CN101532030A - 一种na片段携带外源基因的重组流感病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种NA片段携带外源基因的重组流感病毒载体，该载体能通过病毒拯救方法在细胞内进行拯救，并能在鸡胚中大量扩增。本发明也公开了其制备方法，如下：首先构建用于流感病毒拯救的在流感病毒NA基因组片段上引入了外源基因的质粒，再在宿主细胞上进行拯救。外源基因与NA基因组片段之间用2A片段连接。外源基因包括EGFP报告基因，使用CMV/huPolI双向流感病毒拯救系统。本发明的携带外源基因的重组流感病毒载体克服了外源基因在流感病毒基因组中的容量限制，该重组流感病毒在鸡胚中可以稳定传代，可以应用于疫苗开发，肿瘤治疗，药物开发以及在廉价的鸡胚生物反应器中生产重组细胞因子药物。

Description

一种NA片段携带外源基因的重组流感病毒载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种携带外源基因的重组流感病毒作为病毒载体及其制备方法和应用。

背景技术

病毒载体已广泛应用于基因治疗研究与疫苗开发，并且作为有效的基因递送手段为生命过程的基础研究提供了有力的工具。目前开发的病毒载体主要以DNA病毒为主，其中包括腺病毒载体(Adenovirus，AdV)，痘病毒载体(vacciniavirus)，疱疹病毒载体(Herpes simple virus，HSV)与腺相关病毒载体(Adeno-associated virus，AAV)。慢病毒载体虽然是RNA病毒载体，但是慢病毒载体起作用形式是整合到宿主细胞中的DNA形式，亦可以归属于DNA病毒载体之列。DNA病毒载体中DNA形式的外源基因存在着一种整合到宿主基因组中的风险，因而作为一种重大安全隐患影响着他们在临床上的大量使用。无DNA形式的RNA病毒，因其基因组不存在插入宿主细胞基因组的可能性，开发为病毒载体具有较高的的安全性，因此开发新型的RNA病毒载体将是病毒载体开发的一个重要方向。然而，RNA病毒的基因组较小，基因结构紧凑，生活周期复杂，真正可用的RNA病毒载体较少，目前开发出来的主要有正链RNA病毒，包括脊髓灰质炎病毒载体(Poliovirus)，辛德比斯病毒载体(Sindbis virus，SIN)、西门利克森林病毒(Semliki forest virus，SFV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus，VEE)等，和非节段的负链RNA病毒，主要包括水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和狂犬病毒(rabies virus，RV)。在应用方面，现有这些RNA病毒载体自身有着诸多局限(参见如下文献：颜新敏，张强(2007).非节段负链RNA病毒作为疫苗载体研究进展。动物医学进展，28(11)：71-74；胡伟，段海清，陈惠鹏(2007).RNA病毒作为疫苗载体的研究与应用。生物技术通讯，18(3)：483-485)。

A型流感病毒(Influenza A virus)隶属于正粘病毒科，病毒基因组由8个负链RNA节段组成。流感病毒可以在鸡胚中得以高效的生产扩增，成熟的大规模生产体系已经在现有流感疫苗的生产过程中得到应用(如赛诺非巴斯德公司，葛兰素史克公司，北京科兴公司等)。在鸡胚中进行生产流感病毒有诸多优点，其中包括生产成本低，病毒产量高，安全性高，可规模化生产。流感病毒载体有着非常广阔的应用前景，但是流感病毒载体的开发还不成熟。

