CN102373183A - 禽流感和新城疫混合病毒样颗粒、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供混合病毒样颗粒包含流感病毒的基质蛋白M1，流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA，一个融合膜蛋白，其包含新城疫病毒F蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的红细胞凝集素HA的跨膜区和膜内区；所述含新城疫病毒F蛋白的主要表面抗原的膜外域替换流感病毒的红细胞凝集素HA的5’端的大致相同长度的膜外域；在所述混合病毒样颗粒的表面上同时表达流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA和新城疫病毒的表面抗原F蛋白。本发明还提供禽流感和新城疫二价疫苗，包含所述的混合病毒样颗粒和佐剂。本发明还提供制备混合病毒样颗粒的方法。
Description
技术领域
本发明涉及禽流感和新城疫混合病毒样颗粒，及其制备和应用。
背景技术
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽类(家禽和野禽)的一种感染和/或疾病综合征，发生在鸡、鸭、鹅、鸽子等禽类和鸟类身上，但主要侵害火鸡和鸡，哺乳动物如猪、马、海豹、人等也可感染。根据禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)株的致病性、禽的种类、环境、饲养管理条件以及并发疾病等因素，感染后的禽只表现为无症状感染、轻度的上呼吸道症状、产蛋量下降到急性的致病性死亡等多种形式，直接影响鸡体的健康及其产品质量，是现代化养禽业难以对付的重要禽类呼吸道传染病之一，与马立克氏病、传染性法氏囊病、白血病、网状内皮增生症等一样，也是严重威胁家禽的重要免疫抑制病。被世界动物卫生组织列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
自从1955年证实了1878年意大利暴发的鸡瘟是由A型流感病毒引起的流感以来到2001年，全球共报道了19起高致病性禽流感疫情，其中火鸡发生5起，鸡14起。进入本世纪以来，高致病性禽流感疫情也不断发生。2001年中国香港发生H5N1亚型流感；2003年初，欧洲大陆相继暴发禽流感，2003年2月荷兰发生H7N7亚型、2003年4月比利时发生H7N7亚型、2003年5月德国发生H7N7亚型禽流感。2003年末2004年初，亚洲各国相继暴发禽流感，疫情共涉及10个国家或地区。2003年12月，韩国发生禽流感，2004年1月，日本、越南、台湾、泰国、柬埔赛、印度尼西亚、巴基斯坦、老挝和中国等国家和地区先后发生禽流感，其中日本、台湾发生了H5N2亚型禽流感，其他国家和地区发生了H5N1亚型禽流感。这些疫情的暴发，不但给亚洲各国养禽业造成毁灭性打击，而且严重影响到人民的身体健康，越南、泰国等国家先后发生了禽流感感染人类，造成死亡的严重后果。2004年2月，禽流感又在美洲大陆发生，其中美国发生了H7N7禽流感，4月份加拿大也发生了禽流感。目前，高致病性禽流感特别是H5N1禽流感还在亚洲和北美部分国家和地区蔓延。
我国目前流行的高致病性禽流感主要是H5N1亚型禽流感。目前国内生产的用于预防禽流感的疫苗大部份是采用传统的鸡胚法培养增殖活病毒，经化学试剂灭活后生产成疫苗。这种技术又分为两类不同的制备法：一是直接用野生型病毒感染鸡胚制备，另一类是先采用反向遗传技术改造野生病毒的遗传性，然后用“拯救”改造的新病毒来感染鸡胚，增殖病毒，生产疫苗。
这些流感疫苗制备技术有其优点，但亦存在着很大的缺陷。尤其是流感病毒与众不同的特性，例如：高频率突变，双重及多重亚型病毒之间遗传物质重组及抗原漂移等——使这些疫苗的长期安全性及有效性受到了极大挑战，甚至产生了“无效疫苗”，难以应付新的突变型流感病毒的传染。除此以外，这些疫苗制剂还存在着以下不足：(1)生产周期长：从获得新的亚型病毒株到疫苗生产上市，耗时5-8个月，难以遏制新的疫情大爆发。(2)生产条件高：为预防人为的污染环境及生产的活病毒的泄漏扩散，整套生产必须按规定在生物安全三级实验室条件下进行，病毒的灭活必须保证完全，彻底。(3)无法区别被免疫过的鸡只与受病毒感染的鸡只。
