CN109735477B - 单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术和免疫技术领域，具体涉及单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用。所述减毒突变株，为actA基因、plcB基因和orfX基因都不表达的单核细胞增生李斯特菌。所述突变株毒力显著降低（比野生型降低了至少794倍），同时具有激发较好的免疫保护作用。本发明所述的试剂盒，具有操作简单，检测时间短，特异性强，准确度高，灵敏度高，并且能够准确区分单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株和野生单核细胞增生李斯特菌。

Description

单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术和免疫技术领域，具体涉及单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是革兰染色阳性的兼性胞内寄生菌，作为一种食源性病原菌，能突破人体及动物的肠道屏障、血胎屏障和血脑屏障，引起脑膜炎、胃肠炎、败血症及流产等症状，死亡率高达20％-30％，是重要的人兽共患李斯特菌病的病原菌，也是感染后致死率最高的食源性病原菌。该菌对人类健康造成极大威胁，已引起世界各国的普遍关注和高度重视。

单核细胞增生李斯特菌不仅对畜牧业的发展造成一定影响，还能通过食物链感染人类，威胁到人类的健康，因此做好动物李斯特菌病的预防和控制，消除动物的感染和带菌，从源头上杜绝沿食物链传递感染人类，具有重要公共卫生意义，而疫苗免疫是预防传染病的最有效途径。由于该菌是兼性胞内寄生菌，可以逃逸宿主巨噬细胞的吞噬作用而进入细胞质中，主要介导细胞免疫,这就要求疫苗必须能有效地诱导细胞免疫应答，因此增加了疫苗创制的难度。虽然国际上已对预防李斯特菌病的疫苗进行了几十年的研究，至今尚未有用于临床的有效疫苗问世，无疑增加了李斯特菌病的防控难度。

发明内容

鉴于以上现有技术的情况，本发明的目的在于提供一种单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株，为actA基因、plcB基因和orfX基因都不表达的单核细胞增生李斯特菌。

所述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株Listeria monocytogenesNTSNΔactA/plcB/orfX为野毒型单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的突变菌株，所述Listeria monocytogenes NTSNΔactA/plcB/orfX已于2018年09月10日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC M 2018606。

在一种实施方式中，所述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株，为actA基因、plcB基因和orfX基因被敲除的单核细胞增生李斯特菌。

野毒型单核细胞增生李斯特菌为现有技术，具体信息为：accessionno.CP009897，只要将野毒型单核细胞增生李斯特菌中的actA基因、plcB基因和orfX基因进行敲除，使得actA基因、plcB基因和orfX基因都不表达，即可获得本发明所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，所述actA基因、plcB基因和orfX基因是相邻的基因。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，actA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，actA的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，plcB的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，plcB的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，orfX的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，orfX的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

在一种实施方式中，将野毒型单核细胞增生李斯特菌中的actA基因、plcB基因和orfX基因进行敲除，使得actA基因、plcB基因和orfX基因都不表达，即可获得本发明所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株。

在一种实施方式中，将野毒型单核细胞增生李斯特菌中的actA基因、plcB基因和orfX基因进行敲除时，actA基因、plcB基因完全敲除，orfX基因敲除1-254位核苷酸序列，获得本发明所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株。

本发明一实施例中，actA基因、plcB基因和orfX基因同时被敲除。被敲除的actA基因、plcB基因和orfX基因含有如SEQ ID NO：7所示的序列。

进一步地，所述减毒株还可经过其他基因改造。

所述的其他基因改造是指除actA基因、plcB基因和orfX基因三基因敲除以外的基因改造。所述其他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目标基因的改造。理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没有特别限制。

基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增添、缺失引起的改变。所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除等。目标基因的敲入、目标基因的敲除可以采用基因打靶、同源重组等技术来完成。

进一步地，本发明一实施例中，与野毒型单核细胞增生李斯特菌相比，所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株不引入新的序列。

进一步地，所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株不能表达肌动蛋白聚集因子ActA、磷脂酶PC-PLC和溶解双层膜活性的OrfX。丧失胞内极向运动、裂解磷脂酶活性和溶解双层膜活性。

进一步的，所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株可采用血清型4b菌株为亲本株制备减毒疫苗。所述疫苗免疫易感宿主后，能免疫保护血清型4b强毒菌株的感染。

进一步的，所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株可基于血清型1/2b等其他野毒菌株为基础制备减毒疫苗。所述疫苗免疫易感宿主后，能免疫保护血清型1/2b等其他血清型强毒菌株的感染。