从cDNA直接拯救流感病毒的反向遗传学技术的开发极大简化了流感病毒拯救过程。现有的反向遗传系统主要由12质粒或者8质粒组成。利用反向遗传学技术，越来越多的实验支持，流感病毒基因组的包装采用的是选择性包装的模式，即在流感病毒的每一个基因组片段中都有一定的顺式作用元件(序列特异性)对流感病毒基因组RNA包装到子代病毒过程中起到选择性作用。流感基因组每个片段的包装序列已经确定(参见如下文献：Fujii，K.，Fujii，Y.，Noda，T.，Muramoto，Y.，Watanabe，T.，Takada，A.，Goto，H.，Horimoto，T.，and Kawaoka，Y.(2005).Importance of both the coding and the segment-specific noncoding regions ofthe influenza A virus NS segment for its efficient incorporation into virions.J Virol79(6)，3766-74；该文献中文名为A型流感病毒NS片段编码区和片段特异的非编码区对NS的有效包装进入病毒颗粒重要性。Fujii，Y.，Goto，H.，Watanabe，T.，Yoshida，T.，and Kawaoka，T.(2003).Selective incorporation of influenza virus RNAsegments into virions.Proc Natl Acad Sci USA 100(4)，2002-2007；该文献中文名为流感病毒RNA片段在病毒粒子中的选择性包装。Liang，Y.，Hong，Y.，andParslow，T.G.(2005).cis-Acting packaging signals in the influenza virus PB1，PB2，and PA genomic RNA segments.J Virol 79(16)，10348-55；该文献中文名为流感病毒PB1、PB2与PA基因组片段中的顺式包装信号。Muramoto，Y.，Takada，A.，Fujii，K.，Noda，T.，Iwatsuki-Horimoto，K.，Watanabe，S.，Horimoto，T.，Kida，H.，andKawaoka，Y.(2006).Hierarchy among viral RNA(vRNA)segments in their role invRNA incorporation into influenza A virions.J Virol 80(5)，2318-25；该文献中文名为病毒RNA片段中不同序列区域对病毒RNA包装成为成熟流感病毒颗粒过程中的作用。Noda，T.，Sagara，H.，Yen，A.，Takada，A.，Kida，H.，Cheng，R.H.，andKawaoka，Y.(2006).Architecture of ribonucleoprotein complexes in influenza Avirus particles.Nature 439(7075)，490-2；该文献中文名为流感病毒颗粒中核蛋白复合体的结构。)。其中，NA片段的包装信号位于3’非编码区和3’编码区的前183个核苷酸，以及5’非编码区和5’编码区的前157个核苷酸(参见如下文献：Fujii，Y.，Goto，H.，Watanabe，T.，Yoshida，T.，and Kawaoka，T.(2003).Selectiveincorporation of influenza virus RNA segments into virions.Proc Natl Acad Sci USA 100(4)，2002-2007；该文献中文名为流感病毒RNA片段在病毒粒子中的选择性包装)。

正如所有的病毒载体一样，流感病毒的荷载外源基因的能力有其限制，虽然还没有文献确切证明，在8个流感基因组片段中，最长的基因组片段为PB2和PB1(2341nt)(参见如下文献：Palese，P.，and M.L.Shaw.2007.Orthomyxoviridae：the viruses and their replication，p.1647-1689.In D.M.Knipeand P.M.Howley(ed.)，Fields virology.Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA；该文献中文名为正粘病毒科：病毒与病毒复制。)。为了携带外源基因，曾有尝试通过引入流感亚基因组片段来携带外源基因，但是携带的基因较小并且不稳定(参见如下文献：Vieira Machado，A.，Naffakh，N.，Gerbaud，S.，van der Werf，S.，and Escriou，N.(2006).Recombinant influenza A viruses harboring optimizeddicistronic NA segment with an extended native 5′terminal sequence：Induction ofheterospecific B and T cell responses in mice.Virology 345(1)，73-87；该文献中文名为延长了5’末端区域可以在NA片段携带优化双顺饭子的重组A型流感病毒诱导了小鼠的异特异性B细胞和T细胞反应)。也有尝试使用水泡性口炎病毒病毒表面糖蛋白(VSV-G)来替代流感病毒的HA和NA蛋白意图得到NA可以携带外源基因的重组流感病毒，但是该重组流感病毒在鸡胚上不能传代，在特殊类型的细胞上培养扩增这种流感病毒的成本较高(参见如下文献：Shinya，K.，Fujii，Y.，Ito，H.，Ito，T.，and Kawaoka，Y.(2004).Characterization of aneuraminidase-deficient influenza A virus as a potential gene delivery vector and alive vaccine.Journal of Virology 78(6)，3083-3088；该文献中文名为神经氨酸酶缺失的A型流感病毒作为潜在的基因递送载体和活疫苗的研究)。

