CN101768211A

CN101768211A - 新城疫病毒Italien株HN蛋白和F蛋白及其在基因治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN101768211A
Application number: CN200910022455A
Authority: CN
Inventors: 边惠洁; 陈志南; 尉丁; 冯浩
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2010-07-07

Abstract

本发明涉及一种新城疫病毒Italien株HN蛋白和F蛋白及其在基因治疗药物中的应用，包括NDV Italien株的HN基因和F基因的cDNA以及NDV Italien株的HN蛋白和F蛋白氨基酸序列。本发明的有益效果是：得到了可以单独或串联表达NDV Italien株HN和F基因的真核表达质粒或重组病毒颗粒，使这两种基因能够在真核细胞，包括人体的肿瘤细胞、转化细胞或异常细胞中同时表达其编码产物HN蛋白和F蛋白，并且这两种蛋白可以导致感染细胞与细胞之间融合形成多核巨细胞，最终产生细胞死亡的细胞毒效应。

Description

新城疫病毒Italien株HN蛋白和F蛋白及其在基因治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新城疫病毒NDV-Italien株的唾液酸-神经氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase，HN蛋白)和融合蛋白(fusion protein，F蛋白)及其在基因治疗药物中的应用。

背景技术

新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)是副粘病毒科副粘病毒属的单股负链RNA病毒，通常感染禽类导致新城疫。由于该病毒对人类无致病源性，因此，近年来用于肿瘤治疗。NDV的RNA基因组全长约15kb，包含6个基因，编码六种结构蛋白，其中的血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase，HN)能够识别宿主细胞膜上的含唾液酸的糖蛋白受体，并和病毒的融合蛋白(fusion protein，F)相互作用，促使病毒进入宿主细胞。同时更重要的是，感染了病毒的细胞其表达的HN和F蛋白促使肿瘤细胞与细胞之间发生融合，进而形成多核细胞，最终细胞走向死亡。以往的研究多从病毒分子生物学角度，探讨HN蛋白和F蛋白的相互作用介导病毒对宿主细胞的入侵，或从畜牧业领域研究HN作为病毒的保护性抗原，从而制备针对NDV的疫苗预防新城疫的感染。对F蛋白的研究也主要集中于HN和F蛋白作用后，引起F蛋白空间构象的改变，进而引发病毒包膜和细胞膜的融合。我们研究表明，体外表达HN蛋白和F蛋白具有促进细胞与细胞之间形成多核巨细胞，导致细胞死亡的功能，基于此发现，将HN和F基因共转染靶细胞是一种潜在的基因治疗策略。

基因治疗是指将正常基因或有治疗作用的基因引入肿瘤细胞或体细胞以纠正突变或有缺陷的基因或表达相应的效应分子，从而达到治疗疾病的目的。目前，基因治疗的主要方法包括：基因沉默疗法、自杀基因疗法、免疫基因疗法、基因替代疗法、反义基因疗法、多药耐药相关基因治疗、抗肿瘤新生血管治疗、抗端粒酶治疗和凋亡诱导疗法等。常见报道的治疗基因有TRAIL、caspase-3、凋亡素、抑癌基因和细胞因子基因等。如凋亡素是鸡贫血病毒的vp3基因编码的蛋白质，体外合成或基因工程表达的凋亡素能特异地引起多种人源性恶性肿瘤细胞凋亡，对正常二倍体体细胞无作用。但目前治疗基因的种类仍有限，发现新的、有效的治疗基因仍是基因治疗面临解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供新城疫病毒NDV-Italien株的HN和F基因及其在组织或细胞中进行同时表达，以作为一种疾病治疗的有效成分，用于基因治疗。

本发明的技术解决方案如下：

一种新城疫病毒NDV-Italien株HN蛋白和F蛋白，所述的F基因的cDNA是序列表<400>1的序列，F蛋白的氨基酸序列是序列表<400>3的序列，HN基因的cDNA是序列表<400>2的序列，HN蛋白的氨基酸序列是序列表<400>4的序列。

新城疫病毒NDV-Italien株HN蛋白和F蛋白，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。

一种重组病毒载体，将包含HN或F基因完整开放读码框序列的片段分别连入病毒载体中，可以在真核细胞中分别表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因或F基因，然后通过体外转染或感染的方法，导入培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中并且同时表达两种编码产物。