新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种禽类急性、高度传染性疫病，对养禽业的发展构成了严重的威胁，被世界卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病。自1926年首发于印度尼西亚和英国新城[4]以来，在80多年中，新城疫已在世界上发生过三次大流行。第一次是1926年起源于东南亚，经亚洲向欧洲缓慢移动，经30年时间传播到世界各地。第二次大流行是二十世纪六十年代末始于中东，由于家禽的集约化养殖和大规模世界贸易，传播非常迅速，到1973年波及世界大多数国家，给世界养禽业带来了严重损失。第三次大流行是二十世纪七十年代末起于中东，1981年到达欧洲后迅速蔓延到世界各地，这次流行主要为嗜神经型，是由种鸽传播而引起的。九十年代以来，虽没再发生世界性大流行，但局部地区的爆发和流行时常发生。
新城疫病毒是单股负链RNA病毒中副粘病毒科(Paramyxaviridae)、副粘病毒亚科(Paramyxoviridae)的重要成员，有囊膜，完整的病毒粒子近圆形，表面有纤突。新城疫病毒的基因组长度约1.5kb，6个结构基因的排列顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，NDV基因组长度严格遵守“六核苷酸规律”，编码6种结构蛋白即血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白(F)、基质蛋白(M)、核蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)以及RNA多聚酶(L)，其中F蛋白是主要的宿主保护性抗原之一，可诱导机体产生中和抗体，F蛋白裂解位点附近的氨基酸序列是决定病毒力的主要因素。
疫苗免疫是控制新城疫的有效方法。目前使用的新城疫疫苗包括弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗等。活疫苗一般由感染胚尿囊液冻干而成，可大规模饮水免疫，经济实惠，也可用于喷雾和气雾，但疫苗返强可能引发疾病。灭活疫苗一般是感染性尿囊液用甲醛灭活后与佐剂混合后制成的油乳剂灭活疫苗。基因工程亚单位疫苗是利用重组DNA技术在高效表达系统表达NDV免疫原性基因，并辅以佐剂而制成的疫苗。研究表明，用基因工程方法制成的新城疫亚单位疫苗免疫SPF鸡均能诱导ND抗体产生，对致死剂量的强毒攻击具有一定的保护力，但效果不如弱毒疫苗。
病毒样颗粒(VLP)是含有某种病毒的一个或多个主要结构蛋白，在体外表达系统中自动组装成的不包含病毒核酸的空心颗粒，它的形态和大小与真实的病毒粒子相同或相似，所以能有效的诱导机体免疫系统产生免疫保护反应，作为一种新型疫苗显示出了良好的应用前景。典型的H5N1 AIV粒子呈球形或椭圆形，直径80～120nm，H5N1流感病毒的基因组8个基因片段共编码11种蛋白，病毒的外壳是一层由脂质及脂蛋白构成的膜，包裹着病毒的遗传物质及核蛋白。共有4种蛋白质，属于病毒主要结构蛋白，它们是：基质蛋白M1，形成病毒外壳的主体蛋白；核蛋白NP，形成病毒粒子核衣壳，参与病毒粒子形成；红细胞凝集素HA，病毒外壳表面膜上的主要糖蛋白，共有16个亚型。是诱发宿主机体产生抗体的主要抗原体。神经氨酸苷酶NA，亦是病毒外壳表面膜上的一种糖蛋白，共有9个亚型，同样是诱发抗体产生的主要抗原体。
流感病毒的表面膜蛋白HA和NA是引起机体产生免疫应答的主要诱发物，而基质蛋白M1是形成病毒外壳的主体，亦可作为组织型免疫应答的诱发物。有关的研究证明，基质蛋白M1的正确表达，是保证病毒外壳形成的重要环节，而膜蛋白NA的功能之一是把病毒实体从宿主细胞表面剥离下来，形成病毒颗粒，因此禽流感病毒的结构蛋白M1、HA和NA是合成新型抗禽流感病毒疫苗的核心。蛋白HA、NA和M1等3个主要结构蛋白同时表达就可以自动组装成空心的没有病毒基因组的病毒样颗粒。另外研究证明流感病毒的保守蛋白--NP蛋白可有效刺激CTL(细胞毒T淋巴细胞)反应，抑制病毒感染，在病毒样颗粒中加入NP蛋白将会在一定程度上提高这种新型疫苗的细胞免疫水平。
禽流感病毒和新城疫病毒在鸡体内互为影响，同时感染会加重病情。故有必要提供一种二价疫苗同时预防H5N1禽流感和新城疫。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种疫苗，该疫苗能够同时预防H5N1禽流感和新城疫。
本发明的目的是通过以下内容实现的。
