CN103740654A - 一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用，其命名为B/Yunnan/2/2005Vca(By)，微生物保藏号为：CGMCCNO.7009。该毒株能在Vero细胞上连续传代培养，血凝滴度保持在1:512-1:1024，感染性滴度保持在7.0～7.8log10TCID50/ml，经鉴定具有Ca、Ts表型和Att特性。该毒株可以作为母本株与流行株遗传重配，或者采用反向遗传学技术将其6个内部基因与流行株2个表面蛋白基因进行基因重配，获得含流行株表面抗原的Vero细胞冷适应株，可应用于制备Vero细胞流感减毒活疫苗或流感减毒活疫苗，也可用于流感灭活疫苗的生产。
Description
技术领域：
本发明涉及一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株，并涉及以此适应株作为母本毒株与其他流行毒株进行重配，从而获得含有流行株表面抗原的Vero细胞冷适应株，以作为制备Vero细胞流感减毒活疫苗或流感减毒活疫苗以及流感灭活疫苗的毒种，属于生物制品技术领域。
背景技术：
流感病毒（influenza virus）是一种能引起急性呼吸道疾病的病毒，具有高度传染性，主要经空气飞沫传播，因此它能在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行，发病率高并伴有一定的死亡率，是目前人类尚不能有效控制的世界性传染病。
流感病毒属于正粘病毒科，其病毒颗粒呈球形或丝状，核衣壳呈螺旋对称，病毒基因组为单股负链分节段的RNA，有包膜。根据病毒核蛋白（NP）和基质蛋白（MP）的抗原性，可将流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，其中甲型和乙型流感病毒的基因含有8个RNA片段，丙型流感病毒的基因含有7个片段；甲型流感病毒又可根据流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）抗原性不同，再分为若干亚型。甲型流感病毒常以流行形式出现，乙型流感呈局部爆发，丙型流感主要是以散发形式出现。其中甲型和乙型流感病毒与人类有密切联系，甲型流感病毒除感染人外，还可感染飞禽、猪、马等动物。而人在生活中与这些动物接触频繁，为流感病毒产生变异提供有利条件，变异后的病毒会导致流感流行，变异程度大则导致大流行。
乙型流感病毒是流感的主要病原之一，只有一个亚型，宿主特异性较强，至今只发现感染人和海豹。1990 年就已经报道了世界范围内流行的乙型流感病毒，根据其抗原特性和HA1 区的核苷酸序列,可以分为两大谱系，代表的毒株分别为B/ Yamagata/ 16/ 88 和B/ Victoria/ 2/ 87 (这两大谱系分别简称为Yamagata 系和Victoria系)。同甲型流感病毒一样，乙型流感病毒也是通过在HA和NA基因上的点突变和多种氨基酸选择性突变，特别是血凝素的重链区(HA1)的变异，改变抗原特性来逃避机体已有的免疫保护，从而不断导致流感的流行。因此乙型流感病毒抗原是三价流感疫苗的重要组成部分。
接种流感疫苗是预防和降低流感严重程度的最有效手段，包括灭活疫苗和减毒活疫苗。1941年鸡胚制备的流感灭活疫苗在美国首次获得批准，在全世界得到广泛应用。目前使用的主要是用鸡胚制备的灭活的流感三联裂解疫苗，包括甲型流感病毒H1N1株、H3N2株和乙型流感病毒毒株。疫苗株的组分是由WHO根据每年全球流感病毒的变化规律，推荐的用于下一年度疫苗生产用流感病毒流行株的表面抗原来确定的。
流感减毒活疫苗因具备滴鼻途径接种、提供粘膜免疫和细胞免疫且免疫保护更持久的特点，而优于灭活疫苗。目前只有美国和俄罗斯生产流感减毒活疫苗，其疫苗种子批均来源于鸡胚高产的流感病毒冷适应株，在美国为A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)和B/Ann Arbor/1/66，在俄罗斯为A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)和B/USSR/60/69。
但是，以鸡胚作为培养基质存在以下不足之处：(1)潜在污染、可能造成鸡传染病因接种疫苗而波散；(2)连续传代常变异，造成疫苗与人群中流行毒株不匹配，使疫苗效力降低；(3)培养周期过长，难于大规模生产以满足流感大流行突发性需求；(4)纯化过程复杂；(5)易引起过敏反应。尤其是2003年以来全世界范围内高致病性禽流感的流行，使采用鸡胚生产流感病毒疫苗风险性增加。研究出安全有效的疫苗已经成为流感疫苗重要研究方向，尤其要应对流感大流行时不受鸡胚来源限制，世界卫生组织建议用哺乳动物细胞培养流感病毒来替代鸡胚制备流感疫苗。
现在用于制备流感疫苗的哺乳动物细胞主要是狗肾细胞（MDCK）和非洲绿猴肾细胞（Vero）。虽然MDCK细胞是培养和分离流感病毒较好的哺乳动物细胞系，但其存在潜在的致瘤性，使得其应用于疫苗生产顾虑重重。非洲绿猴肾细胞（Vero）是世界卫生组织批准的可用于人用疫苗生产的传代细胞系，其遗传背景较为清楚，无潜在的致瘤性，安全可靠，且能利用生物反应器进行大规模培养，短期内供给量大。另外，用Vero细胞研制的流感疫苗，可以使机体产生相对较强的体液免疫效应和细胞毒性T淋巴细胞反应。目前Vero 细胞已广泛用于狂犬、乙脑、脊髓灰质炎、肾综合征出血热等疫苗的生产。但是，Vero细胞并不是流感病毒的敏感培养基质，产量较低且多数病毒不能在Vero细胞上连续增殖。我们研究Vero细胞流感多年，已经成功筛选出一株甲型流感病毒Vero细胞高产适应株，在此基础上，如何进一步选育出流感病毒Vero细胞冷适应株，使其能够在25℃也能大量复制且连续高产，成为了Vero细胞流感减毒活疫苗研发的难题。
