CN106754765B - 一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于新城疫疫苗技术领域，具体涉及一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用的专利申请。该病毒样颗粒由新城疫病毒M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；其中M蛋白对应的M1基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，F蛋白对应的F1基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，NP蛋白对应的NP1基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，HN蛋白对应的HN1基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。本发明具有结构蛋白表达水平高、病毒样颗粒自行组装，免疫原性与真实病毒粒子更为接近、病毒样颗粒的产量和纯度高、免疫效果好等技术优势。

Description

一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于新城疫疫苗技术领域，具体涉及一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用的专利申请。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽类为主的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，被OIE列为必报动物疫病，也是我国中长期规划五大优先防治的动物疫病之一。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在病毒学分类中属于副黏病毒科、禽副黏病毒属的一个种，即禽副黏病毒1型，是一种不分节段的单分子负链RNA病毒。

新城疫病毒基因组结构模式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（Phosphor protein，P）、基质蛋白（Matrixprotein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein，L）。新城疫病毒颗粒为有囊膜的病毒粒子，呈多形性，直径约为120nm~300nm，囊膜表面覆盖有8nm长的纤突，病毒粒子内部为一直径17nm左右的卷曲核衣壳。基质蛋白M位于囊膜和核衣壳之间，既与膜结合又与核衣壳结合，是新城疫病毒粒子形成和出芽的主要驱动力。

病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能，安全性高，在形态上与天然病毒颗粒相似，能够通过与病毒感染一样的途径，以接近真实构象的形式递呈给免疫细胞，更容易被机体免疫系统识别，从而有效诱导机体产生免疫保护反应。

病毒样颗粒的制备可基于大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及昆虫杆状病毒这四种表达系统，而利用昆虫杆状病毒表达系统制备的病毒样颗粒种类已占到了30%以上，其主要原因在于该系统具有不同于其他表达系统的独特优点：（1）承载量大：杆状病毒可容纳较大的外源DNA插入(约l0kb)而不影响病毒的复制与装配；(2)高效表达：多角体基因和p10基因有非常强大的启动子能驱动靶基因的高水平表达，外源基因表达量往往是其他系统的几十到几百倍；(3)表达产物后加工较完善：昆虫细胞对蛋白质的后加工系统与哺乳动物细胞接近，具有表达产物能糖基化、磷酸化、脂肪酞化、酞胺化、切割信号肤和形成三级或四级高级结构的特点，所以在结构、生物活性、抗原性和免疫性等方面与天然蛋白有很高的相似性；(4)借助多元表达载体或借几个不同重组病毒共感染，可以同时表达两个或多个外源蛋白，便于研究肽链的装配和蛋白寡聚体的结构和功能；(5)适合表达细胞毒性蛋白：应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使表达产物是细胞毒性蛋白，也不影响表达水平，因为在这些有毒产物表达之前，病毒已经完成复制并释放出大量成熟的子代毒粒，不会干扰病毒的复制；(6)安全性好，杆状病毒是昆虫或者节肢动物病毒，对人畜无害，外源基因插入多角体蛋白基因位点引起其缺失或失活，因此重组病毒不能产生包涵体，这不仅为重组病毒提供了选择标记，而且重组病毒无多角体蛋白形成，失去了病毒粒子的天然防护物一多角体蛋白结晶体，极易在自然环境中失活，不能像野生病毒那样在环境中长期存在，在自然界生存能力弱，所以更加安全；(7)杆状病毒表达载体通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因。因此，用该系统生产病毒样颗粒容易形成产业化。

鸡新城疫自1946年在我国首次报道至今已在中国存在60多年，表现出一定新的临床及流行特点。流行病学数据充分证明基因VII型已经成为我国NDV流行的主要优势基因型，但也存在基因III、IX和VI型等散发，基因VII型NDV所占的比重呈逐年上升趋势。与此同时，NDV经过世界范围内四次大流行后，其宿主范围也不断扩大，迄今能自然或人工感染的禽类已超过250多种。过去认为，NDV一般不对鸭、鹅等水禽有致病性，而近十几年，在鸭群、鹅群中常见新城疫的暴发与流行。大量流行病学调查数据显示，当前我国NDV的优势流行株属于基因VII型，而目前国内普遍使用的疫苗LaSota为基因II型，虽然它们同属一个血清型，但在遗传距离上相差较远，对当前NDV强株的攻击并不能提供理想的免疫保护效力。

