逆转录。对获得的cDNA进行PCR鉴定。用不同的引物分别鉴定重组病毒的NP、NS以及外源片段。结果如图5、6、7所示。

实施例5：重组病毒作为幽门螺杆菌疫苗的应用

6周龄SPF级C57BL/6小鼠分为三组：对照组、实验组1和实验组2，每组5只小鼠。小鼠在接下来两周内通过灌胃4次感染幽门螺杆菌。对照组通过PBS替代幽门螺杆菌。结束灌胃三周后对每组中的小鼠检测是否感染成功。灌胃后4周后用重组流感病毒通过滴鼻感染小鼠进行第一次免疫。第一次免疫三周后进行第二次免疫，第二次免疫两周后对小鼠进行取血并安乐死。整个流程如图8所示。通过ELISA测定小鼠血清中IgG、IgA。结果如图9、10所示。小鼠的胃经匀浆处理经布式肉汤培养基梯度稀释涂布在哥伦比亚血琼脂平板培养3天。之后通过平板计数计算小鼠胃中幽门螺杆菌数量。结果如图11所示。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 462

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 1

atgggcatta agcttaacta tgtagaagca gtagctttga ttagtgccca tattatggaa 60

gaagcgagag ctggtaaaaa gactaagaaa tctgtagaat tgattgacat tggcggtaac 120

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<210> 2

<211> 420

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 2

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Claims

1.一种携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒，其特征在于：

所述重组流感病毒为甲型流感病毒；

所述重组流感病毒的载体为A型流感病毒A/WSN/33或A/PR/8/34；

所述重组流感病毒通过流感病毒反向遗传系统在细胞中拯救出携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒；所述重组流感病毒在MDCK细胞、A549细胞、VERO细胞或鸡胚中进行传代和扩增；

所述幽门螺杆菌基因片段位于经改造甲型流感病毒NS片段上；所述重组流感病毒中幽门螺杆菌基因来源为幽门螺杆菌鼠适应株；

所述幽门螺杆菌基因为Ure A/B亚单位优势抗原表位，其编码基因序列如SEQ ID NO：1所示，已于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO:V202011。

2.根据权利要求1所述的携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒，其特征在于：所述幽门螺杆菌基因为Ure A/B亚单位、NapA、Lpp20、HpaA联合优势抗原表位，其编码基因序列如SEQID NO：2所示，已于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO:V202012。

3.一种如权利要求1或2所述携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为293T、COS细胞或293T和MDCK、COS和MDCK共培养细胞系；所述重组流感病毒在9-11日龄鸡胚、MDCK、Vero、A549细胞中稳定传代。

4.一种制备如权利要求1或2所述携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒的方法，其特征在于：包含如下步骤：

（1）将甲型流感病毒NS片段中RNA剪接位点进行同义点突变；在此基础上通过基因合成手段合成NS1和NS2两端序列；将幽门螺杆菌基因通过自剪接肽段连接于NS1片段后，NS2片段前，形成了5’-3’方向分别为NS1、自剪接肽段、幽门螺杆菌基因、自剪接肽段、NS2的重组NS质粒；其中每段基因的的开放阅读框均保持一致；

（2）将步骤（1）中的重组NS质粒与剩余野生型质粒转染宿主细胞进行拯救重组病毒；

所述外源片段为幽门螺杆菌的保护性抗原及优势表位；或者所述外源片段是尿素酶A和B的全基因或优势表位、或NapA的全基因或优势表位、或Lpp20的全基因或优势表位、或HpaA的全基因或优势表位；或者也是以上多种蛋白的优势表位。

5.一种如权利要求1或2所述携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，其特征在于：所述幽门螺杆菌疫苗为单基因、多价嵌合疫苗；所述重组流感病毒用通用技术加工可供临床用的制剂，所述制剂为液体制剂、冻干制剂、胶囊制剂、片剂或丸剂中的任一种。

6.根据权利要求5所述携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，其特征在于：所述疫苗的接种途径为肌肉注射、皮下注射、口服，或者为鼻腔、口腔、肛门和阴道粘膜途径。

7.一种如权利要求1或2所述携带幽门螺杆菌基因的重组流感病毒在利用鸡胚作为生物反应器生产幽门螺杆菌蛋白中的应用。