反向遗传学，相对于经典遗传学而言，是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失及基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。目前反向遗传学已应用于流感病毒跨种属传播机制、病毒毒力及其致病性研究和疫苗研发。应用于疫苗研发，即6+2重配，例如将鸡胚高产株的六个内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）和当前流行毒株的HA和NA加以重配，获得流行株的鸡胚高产株，用以生产疫苗。相对于传统流感疫苗研制方法耗时繁琐、并且要求足够的鸡胚供应，反向遗传学可以使疫苗的研制周期缩短、工艺简化。因此反向遗传学是应对流感大流行的一个重要手段。
综上所述，流感仍是人类尚不能有效控制的世界性传染病，接种流感疫苗是预防流感主要手段，减毒活疫苗优于灭活疫苗。目前使用鸡胚作为制备流感疫苗的基质，存在很多不足之处，使用Vero细胞制备流感疫苗成为流感疫苗发展的重要方向。如何选育出流感病毒Vero细胞冷适应株，使其不仅在33℃而且在25℃也能大量复制且连续高产，成为了Vero细胞流感减毒活疫苗研发的难题。
目前所用的流感疫苗生产毒种都是与鸡胚高产株重配或天然的鸡配适应株，其一般在Vero细胞上不敏感。国内和国外有厂家直接将WHO提供的流感疫苗生产毒种接种Vero细胞产毒量低或产量不稳定，制约了利用Vero细胞培养流感病毒制备流感疫苗的应用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株，且在Vero细胞上25℃可连续传代并保持稳定高产，该乙型流感病毒Vero细胞冷适应株具有Ca、Ts表型和Att特性。
本发明提供的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株，被命名为B/Yunnan/2/2005Vca (B)，其保藏号为：CGMCC NO. 7009，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市，中国科学院微生物研究所；保藏时间为：2012年12月19日。
本发明的目的之二是提供所述乙型流感病毒Vero细胞冷适应株B/Yunnan/2/2005Vca (B)的制备方法。
本发明提供的保藏号为CGMCC NO. 7009的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株B/Yunnan/2/2005Vca (B)通过下列方法获得：
A. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI的血凝滴度达到1:512的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，33±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液；
B.将步骤 A收获的病毒液反复冻融3次，接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤A和B，如此连续传3代，并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:512，得传代乙型流感病毒；
C. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI的步骤B的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，32±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:256，得传代乙型流感病毒；
D. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤C的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，31±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
E. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤D的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，30±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
F. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤E的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，29±1℃条件下，培养96－120小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
G. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤F的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，28±1℃条件下，培养96-120小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:80，得传代乙型流感病毒；
H. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤G的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，27±1℃条件下，培养96-120小时后，收获病毒液；