目前常用的生产活疫苗的毒株有Mukteswar株（I系苗）、Hitchner B1株（II系苗）、F株（III系苗）、LaSota株（IV系苗）以及V4弱毒苗。其中I系苗为中等毒力型，II、III、IV系疫苗毒力较弱。弱毒苗可通过大规模饮水、喷雾和气雾进行免疫，进而刺激黏膜免疫，而且疫苗毒可以从免疫禽传播给未免疫禽。其不足之处在于污染环境，并且有毒力返强可能，在机体抵抗力下降时，可能引起发病。生产灭活苗的毒种一般包括LaSota、Ulster等，实际生产中多用来制造二联或多联疫苗。灭活苗产生抗体水平较高，持续时间较长，比较容易储存，受母源抗体影响小，免疫不良反应小；但灭活苗免疫时需要较大剂量，所以成本较高。

目前，对于新城疫疫情通常采取封锁疫点、全群扑杀，并消毒直到最后一例病例处理完毕后14天内无新病例为止，因此疫苗免疫成为预防该病的主要手段之一。鉴于新城疫的流行对我国整个养禽业造成的巨大的经济损失，研制新的预防疫苗仍然具有十分重要的应用意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种新城疫病毒样颗粒及其制备方法，从而为新的新城疫疫苗的制备奠定基础。

本发明所采取的技术方案详述如下。

一种新城疫病毒样颗粒，为由M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；其中M蛋白对应的M1基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，F蛋白对应的F1基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，NP蛋白对应的NP1基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，HN蛋白对应的HN1基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

所述新城疫病毒样颗粒作为预防禽新城疫病毒感染灭活疫苗的应用。

所述新城疫病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

（1）人工合成并PCR扩增各结构蛋白基因序列，即分别人工扩增序列表中SEQ IDNO.1~4所示的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因的碱基序列；

（2）构建表达新城疫病毒结构蛋白的重组杆状病毒，具体为，

将步骤（1）中的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因分别克隆至转移载体pFastBac1中，获得重组质粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1；

将重组质粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1分别转化Escherichia coli DH10 Bac 感受态细胞，筛选获得重组杆粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1；

利用脂质体介导转染法，将重组杆粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1分别转染宿主Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1；

（3）新城疫病毒样颗粒的制备和纯化，具体为，

将重组杆状病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1共接种感染宿主Sf9昆虫细胞，四种结构蛋白在表达并自行组装后，所形成的病毒样颗粒会分泌到细胞培养上清中，在初步离心去除细胞碎片后，进行切向流浓缩，再经分子筛过滤和阴离子交换层析后得到纯化的病毒样颗粒。

需要说明的是，上述宿主Sf9昆虫细胞，也可为昆虫Sf21细胞株或昆虫High Five细胞株。

所述新城疫病毒样颗粒的制备方法，步骤（3）中，重组杆状病毒共接种感染宿主Sf9昆虫细胞时，含有重组杆病毒的溶液体积比为：rBV-M1：rBV-F1：rBV-NP1：rBV-HN1=3:2:1:2。

所述新城疫病毒样颗粒的制备方法，步骤（3）中，切向流浓缩操作时，采用50kDa分子量截留的切向流浓缩管在3500r/min水平离心15分钟。

所述新城疫病毒样颗粒的制备方法，步骤（3）中，提纯操作时，采用不连续的20%-40%-60%蔗糖密度梯度离心方法，替代分子筛过滤和阴离子交换层析操作。

本发明的设计思路为：将新城疫病毒四种结构蛋白基因序列克隆、重组至昆虫杆状病毒基因组中，分别得到四种能够表达新城疫病毒结构蛋白的重组杆状病毒，将四种重组杆状病毒经条件优化后，按一定比例共感染昆虫Sf9细胞，重组杆状病毒高效表达四种新城疫结构蛋白并形成完整的病毒样颗粒，收集细胞培养上清经纯化后获得大量新城疫病毒样颗粒。

总体而言，本发明的主要技术优势体现在如下几个方面：

1、病毒样颗粒自行组装，免疫原性与真实病毒粒子更为接近，本发明将四种新城疫病毒结构蛋白组合表达，表达后，这四种结构蛋白自行组装形成了新城疫病毒样颗粒，由于为自组装形成，因而所提供的病毒样颗粒在形态结构和免疫原性方面更加接近真实病毒粒子；