2A短肽(18-22氨基酸)可以在融合蛋白中自我切割，产生单个独立的蛋白(参见如下文献：Szymczak AL，Workman CJ，Wang Y，Vignali KM，Dilioglou S，Vanin EF，Vignali DA(2004)Correction of multi-gene deficiency in vivo using asingle′self-cleaving′2A peptide-based retroviral vector.Nature biotechnology 22：589-594；该文献中文名为使用单个基于2A短肽‘自剪切’的逆转录病毒载体可以在体内矫正多基因缺陷)。通过串联的2A序列可以实现多个基因的同时表达，其特点为，1)串联基因由同一个启动子转录产生单个长片段信使RNA(mRNA)用于表达融合蛋白，2)融合蛋白高效自我切割，切割后的蛋白可以行使其独立的功能，3)串联基因等物质的量表达，前后两个蛋白的表达量一致。

发明内容

为克服上述技术缺陷，本发明提供了一种携带NA片段携带外源基因的重组流感病毒载体及其制备方法和应用。

本发明的携带外源基因的重组流感病毒载体能通过病毒拯救方法在细胞内进行拯救，并能在鸡胚中大量扩增。

所述的流感病毒包括甲型或乙型流感病毒。

所述病毒载体是在其NA基因组片段上携带外源基因。

上述携带外源基因的重组流感病毒载体的制备方法包括如下步骤：

(1)构建用于流感病毒拯救的在流感病毒NA基因组片段上引入了外源基因的质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组流感病毒载体在宿主细胞上进行拯救。

所述外源基因与所述NA基因组片段之间用2A片段连接，外源基因的表达与所述NA基因组片段的读码框一致。

2A DNA序列如下：

5’-tctggcgccaccaacttctccctgctgaagcaggctggcgatgtggaggagaaccctgggccc-3’

在流感病毒NA基因组片段中引入外源基因，实现了外源基因与NA基因的同步表达，充分利用了NA片段的选择性包装信号区域，最大限度的提高了插入基因的长度，并且可以使用鸡胚扩大培养该流感病毒载体。

所述2A片段编码的原始氨基酸序列来自于猪捷申病毒(Porcineteschovirus-1)的2A短肽，且其DNA序列经过了密码子优化。

所述的外源基因包括EGFP报告基因。

优选地，EGFP放在NA基因组片段vRNA的3’包装信号183位，并且EGFP基因转录的终止子去掉，与随后的2A保持相同的读码框，流感病毒NA基因的第一个密码子ATG紧随2A核算序列的3’末端，并保持与2A相同的读编码。

优选地，构建的NA重组片段插入到CMV/huPolI的双向表达质粒：pM-PR8-NA(183)EGFP+2A+NA。

将拯救组合物感染或转染到至少一个宿主细胞中，其中，拯救组合物包含上述的NA(183)EGFP+2A+NA重组质粒与流感病毒的其余7个表达质粒，其中NA的序列信息见GenBank，序列号：AF389120)。

优选地，使用安全性比较高的PR8病毒作为病毒载体的骨架。

所述步骤(2)使用8个hCMV/hPol I双向启动子结构的DNA质粒，包含流感病毒疫苗株A/Petro R/8/34流感病毒的PB2，PB1，PA，NP，HA，M，NS以及含有外源基因的NA片段。pM-PR8-PB2，pM-PR8-PB1，pM-PR8-PA，pM-PR8-HA，pM-PR8-NP，pM-PR8-M与pM-PR8-NS。其中各个片段的序列信息在GenBank中的编号为：PR8-PB2(AF389115)，PR8-PB1(AF389116)，PR8-PA(AF389117)，PR8-HA(AF389118)，PR8-NP(AF389119)，PR8-M(AF389121)与PR8-NS(AF389122)。

