CN116751818A - 一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法。属于疫苗生物制品技术领域。该方法是将2A酶切位点后9个人血管紧张素Ⅱ基因与转铁蛋白进行串联后取代流感病毒NS1的280~340bp的核苷酸序列。同时利用甲型流感病毒冷适应减毒株和流感疫苗候选株的基因片段，完成反向遗传学的流感病毒拯救。本发明的主要用途是皮内注射高血压患者，使得血管紧张素Ⅱ蛋白在机体内表达，完成内源性抗原提呈，刺激机体产生相应抗体，从而拮抗高血压患者体内高水平的血管紧张素Ⅱ，达到治疗高血压的目的。与此同时由于重组流感病毒载体表面携带流感疫苗株的表面抗原，可同时达到流感疫苗使用的目的。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗生物制品技术领域，更具体的说是涉及一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法。
背景技术
流感病毒属于正粘病毒科，单链分节段的负链RNA基因。甲型流感病毒可感染多种哺乳动物（例如猪和马）和禽类，而丙型流感病毒的感染很大程度上仅限于人类。引起人类疾病的只有甲型和乙型流感病毒。目前确定的大多数甲型流感病毒保留了10种NA和17种HA亚型。流感病毒属于有囊膜的RNA病毒，基因组由八个分节段的线性基因片段构成（丙型流感病毒只有七个基因片段），八个基因片段编码十个蛋白，分别为：RNA依赖性RNA聚合酶（PB2，PB1，PA），形成核衣壳的核蛋白(NP)，基质膜蛋白（M），两个表面膜蛋白（血凝素HA和神经氨酸酶NA），非结构蛋白(NS1和NS2)和核出运蛋白(NEP)。
多数人和禽类易感的甲型流感病毒的NS基因，其长度为890个核苷酸，有一个开放读码框编码NS1蛋白，其长度一般为202~237个氨基酸。这种差异是由不同毒株所造成的，有的病毒株其NS1蛋白仅含有124个氨基酸，并且该毒株在组织培养中能形成空斑，同时对火鸡具有高感染性，这表明NS1的C末端超过一半的氨基酸对它的功能是可有可无的。有些病毒株在感染后期，NS1能够形成电子致密的半结晶状的包涵体，这种包涵体在流感病毒感染中刺激机体天然免疫应答具有一定的作用。
NS2的mRNA含有473个核苷酸的一个间断区，它的5’末端前56个核苷酸与NS1的mRNA的5’末端是相同的，从529位又开始继续。
流感病毒基因组可以被基因改造，包括缺失和插入的变异，因此人们尝试通过缺失的位置改造流感病毒，如神经氨酸酶基因（NA）和非结构蛋白1（NS1）等。流感病毒反向遗传学技术的进步和流感病毒载体技术的发展为流感病毒载体的广泛应用带来了机会。
高血压是一种最常见的却又危害严重的慢性疾病，是全球疾病负担最严重的疾病。全球估计有12.8亿30~79岁成年人患有高血压，其中约三分之二生活在低收入和中等收入国家。在我国高血压成为致病致残的第一病因，每年高血压的医疗费用高达318.9亿元，直接经济损失超过2103亿元。根据最新调查数据显示，我国高血压患者已突破3.3亿，中青年高血压(18~64岁)患者约占总体高血压人群的78%。
高血压病及其并发症的危害性往往十分严重，长期不加控制的高血压会导致心血管系统的病变，如动脉粥样硬化、冠心病、心力衰竭、心律失常、心肌梗死等。同时，高血压还会对肾脏、视网膜、大脑等器官造成损害。高血压还是中风和脑卒中的高危因素之一。据统计，高血压是导致全球死亡率居高不下的心血管疾病之一，成为全球范围内的健康问题。高血压是动脉粥样硬化的一种重要危险因素，进而引发心肌梗死，机体左室重构，引发心室扩张，导致充血性心力衰竭，并与终末期心脏病死亡密切相关。
大多数患者发生高血压，需要长期服用药物，超过30%的患者需要两种药物联合治疗。由于患者长期服用药物，患者依从性差，并会产生不良的副作用，降低生命质量。高血压疫苗是治疗高血压的新型药物，主要是通过疫苗，诱导和增强抗体特性的免疫反应，可以控制血压、预防并发症，成为治疗高血压和动脉粥样硬化(AS)的新型有效手段，并且有助于改善AS疾病症状。
Angiotensin II human(Angiotensin II)是一种血管收缩剂，是肾素/血管紧张素系统的主要生物活性肽。Angiotensin II human在调节人类血压中起着核心作用，主要通过血管紧张素II与G蛋白偶联受体(GPCRs)、血管紧张素II 1型受体(AT1R)和血管紧张素II 2型受体(AT2R)之间的相互作用来介导。Angiotensin II Human刺激交感神经兴奋，增加醛固酮生物合成和肾脏活动。Angiotensin II Human诱导血管平滑肌细胞生长，增加成纤维细胞中I型和III型胶原的合成，导致血管壁和心肌增厚，并导致纤维化。AngiotensinII Human也诱导细胞凋亡(apoptosis)。Angiotensin II Human通过LOX-1依赖的氧化还原敏感途径诱导内皮细胞毛细血管生成，并且与AS的发生和发展密切相关。
治疗性高血压疫苗的工作机制主要立足于肾素-血管紧张素-醛固醇系统（therenin-angiotensin-aldosteron system, RAAS），由于它的过度激活是高血压最重要的发病机制，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）与小血管肌肉细胞表面的1型血管紧张素受体(AT1R)结合，引起血管收缩，它还能促进肾脏对钠的再吸收，血管收缩和钠的再吸收都会导致血压升高（图1）。因此如果机体产生AngⅡ特异性受体竞争性结合AngⅡ，就能有效降低血压。但是由于AngⅡ分子量小，它含有八个氨基酸的激素肽，结构简单，免疫原性弱，半衰期短等原因使AngⅡ相关疫苗的研究十分困难。
2007年瑞士Cytos生物技术公司研发的AngⅡ降压疫苗（CYT006-AngQβ）在Ⅱa期临床试验中显示出良好降压效果和安全性，曾经被认为是极有希望的降压疫苗，但是后续研究发现该疫苗的抗体亲和力及反馈性的Ang II升高等问题限制了其降压作用。
治疗性高血压疫苗一直是国内研究的空白领域，目前研究较深入的是华中科技大学的廖玉华教授发明的ATRQβ-001疫苗，具有良好的降压效果，但是需要每个月注射一次，将来患者依从性可能不高，或出现多次免疫注射后的免疫耐受。同时该疫苗是基于噬菌体表达技术的疫苗制备，噬菌体相关疫苗目前尚无任何一款产品上市应用到人体，所以其安全性需要大量研究支持。
综上，如何提供一种治疗效果好、注射频次少、安全性高的高血压治疗性疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）对流感病毒NS基因进行目的性改造：
将原NS1基因的237个氨基酸序列截短为前113个氨基酸，在其后面依次插入2A肽氨基酸序列，增加9个重复的血管紧张素Ⅱ氨基酸序列，增加转铁蛋白氨基酸序列，然后连接上NS2氨基酸序列，得改造后流感病毒NS基因片段；
（2）将所述改造后流感病毒NS基因片段与双向表达质粒连接，构建重组双向表达质粒，命名为re-NS；
（3）将甲型流感病毒冷适应减毒株作为母本株，分别将其基因片段PB2基因、PB1基因、PA基因、M基因、NP基因与双向表达质粒连接，构建重组双向表达质粒，分别命名为：AA-PB2、AA-PB1、AA-PA、AA-M、AA-NP；