2、病毒样颗粒的产量和纯度较高，经表达和纯化条件优化后，新城疫病毒样颗粒的产量和纯度均有较大提升，具有较好产业化应用前景；

3、具有较好免疫效果，利用本发明所提供的新城疫病毒样颗粒所制备的灭活疫苗，在免疫鸡后可诱导机体产生特异性免疫反应，具有较好免疫效果。

附图说明

图1为四种重组杆粒的特异性引物PCR鉴定图谱；其中M：5000bp DNA Marker；1：重组杆粒rBacmid-M1采用M1上游引物/M1下游引物的PCR结果，片段大小约为1100bp；2：重组杆粒rBacmid-F1采用F1上游引物/F1下游引物的PCR结果，片段大小约为1700bp；3：重组杆粒rBacmid-NP1采用NP1上游引物/NP1下游引物的PCR结果，片段大小约为1500bp；4：重组杆粒rBacmid-HN1采用HN1上游引物/HN1下游引物的PCR结果，片段大小约为1700bp；

图2为四种重组杆粒的通用引物M13上游引物/M13下游引物PCR鉴定图谱；其中M：5000bp DNA Marker；1：重组杆粒rBacmid-M1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR结果，片段大小约为3400bp；2：重组杆粒rBacmid-F1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR结果，片段大小约为4000bp；3：重组杆粒rBacmid-NP1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR结果，片段大小约为3800bp；4：重组杆粒rBacmid-HN1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR结果，片段大小约为4000bp；

图3为正常Sf9细胞与重组杆粒转染后出现病变的Sf9细胞示意图，其中（a）正常Sf9细胞，（b）重组杆粒转染后出现病变的Sf9细胞；

图4为新城疫病毒样颗粒的透射电镜图；

图5为新城疫病毒样颗粒免疫鸡群后的血凝抑制抗体效价规律图；

图6为新城疫病毒样颗粒免疫鸡群后的免疫保护试验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍说明如下。

生物材料：

pFastBac1质粒、sf9昆虫细胞、DH10Bac感受肽细胞、DH5α感受态细胞等均为Thermo公司产品；

T载体，购自大连宝生物有限公司；

实验试剂：

Taq聚合酶，购自北京全式金公司；

脂质体转染试剂，为Roche公司产品；

质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒，购自康宁公司；

昆虫无血清培养基SFM-II，为Thermo公司产品；

实验设备：

实验过程中所用超纯水由超纯水发生装置（Christ Spetron Line）制备；

低温台式高速离心机，美国ICE公司产品；

PCR仪，Thermo Fisher Scientific公司产品；

紫外凝胶成像仪，Alpha Innotech Corporation公司产品；

切向流设备、阴离子交换设备为德国赛多利斯公司产品。

还需说明的是，文本简要期间，下述实施例中未具体描述操作，参考现有技术及相关产品说明书进行操作即可，不再赘述。

实施例1

本发明所提供的新城疫病毒样颗粒，为由M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；其中M蛋白对应的M1基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，F蛋白对应的F1基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，NP蛋白对应的NP1基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，HN蛋白对应的HN1基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

需要解释的是，制备新城疫病毒样颗粒时，由于一般采用的为基因工程的方法，即通过基因工程技术将特定基因序列整合进宿主细胞的基因组中，并进而在宿主细胞中得以表达，最后通过特定的分离、提纯技术获得纯化的蛋白颗粒样品。为使相应基因序列能够与宿主细胞更好的结合，发明人参考新城疫病毒强毒株NA-1株的全基因组序列（GenBank登录号：DQ659677），根据相应基因序列设计了特异性引物，并进行了PCR扩增，在保证碱基序列遗传信息不发生根本性改变的基础上，对相关基因序列进行了优化，最终获得了SEQ IDNO.1~4所示的碱基序列。

实施例2

本实施例就新城疫病毒样颗粒制备过程中关键的表达新城疫病毒结构蛋白的重组杆状病毒的构建过程简要介绍如下。

（1）扩增各结构蛋白基因序列

根据实施例1中SEQ ID NO.1~4所示的目的碱基序列，参考现有技术，通过聚合酶链式反应（PCR法）人工扩增获得M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因的碱基序列。