重组病毒载体，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。

一种真核表达质粒，将包含HN或F基因完整开放读码框序列的片段分别连入真核表达质粒，可以在真核细胞中分别表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因或F基因，然后通过转染的方法，导入培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中同时表达两种编码产物。

真核表达质粒，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。

一种真核表达质粒，将包含HN和F基因完整开放读码框序列的片段连入含有内核糖体进入序列(internal ribosome entry site，IRES)的真核表达质粒中，可以在真核细胞中串联表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因和F基因，然后通过转染的方法，导入培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中同时表达两种编码产物。

一种重组病毒载体，将包含HN和F基因完整开放读码框序列的片段通过内核糖体进入序列(internal ribosome entry site，IRES)连接后，连入病毒载体中，构建重组病毒载体，可以在真核细胞中串联表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因和F基因，然后通过体外转染或感染的方法，导入培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中同时表达两种编码产物。

我们研究表明，将HN和F基因克隆、同时在体外转染肿瘤细胞或成纤维细胞，可以引起转染细胞之间相互融合，形成多核巨细胞，最终诱导多核巨细胞死亡。因此，HN基因和F基因可以作为一种治疗人体肿瘤和其他疾病的潜在的治疗基因。本发明是基于新城疫病毒HN和F蛋白具有促膜融合功能、进而诱导细胞死亡的作用而设计的。HN蛋白和F蛋白均位于病毒包膜或者呈现在感染细胞膜表面，HN蛋白和F蛋白的一级结构编码氨基酸残基分别有571和553个，是病毒毒力的主要决定蛋白。正常情况下，HN蛋白以二聚体的形式与F蛋白形成复合物，但是当HN蛋白与细胞膜表面的唾液酸受体结合后，会导致蛋白变构，引起复合物解体，使F蛋白的活性位点暴露，而与邻近细胞膜相互作用最终导致相邻两个细胞膜的融合而形成多核细胞，这种形成的融合多核巨细胞最终均会导致细胞死亡崩解。同时由于肿瘤细胞死亡后释放的大量肿瘤相关抗原被提呈到相关的效应细胞，可以同时增强人体免疫系统对肿瘤的杀伤作用。

本发明的有益效果是：本发明得到了可以单独或串联表达NDVItalien株HN和F基因的真核表达质粒或重组病毒颗粒，使这两种基因能够在真核细胞，包括人体的肿瘤细胞、转化细胞或异常细胞中同时表达其编码产物HN蛋白和F蛋白，并且这两种蛋白可以导致感染细胞与细胞之间融合形成多核巨细胞，最终产生细胞死亡的细胞毒效应。

附图说明

图1为免疫荧光法检测HN和F的促膜融合效应的结果。

图2为素木精-伊红染色显示HN和F的促膜融合效应的结果。

图3为HN和F促膜融合导致的细胞死亡效应的结果。

图4为HN和F基因真核表达质粒图谱以及HN和F基因的真核串联表达质粒pIRES-HN/F图谱。

图5为HN和F基因的穿梭质粒pShuttle-CMV-HN和pShuttle-CMV-F图谱以及HN和F基因真核串联表达的穿梭质粒pShuttle-CMV-HN/F图谱。

保藏证明：

请求保藏的培养物名称：新城疫病毒NDV-Italien

保藏编号：CCTCC-V200908

收到日期：2009年4月30日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

具体实施方式

1材料

1.1病毒和细胞株

强毒株NDV Italien由Volker Schirrmacher教授(德国癌症研究中心)馈赠。

人肝细胞肝癌细胞株FHCC98

非洲绿猴肾细胞株COS-7

1.2菌种与质粒

E.coli JM109购自北京鼎国生物技术有限责任公司；pcDNA3.1(+)质粒购自Invitrogen公司，pIRES质粒购自Clontech公司。

1.3主要试剂

Trizol LS Reagent和Lipofectamine TM2000购自Invitrogen公司；氨苄青霉素购自Genview公司；ReverTra Ace反转录酶购自Toyobo公司；限制性核酸内切酶，Prime STAR DNA聚合酶，T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒(Plasmid Minipreps kit)和DNA凝胶纯化试剂盒为Omega公司产品。AdEasy重组腺病毒系统购自Stratagene公司。