（4）将世界卫生组织在北半球推荐使用的甲型流感病毒毒株的HA基因和NA基因分别与双向表达质粒连接，构建重组双向表达质粒，分别命名为re-HA、re-NA；
（5）在大肠杆菌中进行重组双向表达质粒的扩增，然后提取质粒并进行纯化，之后通过流感病毒反向遗传学技术，将构建的8个重组双向表达质粒共转染哺乳动物细胞，培养收毒即可（利用宿主细胞内的蛋白酶完成了流感病毒基因组的翻译表达和逆转录，从而包装成具有活性的病毒颗粒，完成病毒拯救，并具备上述基因片段的遗传稳定性）。
PB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
agcaaaagcaggtcaattatattcaatatggaaagaataaaagaactacggaatctgatgtcgcagtctcgcactcgcgagatactaacaaaaaccacagtggaccatatggccataattaagaagtacacatcagggagacaggaaaagaacccgtcacttaggatgaaatggatgatggcaatgaaatatccgattacagctgacaagaggataacagaaatgattcctgagagaaatgagcaagggcaaactctatggagtaaaatgagtgatgccggatcggatcgagtgatggtatcacctctggctgtgacatggtggaatagaaatggaccaatgacaagtacggttcattatccaaaaatctacaaaacttattttgagaaagtcgaaaggttaaaacatggaacctttggccctgtccattttagaaaccaagtcaaaatacgccgaagagttgacataaatcctggtcatgcagacctcagtgccaaggaggcacaggatgtaatcatggaagttgttttccctaacgaagtgggggccaggatactaacgtcggaatcgcaattaacaataaccaaagagaaaaaagaagaactccaggattgcaaaatttctcctttgatggttgcgtacatgttagagagagaacttgtccgaaaaacgagatttctcccagttgctggtggaacaagcagtgtgtacattgaagtgttgcacttgactcaaggaacatgctgggaacagatgtacactccaggtggagaagtgaggaatgatgatgttgatcaaagtctaattattgcagccaggaacatagtgagaagagcagcagtatcagcagatccactagcatctttattggagatgtgccacagcacacagattggcgggacaaggatggtggacattcttaggcagaacccaacggaagagcaagctgtggatatatgcaaggctgcaatgggactgagaatcagctcatccttcagttttggcgggttcacatttaagagaacaagcggatcatcagtcaagagagaggaagaagtgcttacgggcaatcttcaaacattgaaaataagggtgcatgagggatacgaggagttcacaatggttgggaaaagggcaacagctatactcagaaaagcaaccaggagattgattcagctgatagtgagtggaagagacgaacagtcgatagccgaagcaataattgtggccatggtattttcacaagaagattgtatgataaaagcagttagaggtgatctgaatttcgttaatagggcaaatcagcgattgaatcccatgcatcaacttttaagacattttcagaaggatgcgaaagtgctttttcaaaattggggaattgaacatatcgacaatgtgatgggaatgattggggtattaccagacatgactccaagcacagagatgtcaatgagagggttaagagtcagcaaaatgggcgtagatgaatactccagcgcggagagagtagtggtgagcattgaccggtttttgagagttcgagaccaacgaggaaatgtactattatctcctgaggaggtcagtgaaacacagggaacagagaaactgacaataacttactcatcgtcaatgatgtgggagattaatggccctgagtcagtgttggtcaatacctatcagtggatcatcagaaactgggaaactgttaaaattcagtggtctcagaatcctacaatgctatacaataaaatggaatttgagccatttcagtctttagttcctaaggccattagaggccaatacagtgggtttgttaggactctattccaacaaatgagggatgtacttgggacatttgataccacccagataataaaacttcttccctttgcagccgccccaccaaagcaaagtagaatgcagttctcttcattgactgtgaatgtgaggggatcaggaatgagaatacttgtaaggggcaattctcctgtattcaactacaacaagaccactaagagactaacaattctcggaaaggatgctggcactttaactgaagacccagatgaaggcacatctggagtggagtccgctgttctgagaggattcctcattctgggcaaagaagataggagatatggaccagcattaagcatcaatgaactgagtaaccttgcgaaaggagaaaaggctaatgtactaattgggcaaggagacgtggtgttggtaatgaaacgaaaacgggactctagcatacttactgacagccagacagcgaccaaaagaattcggatggccatcaattaatgtcgaatagtttaaaaacgaccttgtttctact，SEQ IDNO.8。
PB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