I. 将步骤H收获的病毒液反复冻融3次，接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤H和I，如此连续传代4代，种毒细胞收获液的血凝滴度在波动于0－1:80，得传代乙型流感病毒；
J. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤I的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，26±1℃条件下，培养96－120小时后，收获病毒液；
K. 将步骤J收获的病毒液反复冻融3次，再次接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤J和K，如此连续传代10代，病毒始终保持低水平复制状态，得再传代乙型流感病毒；
L. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤K的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，25±1℃条件下，培养120-168小时后，收获病毒液；
M. 将步骤L收获的病毒液反复冻融3次，接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤L和M，如此连续传代31代，得血凝滴度在1:512-1:1024的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株。
所述步骤A的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)为现有病毒，其保藏号为：CGMCC No.2931，专利号为ZL 2009 1 0094354.6。
本发明提供的保藏号为CGMCC NO. 7009的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株B/Yunnan/2/2005Vca (B)的基本特征：（a）透射电镜观察到所得的流感病毒直径约为80-120nm,具有囊膜的较为典型的流感病毒形态；（b）基因序列分析表明在连续传代培养过程中，不易产生流感病毒基因变异；（c）流感病毒在25℃ Vero细胞上连续传代培养，血凝滴度可保持在1:512；（d）HI实验表明病毒的HA抗原可被羊抗或其它动物抗B亚型流感病毒高免血清特异性识别；（e） B/Yunnan/2/2005Vca (B)活病毒经自然途径感染SPF鸡后，感染鸡无发病和死亡。
本发明的目的之三是提供保藏号为CGMCC NO. 7009的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株B/Yunnan/2/2005Vca (B)的应用，即以乙型流感病毒Vero细胞冷适应株作为母本株与其他流行毒株进行重配，从而获得流行株的Vero细胞冷适应株，具体通过以下两种方法实现：
第一种方法：用常规的重配技术获得流感病毒流行株的Vero细胞冷适应株：
A1. 以1:100-100:1的体积比，将保藏号为CGMCC NO. 7009的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株B/Yunnan/2/2005Vca (B)与其他亚型流感病毒混合，得混合病毒，具体比例由病毒血凝滴度和不同毒株生长性而定；
A2. 在9-10日龄SPF鸡胚上，按每胚接种0.1-0.3ml的量，接种步骤A1的混合病毒，于33±1℃孵育12-48小时，2-8℃过夜冷胚，收集鸡胚尿囊液，得病毒液；
或者在新鲜的Vero细胞上，按0.004-0.008ml/cm2Vero细胞的量，接种步骤A1的混合病毒，置于33±1℃培养48-72小时，得病毒液；
或者在新鲜的MDCK细胞上，按0.004-0.008ml/cm2MDCK细胞的量，接种步骤A1的混合病毒，置于33±1℃培养48-72小时，得病毒液；
A3. 将步骤A2的病毒液中加入抗B/Yunnan/2/2005Vca (B)的抗血清至抗血清浓度为1-80%（体积比），具体浓度视抗体效价为1:10240－1:2560而定，并在Vero细胞上25℃传代筛选，从而选育出流行株的Vero细胞冷适应株；
第二种方法：用现有的反向遗传学技术重配获得流感病毒流行株的Vero细胞冷适应株：
B1. 将保藏号为CCTCC NO. V201253的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株B/Yunnan/2/2005Vca (B)的6个内部基因，即PB2、PB1、PA、NP、M、NS，分别克隆于双向转录载体pHW2000上或其它双向转录载体上，得克隆的Vero细胞冷适应株6个内部基因质粒；将流行株的2个表面蛋白基因HA和NA，也克隆于此双向转录载体上，得流行株2个表面蛋白基因质粒；
B2. 将步骤B1所得克隆的Vero细胞冷适应株6个内部基因质粒与流行株2个表面蛋白基因质粒混合后，共转染哺乳动物细胞297T、Cos1、Vero或MDCK细胞上，37±1℃培养48-72小时，收获细胞液；
B3. 在9-10日龄SPF鸡胚上，按每胚接种0.1-0.2ml的量，接种步骤B2的收获细胞液，25±1℃培养96-120小时，收获病毒液，即获得流行株的Vero细胞冷适应株；
或者在24小时长成致密单层的MDCK细胞上，按0.04-0.08ml /cm2MDCK细胞的量，接种步骤B2的收获细胞液，置于25±1℃培养120-168小时，收获病毒液，即获得流行株的Vero细胞冷适应株；