本发明提供一种混合病毒样颗粒包含流感病毒的基质蛋白M1，流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA，一个融合膜蛋白，其包含新城疫病毒F蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的红细胞凝集素HA的跨膜区和膜内区；所述含新城疫病毒F蛋白的主要表面抗原的膜外域替换流感病毒的红细胞凝集素HA的5’端的大致相同长度的膜外域，在所述混合病毒样颗粒的表面上同时表达流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA和新城疫病毒的表面抗原F蛋白。
本发明还提供一种禽流感和新城疫二价疫苗，包含所述的混合病毒样颗粒和佐剂。
本发明还提供一种制备所述混合病毒样颗粒的方法。
利用包含所述含有融合膜蛋白的混合病毒样颗粒构成的疫苗，可同时预防H5N1禽流感和新城疫，并具有明显的优点和效果：
(1)H5N1禽流感和新城疫VLP二价疫苗能引起机体免疫系统产生强型应答，免疫力强，持续时间长，能同时预防H5N1禽流感和新城疫。
(2)由于病毒样颗粒不含病毒基因组，这种空壳结构的VLP在免疫动物体内就不会发生病毒基因与宿主染色体基因整合，而且整个生产过程不接触活的有感染力的病毒，因此非常安全，对于流感病毒和新城疫病毒两种病毒来说，都无病毒扩散之虞。
(3)和一般的基因工程亚单位疫苗比较，因为病毒样颗粒更接近天然病毒的形态和大小，能刺激机体产生更好的免疫反应，免疫效果更好。
(4)可区别出被人工免疫了的动物与被病毒感染的动物。病毒样颗粒不含流感病毒NS、PB1、PB2等蛋白，因此进行血清测试时，用VLP疫苗免疫的动物，将不会产生特异性抗NS或PB的抗体，可以区分是否为野毒感染。对于新城疫来说，用F蛋白之外的任何病毒结构蛋白如M蛋白、P蛋白等作为检测抗原，都可以区分是否为野毒感染。
下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。
附图说明
图1是用各自特异性引物PCR扩增出的HA(a)、NA(a)、M1(b)、NP(c)、F/HA(d)基因片段的电泳图片。
图2是重组昆虫杆状病毒表达质粒rBacmid-HA(/F/HA)-NA、rBacmid-M1、rBacmid-NP示意图。
图3是病毒样颗粒western blot结果。
图4是病毒样颗粒中的M1蛋白和F蛋白的间接免疫荧光结果。A、M1抗体为RBITC标记显示橙色荧光，C、抗F蛋白抗体为FITC标记显示绿色荧光，B、D为阴性对照。
图5A是蔗糖密度梯度离心纯化后的病毒样颗粒在电子显微镜下的图象，图5B是放大图。
具体实施方式
本发明以Bac-to-Bac
昆虫杆状病毒表达系统为基础，利用H5N1禽流感病毒的基质蛋白M1、表面膜蛋HA和NA蛋白(以及任选地，核蛋白NP)，共同自动组装构建出H5N1禽流感病毒的病毒样颗粒(VLP)。在此基础上，构建H5N1禽流感病毒与新城疫病毒的二价VLP。
首先，将新城疫病毒的主要表面抗原基因F的大部分膜外域替换H5N1禽流感病毒的HA蛋白基因的一部分膜外域，二者构成融合基因(F/HA)，F基因位于融合基因F/HA的5’端。一般情况下，F基因替换大致相等长度的HA基因的5’端序列，以保障融合基因F/HA的长度与HA基因长度大致相等。
然后，按照形成流感病毒样颗粒的方法，将H5N1禽流感病毒的基质蛋白M1、核蛋白NP及表面膜蛋白HA和NA的基因，以及表达新城疫病毒F和流感病毒HA的融合蛋白F/HA的基因，构建于昆虫杆状病毒的载体质粒内，并使其重组入昆虫杆状病毒的遗传物质DNA内，利用宿主昆虫细胞表达这些外源蛋白，自动组装成不含禽流感病毒遗传物质的病毒样颗粒，病毒样颗粒形成后将释放入细胞培养液中。这样形成的VLP既具有H5N1禽流感病毒的主要表面抗原HA，又具有新城疫病毒的主要表面抗原F，为H5N1禽流感病毒与新城疫病毒二价VLP。
需要指出的是，有研究表明，不同的膜蛋白在细胞内表达后会被转运到细胞膜的不同微区域，在细胞膜上的分布主要取决于膜蛋白的跨膜区和膜内域。未经改造的F和HA蛋白有可能在表达后分布于细胞膜的不同微区域，因而当未经改造的F和HA蛋白同时表达时，他们有可能同时整合到同一VLP，但他们在VLP中的含量和比例有很大差异。本发明将F蛋白的部分膜外域融合到缺失部分膜外域的HA上，这样F/HA融合蛋白和HA蛋白含有同样的HA的部分膜外域，跨膜区和膜内域；这样保证F/HA融合蛋白和HA蛋白分布在同一细胞膜的微区域；因此在VLP的形成过程中，F/HA融合蛋白和HA蛋白非常可能地被一样有效地整合到VLP上，他们在VLP中的含量和比例得到保证。