2方法

2.1引物的设计：根据我们向GenBank提交的NDV Italien全长序列(登录号：EU293914)，以其中的HN和F基因序列为模板，设计引物并合成。合成系列两对引物并且在引物的5’端分别加上EcoR V和Xba I的酶切位点，同时在基因开放读码框的起始位点添加Kozak序列。序列如下：

HN sense：5’AATTGATATCAATAGCAGACTTCGGTCATGG 3’

Anti-sense：5’ATTATCTAGACTGACTGGCAGCGTAGGATTC 3’

F sense：5’TAAGATATCATCATGCGCTCCAGATCTTCT 3’

Anti-sense：5’ATTATCTAGAATACCTCCGCCTCTCGTCT 3’

2.2病毒的扩增和收集：将病毒接种9日龄无特殊病原体(specific-pathogen free，SPF)鸡胚尿囊腔，72h后收获尿囊液，所获得的尿囊液以20％蔗糖溶液为介质经差速离心法收集病毒沉淀，病毒沉淀用TNE(Tris+NaCl+EDTA)缓冲液重悬后保存于-70℃。

2.3病毒基因组cDNA的分段扩增：采用Trizol LS提取病毒基因组RNA，并且通过分段RT-PCR扩增的方法获得cDNA亚片段，分别是HN-cDNA和F-cDNA，再通过PrimeSTAR高保真DNA聚合酶对分别以HN-cDNA和F-cDNA片段进行扩增，得到HN和F基因完整开放读码框的片段，连入T载体后测序无误，分别通过EcoRV/Xba I连入pcDNA3.1(+)中，得到质粒pcDNA3.1-HN和pcDNA3.1-F。所得产物测序确认正确。

2.4将HN和F的真核表达质粒通过脂质体或电转染COS-7细胞，免疫荧光法检测确认上述表达质粒能够在真核细胞中有效表达编码产物HN蛋白和F蛋白。

2.5将HN和F真核表达质粒通过脂质体或电穿孔同时转染FHCC98和COS-7细胞，转染48h观察，免疫荧光法观察到共转染两种质粒的细胞与周围细胞出现了融合产生多核巨细胞(图1)，随时间推移所产生的多核巨细胞最终死亡并从培养瓶上脱落(图2)。碘化丙锭(PI)染色显示多核细胞呈阳性着色(图3)。

2.6同时设计另外两对引物，用于扩增HN和F的开放读码框完整片段，但分别包含有Xho I/Mlu I酶切位点(F基因)和Xba I/Not I的酶切位点(HN基因)，同时在基因开放读码框的起始位点添加Kozak序列。引物序列如下

HN+ sense：5’AATTTCTAGAAATAGCAGACTTCGGTCATGG 3’

Anti-sense：5’ATTAGCGGCCGCCTGACTGGCAGCGTAGGATTC 3’

F+ sense：5’TAACTCGAGATCATGCGCTCCAGATCTTCT 3’

Anti-sense：5’ATTAACGCGTATACCTCCGCCTCTCGTCT 3’

2.7采用HN+和F+两对引物，通过PrimeSTAR高保真DNA聚合酶对病毒基因组cDNA进行扩增，得到HN和F基因完整开放读码框的片段，连入T载体后测序无误，分别通过Xho I/Mlu I(F基因)和Xba I/NotI(HN基因)依次先后连入pIRES载体中相应位置。所的产物测序确认正确(图4)。

2.8将所得到串联表达质粒pIRES-HN/F转染COS-7细胞，采用分别针对NDV HN蛋白和F蛋白的单克隆抗体检测两种蛋白的表达情况，随后将该串联表达质粒在体外通过脂质体的方式转染FHCC98和COS-7细胞，两种基因串联表达的产物对两种不同细胞系均具有促膜融合及诱导融合多核巨细胞死亡的功能。

2.9根据NDV Italien株基因组序列合成另外两对引物，分别用于构建单独表达HN和F蛋白的重组腺病毒和串联表达HN和F蛋白的重组腺病毒。在HN1和F1引物对的上下游分别添加Sal I和Xho I酶切位点。序列如下：