或者在24小时长成致密单层的Vero细胞上，按0.04-0.08ml/cm2Vero细胞的量，接种步骤B2的收获细胞液，置于25±1℃培养120-168小时，收获病毒液，即获得流行株的Vero细胞冷适应株。
本发明的难点在于：
（1）乙型流感病毒Vero细胞适应株在25℃培养时也能大量复制且连续高产。
（2）对乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (B)在Vero细胞上的种毒培养条件进行了系统的优化。
（3）乙型流感病毒Vero细胞适应株在鸡胚25℃培养时也能大量复制且连续高产，同时具有减毒特征。
（4）如何应用乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (B)与其他病毒株遗传和反向遗传学重配，进而获得Vero细胞冷适应株进行了研究。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
（1）乙流感病毒Vero细胞冷适应株可以采用微载体发酵罐大规模培养Vero细胞和流感病毒，制备流感减毒活疫苗和大流行流感疫苗。此法较目前以鸡胚作为培养基质生产流感疫苗具有以下优点： 可以采用微载体发酵罐大规模培养Vero细胞和流感病毒，生产工艺易于标准化；
采用标准化的Vero细胞，不含外源生物因子污染；
不含易于引起人体过敏的鸡胚蛋白；
避免了流感病毒在鸡胚培养后病毒的血凝素抗原易产生变化使疫苗效力降低；
在流感大流行突发性时，不受鸡胚来源的影响，能够生产出足够的疫苗满足需求。
（2）本发明在保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)基础上，采用连续梯度降温法，连续传31代，成功选育出保藏号为CGMCC NO. 7009的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株B/Yunnan/2/2005Vca (B)，以该毒株为母株与流行株流感病毒重配，获得Vero细胞乙型流感病毒疫苗生产用毒种，大大促进了Vero细胞流感减毒活疫苗和Vero细胞大流行流感疫苗的开发与应用。
附图说明
图1为B/Yunnan/2/2005Vca (B)连续降温传代血凝效价图。
图2为B/Yunnan/2/2005Vca (B)在25℃连续传代血凝效价图。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
实施例1
保藏号为CGMCC NO. 7009的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株B/Yunnan/2/2005Vca (B)的制备方法：
1. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI的血凝滴度达到1:512的保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)，在维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.2，33±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液；
2. 将步骤1收获的病毒液反复冻融3次，再次接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤1和2，如此连续传代3代，并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:512，得传代乙型流感病毒；
3. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤2的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.2，32±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:256，得传代乙型流感病毒；
4. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤3的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.2，31±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
5. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤4的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.2，30±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
6. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤5的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.2，29±1℃条件下，培养120小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
7. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤6的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.2，28±1℃条件下，培养120小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:80，得传代乙型流感病毒；
8. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤7的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.2，27±1℃条件下，培养120小时后，收获病毒液；
9. 将步骤8收获的病毒液反复冻融3次，再次接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤8和9，如此连续传代4代，种毒细胞收获液的血凝滴度在波动于0-1:80，得传代乙型流感病毒；
10. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤9的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.2，26±1℃条件下，培养120小时后，收获病毒液；
11. 将步骤10收获的病毒液反复冻融3次，再次接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤10和11，如此连续传代10代，病毒始终保持低水平复制状态，得再传代乙型流感病毒；
12. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤11的再传代乙型流感病毒，在维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.2，25±1℃条件下，培养步骤20的传代乙型流感病毒120-168小时后，收获病毒液；
13. 将步骤12收获的病毒液反复冻融3次，再次接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤12和13，如此连续传31代。前6代病毒处于较低复制水平，到第7代时血凝效价达到1:512，第12代达到1:1024，此后维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:512-1:1024，得保藏号为CGMCC NO. 7009的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株，命名为B/Yunnan/2/2005Vca (B)。；
本发明提供的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (B)的相关试验数据见图1－图2和表1，证明此毒株具有在Vero细胞上25℃培养时高效稳定增殖的特性。
血凝抑制试验证明，该株流感病毒经过低温选育后，型别为BY，有BV交叉；无H1N1、H3N2和 A1交叉。
表1， 冷适应后流感病毒BY血清学鉴定
实施例2
实施例1所得乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (B)在Vero细胞上25℃连续传代，仍保持稳定高产且具有Ca、Ts表型和Att特性：
接种1MOI的实施例1的乙型流感病毒到24小时长成致密单层的Vero细胞上，维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.0-7.2，培养168h后，收获病毒液，细胞收获液反复冻融3次，收获的病毒液再次接种到Vero细胞上，方法同上，在25℃Vero细胞上如此连续传代下去，种毒细胞收获液的血凝滴度可维持在1:512-1:1024。
乙型流感病毒Vero细胞冷适应株B/Yunnan/2/2005Vca (B)，具有Ca、Ts表型和Att特性。Ca (cold adaptation)表型：冷适应表型，指毒株在25℃能有效生长；在25℃和33℃培养，二者TCID50的差异小于100倍。Ts (temperature sensitive)表型：温度敏感表型，指毒株在39℃限制生长；39℃培养下的TCID50低于33℃的TCID50至少100倍。Att (attenuation)特性：减毒特性，动物实验，雪貂是最敏感的动物。毒株在雪貂呼吸道复制受限且不致病，具有减毒性。相关试验数据见表2－表3，证明此毒株具有Ca、Ts表型和Att特性。
表2，B/Yunnan/2/2005Vca (B) Ts和Ca表型
表3，B/Yunnan/2/2005Vca (B)雪貂实验结果
实施例3
实施例1所得乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (B)在无血清Vero细胞上25℃连续传代保持稳定高产：
接种1MOI的实施例1的乙型流感病毒到无血清培养24小时已长成致密单层的Vero细胞上，维持母液成分为SFM（Hyclone），青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5ug/ml，pH7.0-7.2，置于25±1℃培养120-168h后，收获病毒液，细胞收获液反复冻融3次，收获的病毒液再次接种到Vero 细胞上，方法同上，在Vero细胞上如此连续传代下去，种毒细胞收获液的血凝滴度可维持在1:256~1:512。
实施例4
实施例1所得乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (B)在鸡胚上25℃连续传代保持稳定高产：
将1MOI的实施例1的乙型流感病毒液，分别稀释为10-3和10-4，接种到的到9-11日龄鸡胚上，每胚接种0.2ml，置于25±1℃培养120-168h后，收获病毒液，细胞收获液反复冻融3次，收获的病毒液再次接种到9-11日龄鸡胚上，方法同上，在鸡胚上上如此连续传代下去，种毒细胞收获液的血凝滴度可维持在1:512~1:1024。
实施例5
实施例1所得乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (B)在MDCK细胞上25℃连续传代保持稳定高产：