PCR扩增用引物序列具体为：

M1上游引物：5’-ATGGACTCATCTAGGACTATTGGACT-3’，

M1下游引物：5’-TTATTTACGGAAGGGGTTGTATTTAGC-3’；

F1上游引物：5’-ATGGGTTCGAAGCCATCCACCCG-3’，

F1下游引物：5’-TTAGGCTCTCGTTGTAGCCCT-3’；

NP1上游引物：5’-ATGTCCAGCGTCTTCGACG-3’，

NP1下游引物：5’-TTAGTAACCCCAGTCAGTATCGTTGT-3’；

HN1上游引物：5’-ATGGACCGCGCCGTGAA-3’，

HN1下游引物：5’-TTACACTCTATCGTCCTTCAGAATCT-3’；

PCR扩增时，反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分钟30秒，共30个循环；最后72℃再延伸10分钟。

对PCR扩增产物进行1%（m/v）琼脂糖凝胶电泳分析，并回收扩增产物备用。

（2）构建穿梭质粒

按照现有技术，将步骤（1）中克隆获得的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因分别克隆至T载体（pMD19T Simple vector）中，转化后测序验证，获得构建正确的重组克隆质粒pT-M1、pT-F1、pT-NP1和pT-HN1。

对上述所获得的重组质粒分别进行酶切（SalI和NotI双酶切），同时对pFastBac1质粒进行酶切，对酶切产物进行电泳检测，并回收酶切产物。

酶切过程中，10μL酶切体系设计如下：

Buffer，4μL；

SalI，0.5μL；

NotI，0.5μL；

重组质粒（或pFastBac1质粒），1μL；

ddH₂O，4μL；

37℃酶切3h。

利用 T4 DNA连接酶将上述重组质粒的酶切产物与pFastBac1质粒的酶切产物进行连接，20μL连接体系设计如下：

重组质粒酶切产物，4μL；

pFastBac1载体酶切产物，1μL；

Buffer，4μL；

T4 DNA连接酶，1μL；

ddH₂O，10μL；

16℃连接过夜。

将连接产物转化至大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞中，用含有特定抗生素的（氨苄青霉素终浓度100μg/mL，庆大霉素终浓度100μg/mL）选择培养基筛选阳性菌落。

对所筛选的阳性菌落经扩增后提取质粒，采用酶切验证及PCR鉴定，以检测M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因是否正确重组至pFastBac1载体中，经鉴定正确的质粒，即可认为穿梭质粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1构建成功。

（3）构建重组杆粒

将步骤（2）中鉴定正确的重组质粒转化至Escherichia coli DH10 Bac 感受态细胞中，使其进行同源重组，经含有三抗（卡那霉素终浓度100μg/mL、庆大霉素终浓度50μg/mL、四环素终浓度70μg/mL）的IPTG条件筛选培养基（IPTG终浓度24mg/mL，X-gal终浓度20mg/mL，该筛选培养基可通过菌落形成颜色判定是否发生同源重组，白色菌落即代表重组成功，蓝色菌落则未成功）培养筛选48h，挑取白斑，获得重组杆粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-HN1、rBacmid-NP1；

对所提取的重组杆粒进一步进行PCR鉴定，以确定重组杆粒构建正确（具体鉴定过程，按Invitrogen公司Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System（试剂盒）操作说明书进行），PCR鉴定时，鉴定用步骤（1）中的特异性引物。

PCR鉴定时，反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分钟30秒，共30个循环；最后72℃再延伸10分钟。

对PCR扩增产物进行1%（m/v）琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。对图1分析可以看出，M1片段大小约为1100bp，F1片段大小约为 1700bp，NP1片段大小约为1500bp， HN1片段大小约为1700bp，结果与预期相符，即M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因片段正确重组进入杆粒中，也即重组杆粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-HN1、rBacmid-NP1构建正确。

（4）构建重组杆状病毒

利用脂质体介导转染法（利用按Roche公司的X-tremeGENE HP DNA transfectionReagent进行转染），将步骤（3）中构建正确的重组杆粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1，分别转染宿主Sf9昆虫细胞，具体过程如下：