HN1 sense：5’AATTGTCGACAATAGCAGACTTCGGTCATGG 3’

Anti-sense：5’ATTACTCGAGCTGACTGGCAGCGTAGGATTC 3’

F1 sense：5’TAAGTCGACATCATGCGCTCCAGATCTTCT 3’

Anti-sense：5’ATTACTCGAGATACCTCCGCCTCTCGTCT 3’

2.10采用HN1引物，以HN-cDNA为模板扩增HN1片段，该片段的两端分别带有Sal I和Xho I的酶切序列。采用F1引物，以F-cDNA为模版扩增F1片段，该片段的两侧分别带有Sal I和Xho I酶切序列。以HN1的上游引物和F1引物对的下游引物，以构建的pIRES-HN/F质粒为模版，扩增HN-IRES-F片段，该片段两端分别带有Sal I和Xho I酶切位点。将所得的三个片段连入T载体，测序无误后，将其通过Sal I和Xho I双酶切后连入AdEasy重组腺病毒系统中的pShuttle-CMV质粒中的相应酶切位点之间，所得的质粒分别命名为pShuttle-CMV-HN，pShuttle-CMV-F和pShuttle-CMV-HN/F(图5)。

2.11将所得的三种穿梭质粒pShuttle-CMV-HN，pShuttle-CMV-F和pShuttle-CMV-HN/F分别与腺病毒骨架结构质粒pAdEasy-1按照说明书所述步骤最终得到包含HN、F完整开放读码框序列以及这两段序列的串联表达片段的重组腺病毒，分别命名为Ad-HN，Ad-F和Ad-HN/F。

2.12将所得的重组病毒体外分别感染FHCC98和COS-7细胞，观察重组病毒Ad-HN和Ad-F在单独感染、联合感染以及Ad-HN/F感染导致基因串联表达时对细胞生长的影响。结果表明，Ad-HN与Ad-F联合感染以及Ad-HN/F感染均具有促膜融合及诱导融合多核巨细胞死亡的功能。

序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>新城疫病毒Italien株HN蛋白和F蛋白及其在基因治疗药物中

的应用

<160>4

<210>1

<211>1791

<212>cDNA

<213>新城疫病毒Italien株(Newcastle disease virus)

<220>

<221>CDS

<222>(47)..(1708)