另外，流感病毒的结构蛋白作为二价VLP的骨架是因为我们发现流感病毒VLP高产、稳定；同时HA蛋白的整合到VLP是高效的；这样可以保证在VLP的表面有足够的HA蛋白，可以作为有效的疫苗使用。
实施列1：H5N1的M1、NP、HA、HA基因和融合基因F/HA的扩增
(1)H5N1亚型禽流感病毒RNA抽提和RT-PCR
按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书(方法)进行。分别取250μL禽流感病毒H5N1亚型毒株感染尿囊液和750μL TRIzol LS，加入1.5mL微量离心管内，用吸管吹打充分混匀，室温放置10min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5分钟后，4℃下12000rpm离心15min；取上清于一新的灭菌1.5mL离心管内，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温放置10min，在4℃下12000rpm离心10min；倾去上清，沉淀中加入70％的乙醇750μL，轻轻混匀，洗涤一次，4℃下12000rpm离心15min，弃去上清，风干；加入10μL用DEPC水处理的无RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA(沉淀)，直接用于RT-PCR或-80℃保存备用。参照TaKaRa的AMV反转录酶的使用说明进行，在20μL反应体系中分别加入以下组分：RNA：3μL；5×RT buffer：4μL；dNTP：4μL；RNA酶抑制剂：0.5μL；引物UP：1μL；引物DN：1μL；AMV：2μL；DEPC水：补至20μL。混匀后，室温放置10min，42℃保温1h，冰浴2min，RT产物直接用于PCR扩增或-20℃保存。
(2)M1、NP、HA、NA基因的PCR扩增
来源于(1)的RT-PCR产物可用于M1、NP、HA、NA基因的扩增。
根据HA基因序列(SEQ ID NO：1)设计的1对引物，用于扩增HA基因，其两端分别加上了Xho I和Nco I/酶切位点，位于P10启动子下，引物序列如下：
HA Xho I：5’-GCCCTCGAGATGAAGGCAATACTAGTG-3’(SEQ ID NO：11)
HA Nco I：5’-GCCCCATGGTTAAATACATATTCTGCACTG-3’(SEQ ID NO：12)
根据NA基因序列(SEQ ID NO：3)设计的1对引物，用于扩增NA基因，其两端分别加上了Sal I和Hind III的酶切位点位于PPH启动子下，这2个引物序列分别是：
NA Sal I：5’-GCCGTCGACATGAATCCAAACCAAAG-3’(SEQ ID NO：13)
NA Hind III：5’-GCCAAGCTTCTACTTGTCAATGGTG-3’(SEQ ID NO：14)
根据M1基因序列(SEQ ID NO：5)设计的1对引物，用于扩增M1基因，其两端分别加上了Sal I和Hind III的酶切位点，位于PPH启动子下，这2个引物序列分别是：
M1Sal I：5’-GCCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAG-3’(SEQ ID NO：15)
M1Hind III：5’-GCCAAGCTTTCACTTGAATCGTTG-3’(SEQ ID NO：16)
根据NP基因序列(SEQ ID NO：7)设计的1对引物，用于扩增NP基因，其两端分别加上了Xho I和Nco I/酶切位点，位于P10启动子下，引物序列如下：
NP Xho I：，5’-AGTCTCGAG ATGAGTGACATCGGAGCCAT-3’(SEQ ID NO：17)
NP Nco I：5’-CATGCCATGGTTAATTGTCATACTCCTCTGCATTG-3’(SEQ ID NO：18)
(3)融合基因F/HA的扩增