所述宿主细胞为293T细胞或Vero细胞。

重组病毒的稳定性鉴定可以在鸡胚中稳定传代。拯救的流感病毒载体在8到10日龄的SPF鸡胚中扩增。

优选地，鸡胚中病毒产量的确定采用HA血凝检测(具体方法参见郭元吉程小雯著《流行性感冒病毒及其实验技术》第88页，第100页)。

优选地，外源基因的存在通过反转录PCR和检测外源基因的表达来确定，按如下具体步骤完成：

从收获鸡胚尿囊液中提取流感病毒RNA，RNA经过Uni12反转录，再用外源基因，此处为EGFP基因，引物特异的引物进行扩增。

收获的病毒接种流感病毒敏感的MDCK细胞，感染后24h-48h，在荧光显微镜检测EGFP报告基因的表达。

上述重组流感病毒载体可应用于1)应用于增强流感病毒疫苗的免疫效果与开发针对其它疾病的疫苗，2)用于肿瘤治疗，3)利用鸡胚作为生物反应器生产外源蛋白，以及4)应用于抗流感药物的筛选。

本发明的有益效果在于开发了一种利用流感病毒携带外源基因作为病毒载体的方法。利用高效自我剪切的2A短肽在安全的流感病毒疫苗株(PR8株)的NA基因片段携带外源基因，克服了外源基因在流感病毒基因组中的容量限制。该重组流感病毒在鸡胚中可以稳定传代，表明利用廉价的鸡胚能得到大量的重组流感病毒，为以后构建携带外源基因的流感病毒载体奠定了基础。重组流感病毒载体可以应用于疫苗开发，肿瘤治疗，药物开发以及在廉价的鸡胚生物反应器中生产重组细胞因子药物。

附图说明

图1是本发明的含有外源基因EGFP的NA片段的结构示意图以及串联双向hCMV/hPol I启动子的pM载体结构示意图；

图2是本发明中含有外源基因与2A片段融合基因构建示意图；

图3是本发明中含有外源基因的重组NA基因组片段结构示意图；

图4是本发明中一个优选实施例的pM-PR8NA(183)EGFP+2A+NA重组质粒的测序结果示意图；

图5是本发明的重组流感病毒拯救示意图；

图6是本发明的拯救流感病毒的一个优选实施例的反转录PCR鉴定示意图与外源蛋白表达示意图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1：含有外源基因的嵌和NA片段的结构示意图以及CMV/PolI双向表达系统的结构示意图。

图1A，整个重组NA片段依次从3’段到5’的组成为：NA基因片段的包装信号(PR8NA的3’非编码区以及编码区的前183nt)，外源蛋白表达框(此处优选EGFP报告基因)，2A短肽编码区，NA基因编码框(ATG到终止密码子，其中包括编码区的157nt包装信号)以及5’非编码区。

双向启动子CMV/Pol I的结构示意图(图1B)，具体的结构与文献中提到的相似(Hoffmann，E.，Neumann，G.，Kawaoka，Y.，Hobom，G.，and Webster，R.G.(2000).A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eightplasmids.Proc Natl Acad Sci USA 97(11)，6108-13；该文献中文名为通过8个质粒产生A型流感病毒的DNA转染系统)，主要差别是，这个pM载体使用的酶切位点是识别7个bp碱基的SapI位点，其具体的结构序列见图1C，箭头指示部分为SapI酶切割位点。其中CMV-BGH负责转录mRNA起到表达病毒蛋白的作用，huPolI-mTer负责从与CMV启动方向相反的方向利用PolI转录酶转录得到流感病毒的病毒RNA。

通过SapI酶切，两端含有SapI的流感基因片段(包括图1A中的嵌和PR8NAcDNA片段)可插入到pM质粒中。

实施例2：外源基因与2A融合的DNA片段的获得。

合成上下互补两条寡核苷酸链，退火后形成含有酶切位点的双链DNA片段：GAATTC(EcoRI)agg ACCGGT(AgeI)tctggcgccaccaacttctccctgctgaa gcaggctggcgatgtggaggagaaccctGGGCCC(ApaI)atgACTAGT(SpeI)下划线部分为2A序列。双链片段连接插入到pMD18T-simple载体(TaKaRa公司，大连)，得到pT-2A(图2)，其中5’端引入了EcoRI与AgeI位点，3’端引入了ApaI与SpeI位点。