将转染试剂恢复室温，吸取4μL转染试剂与2μL重组杆粒（用无血清Grace将重组杆粒稀释至2μg/100μL）轻轻混合，室温孵育30min；

然后将混合物加入已准备好的sf9细胞六孔板中；

28℃培养96小时，待细胞病变（如图3所示）后，收集细胞上清液即为第一代重组杆状病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1；

接着继续将第一代重组杆状病毒接种昆虫Sf9细胞，同样培养条件下，收集第二代重组杆状病毒；

以此类推，收集至第四代重组杆状病毒。

为便于检测分析，可将每一代重组杆状病毒于-80℃保存备用。

培养过程中，根据情况对培养物进行PCR鉴定，以检测含有M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因片段的重组杆状病毒是否完整和正确，鉴定时设计一对通用性引物序列具体如下：

M13上游引物：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，

M13下游引物：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’；

PCR鉴定时，反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、55℃退火40秒、72℃延伸4分钟，共30个循环；72℃再延伸10分钟。

对PCR扩增产物进行1%（m/v）琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示。对图2分析可以看出，含有M1基因片段的基因组大小约为3400bp；含有F1基因片段的基因组大小约为4000bp；含有NP1基因片段的基因组片段大小约为3800bp；含有HN1基因片段的基因组片段大小约为4000bp，结果与预期符合，及重组杆状病毒结构完整、有效，可以进一步应用。

实施例3

本实施例就新城疫病毒样颗粒中结构蛋白的表达、组装及纯化过程简要介绍如下。

（1）新城疫病毒样颗粒中结构蛋白的表达

将实施例2中所收集的含有第四代重组杆状病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1的上清以体积比3:2:1:2的比例，加入悬浮培养的昆虫Sf9细胞（总体积为300mL细胞培养液中加入3mL的rBV-M1、2mL的rBV-F1、1mL的rBV-NP1、2mL的rBV-HN1），感染时间为96小时；

感染后，将感染的细胞置于28℃、120r/min摇床培养；

在此培养过程中，结构蛋白在宿主细胞中分别表达后会自行组装，组装后的病毒样颗粒会分泌到细胞培养上清中。

（2）新城疫病毒样颗粒的纯化

收集步骤（1）中的细胞培养上清，经8000r/min离心30分钟后，可初步去除大的细胞碎片；

采用50kDa分子量截留的切向流浓缩管在3500r/min水平离心15分钟，浓缩样品再经过分子筛过滤和阴离子交换层析后得到纯化的病毒样颗粒样品。

上述提纯操作也可采用替代方案：采用不连续的20%-40%-60%蔗糖密度梯度离心，此时浓缩样品在20%和40%蔗糖层的中间会形成白色条带，而杆状病毒则沉淀于底部，其他小的杂蛋白会停留在顶层，收集白色条带层即为纯化的病毒样颗粒样品。

对纯化后的病毒样颗粒进行电子透射电镜观察，病毒样颗粒形态如图4所示。

同时，参照国家标准《GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术》，对所制备的新城疫病毒样颗粒进行血凝效价检测，检测结果显示未纯化的新城疫病毒样颗粒血凝效价为2⁷，纯化后的新城疫病毒样颗粒血凝效价为2¹⁰，纯化步骤可明显提高样品纯度以及血凝效价浓度。

实施例4

本实施例就实施例3所制备的病毒样颗粒作为疫苗使用时的免疫效果进行简要评价。

（1）免疫方案

取30只SPF鸡，随机分3组，每组10羽；

实验组：新城疫病毒样颗粒，每羽注射100μL体积，其中包含有10μg的新城疫病毒样颗粒（实施例3检测结果表明，10μg新城疫病毒样颗粒的血凝效价为2⁹）；

阳性对照组：新城疫病毒NA-1株经紫外射线灭活，每羽注射100μL体积，其中血凝效价为2⁹；

阴性对照组：生理盐水，100μL/只；

7日龄首免（胸部肌肉注射），间隔7周加强免疫一次。

（2）血凝抑制试验

从免疫后第一周开始，每隔一周翅下静脉采血，分离血清，-20℃保存备用。

参照国家标准《GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术》，以新城疫血凝抑制试验阳性抗原作为检测抗原，倍比稀释血清样品后，加入25μL四单位抗原等体积混合，于37℃作用30分钟，再加入25μL的1%鸡红细胞，冰上作用40分钟，HI效价为发生红细胞完全凝集抑制的最高血清稀释倍数。