<223>F

<400>1

acgggtagaa gaatttggat cccggttggc acattcaagg tgcaagatgg gctccagatc 60

ttctaccagg atcccggtac ctctaatgct gatcatccga attgcgctga cactgagctg 120

tatccgtctg acaagctctc ttgatggcag gcctcttgca gctgcaggga tcgtggtaac 180

aggagataaa gcagtcaaca tatacacctc atcccagaca gggtcaatca tagtcaagtt 240

actcccaaat atgcccaagg acaaagaggc gtgtgcaaaa gccccattag aggcatacaa 300

caggacactg actactttgc tcacccccct tggcaattct atccgcagga tacaagagtc 360

tgtgactact tccggaggaa ggagacagag acgctttata ggtgccatta tcggcagtgt 420

agctcttggg gttgcaacag ctgcacagat aacagcagcc tcggccctga tacaagccaa 480

ccagaatgct gccaacatcc tccggcttaa ggagagcatt gctgcaacca atgaagctgt 540

gcacgaggtc actgacggat tatcacaact agcagtggca gtagggaaga tgcagcagtt 600

tgttaatgac cagtttaata atacagcgca agaattggac tgtataaaaa ttacacagca 660

ggtcggtgta gaactcaact tgtacctaac tgaattgact acagtattcg ggccacaaat 720

cacttcccct gccttaactc cgctgactat ccaggcgctt tacaatttag ctggtggtaa 780

tatggattac ttgctgacta agttaggtgt agggaacaac caactcagct cattaattgg 840

tagcggcttg atcaccggca accctattct gtacgactca cagactcaga tcttgggtat 900

acagataact ttgccttcag tagggaacct aaataatatg cgtgccacct acttggagac 960

cttatctgta agcacaacca agggatttgc ctcagcactt gtcccaaaag tggtgacaca 1020

ggtcggttcc gtgatagaag aacttgacac ctcatactgt atggagaccg acttggatct 1080

atactgtaca agaatagtga cattccctat gtctcctggt atttattcct gtctgagcgg 1140

taatacatcg gcttgcatgt attcaaagac tgaaggcgca cttactacgc catatatggc 1200

tctcaaaggc tcagttatcg ccaattgcaa gatgacaaca tgtagatgtg cagacccccc 1260

gggtatcata tcgcaaaatt atggagaagc tgtgtcctta atagataggc actcatgcaa 1320

tgtcttatcc ttagacggga taactctgag gctcagtggg gaatttgatg caacctatca 1380

aaagaatatc tcaatactag attctcaagt tatagtgaca ggcaatctcg atatatcaac 1440

tgagcttggg aatgtcaaca actcaataag taatgccctg aataagttag aggaaagcaa 1500

cagcaaacta gacaaagtca atgtcaaact gaccagcaca tctgctctca ttacctacat 1560

cgttttaact gtcatatctc ttgtttttgg tgtacttagc ctggttctag catgctacct 1620

gatgtacaag caaaaggcac aacaaaagac cttattatgg cttgggaata atacccttga 1680

tcagatgaga gccactacaa aaatatgaat gcagacgaga ggcggaggta tccccaatag 1740

caatttgcgt gtaaattctg gcaacctgtt aattagaaga attaagaaaa a 1791

<210>2

<211>2002

<212>cDNA

<213>新城疫病毒Italien株(Newcastle disease virus)

<220>

<221>CDS

<222>(92)..(1807)