以pCDNA-EGFP为模板，通过PCR扩增EGFP报告基因，引物为GFP(1+20)EI与GFP(720-24)Age并通过5’引入的EcoRI位点与3’端引入的AgeI位点，插入到pT-2A，得到pT-EGFP-2A(图2)。EcoRI与SpeI切下EGFP+2A融合片段备用。

GFP(1+20)EI     ccAgaattcATGGGCTTGGTGAGCAAGGG

GFP(720-24)Age  GAAaccggtCTTGTACAGCTCGTCCATGCC

实施例3：构建pM-PR8NA(183)EGFP+2A+NA质粒。

以含有PR8NA全长基因片段的质粒pPolI-PR8NA为模板，以Sap-NA(1+20)EcoRV与PR8NA(183-24)EiAS为引物对，利用PCR技术扩增出流感病毒NA片段3’端的选择性包装信号部分，其中包括3’端非编码区和3’段编码区的前183位核苷酸，并在非编码区的一端引入EcoRV和SapI位点，183一端引入EcoRI位点、AgeI位点和SpeI位点。插入pMD18T-simple载体，得到pT-183(图3)。

pT-183经EcoRI与SpeI与酶切，插入实施例2中得到的EGFP+2A融合片段，得到pT-183EGFP+2A(图3)。

以上述的质粒pPolI-PR8NA为模板，以PR8NA(1+26)ApaI与Sap-NA-1413R-XbaI为引物对，利用PCR技术扩增出流感病毒NA基因组片段片段第一个密码子ATG到5’端最后一个核苷酸，其中包括5’端非编码区和5’段编码区的末端的157位核苷酸，并在在一端引入ApaI位点，；另一端引入SapI和XbaI位点。扩增的DNA片段通过ApaI与XbaI酶切插入到pT-183EGFP+2A，得到质粒pT-PR8NA(183)EGFP+2A+NA(图3)。PR8NA(183)EGFP+2A+NA片段两端含有SapI位点，经此酶切出的片段插入pM(图1)得到含有外源基因EGFP的重组PR8NA基因片段的质粒pM-PR8NA(183)EGFP+2A+NA。

Sap-NA(1+20)EcoRV  GATATCgctcttcggccAGCAAAAGCAGGGGTTTAAA

PR8NA(183-24)EiAS  actagtGTCgggcccCTCgaattcCCAGGTGCTATTTTTATAGGTAAT

PR8NA(1+26)ApaI    GTCgggcccATGAATCCAAATCAGAAAATAACAAC

Sap-NA-1413R-XbaI  GGAtctagagctcttcatAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAAC

构建质粒经酶切鉴定为正确，并对整个质粒进行了测序鉴定，序列正确无误，其中2A片段的区域的结果见图4。2A序列的5’端通过AgeI位点连接有EGFP基因，3’端通过ApaI位点连接有PR8NA基因，各个区域已经在图中作出标示。

实施例4：NA含有外源基因的重组流感病毒的拯救。

图5所示为流感病毒的拯救示意图。共转染pM-PR8NA(183)EGFP+2A+NA与PR8流感病毒的其它七个表达质粒(pM-PR8-PB2，PB1，PA，HA，NP，M与NS)到293T细胞或Vero细胞。具体步骤如下：

使用含10％FBS的高糖DMEM完全培养基进行293T细胞或Vero细胞的传代培养。第一天，接种细胞到6孔培养板。第二天，80-90％饱和度的293T细胞或Vero细胞用转染拯救流感病毒的8个质粒(0.5ug/质粒，总计4ug每孔)，转染试剂使用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen公司)转染方法，转染试剂用量为1ug DNA：2ul Lipo，具体步骤参照说明书。转染后24h，去除细胞培养液，用Hanks培养液彻底洗去残留的培养基，然后加入2ml含有1ug/ml的TPCK胰酶(Fluka公司)。48h到60h，收集细胞上清，其中含有拯救的重组病毒。取200ul接种10日龄鸡胚，48h后，鸡胚放到4度过夜，第二天取鸡胚尿囊液100ul测定其中的HA血凝(具体方法同上《流行性感冒病毒及其实验技术》第88页，第100页)。