F/HA基因的核酸序列见SEQ ID NO：9；F/HA蛋白质的氨基酸序列见SEQ ID NO：10。融合基因根据其核酸序列合成。融合基因F/HA包含新城疫F基因5’端的1-200氨基酸和H5N1的HA基因的3’端185-568(共384)氨基酸。融合基因F/HA编码584氨基酸，其基因序列如SEQ ID NO：9所示。融合基因F/HA由人工合成。根据融合基因F/HA的序列(SEQ ID NO：9)，设计的1对引物，用于扩增融合基因F/HA，其两端分别加上了Xho Ⅰ和Sph I酶切位点，位于P10启动子下，引物序列如下：
F/HA EcoR I：5’-CCGGAATTCATGGGCTCCAGACCTTC-3’(SEQ ID NO：19)
F/HA Hind III：5’-CCCAAGCTTTTAAATGCAAATTCTGCATT-3’(SEQ ID NO：20)
采用M1、NP、HA、NA、F/HA各自特异性引物，将反转录的产物或合成的DNA片断直接用作PCR扩增M1、NP、HA、NA、F/HA基因的模板。PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性40S，56℃退火90s，72℃延伸90s，循环30次，最后延伸10min，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5ug/ml溴化乙锭，EB)电泳检测。PCR扩增的HA基因的长度约1.7Kb(图1a)，NA基因的长度约1.35Kb(图1a)，M1基因的长度约0.75Kb(图1b)，NP基因的长度约为1.5Kb(图1c)，融合基因F/HA的长度约为1.7Kb(图1d)。所有的PCR产物样品经电泳凝胶抽提后，获得纯化的M1、NP、HA、NA、F/HA基因DNA片段，经限制性内切酶Xho I/+Nco I(消化HA片段)、Sal/Hind III(消化NA片段)，Xho I/Nco I(消化NP片段)、Sal I/Hind III(消化M1片段)、Xho Ⅰ和Sph I(消化F/HA片断)37℃分别消化后，再进一步纯化，以备下一步构建重组质粒用。具体操作如下：制备1％琼脂糖凝胶含0.5ug/ml溴化乙锭，将所有PCR样品加入凝胶的样品槽内，设置电压100V，电泳时间40min在长波紫外灯下，切下含有样品带的凝胶条，装入小塑料离心管中。参照胶回收试剂盒(Qiagen公司产品)说明书，抽提纯化M1、NP、HA、F/HA和NA基因DNA片段。经限制性内切酶37℃过夜消化后，用胶回收试剂盒(Qiagen公司产品)，按照说明指导，离心过柱，纯化回收酶切消化后的M1、NP、HA、NA、F/HA片段。
实施例2：构建表达M1、NP、HA、NA、F/HA基因的昆虫杆状病毒表达质粒及在昆虫细胞
中合成重组的昆虫杆状病毒
(1)构建表达M1和NP基因的重组质粒
昆虫杆状病毒质粒PFastBac(Invitrogen公司产品)经限制性内切酶Sal I/Hind III 37℃酶切3小时后，用胶回收试剂盒回收纯化酶切后的质粒PFastBac。在T4 DNA连接酶的作用下，酶切后的质粒与酶切后的M1 DNA片段于16℃连接过夜。反应体系如下：10×T4连接缓冲液1ml，M1酶切回收的DNA片段3ml，酶切PFastBac质粒回收产物1ul，T4 DNA连接酶1ul，ddH2O补至10ul。采用热休克方法将连接产物转导入Top10感受态细胞中加入到于一小塑料离心管中，轻轻混合后将小管置于冰上30min，转入42℃水浴中热休克90s，迅速放回冰上5分钟，向其中加入200ulLB培养液。37℃摇床培养1小时。取100ul菌液涂布于LB固体培养基(含有氨苄和庆大霉素两种抗生素)上，37℃培养16h，从平板上挑取阳性克隆菌落，进行菌液PCR，抽提质粒后用Sal Ⅰ/HindⅢ进行单双酶切鉴定。DNA序列测定后，获得重组质粒PFastBac-M1。
表达NP基因的重组质粒PFastBac-NP的构建方法同上。
(2)构建表达HA或F/HA和NA基因的重组质粒
昆虫杆状病毒表达质粒PFastBac-dual(Invitrogen公司产品)经限制性内切酶Xho I/NcoI酶切后，在T4DNA连接酶的作用下，将被同样的内切酶消化后的HA基因DNA片段插入到P10启动子的下方，此连接产物随后经热体克法转导入Top10感受态细胞中，培养、抽提数个阳性克隆菌落的重组质粒DNA，菌液PCR和Xho I/Nco I酶切鉴定及DNA序列测序确定无误后，挑选其中的1个重组质粒DNA，进行第二次酶切。所用的限制性内切酶为Sal I/HindIII。用同样的内切酶酶切NA基因DNA片段，并将其插入到重组质粒的另一个启动子PPH的下方，经转化、筛选、培养、抽提，获得二度重组的质粒。DNA测序后，即为所需的重组昆虫杆状病毒表达质粒PFastBac-dual-HA-NA。
