CN104513317B - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新城疫病毒融合蛋白，该融合蛋白包括F蛋白中的两个保护性抗原片段F1蛋白和F2蛋白，还包括HN蛋白。其中，所述F1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，所述F2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，所述HN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。本发明还公开了含免疫量的新城疫病毒融合蛋白的疫苗组合物及其在预防和/或治疗基因VII型新城疫病毒中的应用。该新城疫疫苗组合物能同时产生细胞免疫和体液免疫；还对基因VII型的新城疫病毒均能产生保护性免疫，具有广谱性。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品，特别是涉及一种疫苗组合物及其制备方法和应用。

背景技术

新城疫（New castle Disease，ND）俗称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒（New castleDisease Virus，NDV）引起的一种可导致禽类急性、高度接触性、致死性传染病，常呈败血症，以呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、黏膜和浆膜出血为主要特征，是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一，被世界动物卫生组织（OIE）列为A类传染病。

自1926年发现ND以来，ND已经发生了四次大流行。从临床上分离到的NDV毒株基因型来看，目前流行的ND主要是由基因VII型NDV为主的毒株所致，使我国的养禽业遭受了巨大的经济损失。目前，接种疫苗仍然是预防和控制新城疫病毒大流行的最有效手段。

NDV属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属禽副粘病毒血清1型，是有囊膜的负链、不分阶段的RNA病毒。现有的NDV只有一个血清型，但各毒株之间的毒力、对动物的致病性均有很大的差异。其基因组结构模式为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'的，依次编码6种特异性的结构蛋白：核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（Phospho protein，P）、基质蛋白（Matrix protein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protem，HN）、大分子蛋白（Large protein，L）。其中，HN蛋白和F蛋白构成囊膜外表面的纤突，与NDV的致病性密切相关；并且，这两种蛋白是NDV的功能性糖蛋白，是重要的宿主保护性抗原，具有良好的免疫原性。

在感染过程中，首先，HN蛋白介导病毒识别，并吸附于细胞表面含唾液酸的受体，以参与病毒粒子的感染；然后，F蛋白通过释放融合多肽，促进病毒囊膜与宿主细胞膜表面脂蛋白膜的融合，从而促进核衣壳释放到胞浆中，使病毒基因组进入宿主细胞，发挥致病作用。

发明内容

本发明提供了一种新型的新城疫病毒融合蛋白，以及含免疫量的新城疫病毒融合蛋白的疫苗组合物及其应用。该疫苗组合物能同时产生细胞免疫和体液免疫；还对基因VII型的新城疫病毒均能产生保护性免疫，具有广谱性。

本发明的主要目的在于提供一种新城疫病毒融合蛋白，包括：（1）F蛋白中的两个保护性抗原片段F1蛋白和F2蛋白；（2）HN蛋白。

优选地，所述的F1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，所述的F2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，所述的HN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。

更优选地，所述的F1蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述的F2蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述的HN蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

优选地，所述的新城疫病毒融合蛋白为在HN蛋白两端分别添加F1蛋白片段和F2蛋白片段。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述的新城疫病毒融合蛋白的方法，所述制备方法包括：通过基因工程手段，依次构建新城疫病毒融合蛋白的克隆载体、表达载体，并对新城疫病毒融合蛋白进行表达、纯化及鉴定。

本发明的再一目的在于提供一种用于预防基因VII型新城疫病毒感染的疫苗组合物，其包括一免疫量的所述的新城疫病毒融合蛋白和/或一兽医学上可接受的佐剂。

优选地，所述的新城疫疫苗组合物单位剂量中含新城疫病毒融合蛋白组分的含量为5-50μg，优选为10-40μg。

含本发明所述的新城疫病毒融合蛋白的疫苗组合物中，较佳地还可包括一兽医学上可接受的佐剂，所适用的免疫佐剂不限，可以是任何一种常用于疫苗的佐剂，包括油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、丙烯酸聚合物佐剂、水性佐剂、脂质体中的一种或几种。

本发明所用术语“丙烯酸聚合物佐剂”为至少含有丙烯酸聚合物的佐剂溶液；优选地，所述丙烯酸聚合物还可为丙烯酸聚合物、可代谢油的混合物；更优选地，所述丙烯酸聚合物为均聚物或共聚物，进一步优选为Carbopol。