agcaaaagcaggcaaaccatttgaatggatgtcaatccgaccttacttttcttgaaagttccagcgcaaaatgccataagtactacattcccttatactggagatcctccatacagccatggaacaggaacaggatacaccatggacacagtcaacagaacacatcaatattcagaaaaggggaagtggacaacaaacacggaaactggagcgccccaacttaacccaattgatggaccactacctgaggacaatgaaccaagtggatatgcacaaacagactgcgtcctggaagcaatggctttccttgaagaatcccacccaggaatctttgaaaactcgtgtcttgaaacgatggaggttattcaacaaacaagagtggacaaactgacccaaggtcgtcagacctatgattggacattgaacagaaatcagccggctgcaactgcgctagccaacactatagaggtcttcagatcgaatggtctgacagctaatgaatcgggaaggctaatagatttcctcaaggatgtgatagaatcaatggataaagaggagatggaaataacaacacacttccaaagaaaaagaagagtaagagacaacatgaccaagaaaatggtcacacaacgaacaataggaaagaagaagcaaagattgaacaagagaatctatctaataagagcactgacattgaacacaatgactaaagatgcagagagaggtaaattaaagagaagagcaattgcaacacccggtatgcagatcagagggttcgtgtactttgtcgaaacactagcgagaagtatttgtgagaatcttgaacagtctgggcttccggttggaggtaatgaaaagaaggctaaactggcaaatgttgtgagaaaaatgatgactaattcacaagacacagagctctctttcacaattactggagacaataccaaatggaatgagaatcaaaatcctcggatgttcctggcgatgataacatacatcacaagaaatcaacctgaatggtttagaaacgtcctgagcatcgcacctataatgttctcaaataaaatggcaagactagggaaaggatacatgttcaaaagcaagagcatgaagctccgaacacaaataccagcagaaatgctaacaagtattgacctgaaatactttaatgaatcaacaagaaagaaaatcgagaaaataaggcctctcctaatagatggcacagtctcattgagtcctggaatgatgatgggcatgttcaacatgctaagtacagtcttaggagtctcaatcctgaatcttggacaaaagaagtacaccaaaacaacatactggtgggacggactccaatcctctgatgacttcgccctcatagtgaatgcaccaaatcatgagggaatacaagcaggagtggatagattctacagaacctgcaagctagtcggaatcaatatgagcaaaaagaagtcctacacaaataggacagggacatttgaattcacaagctttttctatcgctatggatttgtagccaattttagcatggagctgcccagctttggagtgtctggaattaatgaatcggatgatatgagcattggggtaacagtgataaagaacaacatgataaacaatgaccttgggccagcaacagcccaaatggctcttcaactattcatcaaagactacagatatacgtaccggtgccacagaggagacacacaaattcagacaaggagatcattcgagctaaagaagctgtgggagcaaacccgctcaaaggcaggacttttgatttctgatggaggaccaaacttatacaatatccggaatctccacattccagaagtctgcttgaagtgggagctaatggatgaagactatcaggggaggctttgtaatcccctgaatccatttgtcagtcataaggagattgagtctgtaaacaatgctgtggtaatgccagctcacggtccagccaagagcatggaatatgatgctgttgctactacacactcctggatccctaagaggaaccgctccattctcaacacaagccaaaggggaattcttgaggatcaacagatgtatcagaagtgttgcaatctattcgagaaattcttccctagcagttcgtacaggagaccagttggaatttccagcatggtggaggccatggtgtctagggcccggattgatgcacggattgacttcgagtctggacggattaagaaagaggagttcgctgagatcatgaagatctgttccaccattgaagagctcagacggcaaaaatagtgaatttagcttgtccttcatgaaaaaatgccttgtttctact，SEQ IDNO.9。
PA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
agcaaaagcaggtactgatccgaaatggaagaatttgtgcgacaatgcttcaatccgatgattgtcgagcttgctgaaaaagcaatgaaagagtatggagaggatcggaaaatcgaaacaaacaaatttgcagcaatatgcactcacttggaagtatgcttcatgtattcagattttcatttcatcaatgagcaaggcgagtcaataatagtagagcttgatgatccaaatgcacttttgaagcacagatttgaaataatagagggaagagatcgcacaatggcctggacagtagtaaacagtatttgcaacactacaggagctgagaaaccgaagtttctgccagatttgtatgattacaaggagaatagattcatcgagattggagtgacaaggagggaagtccacatatactatcttgaaaaggccaataaaattaaatctgagaagacacacatccacattttctcattcactggggaagaaatggccacaaaggccgactacactctcgatgaggaaagcagggctaggatcaagaccagactattcaccataagacaagaaatggctagcagaggcctctgggattcctttcgtcagtccgaaagaggcgaagaaacaattgaagaaagatttgaaatcacagggacaatgcgcaggctcgccgaccaaagtctcccgccgaacttctcctgccttgagaattttagagcctatgtggatggattcgaacccaacggctacattgagggcaagctttctcaaatgtccaaagaagtaaatgctaaaattgagccttttctgaaaacaacaccaagaccaattaaacttccggatgggcctccttgctctcagcggtccaaattcctgctgatggatgctttaaaattaagcattgaggacccaagtcacgaaggagagggaataccactatatgatgcgatcaagtgtatgagaacattctttggatggaaagaaccctatgttgttaaaccacacgataagggaataaatccaaattatctgctgtcatggaagcaattactggcagaactgcaggacattgagaatgaggagaagattccaagaaccaaaaacatgaagaaaacgagtcagctaaagtgggcacttggtgagaacatggcaccagagaaggtagactttgacgactgtagagatataagcgatttgaagcaatatgatagtgatgaacctgaattaaggtcactttcaagctggatccagaatgagttcaacaaggcatgcgagctgaccgattcaatctggatagagctcgatgagattggagaagatgtggctccaattgaacacattgcaagcatgagaaggaattacttcacagcagaggtgtctcag