同时表达融合基因F/HA和NA基因的重组质粒PFastBac-dual-F/HA-NA的构建方法同上。
(3)重组昆虫杆状病毒基因组的合成及提取
将纯化的重组PfatBac-M1、PfatBac-NP、PFastBac-dual-HA-NA和PFastBac-dual-F/HA-NA质粒分别转导入特殊的E.coli感受态细胞株DH 10 Bac细胞中(美国Invitrogen公司产品)。DH10Bac细胞含有一特殊的大分子质粒Bacmid，其内包含有昆虫杆状病毒AcMNPV的全部基因组。一旦重组的表达质粒整合入大分子质粒Bacmid的特别位点后，经3种抗菌素(庆大霉素、四环素和卡那霉素)的筛选及IPIG的诱导和X-Gal底物反应进行蓝白斑筛选，阳性克隆菌落呈白色，而非重组的野生菌落呈兰色。实验条件均按照Invitrogen公司提供的实验手册指导而设定。挑选的阳性克隆置于3ml的LB培养液中(含上述3种抗生素)，经37℃摇床培养24小时，按照实验手册标明的大分子质粒Bacmid小量制备法，提取纯化带有M1基因、NP基因、HA-NA或F/HA-NA基因的重组大分子质粒Bacmid。
(4)重组昆虫杆状病毒的制备
将昆虫细胞株sf9细胞(美国Invitrogen公司产品)培养于无血清的sf-900II昆虫细胞培养液中(Invitrogen公司产品)，温度设置为27℃，根据Invitrogen公司提供的实验手册，采用脂质体转染法，将纯化的重组大分子质粒Bacmid与脂质溶液cellfectin(Invitrogen公司产品)混合，转染入sf9细胞中，27℃培养4至5天后，收集细胞培养上清液，3000rpm离心10分钟收集上清液，获得低滴度的重组昆虫杆状病毒，再用此上清液感染新培养的sf-9细胞；3天后收集细胞培养上清液，即为所需的放大培养后的高浓度重组昆虫杆状病毒，命名为Bac-M1，Bac-NP、Bac-HA-NA和Bac-F/HA-NA。对获取的用于放大培养和蛋白表达的重组昆虫杆状病毒进行蚀斑实验，确定病毒的噬斑形成单位(plaque forming units，PFU)。
1)用含10％FBS的Grace氏培养基将Sf9细胞传代接种到六孔培养板中，细胞密度为约1×106个细胞/ml，每孔加2ml(6孔板)，轻轻混匀，室温使细胞贴壁1小时以上。
2)将P3代种毒液用不含FBS的Grace’s培养基做10倍倍比稀释待用。
3)弃去六孔板中的培养基，用不含血清的培养基清洗细胞3次，然后将上述稀释好的重组病毒液加入孔中，每个稀释度做两个复孔，室温下感染1小时。
4)制备覆盖液(以下为一块六孔板的量)：7ml 2×Grace氏培养基+140μl的双抗+7ml2％的高压灭菌琼脂糖凝胶+1.4ml FBS，轻轻地混匀，然后将瓶再放置42℃水浴，病毒感染1h后吸尽每孔中的病毒液，并快速用上述制备的覆盖液覆盖细胞。
5)待琼脂糖凝固后将六孔板用保鲜膜包好并置于27℃培养箱中培养3-5天。
6)加入1ml浓度为1mg/ml的中性红，室温孵育2小时后吸去染液，观察到重组病毒形成的近似透明的小点即为空斑。计算统计观察病毒空斑的形成情况(PFU)。
用于放大培养重组杆状病毒Bac-M1，Bac-NP、Bac-HA-NA和Bac-F/HA-NA的细胞离心沉淀物，经细胞裂解缓冲液处理后，4℃离心(13,000rpm)10分钟(或者将细胞在冰浴的情况下进行超声波破碎)，收集上清液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析基质蛋白M1(或者NP、HA、F/HA和NA蛋白)是否在昆虫细胞Sf9中表达。简单而言，将10μl上清液样品中加入10ul的2×SDS上样缓冲液，100℃处理5min后，10000rpm离心5分钟，将所有20ul的上清样品加入4％-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen公司产品)的点样孔中。设置电泳条件为恒定电压100V，温度为4℃，电泳时间约3小时。待指示液溴酚兰接近凝胶底部时，停止电泳。凝胶置于1％R型考马斯亮蓝染色液中，摇晃染色1小时，然后置于脱色液中脱色过夜。
实施例3：M1、NP、HA、F/HA和NA基因在共同转染的悬浮培养的昆虫细胞sf-9中的表达