本发明所用术语“水性佐剂”又称“水佐剂”、“水基佐剂”或“水溶性佐剂”，是一种聚合物水溶性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，滴入水中能迅速与水混溶。

本发明所用术语“脂质体”是理想的免疫佐剂，以其制备的新城疫疫苗组合物还可称为“新城疫病毒样颗粒”；其膜材包括磷脂、固醇类；更优选地，所述脂质体的膜材包括卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、硬质酰胺、二氧乙烯十六烷基醚、四氧乙烯十二烷基醚中的一种或几种。

优选地，所述的脂质体是中性脂质体、负电性脂质体或正电性脂质体；更优选地，所述的脂质体为正电性脂质体。

优选地，所述的脂质体将新城疫病毒融合蛋白包裹于脂质体内或镶嵌于脂质体膜中或由于电荷作用而吸附于膜上。

本发明还提供一种制备所述的新城疫病毒样颗粒的方法，所述的制备方法包括：

（1）将通过基因工程手段所获得的新城疫病毒融合蛋白纯化、冻干后，用含稳定剂的缓冲液制备成新城疫抗原原液；

（2）将脂质体原料溶于有机溶剂中，将所述脂质体溶液于旋转蒸发仪中真空旋转蒸发，成膜，在膜材中加入所述缓冲液，并加入几粒小玻璃珠，旋转蒸发，待薄膜从瓶壁上完全脱落后，静置得空脂质体；

（3）将所述新城疫抗原原液加入制得的空脂质体中，用高压匀浆机高压均质循环脂质体颗粒，除菌过滤，即成所述新城疫病毒样颗粒。

优选地，所述步骤（1）中的所述稳定剂为氨基酸、单糖、二糖、多元醇中的一种或几种；所述步骤（2）中的所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一种或几种；所述步骤（2）中所述膜材的终浓度为1%-5%（W/W），优选为2%（W/W）；所述步骤（2）中所述旋转蒸发温度为30-65℃，所述高压压力为15-30Kpa；所述步骤（1）、（2）中的所述缓冲液为pH值5.4-7.8范围内的磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、碳酸钠缓冲液、生理盐水中的一种或几种。

本发明所述的新城疫疫苗组合物制备方法，还包括薄膜法与冷冻干燥法结合、逆相蒸发法与冷冻干燥法结合、薄膜分散法、冷冻干燥法、注入法、加压挤出法、熔融法、复乳法、冻融法、表面活性剂处理法、前脂质体法、空白前脂质体法、pH及醋酸梯度法等。

本发明还提供了所述的新城疫病毒融合蛋白及所述的新城疫疫苗组合物在制备预防和/或治疗基因VII型新城疫病毒中的应用。

本发明在制备用于保护动物免患基因VII型新城疫病毒所引起的疾病的新城疫疫苗组合物中的应用时，所用新城疫疫苗组合物的免疫量为0.3mL/羽。

所述的新城疫疫苗组合物在给予免疫动物时，可以通过肌肉注射、皮下注射、口服途径、静脉注射或点眼、滴鼻途径，优选为通过皮下注射或肌肉注射。

基于此，本发明具有以下突出的优点：

（1）本发明所述的新城疫病毒融合蛋白是通过基因工程手段获得的，易于大规模生产，便于储存；

（2）本发明所述的新城疫疫苗组合物所含抗原的主要组分为新城疫病毒融合蛋白，而该融合蛋白包含F1蛋白、F2蛋白和HN蛋白，能同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫；

（3）本发明所述的新城疫疫苗组合物具有广谱性，能抗基因VII型的新城疫病毒，免疫动物后可诱导动物产生抗基因VII型新城疫病毒的抗体。

序列表中：

序列1为新城疫病毒F1蛋白的核苷酸序列；

序列2为新城疫病毒F1蛋白的氨基酸序列；

序列3为新城疫病毒F2蛋白的核苷酸序列；

序列4为新城疫病毒F2蛋白的氨基酸序列；

序列5为新城疫病毒HN蛋白的核苷酸序列；

序列6为新城疫病毒HN蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本实施例中所用的“免疫量”是指提供针对新城疫疫苗组合物的免疫剂量，主要取决于以下因素：被免疫动物的物种、品种、年龄、重量大小、健康状态以及动物之前是否接受过对抗同样病毒的疫苗。