本发明的第二方面，提供了前述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株的构建方法，包括步骤：将野毒型单核细胞增生李斯特菌中的actA基因、plcB基因和orfX基因敲除。

可以采用现有的基因编辑方法敲除所述actA基因、plcB基因和orfX基因。优选地，可采用同源重组的方法敲除actA基因、plcB基因和orfX基因。还可采用其他方法实现基因敲除，并不限于实施例所列举的方式。

基于actA基因的敲除，actA基因的完整序列或部分序列从染色体DNA中去除；基于plcB基因的敲除，plcB基因的完整序列或部分序列从染色体DNA中被去除；基于orfX基因的敲除，orfX基因的完整序列或部分序列从染色体DNA中去除。

在一实施例中，基于actA基因的敲除，actA基因的完整序列从染色体DNA中去除；基于plcB基因的敲除，plcB基因的完整序列从染色体DNA中被去除；基于orfX基因的敲除，orfX基因的部分序列从染色体DNA中去除。

进一步的，基于orfX基因的敲除，orfX基因的1-254位序列从染色体DNA中去除。

在一实施例中，同时敲除actA基因、plcB基因和orfX基因。

本发明的第三方面，提供了前述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株在制备单核细胞增生李斯特菌活疫苗中的用途。

本发明的第四方面，提供了一种单核细胞增生李斯特菌活疫苗，含有前述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株。

进一步的，所述单核细胞增生李斯特菌活疫苗中还含有佐剂。

所述单核细胞增生李斯特菌活疫苗包含疫苗载体，所述载体用于运送同源或异源抗原的增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株。所述异源抗原包括多种肿瘤抗原、多种传染性病原的抗原。

本发明的第五方面，提供了actA基因、plcB基因和orfX基因共同作为靶基因在筛选单核细胞增生李斯特菌感染治疗药物中的用途。

本发明所述单核细胞增生李斯特菌感染治疗药物为以actA基因、plcB基因和orfX基因为治疗靶基因，使actA基因、plcB基因和orfX基因敲除、不表达的药物或者以actA基因、plcB基因和orfX基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以actA基因、plcB基因和orfX基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以actA基因、plcB基因和orfX基因为靶点，筛选使这三个基因不表达的药物，用于使单核细胞增生李斯特菌毒性减弱，以治疗单核细胞增生李斯特菌感染。例如，该单核细胞增生李斯特菌感染治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使actA基因、plcB基因和orfX基因敲除或不表达；或者通过制备actA蛋白拮抗剂、plcB蛋白拮抗剂和orfX蛋白拮抗剂，使actA基因、plcB基因和orfX基因表达的蛋白不发挥作用。

本发明的第六方面，提供一种PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于鉴定前述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株/野毒单核细胞增生李斯特菌，所述试剂盒中包括actA基因检测引物和/或plcB基因检测引物。

所述actA基因检测引物为能够扩增actA基因中部分片段或全长序列的引物。

所述plcB基因检测引物为能够扩增plcB基因中部分片段或全长序列的引物。

进一步的，所述actA基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的反向引物。所述plcB基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的反向引物。

actA基因正向引物：5’-AGCGGATGAGTCTACACCACAA-3’(SEQ ID NO.8)；

actA基因反向引物：5’-GATTACTGGTAGGCTCGGCATA-3’(SEQ ID NO.9)。

plcB基因正向引物：5’-GATAATCCGACAAATACTGACG-3’(SEQ ID NO.10)；

plcB基因反向引物：5’-TTCATAGAGCCATTCTTTCACG-3’(SEQ ID NO.11)。

本发明的试剂盒采用PCR检测技术进行actA基因和/或plcB基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象是否属于前述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株/野毒单核细胞增生李斯特菌。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。

基于本发明所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。

所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶。加入本发明的引物、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。

优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有单核细胞增生李斯特菌actA基因和/或plcB基因表达的DNA样本。

优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为不含有单核细胞增生李斯特菌actA基因和/或plcB基因表达的DNA样本。

本发明的第七方面，提供前述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述actA基因和/或plcB基因检测引物；

(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(4)PCR反应结束后，分析结果。

优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。

步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。

优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：94℃5min，94℃30s，60℃35s，72℃5min，30个循环。