tgcagagccacagaatatataatgaagggggtatacattaatactgccttgcttaatgcatcctgtgcagcaatggacgatttccaactaattcccatgataagcaaatgtagaactaaagagggaaggcgaaagaccaatttatatggtttcatcataaaaggaagatctcacttaaggaatgacaccgacgtggtaaactttgtgagcatggagttttctctcactgacccaagacttgagccacacaaatgggagaagtactgtgttcttgagataggagatatgctactaagaagtgccataggccaggtgtcaaggcccatgttcttgtatgtgaggacaaatggaacatcaaagattaaaatgaaatggggaatggagatgaggcgttgcctccttcagtcactccaacaaatcgagagtatgattgaagccgagtcctctgtcaaggagaaagacatgaccaaagagtttttcgagaataaatcagaaacatggcccattggagagtcccccaaaggagtggaagaaggttccattgggaaggtctgcaggactttattagccaagtcggtattcaatagcctgtatgcatctccacaattagaaggattttcagctgaatcaagaaaactgcttcttgtcgttcaggctcttagggacaatcttgaacctgggacctttgatcttggggggctatatgaagcaattgaggagtgcctgattaatgatccctgggttttgcttaatgcgtcttggttcaactccttcctaacacatgcattaagatagttgtggcaatgctactatttgctatccatactgtccaaaaaagtaccttgtttctact，SEQ ID NO.10。
M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
agcaaaagcaggtagatattgaaaaatgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcgtcccgtcaggccccctcaaagccgagatcgcacagagacttgaagatgtctttgctgggaagaacaccgatcttgaggctctcatggagtggctaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattttgggatttgtattcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccaaaatgccctcaatgggaatggggatccaaataacatggacagagcagttaaactgtatagaaagcttaagagggagataacattccatggggccaaagaaatagcgctcagttattctgctggtgcacttgccagttgtatgggcctcatatacaacaggatgggggctgtgaccactgaagtggcctttggcctggtatgtgcaacctgtgaacagattgctgactcccagcataggtctcataggcaaatggtgataacaaccaatccactaataagacatgagaacagaatggttctggccagcactacagctaaggctatggagcaaatggctggatcgagtgagcaagcagcagaggccatggaggttgctagtcaggctaggcaaatggtgcaggcaatgagagccattgggactcatcctagctccagtgctggtctaaaaagtgatcttcttgaaaatttgcaggcctatcagaaacgaatgggggtgcagatgcaacgattcaagtgaccctcttgttgttgccgcgagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtctttttttcaaatgcaattatcgcttctttaaacacggtctgaaaagaggggcttctacggaaggagtaccagagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacagcagagtgctgtggatactgacgatagtcattttgtcagcatagagctggagtaaaaaactaccttgtttctact，SEQ ID NO.11。
NP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
Agcaaaagcagggtagataatcactcactgagtgacatcaaaatcatggcgtcccaaggcaccaaacggtcttatgaacagatggaaactgatggggaacgccagaatgcaactgaaatcagagcatccgtcgggaagatgattgatggaattggacgattctacatccaaatgtgcaccgaacttaaactcagtgattatgaggggcggctgatccagaacagcttaacaatagagagaatggtgctctctgcttttgacgagaggaggaataaatatctggaagaacatcccagcgcggggaaggatcctaagaaaactggaggacccatatacaagagagtagatggaaagtggatgagggaactcgtcctttatgacaaagaagaaataaggcgaatctggcgccaagctaataatggtgatgatgcaacagctggtctgactcacatgatgatctggcattccaatttgaatgatacaacataccagaggacaagagctcttgttcgcaccggaatggatcccaggatgtgctctttgatgcagggttcgactctccctaggaggtctggagccgcagccgctgcagtcaaaggagttgggacaatggtgatggagttgatcaggatgatcaaacgtgggatcaatgatcggaacttctggagaggtgagaatgggcggaaaacaaggattgcttatgagagaatgtgcaacattctcaaaggaaaatttcaaacagctgcacaaagagcaatgatggatcaagtgagagaaagccggaacccaggaaatgctgagatcgaagatctcatctttctggcacggtctgcactcatattgagaggctcagttgctcacaaatcttgtctgcctgcctgtgtgtatggacctgccgtagccagtgggtacgaattcgaaaaagagggatactctttagtagggatagaccctttcaaactgcttcaaaacagccaagtatacagcctaatcagaccgaacgagaatccagcacacaagagtcagctggtgtggatggcatgcaattctgctgcatttgaagatctaagagtatcaagcttcatcagagggaccaaagtaatcccaagggggaaactttccactagaggagtacaaattgcttcaaatgaaaacatggatactatggaatcaagtactcttgaactgagaagcaggtactgggccataaggaccagaagtggaggaaacactaatcaacagagggcctctgcaggtcaaatcagtgtacaacctacgttttctgtgcaaagaaacctcccatttgacaaaccaaccatcatggcagcattcactgggaatgcagagggaagaacatcagacatgagggcagaaatcataaggatgatggaaggtgcaaaaccagaagaagtgtccttccaggggcggggagtcttcgagctctcggactaaaaggcaacgaaccccatcgtgccctcttttgacatgagtaatgaaggatcttatttcttcggagacaatgcagaggagtacgacaattaaggaaaaattacccttgtttctact，SEQ ID NO.12。
所取得的有益效果：当新的重组病毒感染细胞后，本发明所构建的NS基因全长在细胞质内表达，在2A作用下血管紧张素Ⅱ和转铁蛋白被切割下来，同时转铁蛋白完成自组装形成纳米颗粒，血管紧张素Ⅱ在该纳米颗粒的表面广泛分布，在完成皮内注射后，通过内源性抗原提呈，刺激机体产生抗AngⅡ的抗体，从而拮抗高血压患者体内高水平的AngⅡ，达到降低血压的目的。
本发明的8质粒流感病毒反向遗传学拯救系统，其中的5个质粒携带的病毒基因片段来源于甲型流感病毒冷适应减毒株，具体包括：PA、PB1、PB2、M和NP基因，它们具备低温减毒的特性，保证了所制备的疫苗的减毒特征和安全性。
本发明的8质粒流感病毒反向遗传学拯救系统，其中的2个质粒携带的病毒基因片段分别是HA和NA，它们则来源于本年度世界卫生组织在北半球推荐使用的流感病毒疫苗株（流感疫苗候选株），保证了所制备的疫苗与世界卫生组织推荐疫苗株的匹配程度，使得接种者最大受益。实现“一针防两病”的目的：预防流感病毒感染和治疗高血压。
本发明所使用质粒携带的NS基因片段是经过改造的，使得该活病毒对机体免疫系统产生的干扰素敏感，在机体细胞内复制受到限制，从而进一步保障了所制备的疫苗的安全性。
进一步的，所述转铁蛋白为人转铁蛋白或幽门螺旋杆菌转铁蛋白。
进一步的，所述改造后流感病毒NS基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述双向表达质粒为pHW2000或pAD3000。
进一步的，所述甲型流感病毒冷适应减毒株为A/AnnArbor/6/60、A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)、A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)。
进一步的，所述哺乳动物细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、Vero细胞。
进一步的，还包括纯化步骤，所述纯化包括超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心、疏水层析和阴离子层析。
上述制备方法制备的疫苗，通过皮内注射方式进行免疫。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
（1）本发明提供的重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗，其表达的带有AngⅡ的转铁蛋白自组装成纳米颗粒，需要在胞内完成，然后通过抗原提呈细胞进一步发挥免疫应答作用，由于机体皮内的天然免疫细胞丰富，如朗格汉斯细胞、树突细胞、NK细胞等，使得抗原提呈高效，并能有效节约抗原用量，进一步保障了疫苗的安全性。本发明制备的疫苗具备更广泛的适用性，并可激活有效的粘膜免疫和细胞免疫，有效性、安全性更加确切。
（2）本发明制备的重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗经皮内免疫后能够取得较好的免疫原性，提高免疫保护效果，免疫持久性强。结合无针注射器的使用，能够有效增加患者接种的依从性。
（3）本发明提供的病毒拯救方法具有时效性，能根据每年流感病毒的流行特点，为高血压患者针对性的制备有效的流感疫苗，制备快速，免疫原性、免疫保护效果显著，并且具有很好的安全性。本发明所采用的反向遗传操作技术，应用于流感病毒的拯救先进而成熟，具有方便简捷、定位可控等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明血管紧张素II与高血压之间的关系模式图；
图2为本发明实施例2中天然NS1蛋白结构模式图；
图3为本发明实施例2中人转铁蛋白和NS1共表达的模式图；
图4为本发明实施例2中人转铁蛋白从NS1上通过2A自酶切后形成两个独立的蛋白模式图，其中，左侧为NS1二聚体，右侧为人转铁蛋白形成的二聚体；
图5为本发明实施例2中被截短的NS1蛋白；
图6为本发明实施例2中被2A自酶切下来的人转铁蛋白具备自组装能力；
图7为本发明实施例3中SBP降压效果监测结果；
图8为本发明实施例3中DBP降压效果监测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备
1）以流感病毒A/New Caledonia/20/99(H1N1)的NS基因为模板，对NS基因进行目的性改造：
即将原NS1基因的237个氨基酸序列截短为前113个氨基酸，在其后面依次插入2A肽氨基酸序列，增加9个重复的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)氨基酸序列，增加人转铁蛋白（HF）氨基酸序列，然后连接上NS2氨基酸序列。通过分子生物酶切(如BspQI酶)，在连接酶的作用下，按照酶说明书进行具体操作，使得改造后流感病毒NS基因片段与双向表达质粒（如pHW2000或pAD3000）进行连接，构建重组双向表达质粒，命名为：re-NS。