本实施例中所用的新城疫病毒F1蛋白、F2蛋白、HN蛋白的序列，来源于已报道的新城疫中国分离株，在NCBI中的登录号为JF343539。

本实施例通过基因工程手段，以大肠杆菌表达载体为例进行表达，从而获得新城疫病毒融合蛋白，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本实施例以油佐剂、脂质体作为佐剂制备新城疫疫苗组合物为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本实施例中所用的攻毒毒株为新城疫北京株，该毒株的保藏号为CVCC AV1611，保藏单位为国家兽医微生物菌种保藏管理中心，购自中国兽医药品监察所。

下述实施例中所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1新城疫病毒融合蛋白克隆载体的构建

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的新城疫China/Guangxi9/2003（登录号：JF343539）中的基因序列，分别选取F1、F2、HN蛋白基因的核苷酸序列（详见序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3），通过基因工程手段将他们串联起来作为新城疫病毒的融合蛋白。

1.1引物设计

根据选取的F1、HN、F2蛋白基因的核苷酸序列，即SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQID No.2，分别设计各自片段的引物，详情如下。其中，F1上下游引物两端分别添加SacI和XbaI限制性内切酶位点；HN上下游引物两端分别添加XbaI和XhoI限制性内切酶位点；F2上下游引物两端分别添加XhoI和HindIII限制性内切酶位点。

引物1扩增F1片段，序列如下：

上游：CGAGCTCATGCTTGACGGCAGGCCTCTTGCAG

下游：GCTCTAGAGCGCGGTCCATACCTATAAAGC

引物2扩增HN片段，序列如下：

上游：GCTCTAGAGCTTTATAGGTATGGACCGCGC

下游：CCGCTCGAGGTCTTTGAATATTAAACCTTAT

引物3扩增F2片段，序列如下：

上游：CCGCTCGAGATAAGGTTTAATATTCAAAGAC

下游：CCCAAGCTTTTAGACTTTTTCTAGCTTGCTGTTG

1.2RT-PCR

新城疫病毒尿囊液培养上清，按照RNA提取试剂盒说明书，提取新城疫病毒总RNA，并按照反转录试剂盒说明，将其反转录成相应cDNA片段，-20℃保存。以cDNA片段为模板，按照PCR反应试剂盒说明，分别扩增F1、HN、F2片段，PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性45s，52℃复性30s，72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物使用1%凝胶进行电泳检测。

检测结果显示：分别出现264、1716、360bp附近出现条带，与F1、HN、F2目的基因片段大小相同。

将目的片段分别使用凝胶回收试剂盒进行回收。

1.3克隆载体的构建

将回收的F1、HN、F2片段，分别与克隆载体pMD18-T进行连接，连接体系为：目的基因20μL、pMD18-T载体0.5μL、连接酶缓冲液2.0μL、T4DNA连接酶1.0μL、灭菌双蒸水8.5μL；连接反应条件为16℃、30min。将连接产物加入DH5α感受态细胞，冰上放置30min，然后42℃加热45s，置冰上1min，加入890μL的LB液体培养基，37℃振荡培养60min，将培养物接种含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板，37℃培养过夜。

观察结果显示：LB固体培养基出现白色小菌落。

挑典型菌落，接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，200rpm培养10h。使用质粒回收试剂盒提取各转化菌质粒，分别命名为pMD18-T-F1、pMD18-T-HN、pMD18-T-F2，并进行酶切鉴定。

1.4克隆载体的构建和鉴定

1.4.1pMD18-T-F1和pMD18-T-HN的酶切鉴定

将1.3转化菌提取质粒后，pMD18-T-F1使用SacI和XbaI限制性内切酶进行双酶切；pMD18-T-HN使用XbaI和XhoI限制性内切酶进行双酶切，酶切产物电泳后，将鉴定为阳性的质粒，送基因公司进行测序分析。结果显示：pMD18-T-F1酶切后，出现2600bp左右的载体片段和260bp左右的F1片段；pMD18-T-HN酶切后，出现2600bp左右的载体片段和1700bp左右的HN片段。