本发明的第八方面，提供了前述试剂盒在制备actA基因和/或plcB基因检测产品中的用途。

优选地，所述检测产品用于检测和筛选单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株/野毒单核细胞增生李斯特菌。

本发明的第九方面，提供PlcB蛋白和LLO蛋白在制备ELISA诊断试剂盒中的用途，所述试剂盒用于鉴定单核细胞增生李斯特菌三基缺失减毒突变株免疫或野毒单核细胞增生李斯特菌感染。

在一实施例中，所述ELISA诊断试剂盒至少包括：ELISA反应板，所述ELISA反应板上分别包被有PlcB蛋白和LLO蛋白。

所述PlcB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

所述LLO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明旨研制了一种单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株，所述突变株毒力显著降低(比野毒型降低了至少794倍)，同时具有激发较好的免疫保护作用。本发明所述的试剂盒，具有操作简单，检测时间短，特异性强，准确度高，灵敏度高，并且能够准确区分单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株和野毒单核细胞增生李斯特菌。

本发明菌株保藏信息如下：

菌株名称：Listeria monocytogenes NTSNΔactA/plcB/orfX

保藏号为：CCTCC M 2018606；

保藏日期：2018年09月10日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：CCTCC；

保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。

附图说明

图1：本发明的PCR扩增内外侧引物试验结果图

(M：DL5000 1：SW-NTSNΔactA/plcB/orfX 2：SW-NTSN 3：SW-NTSNΔactA/plcB/orfX

4：SW-NTSNΔactA/plcB/orfX 5：SW-NTSNΔactA/plcB/orfX

6：SN-NTSN 7:SN-NTSNΔactA/plcB/orfx 8:SN-NTSNΔactA/plcB/orfx

9:SN-NTSNΔactA/plcB/orfx 10:SN-NTSNΔactA/plcB/orfx)。

图2A：本发明的PCR方法鉴别NTSNactA/plcB/orfx和野毒型李斯特菌结果图

(M：DL2000 1：NTSNactA/plcB/orfx-actA 2：NTSNΔactA/plcB/orfx-actA

3：NTSNΔactA/plcB/orfx-actA 4：NTSN-actA 5：NTSN-actA)。

图2B：本发明的PCR方法鉴别NTSNactA/plcB/orfx和野毒型李斯特菌结果图

(M：DL2000 1：NTSNactA/plcB/orfx-plcB 2：NTSNΔactA/plcB/orfx-plcB

3：NTSNΔactA/plcB/orfx-plcB 4：NTSN-plcB 5：NTSN-plcB)。

图3：本发明的NTSNΔactA/plcB/orfX对靶动物绵羊免疫保护作用的测定结果图。

图4：本发明的LM在YAC培养基上的磷脂酶活性测定结果图。

图5A：本发明的NTSNΔactA/plcB/orfX免疫绵羊后，采用间接ELISA方法区分野毒毒株感染结果图。

(间接ELISA方法检测抗PlcB血清抗体，****表示为极显著差异)

图5B：本发明的NTSNΔactA/plcB/orfX免疫绵羊后，采用间接ELISA方法检测诱导绵羊产生的免疫应答结果图。

(间接ELISA方法检测抗LLO血清抗体，ns表示无显著性差异)

具体实施方式

由于单核细胞增生李斯特菌是兼性胞内寄生菌，在预防和控制该菌感染的过程中，机体的细胞免疫应答起着决定性的作用，因此要求疫苗必须具有较好地诱导细胞免疫应答的特性，而减毒活疫苗则在诱导细胞免疫应答方面具有较好潜力的疫苗类型重要的内容。另一方面，由于单核细胞增生李斯特菌是胞内寄生菌，能溶解宿主细胞吞噬泡膜，在胞浆中生长繁殖，并可侵袭多种非吞噬细胞，这使它具有诱导CD8⁺T细胞介导的保护性免疫应答的能力，单核细胞增生李斯特菌所具有的独特免疫应答机制使它成为一种非常具有吸引力的运送来自肿瘤和传染性病原体的外源抗原的疫苗载体。

单核细胞增生李斯特菌种由13个血清型构成，引起临床李斯特菌病暴发的主要血清型为4b，其次为1/2b，因此研制抗血清型4b和1/2b型菌株感染的疫苗显得尤为必要。血清型致病性与其携带的毒力基因密切相关，因此通过毒力基因缺失的方法可使其毒力降低。已有的研究报道主要针对血清型1/2a的菌株开展的研究，科研者已开展了与减毒相关的研究工作,如LM△dal/dat、LM△actA、LM△hly、LM△plcB、LM△plcA、LM△inlA、LM△inlB、LM△inlAB等。目前尚未有对actA、plcB和orfX基因同时敲除的研究报道。