接种1MOI的实施例1的乙型流感病毒到24小时已长成致密单层的MDCK细胞上，，维持母液成分为DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml，pH7.0-7.2，置于25±1℃培养120-168h后，收获病毒液，细胞收获液反复冻融3次，收获的病毒液再次接种到MDCK细胞上，方法同上，在MDCK细胞上如此连续传代下去，种毒细胞收获液的血凝滴度可维持在1:512-1:1024。
实施例6
采用遗传重配技术获得Bv亚型流感病毒Vero细胞冷适应株
①流感病毒遗传重配
将流感病毒非Vero细胞适应株Bv/Heilongjiang/116/2010与B/Yunnan/2/2005Vca (B) (Yamagata谱系)两病毒株按9:1比例混合，分别接种9-11日龄SPF鸡胚，每种比例接种两枚鸡胚，每胚接种0.2ml，33±1℃孵育24h， 2℃过夜冷胚，收集鸡胚尿囊液为病毒收获液。
②重配后流感病毒Bv 亚型Vero细胞冷适应株的选育
将流感病毒混合液与B/Yunnan/2/2005Vca (By)抗血清（抗体效价1:640）以2:1的比例混合，37℃中和2小时后，接种到培养24h的Vero细胞上，收获病毒液再用抗体同法处理在Vero 细胞上传代一次。以后不加抗血清在Vero细胞上再连续传10代。
③血清学鉴定病毒型别
将最后一次收获病毒液测其血凝滴度并配置成4个血凝单位抗原，用H3N2阳性血清、H1N1阳性血清、B型（Victoria谱系）阳性血清、B型（Yamagata谱系）阳性血清与病毒液以半加敏法进行血凝抑制试验(H I)，血凝滴度1:256，经鉴定为Bv亚型流感病毒。
实施例7
采用遗传重配技术获得By亚型流感病毒Vero细胞冷适应株
①遗传重配获得Bv亚型流感病毒Vero细胞冷适应株，方法见实施例6。
②遗传重配获得By亚型流感病毒Vero细胞冷适应株。
a. 流感病毒遗传重配
将流感病毒非Vero细胞适应株By/Guangdong/143/2009与重配Bv亚型Vero细胞适应株两病毒株按8:2比例混合，分别接种9-11日龄SPF鸡胚，每种比例接种两枚鸡胚，每胚接种0.2ml，33±1℃孵育24h， 2℃过夜冷胚，收集鸡胚尿囊液为病毒收获液。
b. 重配后流感病毒By亚型Vero细胞冷适应株的选育
将流感病毒混合液与Bv抗血清（抗体效价1:640）以2:1的比例混合，37℃中和2小时后，接种到培养24h的Vero细胞上，收获病毒液再用抗体同法处理在Vero 细胞上传代一次。以后不加抗血清在Vero细胞上再连续传10代。
c. 血清学鉴定病毒型别
将最后一次收获病毒液测其血凝滴度并配置成4个血凝单位抗原，用H3N2阳性血清、H1N1阳性血清、B型（Victoria谱系）阳性血清、B型（Yamagata谱系）阳性血清与病毒液以半加敏法进行血凝抑制试验(H I)，血凝滴度1:256，经鉴定为By亚型流感病毒。
实施例8
反向遗传学重配获得Bv亚型流感病毒Vero细胞冷适应株
① 将流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (By)的6个内部基因克隆于双向转录载体pHW2000。
② 将非流感病毒Vero细胞适应株Bv/Heilongjiang/116/2010的2个表面蛋白基因克隆于双向表达载体pHW2000。
③将流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (By)的6个内部基因质粒与Bv/Heilongjiang/116/2010的2个表面蛋白基因质粒，8个质粒共2μg，加入转染试剂Lipofectamine 2000，共转染生长12-24小时、长满80-90%的293T细胞，培养48h，收获病毒液，反复冻融三次，测其血凝滴度为1:32。表明病毒被拯救成功。
④ 将病毒液在Vero细胞上连续传代，获得具有Bv/Heilongjiang/116/2010的HA/NA的流感病毒Vero细胞冷适应株。
⑤ 血清学鉴定病毒型别
将最后一次收获病毒液测其血凝滴度并配置成4个血凝单位抗原，用H3N2阳性血清、H1N1阳性血清、B型（Victoria谱系）阳性血清、B型（Yamagata谱系）阳性血清与病毒液以半加敏法进行血凝抑制试验(H I)，血凝滴度1:256，经鉴定为Bv亚型流感病毒。
实施例9
反向遗传学重配获得By亚型流感病毒Vero细胞冷适应株
① 将流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (By)的6个内部基因克隆于双向转录载体pHW2000。
② 将非流感病毒Vero细胞适应株By/Guangdong/143/2009的2个表面蛋白基因克隆于双向表达载体pHW2000。
③将流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (By)的6个内部基因质粒与By/Guangdong/143/2009的2个表面蛋白基因质粒，8个质粒共2μg，加入转染试剂Lipofectamine 2000，共转染生长12-24小时、长满80-90%的293T细胞，培养72h，收获病毒液，反复冻融三次，测其血凝滴度为1:64。表明病毒被拯救成功。
④ 将病毒液在Vero细胞上连续传代，获得具有By/Guangdong/143/2009的HA/NA的流感病毒Vero细胞冷适应株。
⑤ 血清学鉴定病毒型别
将最后一次收获病毒液测其血凝滴度并配置成4个血凝单位抗原，用H3N2阳性血清、H1N1阳性血清、B型（Victoria谱系）阳性血清、B型（Yamagata谱系）阳性血清与病毒液以半加敏法进行血凝抑制试验(H I)，血凝滴度1:256，经鉴定为By亚型流感病毒。