将酶切正确的质粒送基因公司测序，测序结果表明：目的基因和载体连接正确。

1.4.2pMD18-T-F1-HN的构建

pMD18-T-F1、pMD18-T-HN分别使用SacI和XbaI限制性内切酶双酶切，酶切产物电泳后，使用DNA凝胶回收试剂盒，将酶切后F1、pMD18-T-HN目的条带回收。使用DNA连接试剂盒，将F1、pMD18-T-HN进行连接，连接体系为：F1片段1μL、pMD18-T-HN5μL、buffer2μL、连接酶2μL，灭菌水10μL；连接条件为：16℃反应过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，转化过程同1.3。

结果表明：pMD18-T-F1酶切后，出现260bp的F1片段和2600bp的载体片段；pMD18-T-HN酶切后，在4300bp附近出现条带。

将F1片段和pMD18-T-HN连接后转化DH5α感受态细胞，培养过夜，在LB固体培养基出现白色小菌落，挑单菌落接种含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，出现浑浊，使用质粒提取试剂盒提取质粒，进行鉴定。

1.4.3pMD18-T-F1-HN鉴定

将1.4.2提取的质粒，使用SacI、XhoI限制性内切酶双酶切，酶切产物进行电泳，将酶切正确的质粒送基因公司进行测序。

结果表明：酶切后，出现2600bp的载体片段和2000bp左右的目的条带。将酶切正确的质粒进行测序分析，分析结果显示：F1和HN正确连接到载体，pMD18-T-F1-HN连接成功。

1.5pMD18-T-F1-HN-F2载体的构建和鉴定

1.5.1pMD18-T-F1-HN-F2载体的构建

pMD18-T-F2、pMD18-T-F1-HN分别使用XhoI、HindIII双酶切，酶切产物电泳后，使用胶回收试剂盒分别回收F2、pMD18-T-F1-HN目的条带，使用DNA连接试剂盒，将F2、pMD18-T-F1-HN目的条带进行连接，连接体系为：F2片段1μL、pMD18-T-F1-HN5μL、buffer2μL、连接酶2μL，灭菌水10μL；连接条件为：16℃反应过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，转化过程同1.3。

结果显示：XhoI、HindIII双酶切后电泳后，在360bp和5000bp附近出现条带。将其回收后连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，培养过夜，在含100μg/mL的LB固体培养基出现小菌落，挑单菌落接种100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，出现浑浊，使用质粒提取试剂盒提取质粒，送基因公司进行测序分析，同时进行酶切鉴定。

1.5.3pMD18-T-F1-HN-F2载体的鉴定

pMD18-T-F1-HN-F2质粒使用SacI、HindIII进行双酶切鉴定，酶切产物电泳。结果显示：电泳后，分别出现2600bp的载体片段和2400bp左右的目的条带。

将鉴定为阳性的质粒送基因公司进行测序分析，结果显示：pMD18-T-F1-HN-F2连接正确。

实施例2新城疫病毒融合蛋白表达载体的构建

2.1pET-28a-T-F1-HN-F2表达载体的构建

pET-28a和pMD18-T-F1-HN-F2分别使用SacI、HindIII进行双酶切，酶切产物进行电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒回收相应的目的条带。结果显示：酶切后，pET-28a载体在5300bp附近出现条带，pMD18-T-F1-HN-F2在2400bp附近出现条带。

将目的条带回收，使用DNA连接试剂盒进行连接，连接体系为：pET-28a1μL、F1-HN-F25μL、buffer2μL、连接酶2μL，灭菌水10μL；连接条件为：16℃反应过夜。连接产物转化Bal21感受态细胞，转化过程同1.3，转化菌接种含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平皿。

2.2pET-28a-T-F1-HN-F2表达载体的鉴定

将2.1转化的Bal21细胞隔夜培养，挑单菌落接种含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃、180rpm培养过夜，使用DNA提取试剂盒提取相应质粒，将质粒使用PCR试剂盒进行鉴定。将PCR阳性质粒送基因公司进行测序分析。

结果显示：PCR扩增出2400bp的目的条带，而阴性对照未出现条带；测序结果表明，pET-28a-T-F1-HN-F2构建正确。

实施例3新城疫病毒融合蛋白的表达、鉴定及纯化

3.1新城疫病毒融合蛋白的表达及鉴定

将含pET-28a-T-F1-HN-F2质粒的Bal21菌，按1%（V/V）接种量接种含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养6-8h，使细菌OD₆₀₀在0.6-1.0之间，加入IPTG，使终浓度为1mmol/L，继续培养5h，取样进行SDS-PAGE电泳，使用鸡抗新城疫阳性血清进行Western blot鉴定。