单核细胞增生李斯特菌的致病性与其多个毒力基因密切相关，它们参与了粘附、入侵、胞内繁殖及细胞间的扩散和传播。其中，hly基因编码的LLO是该菌的重要毒力因子，可促使细菌从细胞内的吞噬小体中释放，进入细胞质得以扩散。actA，plcB基因和orfX基因的编码产物ActA和PC-PLC是与LM致病性相关的主要毒力因子，actA编码的表面蛋白ActA在该菌胞内运动中起着重要作用，能产生一种使肌动蛋白聚合的因子，诱导单核细胞增生李斯特菌一极的肌动蛋白的聚合，以促进其在宿主细胞内的极向运动。基因plcB编码广谱磷脂酶C(PC-PLC)，在吞噬泡双层膜溶解中起作用。orfX与溶解双层膜密切相关。本研究通过同源重组的方法将单核细胞增生李斯特菌基因组中的上述三个基因进行了无痕敲除，使其丧失表达ActA、PC-PLC和OrfX的基础上，具有良好的安全性和免疫保护特性。LLO、PlcB和ActA是重要的毒力因子，同时具有保护性抗原的特性，野毒菌株在感染的过程中宿主能针对这些抗原产生特异性抗体。因此，通过测定野毒株和减毒缺失株中均能表达的LLO的抗体，以及只有野毒株诱导宿主产生的抗PlcB抗体，可以精确的区分疫苗免疫和野毒强毒株感染。

所述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株Listeria monocytogenesNTSNΔactA/plcB/orfX为野毒型单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的突变菌株，所述Listeria monocytogenes NTSNΔactA/plcB/orfX已于2018年09月10日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC M 2018606。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术

BHI培养基(BactoTM Brain Heart Infusion)购买自BD公司；高保真Taq酶、限制性内切酶Sal I、EcoR I和高保真酶购自Takara公司；羊抗鼠IgG购自Sigma公司；6周龄BALB/c小鼠由扬州大学比较医学中心提供。

本发明中，NTSNΔactA/plcB/orfX与Listeria monocytogenes NTSNΔactA/plcB/orfX指代相同内容，均指代本发明所述的单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株。

实施例1单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株(NTSNΔactA/plcB/orfX)的构建

1.单核细胞增生李斯特菌敲除相邻3个基因actA、plcB、orfX所用上游同源片段的扩增试剂盒提取血清型4b的单核细胞增生李斯特菌NTSN基因组，设计引物如下：

正义：

5’-ACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTTTAGAATACGAAGGGCAATCAG-3’(SEQ ID NO：13)

反义：

5’-CGCTCGTGTTCATTCAAAATTCTTATACTCCCTCCTCGTGAT-3’(SEQ ID NO：14)

正义引物含pAULA载体同源片段(下划线标出)。PCR反应体系为50μL:

NTSN：1μL

10×缓冲液：10μL

上游引物(100μmol/L)：2μL

下游引物(100μmol/L)：2μL

Taq酶(3U/μL)：1μL

4种dNTP混合物(2.5mmol/L):1μL

超纯水：33μL

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸5min，

30个循环，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离，回收长为649bp的基因同源片段。2.单核细胞增生李斯特菌敲除相邻3个基因actA、plcB、orfX基因所用下游同源片段的扩

增

试剂盒提取单核细胞增生李斯特菌NTSN基因组，采用引物如下：

正义：

5’-ATCACGAGGAGGGAGTATAAGAATTTTGAATGAACACGAGCG-3’(SEQ ID NO：

15)

反义：

5’-TTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGATCACCGTTTGAAGACATACCAGG-G3’

(SEQ ID NO：16)

正义引物含pAULA载体同源片段(下划线标出)。PCR反应体系为50μL:

NTSN：1μL

10×缓冲液：10μL

上游引物(100μmol/L)：2μL

下游引物(100μmol/L)：2μL

Taq酶(3U/μL)：1μL

4种dNTP混合物(2.5mmol/L):1μL

超纯水：33μL

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，67℃退火35s，72℃延伸5min，

30个循环，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离，回收长为611bp的基因同源片段。

3.EcoR I和Sal I双酶切pAULA质粒

PCR反应体系为50μL:

pAULA质粒：5μL

10×缓冲液：2μL

EcoR I酶：0.5μL

Sal I酶：0.5μL

超纯水：12μL

37℃酶切3h，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离，回收长为9086bp的pAULA质粒。