Claims (5)
1.一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株，命名为B/Yunnan/2/2005Vca (B)，该毒株的微生物保藏号为：CGMCC NO. 7009。
2.如权利要求1所述乙型流感病毒Vero细胞冷适应株在制备流行株的Vero细胞适应株中的应用。
3.如权利要求1所述乙型流感病毒Vero细胞冷适应株在制备流感疫苗中的应用。
4.一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株的制备方法，其特征在于经过以下步骤：
A. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI的血凝滴度达到1:512的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，33±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液；
B.将步骤 A收获的病毒液反复冻融3次，接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤A和B，如此连续传3代，并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:512，得传代乙型流感病毒；
C. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI的步骤B的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，32±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:256，得传代乙型流感病毒；
D. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤C的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，31±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
E. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤D的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，30±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
F. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤E的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，29±1℃条件下，培养96－120小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
G.. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤F的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，28±1℃条件下，培养96-120小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:80，得传代乙型流感病毒；
H. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤G的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，27±1℃条件下，培养96-120小时后，收获病毒液；
I. 将步骤H收获的病毒液反复冻融3次，接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤H和I，如此连续传代4代，种毒细胞收获液的血凝滴度在波动于0－1:80，得传代乙型流感病毒；
J. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤I的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，26±1℃条件下，培养96－120小时后，收获病毒液；
K. 将步骤J收获的病毒液反复冻融3次，再次接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤J和K，如此连续传代10代，病毒始终保持低水平复制状态，得再传代乙型流感病毒；
L. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤K的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，25±1℃条件下，培养120-168小时后，收获病毒液；
M. 将步骤L收获的病毒液反复冻融3次，接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤L和M，如此连续传代31代，得血凝滴度在1:512-1:1024的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤A的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)为现有病毒，其保藏号为：CGMCC No.293。
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