改造后流感病毒NS基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
ATGGACAGCCACACCGTGAGCAGCTTCCAGGTGGACTGCTTCCTGTGGCACGTGAGGAAGCAGGTGGCCGACCAGGACCTGGGCGACGCCCCCTTCCTGGACAGGCTGAGGAGGGACCAGAAGAGCCTGAAGGGCAGGGGCAGCACCCTGGGCCTGAACATCGAGACCGCCACCTGCGTGGGCAAGCAGATCGTGGAGAGGATCCTGAAGGAGGAGAGCGACGAGGCCTTCAAGATGACCATGGCCAGCGCCCTGGCCAGCAGGTACCTGACCGACATGACCATCGAGGAGATGAGCAGGGACTGGTTCATGCTGATGCCCAAGCAGAAGGTGGCCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCGACAGGGTGTACATCCACCCCTTCGACAGGGTGTACATCCACCCCTTCGACAGGGTGTACATCCACCCCTTCGACAGGGTGTACATCCACCCCTTCGACAGGGTGTACATCCACCCCTTCGACAGGGTGTACATCCACCCCTTCGACAGGGTGTACATCCACCCCTTCGACAGGGTGTACATCCACCCCTTCGACAGGGTGTACATCCACCCCTTCGTGGACTGCAGCACCCTGATCCTGAACATGGCCGACTGCCTGAGCTTCGTGAGCAGCGGCGGCACCGTGGCCAAGCCCGAGGGCACCTGCTGCAGCGGCCTGAAGACCGTGCTGAAGGCCGACAGCCAGTGCCTGTGCGAGGCCTTCAAGAGCAGCGCCAGCCTGGGCGTGACCCTGAACATCACCAAGGCCAGCACCCTGCCCGCCGCCTGCAAGCTGCACGCCCCCATGGACAGCCACACCGTGAGCAGGTTCGGCGACATCCTGATGAGGATGAGCAAGATGGGCCTGGGCAGCAGCAGCGGCGACCTGAACGGCATGATCACCCAGTTCGAGAGCCTGAAGCTGTACAGGGACAGCCTGGGCGAGGCCGTGATGAGGCTGGGCGACCTGCACAGCCTGGGCCACAGGAACGGCAAGTGGAGGGAGGGCCTGGGCGGCAAGTTCGAGGAGATCAGGTGGCTGATCGAGGAGGTGAGGCACAAGCTGAAGACCACCGAGAACAGCTTCGAGGGCATCACCTTCATGGGCGCCCTGGGCCTGCTGTTCGAG，SEQ ID NO.1。
改造后流感病毒NS基因片段编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
MDSHTVSSFQVDCFLWHVRKQVADQDLGDAPFLDRLRRDQKSLKGRGSTLGLNIETATCVGKQIVERILKEESDEAFKMTMASALASRYLTDMTIEEMSRDWFMLMPKQKVAGATNFSLLKQAGDVEENPGPDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFVDCSTLILNMADCLSFVSSGGTVAKPEGTCCSGLKTVLKADSQCLCEAFKSSASLGVTLNITKASTLPAACKLHAPMDSHTVSRFGDILMRMSKMGLGSSSGDLNGMITQFESLKLYRDSLGEAVMRLGDLHSLGHRNGKWREGLGGKFEEIRWLIEEVRHKLKTTENSFEGITFMGALGLLFE，SEQ ID NO.2。
其中，截短后的NS1基因编码的前113个氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
MDSHTVSSFQVDCFLWHVRKQVADQDLGDAPFLDRLRRDQKSLKGRGSTLGLNIETATCVGKQIVERILKEESDEAFKMTMASALASRYLTDMTIEEMSRDWFMLMPKQKVAG，SEQ ID NO.3。
2A肽（P2A）的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
ATNFSLLKQAGDVEENPGP，SEQ ID NO.4。
9个重复的血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
DRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPFDRVYIHPF，SEQ ID NO.5。
人转铁蛋白（HF）的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
VDCSTLILNMADCLSFVSSGGTVAKPEGTCCSGLKTVLKADSQCLCEAFKSSASLGVTLNITKASTLPAACKLHAP，SEQ ID NO.6。
NS2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
MDSHTVSRFGDILMRMSKMGLGSSSGDLNGMITQFESLKLYRDSLGEAVMRLGDLHSLGHRNGKWREGLGGKFEEIRWLIEEVRHKLKTTENSFEGITFMGALGLLFE，SEQ ID NO.7。
2）选用甲型流感病毒冷适应减毒株A/AnnArbor/6/60(AA) (H2N2)为母本株，提供PB1、PB2、NP、PA的4个基因片段，即PB1 GenBank: AY210012.1；PB2 GenBank: AY209938.1；NP GenBank: AY210074.1；PA GenBank: AY209994.1。选用甲型流感病毒冷适应减毒株A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)为母本株，提供M基因，即：M GenBank: M81576.1。
通过反向遗传学的方法，分别将其基因片段PB2基因、PB1基因、PA基因、M基因、NP基因与双向表达质粒进行连接，构建重组双向表达质粒，分别命名为：AA-PB2、AA-PB1、AA-PA、AA-M和AA-NP。
3）选用世界卫生组织推荐的2022年度北半球流感疫苗候选株A/New Caledonia/20/99(H1N1)的HA基因GenBank: AJ344014.1和A/Victoria/2004/2009(H1N1)的NA基因GenBank: GQ243762.1，构建主要表位基因。
通过反向遗传学的方法将HA基因和NA基因分别与双向表达质粒进行连接，构建重组双向表达质粒，命名为：re-HA和re-NA。