结果如图5所示，实验组和阳性对照组的血凝抑制效价呈明显上升趋势，于免疫后第3周达到峰值，第7周低于临界保护值（血凝抑制效价4log2为评价新城疫疫苗免疫效果的临界保护值）时进行加强免疫一次，血凝抑制效价又开始上升，经历6周后，其效价维持在临界保护值附近。

（3）免疫保护试验

在免疫后第16周，采用新城疫病毒NA-1株对实验鸡群进行攻毒，具体是将新城疫病毒NA-1株通过滴鼻途径感染鸡群，之后在10天期间观察鸡群的存活情况。

结果如图6所示，实验组和阳性对照组未出现鸡死亡，即存活率为100%，而阴性对照组（X形）在第5天死亡6只和第6天死亡4只，即存活率为0%。

综上所述，本发明专利设计和制备的新城疫病毒样颗粒可以刺激鸡体产生有效的抗体效价，并且可以保护鸡群免受活病毒的攻击，存活率达100%。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大学

<120> 一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1094

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggactcat ctaggactat tggactctac ttcgactccg ccctcccctc gtcttcgctg 60

ttggcattcc cgattgtttt gcaggatacc ggtgacggca agaaacagat cactcctcaa 120

taccgcattc agcgtctgga tagctggacc gactctaagg aagattcagt cttcatcacc 180

acttacggct tcatcttcca aattggaaac gaggaagcca ctgttggcgt gattaacgat 240

aaccctcgcc acgagctgct ctccagcgct atgctctgct tgggtagcgt gcccaacgac 300

ggcgatctgg tcgaactcgc tcgcgcctgt ctgaccatgg tggtcactcg taagaaatct 360

gctacaaaca cggagaggat cgtcttctca gttgtgcaag cacccagagt gctccagagt 420

tgcatggtcg ttgccaaccg ctactcttca gtgaacgctg tcaagcatgt taaagcccca 480

gagaagatcc cgggatcggg caccctcgaa tacaaagtga acttcgtcag tttgactgtg 540

gtcccacgcc gtgacgtgta ccgcatcccg actgctgttc tgaaagtgag cggaagttcg 600

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atgggttcga agccatccac ccgcatccca gctccgctca tgttgatcac tcgtattatg 60