结果显示：相对于对照，含pET-28a-T-F1-HN-F2质粒的Bal21菌经IPTG诱导5h，在80KDa附近出现相应的目的条带，主要存在于包涵体中。Western blot结果表明：该重组蛋白可与鸡抗新城疫阳性血清发生特异性结合反应。

3.2新城疫病毒融合蛋白的纯化

使用Ni⁺亲和层析柱对上述表达产物进行纯化。将含pET-28a-T-F1-HN-F2质粒的Bal21菌，按1%（V/V）接种量接种含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养6-8h，使细菌OD₆₀₀在0.6-1.0之间，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，继续培养5h后，收集细菌进行超声破碎，8000rpm离心30min，收集沉淀，使用包涵体溶解液溶解后，使用Ni⁺亲和层析柱进行纯化，纯化蛋白使用生理盐水进行透析，透析蛋白使用紫外分光光度计测定蛋白浓度，使用SDS-PAGE对其纯度进行鉴定。

鉴定结果表明：新城疫病毒融合蛋白，即重组T-F1-HN-F2蛋白，经Ni⁺亲和层析柱纯化，透析后得到浓度为200μg/mL的含新城疫病毒融合蛋白溶液，将其作为新城疫病毒融合蛋白的储备液；透析蛋白使用SDS-PAGE鉴定，仅在80KDa附近出现条带。

将鉴定合格后的新城疫病毒融合蛋白使用冻干机进行冻干，以便长期保存。

实施例4不同佐剂类型的新城疫疫苗组合物的制备

4.1不含佐剂的新城疫疫苗组合物的制备

将实施例3制备的200μg/mL新城疫病毒融合蛋白的储备液，用生理盐水进行稀释，使其含新城疫病毒融合蛋白的终浓度分别为5、25、50μg/mL，依次编码为疫苗1、疫苗2、疫苗3。

将制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3于2-8℃保存备用。

4.2含油佐剂的新城疫疫苗组合物的制备

取注射用白油94份，加司本-806份混合后，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌至透明为止，高压灭菌后备用，即为油相。

将实施例3制备的200μg/mL新城疫病毒融合蛋白的储备液进行稀释，使其含新城疫病毒融合蛋白的浓度依次为15、75、150μg/mL，分别于无菌容器中，加入4%灭菌并冷却后的吐温-80，边加边搅拌，使吐温-80完全溶解为止，即为水相1、水相2、水相3。

乳化机的转子先用0.5%甲醛溶液浸泡消毒4h以上，使用前以热的无菌蒸馏水冲洗干净。取油相2份置乳化器内，开动电机搅拌，然后依次分别徐徐加入1份水相1、水相2、水相3，再以17500r/min乳化5min即可。在乳化终止前加入1%硫柳汞钠，使其终浓度为0.01%。制备的疫苗即为含油佐剂的5、25、50μg/mL新城疫病毒融合蛋白的疫苗组合物，将其编码为疫苗4、疫苗5、疫苗6，于2-8℃保存备用。

4.3新城疫病毒样颗粒的制备

将实施例3制备出的冻干后的新城疫病毒融合蛋白用含1%海藻糖的生理盐水溶解，制备成200μg/mL的新城疫抗原原液。

本实施例所述的新城疫疫苗组合物的制备方法之薄膜法与冷冻干燥法相结合，包括以下操作步骤：

（1）将大豆卵磷脂、胆固醇按照质量比为3:1混合，然后溶于三氯甲烷中，将该混合溶液置于旋转蒸发仪的茄型瓶中，45℃水浴作为蒸发温度，真空旋转蒸发，成膜。

（2）按膜材终浓度为2%（W/W）加生理盐水，并加入几粒小玻璃珠，45℃旋转蒸发，待薄膜从瓶壁上完全脱落后，静置约25min，使瓶中液体呈乳白色悬浊液。

（3）将不同体积的新城疫抗原储备液加入制得的空脂质体中，用高压匀浆机在15-30Kpa的高压下均质循环脂质体颗粒5次，除菌过滤后即为所制备的新城疫病毒样颗粒，使含新城疫病毒融合蛋白的含量依次为5、25、50μg/mL，依次编码为疫苗7、疫苗8、疫苗9。