<223>HN

<400>2

acgggtagaa cggtcggaga agccacccct caatcgggaa tcaggcctca caacgtcctt 60

tctaccgcat caccaatagc agacttcggt catggaccgt gcagttggca gagttgcgct 120

agagaatgaa gaaagagaag cgaagaatac atggcgcttt gtattccgga tcgcaatctt 180

tcttttaata gtaataacct tagccatctc tgcagccgcc ctggtatata gcatggaggc 240

tagcacgtct ggcgaccttg ttggcatacc aactgtgatc tctagggcag aggaaaagat 300

tacatctgca ctcagttcta atcaagatgt agtagatagg atatataagc aggtggccct 360

tgagtctccg ttggcgttgc taaacactga atctgtaatt atgaatgcaa taacgtctct 420

ctcttatcaa atcaatggag ctgcaaataa tagcgggtgt ggggcacctg ttcatgaccc 480

agattatatc ggggggatag gcaaagaact tattgtagat gacgctagtg atgtcacatc 540

attctacccc tctgcgttcc aagaacacct gaattttatc ccggcaccta ctacaggatc 600

aggttgcact cggataccct cattcgacat aagtgctacc cactactgtt acactcacaa 660

tgtgatatta tctggttgca gagatcactc acactcacat cagtacttag cacttggtgt 720

gcttcggaca tctgcaacag ggagggtatt cttttctact ctgcgttcca tcaatttgga 780

tgacaaccaa aatcggaagt cttgcagtgt gagtgcaact cccctaggtt gtgatatgct 840

gtgctctaaa atcacagaga ctgaggaaga ggattatagt tcagttaccc ccacatctat 900

ggtgcatgga aggttagggt ttgacggtca ataccatgag aaggacctag acgtcataac 960

tttatttaag gattgggtgg caaattaccc aggagtgggg ggtgggtctt ttattgacaa 1020

ccgcgtatgg ttcccagtct acggagggct aaaacccaat tcgcctagcg acaccgcaca 1080

agaagggaga tatgtaatat acaagcgcta caatgacaca tgcccagatg aacaagatta 1140

ccagattcgg atggctaagt cttcgtataa gcctgggcgg tttggtggaa aacgcgtaca 1200

gcaagccatc ttatctatca aggtgtcaac atctttgggc gaggacccgg tgctgactgt 1260

accgcctaat acagtcacac tcatgggggc cgaaggcaga gttctcacag tagggacatc 1320

tcatttcctg tatcaacgag ggtcttcata cttctctccc gctttattat accccatgac 1380

agtcaacaac aaaacggcta ctcttcatag tccttacaca ttcaatgctt tcactcggcc 1440

aggtagtgtc ccttgccagg catcagcaag atgccccaac tcatgtgtca ctggagttta 1500

tactgatccg tatcccttag tcttccatag gaaccacacc ttgcgggggg tattcgggac 1560

aatgcttgat gataaacaag caagacttaa ccctgtatct gcagtatttg ataacatatc 1620

ccgcagtcgc ataacccggg taagttcaag cagtaccaag gcagcataca cgacatcgac 1680

atgttttaaa gttgtcaaga ccaataaaac atattgcctc agcattgcag aaatatccaa 1740

taccctcttc ggggaattca ggatcgttcc tttactagtt gagattctca aggaagatgg 1800

ggtttaagaa gccaggtccg gccagttgag tcaactgtgg gaggattgga aagatgacat 1860

tgtgtcacct attttttgta atgccaaggg tcaaactgaa taccggcgcg agcccgaatc 1920

ctacgctgcc agtcagccat aattagctag tgctaatatg attagtctta atcttgtcga 1980

tagtcacttg gttaagaaaa aa 2002

<210>3

<211>553

<212>Amino Acid

<213>新城疫病毒Italien株(Newcastle disease virus)

<220>

<221>Amino Acid

<222>(1)..(553)

<223>fusion protein

<400>3

Met Gly Ser Arg Ser Ser Thr Arg Ile Pro Val Pro Leu Met Leu

1 5 10 15

Ile Ile Arg Ile Ala Leu Thr Leu Ser Cys Ile Arg Leu Thr Ser

20 25 30

Ser Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr

35 40 45

Gly Asp Lys Ala Val Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser

50 55 60

Ile Ile Val Lys Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Ala

65 70 75

Cys Ala Lys Ala Pro Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr

80 85 90

Leu Leu Thr Pro Leu Gly Asn Ser Ile Arg Arg Ile Gln Glu Ser

95 100 105

Val Thr Thr Ser Gly Gly Arg Arg Gln Arg Arg Phe Ile Gly Ala

110 115 120

Ile Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile

125 130 135

Thr Ala Ala Ser Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala Asn

140 145 150

Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val

155 160 165

His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val Ala Val Gly

170 175 180

Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Asn Thr Ala Gln

185 190 195

Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val Glu Leu

200 205 210

Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln Ile

215 220 225

Thr Ser Pro Ala Leu Thr Pro Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn

230 235 240

Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Val

245 250 255

Gly Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr

260 265 270

Gly Asn Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Ile Leu Gly Ile

275 280 285

Gln Ile Thr Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala

290 295 300

Thr Tyr Leu Glu Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Phe Ala

305 310 315

Ser Ala Leu Val Pro Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile

320 325 330

Glu Glu Leu Asp Thr Ser Tyr Cys Met Glu Thr Asp Leu Asp Leu

335 340 345

Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr

350 355 360

Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr

365 370 375

Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met Ala Leu Lys Gly Ser Val

380 385 390

Ile Ala Asn Cys Lys Met Thr Thr Cys Arg Cys Ala Asp Pro Pro

395 400 405

Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val Ser Leu Ile Asp

410 415 420

Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile Thr Leu Arg

425 430 435

Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile Ser Ile

440 445 450

Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser Thr

455 460 465

Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asn Lys

470 475 480

Leu Glu Glu Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu

485 490 495

Thr Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile

500 505 510

Ser Leu Val Phe Gly Val Leu Ser Leu Val Leu Ala Cys Tyr Leu

515 520 525

Met Tyr Lys Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly

530 535 540

Asn Asn Thr Leu Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Lys Ile

545 550 553

<210>4

<211>571

<212>Amino Acid

<213>新城疫病毒Italien株(Newcastle disease virus)

<220>

<221>Amino Acid

<222>(1)..(571)