上述重组双向表达质粒的构建方法为：
根据上述基因和其对应的基因号，通过化学合成得到相应的核苷酸序列，将它们分别连接于构建好的载体pHW2000上，构建重组双向表达质粒。
也可以分别对流感病毒提取病毒的总RNA，从母本株用PCR的方法扩增PB1、PB2、NS、M、NP、PA、HA、NA基因片段，测序后分别连接于构建好的载体pHW2000上，构建重组双向表达质粒。
载体pHW2000的构建参照Hoffmann E，Neumann G，Kawaoka Y，Hobom G，WebsterRG.A DNA transfectionsystem for generation of influenza A virus from eightplasmids.Proc Natl Acad SciU S A.2000May 23；97(11)6108-13。
4）如上所述8个重组双向表达质粒归纳为：含有PB2编码基因的重组双向表达质粒（AA-PB2）、含有PB1编码基因的重组双向表达质粒（AA-PB1）、含有PA编码基因的重组双向表达质粒（AA-PA）、含有M编码基因的重组双向表达质粒（AA-M）、含有NS编码基因的重组双向表达质粒(re-NS)、含有NP编码基因的重组双向表达质粒（AA-NP）、含有HA编码基因的重组双向表达质粒(re-HA)和含有NA编码基因的重组双向表达质粒(re-NA)。
利用反向遗传技术拯救流感病毒疫苗株。培养细胞系293T细胞，通过脂质体或电穿孔转染受体细胞系。将含有流感病毒PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、NA基因片段的8个重组双向表达质粒共转染上述细胞系。
流感病毒反向遗传操作技术具体如下：
①提取质粒：使用无内毒素小量中提试剂盒提取即可，提取质粒后对质粒质量进行控制：
浓度范围600~3000ng/μL；
A260：A280范围1.8~1.99；
常规DNA电泳图显示单一条带，大小正确；
②稀释质粒：共8个质粒，每个质粒终浓度为100ng/μL，稀释液使用无核酸酶的水即可；
③转染：以转染试剂盒为例，对8个质粒，每个质粒取2μL，共计16μL，与Buffer EC84μL，共计100μL，在EP管中混匀；加入Enhanser 12μL，再次混匀，室温静止5min；加入转染剂15μL，混匀，室温静止15min；加入500μL的细胞生长液（基础培养基DMEM，加入体积比为10%的胎牛血清），混匀后，滴加到6孔板的细胞面上，轻轻摇匀后，37℃，静止培养12~18hour；
④转染前的细胞准备：在转染前的24小时准备细胞，使用293T细胞，胞龄控制在24hour，转染操作前，先对细胞换液处理，弃全部细胞培养液，加入新鲜培养液，6孔板中，每孔加入2.5mL；
⑤转染后的换液：在转染后的12~18hour后，对细胞进行换液，弃全部培养液，加入新鲜培养液，6孔板中，每孔加入3mL；
⑥换液后的收获：在37℃条件下，换液后继续静止培养至48~72 hour后收毒。收毒方法收获将整个细胞培养板冻于-80℃冰箱内，冻融一次后接种鸡胚；
⑦接种11日龄的鸡胚，收集上一步获得的全部液体接种鸡胚，每个鸡胚接种0.9mL，收获液全部予以接种鸡胚。在温度37℃和湿度60%条件下培养鸡胚72小时后，在4℃冷胚过夜。收集鸡胚尿囊液，建立原代种子库（即本发明所述重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的原始病毒种子），完成流感病毒的反向遗传学拯救。
通过超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心、疏水层析和阴离子层析的方法纯化后获得的治疗性高血压疫苗也属于本发明的保护范围。
5）工作种子的系统性检测
检测指标包括：采用红细胞凝集试验测定病毒的滴度（＞1：160）、细胞病变法测定病毒的TCID50（＞100）、鸡胚感染力测定EID50（＞100）、免疫扩散法测定血凝素型别和血凝素含量（血凝素型别鉴别试验符合药典要求）、采用电镜观察病毒颗粒（能够观察到完整病毒颗粒）、SDS-PAGE测定病毒的主要蛋白抗原成分（蛋白电泳条带数目和大小正确）、间接免疫荧光测定病毒的抗原表达特异性。
重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗株种子库毒株或传代至15代的病毒株采用RT-PCR测定血管紧张素和人转铁蛋白的稳定性（基因测序证实序列一致）。
将该重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗在鸡胚上培养，增殖培养后收集病毒液，对病毒液超滤浓缩、柱层析纯化，制备治疗性疫苗半成品。进一步制备成皮内注射活疫苗成品剂型。该重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗在SRH大鼠体内进行安全性、有效性、稳定性的研究。
建立哺乳动物细胞培养用于该病毒疫苗株的策略，采用微载体技术、片状载体生产流感病毒，用MDCK培养基，常规的培养基包括MEM、DMEM等。培养基的pH值为6.8~7.3，PO2为35％~60％，m.o.i(multiplicity of infection)为0.002~0.5。接种病毒后加入胰蛋白酶帮助切割流感病毒HA0蛋白，才能使流感病毒吸附于细胞，进而进入细胞进行复制。
实施例2
改造后的NS1蛋白表达、人转铁蛋白自组装和AngⅡ工作原理
如图2-图6所示。
图2为天然NS1蛋白结构模式图。拮抗宿主干扰素产生的原理：甲型流感病毒感染人体后会诱发宿主的天然免疫应答，通过Toll样受体和RIG样受体等模式识别受体介导的信号通路，诱导I型干扰素以及其它的细胞因子产生，发挥抗病毒作用。其中NS1可结合病毒的双链RNA，靶向RIG和E3泛素连接酶TRIM25等方式抑制宿主发挥抗病毒作用。
图3为人转铁蛋白和NS1共表达的模式图。人转铁蛋白的一个单体，其在细胞内表达后紧靠着NS1蛋白。表达之后，在2A自酶切发生之前，两者均具有较好的空间结构
图4为人转铁蛋白从NS1上通过2A自酶切后形成两个独立的蛋白模式图。左侧为NS1二聚体，人转铁蛋白不再黏附其上。右侧为人转铁蛋白形成的二聚体，呈独立状态。AngⅡ表达在其表面，即每一个人转铁蛋白单体上具有9个AngⅡ，二聚体人转铁蛋白表面具有18个AngⅡ。
图5为被截短的NS1蛋白，其前113个氨基酸序列仍然保持六个α螺旋的空间结构对病毒RNA的结合能力，保证了病毒的复制活性。但是其尾部被截短和取代后，不完整，不能刺激Toll样受体和RIG样受体等模式识别受体介导的信号通路，保障了重组流感病毒载体在细胞内的有限的复制能力。
图6为被2A自酶切下来的人转铁蛋白具备自组装能力，无需特殊处理和媒介作用，24个人转铁蛋白能够自组装成一个完整的纳米颗粒模式图。该纳米颗粒为实心颗粒，AngⅡ表达在其表面。即24个人转铁蛋白形成的纳米颗粒表面有216个AngⅡ覆盖在上面，保障了其重复的抗原性。
实施例3
重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗对模式动物SHR的治疗效果