实施例5新城疫疫苗组合物的检验

将实施例4制备的不同佐剂类型的新城疫疫苗组合物（即疫苗1至疫苗9）按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》（二〇〇〇年版）方法进行无菌检验以及安全检验。

无菌检验和安全检验结果显示：各疫苗组合物均符合规定的标准。

实施例6动物实验

选取30日龄的SPF鸡95只，随机挑选5只作为空白对照，其余90只随机分成9组，10只/组，分别经肌肉注射实施例4制备的不同佐剂类型的新城疫疫苗组合物（即疫苗1至疫苗9）、生理盐水（作为空白对照），注射剂量0.3mL/羽。

于免疫后的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第90天，分别采集并分离各试验组的血清，并利用血凝抑制试验（HI）检测血清中的新城疫抗体水平，检测结果见表1。

表1不同时间段各试验组新城疫抗体水平的检测结果汇总

由表1可知：各试验组的新城疫疫苗组合物免疫后的抗体滴度均于免疫后第15天开始上升，并于第30天达到最大值；平行比较同样新城疫病毒融合蛋白含量的，且不含佐剂、含油佐剂、含脂质体的新城疫疫苗组合物，发现含脂质体的新城疫疫苗组合物（即疫苗7至疫苗9）所产生的抗体水平均较高，其次是含油佐剂的新城疫疫苗组合物（即疫苗4至疫苗6），再次是不含佐剂的新城疫疫苗组合物（即疫苗1至疫苗3）；特别地，含脂质体的新城疫疫苗组合物（即疫苗7至疫苗9）免疫后所产生的抗体水平在第30天达到最高值后，能持续30天左右。而空白对照组未产生特异性抗体。

实施例7攻毒保护试验

同实施例6，选取30日龄的SPF鸡95只（HI抗体≤4），随机挑选5只作为空白对照，其余90只随机分成9组，10只/组，分别经肌肉注射实施例4制备的不同佐剂类型的新城疫疫苗组合物（即疫苗1至疫苗9）、生理盐水（作为空白对照），注射剂量0.3mL/羽。

免疫后第30天，通过肌肉注射10^5.0ELD₅₀新城疫北京株，1.0mL/只，分别对每个免疫组和对照组进行攻毒，观察至第15天，并记录各免疫组与对照组存活及死亡情况，结果详情见表2。

表2各免疫组攻毒保护试验后的结果汇总

试验组号	免疫原	保护率
			7	疫苗1	100%（10/10）
8	疫苗2	100%（10/10）
			9	疫苗3	100%（10/10）
10	疫苗4	100%（10/10）
			11	疫苗5	100%（10/10）
12	疫苗6	100%（10/10）
			13	疫苗7	100%（10/10）
14	疫苗8	100%（10/10）
			15	疫苗9	100%（10/10）
16	生理盐水	0（0/5）

由表2可知：免疫后第30天，除生理盐水对照组外，各免疫组可完全抵抗新城疫北京株的攻击，均可获得完全保护。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种新城疫病毒融合蛋白，由以下组分构成：

(1)F蛋白中的两个保护性抗原片段F1蛋白和F2蛋白；

(2)HN蛋白，

其中，所述的F1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，所述的F2蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.4，所述的HN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，所述的新城疫病毒融合蛋白为通过在HN蛋白两端分别添加F1蛋白片段和F2蛋白片段构建的F1-HN-F2融合蛋白。

2.一种用于预防新城疫病毒基因VII型病毒感染的疫苗组合物，其包括一免疫量的如权利要求1所述的新城疫病毒融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，还包括一兽医学上可接受的佐剂。

4.根据权利要求2或3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物单位剂量中含新城疫病毒融合蛋白的含量为5-50μg。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物单位剂量中含新城疫病毒融合蛋白的含量为10-40μg。

6.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的佐剂包括油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、水性佐剂、脂质体中的一种或几种。

7.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的佐剂包括丙烯酸聚合物佐剂。

8.根据权利要求2-7任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗基因VII型新城疫病毒的疫苗组合物中的应用。