ctgatcctcg gatgcatccg cttgacctcc agcctggacg gtcgtcctct ggctgccgca 120

ggcatcgtgg tcactggaga taaggctgtc aacgtttaca cctcttcaca gactggctca 180

atcattgtca aactgctccc taacatgccc aaggacaaag aggcctgtgc aagggcgcca 240

ttggaagcct acaacagaac actgaccact ttgctgacgc cgctcggtga ctcaattagg 300

aagatccagg gatccgtgag cacctctggt ggccgccgtc aaaaaagatt cattggagct 360

gttatcggta gtgtggcact gggagtcgcg acagcggctc aaatcacggc cgcagcggct 420

ctgattcagg ctaaccaaaa cgccgcaaac attctccgca tcaaggaatc catcgcggct 480

acaaacgagg ccgttcacga agtgacggac ggattgagcc agctgtctgt ggcagtcggc 540

aagatgcagc aattcgtcaa cgaccaattc aacaacacag ctcgtgagct cgattgcatc 600

aaaattacgc agcaagttgg agtggagttg aacctgtacc tcacagaact gacaacggtg 660

ttcggtcctc agatcacctc ccccgctctc acacagttga cgatccaagc actgtacaac 720

ctcgcgggtg gtaacatgga ctacctcttg accaagctgg gcatcggaaa caaccagttg 780

agttcgctga ttggttcggg cttgatcact ggctacccta ttctgtacga ttcccagaca 840

caactgctcg gcatccaagt taacttgccc agcgtgggaa acctgaacaa catgagggcc 900

acatacctcg agacgttgtc agttagtacc actaagggtt acgcttccgc cttggtgccc 960

aaagttgtga ctcaggtcgg ctctgttatc gaggaactgg acacaagcta ctgcattgaa 1020

tctgacttgg atctgtactg tacccgtatc gtcactttcc caatgtcacc gggtatttac 1080

tcatgcctga gtggcaacac ctcagcttgt atgtacagta agactgaggg cgctctcaca 1140

acgccataca tggccttgaa gggatccgtg atcgcaaact gcaaaattac cacttgccgc 1200

tgtgcggacc ctcccggaat catttcacag aactacggag aggctgtgag tctcatcgac 1260

aggcattcgt gtaacgtcct ctccttggat ggcatcaccc tgagactcag cggagaattc 1320

gatgccactt accagaagaa catctcgatt ctggactccc aagtcatcgt taccggtaac 1380

ctcgatattt ctactgagtt gggcaacgtc aacaactcga tctccaacgc tctggaccgc 1440

ctcgccgaaa gcaactctaa gctggataaa gtgaacgtcc gtctgacctc aactagtgcc 1500

ctcattacct acatcgtgct cactgtcatc agcttggtct tcggcgcatt gtctctggtt 1560

ctcgcgtgct acctgatgta caagcagaaa gctcagcaaa agacattgct gtggctggga 1620

aacaacacgc tcgaccaaat gagggctaca acgagagcct aa 1662

<210> 3

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgtccagcg tcttcgacga gtacgaacag ttcctggctg cccaaacccg tcctaacggt 60

actcacggtg gcggagagaa gggctcgacc ctgaaagtgg aagtccccgt tttcgctctc 120

aactccgacg atccagagga tcgctggaac ttcgccgtgt tctgcttgcg tatcgctgtc 180

agcgaagacg ccaacaagcc cttgcgccag ggtgctctga tttctctgct ctgttctcac 240

tcacaagtta tgcgtaacca tgtggcactc gcgggcaaac agaacgaggc tactctcgcc 300

gtcttggaaa ttgacggctt cgcaaacagc gttccccaat tcaacaacag gtccggagtg 360

agcgaggaaa gggcccagag attcatggtc atcgcaggat ccctgccaag agcatgcagc 420

aacggcacac ctttcgtgac ggctggagtc gaggacgatg ccccagaaga tatcacagac 480

acgctcgagc gcatcttgtc aattcaggtg caagtctggg ttactgtggc caagaccatg 540

actgcatacg aaacagcgga cgagagtgaa acgcgccgta tcaacaggta catgcagcaa 600

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accgctggtg gctcttcaac ttactacaac ctcgtcggcg acgttgattc atacatccgc 780

aacaccggat tgactgcctt cttcctcacc ttgaagtacg gcattaacac aaaaacgtcc 840

gctctggccc tcagttcgct gactggagac atccagaaga tgaaacaact gatgcgcctc 900

taccgtatga agggagagaa cgctccgtac atgaccttgc tgggcgactc tgatcagatg 960

tcattcgcac ccgcggaata cgcccaattg tactctttcg ctatgggtat ggcctcagtt 1020

ctggataagg gcacaggaaa ataccagttc gctagggact tcatgagtac gtcgttctgg 1080

agactgggag tggagtacgc tcaggcccaa ggttccagca tcaacgagga tatggcagcg 1140

gaattgaagc tgactccagc tgcaaggaga ggtctcgcag cggctgccca gcgcgtgagt 1200

gaggaaatcg gctcgatgga tattcctaca cagcaagctg gagtcttgac gggtctgtca 1260

gacgagggac cccgtacacc acaaggaggt agtaacaagc cgcagggtca acctgatgcc 1320

ggtgacggcg aaacgcagtt cctggacttc atgagggcag tggcgaacag catgagagag 1380

gcaccgaacc ctgcgcaatc taccactcat cccgaacctc ccccaacccc aggagcttct 1440

caggacaacg atactgactg gggttactaa 1470

<210> 4

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atggaccgcg ccgtgaaccg tgtggtcctc gaaaacgagg aacgtgaggc aaagaacact 60