（1）实验动物：
购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。12周龄，平均体重250g，雄性SHRs大鼠。它是自发性高血压大鼠，在发病后其血压高出正常大鼠血压水平。
（2）动物免疫：
初次免疫：大鼠进入实验室适应一周后，采用两后股四头肌处免疫的方式对大鼠进行免疫。免疫前禁水、禁食，第0周进行初次免疫，免疫剂量为250μg/只。
加强免疫：在初次免疫后第21天，再加强免疫1次，免疫剂量和方法同前。
空白对照组在相同条件下注射生理盐水。
（3）血压的测定：
按照SoftronTM智能无创血压计BP-98A(北京软隆科技有限责任公司）操作手册，采用无创尾压测量法来测量尾部动脉血压。
第0、2、4、8、10、12周测量血压并记录。结果如图7、图8所示。
图7结果表明，在使用本发明制备的重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗治疗后，自发性高血压大鼠的收缩压（SBP）降压效果监测显示，经过治疗后的第2周开始出现血压下降趋势，在治疗后的第6周降压到最佳效果，并能够维持在155mmHg上下范围波动。图8结果表明，在使用本发明制备的重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗治疗后，自发性高血压大鼠的舒张压（DBP）降压效果监测显示，在经过治疗后的第6周出现血压的显著降低，在第8周开始出现一定程度的升高，但仍然低于对照组的DBP值。
（4）抗体滴度的测定：
1）在治疗后的第12周采集模式动物的周尾静脉采血，采血液后，将血液于37℃水浴中放置或于4℃冰箱中放置过夜，离心，收集血清，于56℃水浴中放置半小时灭活血清，并进行分装，保存于-20℃备用。
2）用AngⅡ（conjugated to bovine serum albumin）包被96孔酶标板，使用浓度为100μg/mL，（每孔100μL），4℃包被过夜。
3）将包被板从2~8℃取出后，洗板4次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，在吸水纸上拍干，加入预先配制的封闭液，300μl/孔，盖封板膜，37±1℃孵育90分钟。
4）参考品处理：根据参考品标示抗原含量，以150mmol/L氯化钠溶液稀释至80μg/ml，再加等量处理液稀释为40μg/ml（已加处理液的上清为2倍稀释液），在EP管中用样品稀释液10倍稀释至4000ng/ml。
5）加样：取出封闭后的酶标板，弃去封闭液，加入洗涤液300μl/孔，轻轻震荡约30s，弃掉洗液，每次洗涤均尽量弃尽孔内残留洗液，并在吸水纸上拍干，重复洗涤4次。将稀释好的各个浓度的工作参考品、质控组及供试品解吸附稀释液、供试品未解吸附稀释液依次加入到板孔中，100μl/孔，平行2个复孔；加入100μl/孔样品稀释液作为阴性对照，平行2孔。盖上封板膜，37±1℃孵育60分钟。
6）加酶标记二抗：弃去孔内液体，用洗涤液洗板4次，每次洗涤液体积为300μl/孔，每次洗涤均尽量弃尽孔内残留洗液，在吸水纸上拍干；加入稀释好的酶标记二抗，100μl/孔，盖封板膜，37±1℃，孵育60分钟。
7）显色：弃去96孔板内的酶标记二抗，洗板4次，每次洗涤液体积为300μl/孔，每次洗涤均尽量弃尽孔内残留洗液，在吸水纸上拍干；加TMB显色液（提前从2~8℃取出，平衡至室温），100μl/孔，37℃避光显色15分钟。
8）终止：显色到时后立即加终止液100μl/孔，轻微震荡混匀。
9）检测：加终止液后，立即将酶标板放入酶标仪，在450nm/630nm波长下测吸光度值。
在治疗的第12周，测定血清结果显示：治疗组的平均吸光度值为0.6557±0.0053，空白对照组的平均吸光度值为0.0179±0.0046。结果显示两组之间具有显著差异。
本发明制备的重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗，目前没有进入临床试验，不能确定准确的注射次数和剂量。但是根据动物和人的年龄和体重相对比值，可以6个月注射一次，注射剂量＜1000PFU/剂。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）对流感病毒NS基因进行目的性改造：
将原NS1基因的237个氨基酸序列截短为前113个氨基酸，在其后面依次插入2A肽氨基酸序列，增加9个重复的血管紧张素Ⅱ氨基酸序列，增加转铁蛋白氨基酸序列，然后连接上NS2氨基酸序列，得改造后流感病毒NS基因片段；
（2）将所述改造后流感病毒NS基因片段与双向表达质粒连接，构建重组双向表达质粒，命名为re-NS；
（3）将甲型流感病毒冷适应减毒株作为母本株，分别将其基因片段PB2基因、PB1基因、PA基因、M基因、NP基因与双向表达质粒连接，构建重组双向表达质粒，分别命名为：AA-PB2、AA-PB1、AA-PA、AA-M、AA-NP；
（4）将世界卫生组织在北半球推荐使用的甲型流感病毒毒株的HA基因和NA基因分别与双向表达质粒连接，构建重组双向表达质粒，分别命名为re-HA、re-NA；
（5）将构建的8个重组双向表达质粒共转染哺乳动物细胞，培养收毒即可。
2.如权利要求1所述的一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法，其特征在于，所述转铁蛋白为人转铁蛋白或幽门螺旋杆菌转铁蛋白。
3.如权利要求1所述的一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法，其特征在于，所述改造后流感病毒NS基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述的一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法，其特征在于，所述双向表达质粒为pHW2000或pAD3000。
5.如权利要求1所述的一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法，其特征在于，所述甲型流感病毒冷适应减毒株为A/AnnArbor/6/60、A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)、A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)。
6.如权利要求1所述的一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、Vero细胞。
7.如权利要求1所述的一种重组流感病毒载体治疗性高血压疫苗的制备方法，其特征在于，还包括纯化步骤，所述纯化包括超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心、疏水层析和阴离子层析。
8.权利要求1-7任一所述制备方法制备的疫苗，其特征在于，通过皮内注射方式进行免疫。
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