实施例5：重组PR8病毒在鸡胚中的扩大培养。

收获第一次接种的鸡胚尿囊液，取5ul做成，用1×PBS稀释500倍，然后取200ul稀释液接种8到10日龄鸡胚，48h后按照实施例4中提及的方法，先测定HA血凝，然后收获鸡胚尿囊液。拯救的重组流感鸡可以在鸡胚中反复扩增。

实施例6：外源基因在重组流感病毒基因组中的稳定性鉴定。

取200ul鸡胚尿囊液，按照标准的方法Trizol方法(《分子克隆实验指南》第518页)进行病毒RNA提取，提取后用流感病毒的通用引物Uni12(序列信息：AGCAAAAGCAGG)进行反转录，反转录条件：42℃孵育1h，然后用针对外源基因片段(此处为EGFP基因)的特异性引物GFP(1+20)EI与GFP(720-24)Age，进行PCR扩增，扩增得到的PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定，结果如图6A所示。

实施例7：重组流感病毒基因组NA片段上外源基因在在细胞中的表达鉴定。

使用含10％FBS的高糖DMEM完全培养基进行MDCK细胞的传代培养。第一天MDCK接种细胞到6孔培养板。第二天，待MDCK细胞生长到80-90％饱和度时，用鸡胚中三次传代的带EGFP基因的重组流感病毒感染细胞，具体方法为，用无血清的DMEM的培养液1000倍稀释流感病毒，然后更换细胞培养基为流感病毒稀释液，1.0-1.5小时后，弃去病毒液，更换为含10％FBS的高糖DMEM完全培养基，病毒感染36h到48h感染后，用倒置荧光显微镜(Leica公司)观察EGFP的表达，可以看到，EGFP基因可以在36h和48h有很好的表达(图6B)。以上结果表明在第三代流感病毒中，外源基因EGFP可以在重组流感病毒中稳定传代。

以上实施例仅用以说明本发明的优选技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120>一种NA片段携带外源基因的重组流感病毒载体及其制备方法和应用

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>63

<212>DNA

<213>2A

<400>1

<210>1

<211>87

<212>DNA

<213>外源基因与2A融合的DNA片段

<400>2

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>GFP(1+20)EI人工序列

<400>3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>GFP(720-24)Age人工序列

<400>4

<210>1

<211>37

<212>DNA

<213>Sap-NA(1+20)EcoRV人工序列

<400>5

<210>1

<211>48

<212>DNA

<213>PR8NA(183-24)EiAS人工序列

<400>6

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>PR8NA(1+26)ApaI人工序列

<400>7

<210>1

<211>43

<212>DNA

<213>Sap-NA-1413R-XbaI人工序列

<400>8

Claims (9)

1、一种NA片段携带外源基因的重组流感病毒载体，其特征在于，所述病毒载体能通过病毒拯救方法在细胞内进行拯救，并能在鸡胚中大量扩增。

2、如权利要求1所述的重组流感病毒载体，其特征在于，所述的流感病毒包括甲型或乙型流感病毒。

3、如权利要求1-2之一所述的携带外源基因的重组流感病毒载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建用于流感病毒拯救的在流感病毒NA基因组片段上引入了外源基因的质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组流感病毒载体在宿主细胞上进行拯救。

4、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述外源基因与所述NA基因组片段之间用2A片段连接，外源基因的表达与所述NA基因组片段的读码框一致。

5、如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述2A片段编码的原始氨基酸序列来自于猪捷申病毒(Porcine teschovirus-1)的2A短肽，且其DNA序列经过了密码子优化。

6、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的外源基因包括EGFP报告基因。

7、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)使用8个hCMV/hPol I双向启动子结构的DNA质粒，包含流感病毒疫苗株A/PR/8/34流感病毒的PB2，PB1，PA，NP，HA，M，NS以及含有外源基因的NA片段。

8、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞或Vero细胞。

9、如权利要求1或2所述的携带外源基因的重组流感病毒载体的应用。

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