<223>hemagglutinin-neuraminidase

<400>4

Met Asp Arg Ala Val Gly Arg Val Ala Leu Glu Asn Glu Glu Arg

1 5 10 15

Glu Ala Lys Asn Thr Trp Arg Phe Val Phe Arg Ile Ala Ile Phe

20 25 30

Leu Leu Ile Val Ile Thr Leu Ala Ile Ser Ala Ala Ala Leu Val

35 40 45

Tyr Ser Met Glu Ala Ser Thr Ser Gly Asp Leu Val Gly Ile Pro

50 55 60

Thr Val Ile Ser Arg Ala Glu Glu Lys Ile Thr Ser Ala Leu Ser

65 70 75

Ser Asn Gln Asp Val Val Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu

80 85 90

Glu Ser Pro Leu Ala Leu Leu Asn Thr Glu Ser Val Ile Met Asn

95 100 105

Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn

110 115 120

Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val His Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly

125 130 135

Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp Ala Ser Asp Val Thr Ser

140 145 150

Phe Tyr Pro Ser Ala Phe Gln Glu His Leu Asn Phe Ile Pro Ala

155 160 165

Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro Ser Phe Asp Ile

170 175 180

Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile Leu Ser Gly

185 190 195

Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu Gly Val

200 205 210

Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu Arg

215 220 225

Ser Ile Asn Leu Asp Asp Asn Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val

230 235 240

Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Ile Thr

245 250 255

Glu Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Ser Ser Val Thr Pro Thr Ser Met

260 265 270

Val His Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp

275 280 285

Leu Asp Val Ile Thr Leu Phe Lys Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro

290 295 300

Gly Val Gly Gly Gly Ser Phe Ile Asp Asn Arg Val Trp Phe Pro

305 310 315

Val Tyr Gly Gly Leu Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ala Gln

320 325 330

Glu Gly Arg Tyr Val Ile Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro

335 340 345

Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys

350 355 360

Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser

365 370 375

Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu Asp Pro Val Leu Thr Val

380 385 390

Pro Pro Asn Thr Val Thr Leu Met Gly Ala Glu Gly Arg Val Leu

395 400 405

Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Tyr

410 415 420

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Asn Asn Lys Thr

425 430 435

Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr Arg Pro

440 445 450

Gly Ser Val Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser Cys

455 460 465

Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Val Phe His Arg

470 475 480

Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Asp Lys

485 490 495

Gln Ala Arg Leu Asn Pro Val Ser Ala Val Phe Asp Asn Ile Ser

500 505 510

Arg Ser Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala

515 520 525

Tyr Thr Thr Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr

530 535 540

Tyr Cys Leu Ser Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu

545 550 555

Phe Arg Ile Val Pro Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Glu Asp Gly

560 565 570

Val

571

Claims

1.一种新城疫病毒NDV-Italien株HN蛋白和F蛋白，其特征在于：所述的F蛋白cDNA是序列表<400>1的序列，F蛋白的氨基酸序列是序列表<400>3的序列，HN蛋白cDNA是序列表<400>2的序列，HN蛋白的氨基酸序列是序列表<400>4的序列。

2.如权利要求1所述的新城疫病毒NDV-Italien株HN蛋白和F蛋白，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。

3.一种重组病毒载体，将包含权利要求1所述的HN或F基因完整开放读码框序列的片段分别连入病毒载体中，该重组病毒载体可以在真核细胞中分别表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因或F基因；通过体外转染或感染的方法，可以将该重组病毒载体导入体外培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中并且同时表达两种编码产物。

4.如权利要求3所述的重组病毒载体，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。

5.一种真核表达质粒，将包含权利要求1所述的HN或F基因完整开放读码框序列的片段分别连入真核表达质粒，可以在真核细胞中分别表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因或F基因；通过转染的方法，同时将两种真核表达质粒导入培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中同时表达两种编码产物。

6.如权利要求5所述的真核表达质粒，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。

7.一种真核表达质粒，将包含权利要求1所述的HN和F基因完整开放读码框序列的片段连入含有内核糖体进入序列(internalribosome entry site，IRES)的真核表达质粒中，可以在真核细胞中串联表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因和F基因，然后通过转染的方法，导入体外培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中同时表达两种编码产物。

8.如权利要求7所述的真核表达质粒，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。

9.一种重组病毒载体，将包含权利要求1所述的HN和F基因完整开放读码框序列的片段通过内核糖体进入序列(internalribosome entry site，IRES)连接后，连入病毒载体中，构建重组病毒载体，可以在真核细胞中串联表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因和F基因，然后通过体外转染或感染的方法，导入培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中同时表达两种编码产物。

10.如权利要求9所述的重组病毒载体，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。