将200ml sf-9细胞混合液悬浮培养于1升体积的三角摇瓶中，细胞培养液为无血清的sf-900II(或Invitrigen公司的Grace昆虫培养基)，摇床的摇速为100rpm，温度恒定于27℃。当细胞浓度达到2×106细胞/ml时，用Bac-M1、Bac-NP、Bac-HA-NA、Bac-F/HA-NA昆虫杆状病毒共同转染sf9细胞。病毒的MOI比例为3(Bac-M1和Bac-NP)：1(Bac-HA-NA)：1(Bac-F/HA-NA)。转染的细胞经恒温摇动培养3天后，收集所有样品，4℃离心30分钟，离速为3000rpm，收集上清液。离心下来的细胞沉淀物用细胞裂解液处理后，4℃离心10分钟，离速10,000rpm。保留离心后的上清液。实验进行的同时构建合成的野生型昆虫杆状病毒用于转染悬浮培养的sf-9细胞，MOI为5。作为设置的阴性对照，转染后的细胞培养、样品的收集及细胞裂解的条件与步骤与上述实验一样。收集的所有样品，用于Western blots分析。其实验操作如下：每个样品(包括阴性对照)分别取10μl的细胞裂解抽提液及细胞培养上清液，再各自加入10ul的2×SDS上样缓冲液。100℃处理5min后，将所有20μl的混合样品加入4％-12％SDS聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中。设置恒定电压120V，温度为4℃，时间3小时，当蓝色指示剂溴酚兰完全靠入凝胶底端时，停止电泳，取出凝胶。剪一张与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(PVDF膜)及两张滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡5分钟后与凝胶、滤纸一起浸入预冷2小时以上的转移缓冲液中，按滤纸——凝胶——硝酸纤维素膜——滤纸的顺序安装入转印夹。将夹中靠近凝胶的一侧接负极，恒压25V转移电泳1h。用镊子夹取出硝酸纤维素膜，用PBS-T漂洗液洗涤，而后转移至5％的脱脂奶粉/PBS溶液中，摇荡封闭1小时。用PBS-T漂洗液洗涤3次，每次3分钟；然后将硝酸纤维素膜转入一塑料袋中，加入3ml以1∶500稀释于5％脱脂奶粉/PBS中抗H5N1禽流感病毒鸡源多克隆抗体(一抗)，置于4℃平缓摇动过夜。翌日，取出纤维素膜，用PBS-T漂洗液洗涤3次，每次10分钟，将此硝酸纤维素膜再装入另一新的塑料袋中，加入5ml以1∶10000稀释于5％脱脂奶粉/PBS中的辣根过氧化物酶标记的驴抗鸡IgG(二抗)，室温下摇动温育1h。弃二抗，PBS-T漂洗纤维素膜3次，每次10分钟，将漂洗后的硝酸纤维素膜移至一平皿中，加入DAB第五显色液，可见在各自相对应的分子量位置上，M1、NP、HA/F/HA和NA的特异性条带。说明M1，NP，HA/F/HA和NA在转染的悬浮培养的SF-9昆虫细胞中有效地表达了。
实施例4：病毒样颗粒的纯化及间接免疫荧光检测和电镜观察。
将上述离心收集的细胞上清液装入13ml的超速离心管内，称重、平衡、封管后，放入超速离心机(Bechmem公司产品)内，4℃100,000rpm离心1小时，然后取出离心管，小心倒掉上清液，保留离心管底的深沉物。加入5ml的PBS，放入4℃冰箱内，溶解24小时。次日，在另一个13ml的超速离心管内，先小心地加入1ml 60％的庶糖溶液，然后依次加入1ml 30％及3ml 20％的庶糖溶液，最后将5ml的溶解后的样品液置于其上。精确称重、平衡后，封管上超速离心机。4℃100,000rpm离心1小时。取出离心管，分别收集位于20％与30％及30％与60％浓度交界处的二条带，即纯化的病毒样颗粒。Weatern blots分析纯化浓缩后的病毒样颗粒样品。其操作步骤与上述实施例3中Western blots分析一样，只是将所取的样品进行了稀释，即1μl的病毒样颗粒样品，加入9ul的水，再加入10ul的2×SDS上样缓冲液。100℃变性5min后，上样入4％-12％聚丙烯酰氨凝胶样品槽内，Western blots结果显示，从这二条带所获得的大分子颗粒，的确是由M1、NP、HA/F/HA和NA构成的病毒样颗粒。尤其是从30％与60％浓度交界处取得的似病毒颗粒含量大，特异性条带浓度深。说明转染后，病毒样颗粒在宿主细胞中有效地自我组装，并释放入细胞培养上清液中，进一步的间接免疫荧光实验和电镜结果证实了这一点(图4、图5)。