tggaggttgg ttttcagaat cgcggtgctg ctcttgatgg tcatgacatt ggctatttca 120

gctgccgcac tggcctactc cagcgaagca agtactcctc acgacctggc tggtatctca 180

accgtcatta gtaaaactga ggataaggtt acaagcctgc tctcttcaag tcaggacgtg 240

atcgatagga tttacaagca agtcgcgctc gaaagcccct tggctttgct gaacacggag 300

tctatcatta tgaacgccat caccagcctg tcttaccaga ttaacggagc ggctaacaac 360

tctggttgcg gcgtccctgt tcatgacccc gattacatcg gtggcattgg caaggaattc 420

atcgttgacg atatttcgga cgtgacctcc ttctacccaa gcgcctacca agagcacctg 480

aacttcatcc cagcaccgac cactggatca ggttgtaccc gcatcccttc tttcgacatg 540

tcaacaacgc attactgcta cactcacaac gtgatcctga gtggttgtcg tgatcactca 600

catagtcacc agtacttggc cctgggagtt ctcaggacat ctgcaacggg tagagtgttc 660

ttcagtactc tgcgctcgat caacctcgac gatacacaaa accgtaagtc gtgctccgtc 720

agcgctactc ccttgggctg cgacatgctg tgttctaaag ttacagaaat cgaggaagag 780

gattacaagt ccattacccc aactagcatg gtccatggca ggttgggatt cgacggacag 840

taccacgaga aagacctcga taccactgtc ttgttcaagg attgggttgc caactaccca 900

ggcgtgggag gtggcagctt catcgacgat agagtctggt tcccggttta cggaggtctc 960

aaaccaaact ctccgtcaga cacagctcaa gaaggaaaat acgtgatcta caagcgctac 1020

aacgatacct gtcctgacga gcaggattac caaatccgta tggctaaatc gtcctacaag 1080

ccaagacgtt tcggaggaaa gagagtccag caagccatcc tgtccattaa agttagtacg 1140

tcgctgggaa aggaccccgt gctcaccatc cctcccaaca caattacgct gatgggcgct 1200

gaaggacgca tcctcaccgt cggcacttcg catttcttgt accagcgtgg aagctcttac 1260

ttctcacctg ctctcttgta ccccatgacc gtgaacaaca agaccgcgac tctgcacagc 1320

ccatacacgt tcaacgcttt caccaggcca ggtagtgtcc cgtgccaggc gtcggctaga 1380

tgcccaaact cctgtatcac aggcgtgtac acggaccctt accccctgat tttccatcgc 1440

aaccacactc tccgtggtgt cttcggcaca atgctcgacg atgaacaagc gaggttgaac 1500

ccagtgtcag ctgtcttcga ctccatcagc aggtctagag ttacgagagt gtcaagttcg 1560

tccaccaaag ccgcatacac aacgtccact tgcttcaagg ttgtgaaaac aaacaaggcc 1620

tactgtttgt ctatcgcaga aatttcaaac actctgttcg gcgagttcag gatcgtgcct 1680

ctgctcgtcg agattctgaa ggacgataga gtgtaa 1716

Claims (4)

1.一种新城疫病毒样颗粒，其特征在于，由M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；其中M蛋白对应的M1基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，F蛋白对应的F1基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，NP蛋白对应的NP1基因的碱基序列如SEQID NO.3所示，HN蛋白对应的HN1基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述新城疫病毒样颗粒在制备预防禽新城疫病毒感染灭活疫苗药剂中的应用。

3.权利要求1所述新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）人工合成各结构蛋白基因序列，即分别人工合成SEQ ID NO.1~4所示的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因的碱基序列；

（2）构建表达新城疫病毒结构蛋白的重组杆状病毒，具体为，

将步骤（1）中的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因分别克隆至转移载体pFastBac1中，获得重组质粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1；

将重组质粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1分别转化Escherichia coli DH10 Bac 感受态细胞，筛选获得重组杆粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1；

利用脂质体介导转染法，将重组杆粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1分别转染宿主Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1；

（3）新城疫病毒样颗粒的制备和纯化，具体为，

将重组杆状病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1共接种感染宿主Sf9昆虫细胞，四种结构蛋白在表达并自行组装后，所形成的病毒样颗粒会分泌到细胞培养上清中，经离心去除细胞碎片，切向流浓缩，再经分子筛过滤和阴离子交换层析后得到纯化的病毒样颗粒；

重组杆状病毒共接种感染宿主Sf9昆虫细胞时，含有重组杆病毒的溶液体积比为：rBV-M1：rBV-F1：rBV-NP1：rBV-HN1=3:2:1:2；

切向流浓缩操作时，采用50kDa分子量截留的切向流浓缩管在3500r/min水平离心15分钟。

4.如权利要求3所述新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，提纯操作时，采用不连续的20%-40%-60%蔗糖密度梯度离心方法，替代分子筛过滤和阴离子交换层析操作。

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