间接免疫荧光实验操作步骤如下：将sf9细胞种到24孔板中，每孔10万细胞，实施例3的操作步骤，对所种细胞进行感染，感染72小时后，用PBS将细胞洗涤3次，每次5分钟，然后加入100％预冷的甲醇-20°固定细胞10分钟，再加入0.05％的Triton x-100室温处理10分钟，加入3％的BSA四度封闭过夜，第二天用PBS将细胞洗涤3次，每次5分钟，然后向孔中加入RBITC标记的A型流感特异的M1单克隆抗体，或者FITC标记的抗新城疫病毒F蛋白的单抗，37°反应1小时，反应结束后用PBS将细胞洗涤3次，每次5分钟，洗涤结束后在荧光显微镜下观察。用抗M1的单抗和F的单抗进行免疫电镜观察，可以看到荧光标记的病毒样颗粒，其中抗M1的抗体为RBITC标记，显示橙色荧光(图4A)，抗F的抗体为FITC标记，显示绿色荧光(图4C)，而对照没有荧光信号((图4B、D)。
电镜拍片实验操作如下：将少量的纯化浓缩后的似病毒颗粒样品固定处理后，置于新制备的无负荷的塑胶/碳包被网络格上，用数滴蒸馏水轻轻冲洗几次后，加上2％磷钨酸钠溶液进行负染色。电子透视显微镜下观察并拍片，如图5所示，病毒样颗粒的外观及体积大小相近。
实施例5：H5N1禽流感和新城疫二价VLP免疫SPF鸡
60只SPF鸡购自广东温氏食品集团SPF鸡场，各组免疫动物具体免疫实施方式见表1。2周龄的SPF鸡在免疫后21天翼静脉采血，常规分离血清。分别用H5N1全病毒灭活抗原和新城疫病毒灭活抗原(购自哈尔滨兽医研究所)，采用血凝抑制试验(HI)检测血清中H5N1禽流感抗体和新城疫抗体，参照甘孟侯(2002)方法进行进行。结果表明，H5N1禽流感和新城疫二价VLPs免疫2周龄SPF鸡，免疫鸡血清中既有抗H5N1禽流感的抗体，也产生了新城疫病毒的HI抗体(表2)。
表1 H5N1猪流感和新城疫二价VLP免疫SPF鸡实验方案
表2 H5N1禽流感和新城疫二价VLP免疫SPF鸡血清HI检测结果
Claims (8)
1.混合病毒样颗粒，其特征在于，包含：
流感病毒的基质蛋白M1；
流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA；
一个融合膜蛋白，其包含新城疫病毒F蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的红细胞凝集素HA的跨膜区和膜内区；所述含新城疫病毒F蛋白的主要表面抗原的膜外域替换流感病毒的红细胞凝集素HA的5’端的大致相同长度的膜外域；
在所述混合病毒样颗粒的表面上同时表达流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA和新城疫病毒的表面抗原F蛋白。
2.如权利要求1所述的混合病毒样颗粒，其中所述混合病毒样颗粒还含有流感病毒的神经氨酸苷酶NA。
3.如权利要求1或2所述的混合病毒样颗粒，其中所述混合病毒样颗粒还含有流感病毒的核蛋白NP。
4.如权利要求1所述的混合病毒样颗粒，其中融合膜蛋白的序列如SEQ ID NO：10所示。
5.禽流感和新城疫二价疫苗，其特征在于，包含如权利要求1-4所述的混合病毒样颗粒和佐剂。
6.制备混合病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
构建昆虫杆状病毒表达载体，其表达载体含有流感病毒的基质蛋白M1，流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA，或一个融合膜蛋白，其包含新城疫病毒F蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的红细胞凝集素HA的跨膜区和膜内区；所述含新城疫病毒F蛋白的主要表面抗原的膜外域替换流感病毒的红细胞凝集素HA的5’端的大致相同长度的膜外域；
用所述构建的昆虫杆状病毒表达载体按比例同时感染昆虫细胞，包装出混合病毒样颗粒，其表面上同时表达流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA和新城疫病毒的表面抗原F蛋白。
7.如权利要求6制备混合病毒样颗粒的方法，其特征在于，其中所述构建昆虫杆状病毒表达载体还含有流感病毒的神经氨酸苷酶NA，其包装出混合病毒样颗粒含有流感病毒的神经氨酸苷酶NA。
8.如权利要求6或7制备混合病毒样颗粒的方法，其特征在于，其中所述构建昆虫杆状病毒表达载体还含有流感病毒的核蛋白NP，其包装出混合病毒样颗粒含有流感病毒的核蛋白NP。
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