4.重组质粒pAULA-actA-U/orfX-D的构建

将actA，orfX基因同源片段actA-U和orfX-D与载体进行连接反应，体系如下：

actA基因同源片段：1μL(SEQ ID NO：17)

orfX基因同源片段：1μL(SEQ ID NO：18)

pAULA(EcoR I-Sal I)：3μL

5×CE II Buffer：4μL

ExnaseTM II：2μL

体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡。置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

获得质粒用EcoR I和Sal I进行双酶切，0.8％琼脂糖电泳观察到长约2200bp的目的条带，然后将重组质粒插入的序列进行测序，以验证构建的正确性。

5.穿梭载体pAULA-actA-U/orfX-D的构建

将重组质粒pAULA-actA-U/orfX-D热击法转化至E.coli DH5α宿主菌中，取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，在冰上放置30min。42℃热激45秒，冰水浴孵育2min。加入900μl SOC或LB培养基，37℃金属浴孵育10min充分复苏。37℃摇菌2h后，将菌液均匀涂布在含有红霉素的LB平板上，于37℃过夜培养。提取质粒进行PCR鉴定，验证正确。将初步鉴定为阳性的克隆穿梭载体pAULA-actA-U/orfX-D送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果通过MEGA5软件进行比对分析，选取比对结果正确的阳性克隆菌进行保存，并作为下一步构建的实验材料。

6.突变菌NTSNΔactA/plcB/orfX的构建

取10μL穿梭载体pAULA-actA-U/orfX-D以电穿孔法转化野毒型单核细胞增生李斯特菌NTSN。将阳性克隆接种含有5μg/ml红霉素的BHI固体培养基中在42℃培养箱培养24小时后，取单菌落转接至同样的培养基中在同样的条件下培养，转接8代，使同源片段actA-U/orfX-D与染色体上的actA-U//actA/plcB/orfX/orfX-D基因进行同源重组；再转接至BHI固体培养基中转接8代后，促使LM中的质粒脱掉，将菌液稀释后涂布到BHI平板上，将长出的菌落进行对应，接种至加有终浓度为5μg/ml红霉素的BHI平板上，凡在该平板上不长的菌落，进行PCR鉴定，将阳性克隆命名为NTSNΔactA/plcB/orfX。所述NTSNΔactA/plcB/orfX已于2018年09月10日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC M 2018606。

PCR鉴定所用引物及PCR条件如下：

外侧鉴定正义引物SW-F:5’-GTGTCCTTAACTCTCTCTGTCA-3’(SEQ ID NO：19)

外侧鉴定反义引物SW-R:5’-ACAAGCCTTAGAAAACCCCAAT-3’(SEQ ID NO：20)

PCR反应体系为25μL:

10×缓冲液：2.5μL

外侧鉴定正义引物SW-F(100μmol/L)：0.5μL

外侧鉴定反义引物SW-R(100μmol/L)：0.5μL

Taq酶(3U/μL)：0.25μL

4种dNTP混合物(2.5mmol/L):2μL

基因组DNA：2μL

超纯水：17.25μL

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，60℃退火4min，72℃延伸5min，30个循环；72℃10min。扩增后进行电泳。

内侧鉴定正义引物SN-F：5’-GTCAGCGGATGAGTCTACACCACAA-3’(SEQ ID NO：21)

内侧鉴定反义引物SN-R：5’-TTTGGATTACTGGTAGGCTCGGCAT-3’(SEQ ID NO：22)

PCR反应体系为25μL:

10×缓冲液：2.5μL

内侧鉴定正义引物SN-F(100μmol/L)：0.5μL

内侧鉴定反义引物SN-R(100μmol/L)：0.5μL

Taq酶(3U/μL)：0.25μL

4种dNTP混合物(2.5mmol/L):2μL

基因组DNA：2μL

超纯水：17.25μL

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，60℃退火4min，72℃延伸5min，30个循环；72℃10min。扩增后进行电泳。

7.结果

外侧，内侧引物分别扩增野毒株和突变株。外侧引物扩增出野毒株片段大小为3588bp，突变株片段大小为2353bp；内侧引物扩增出野毒株片段大小为1073bp，突变株扩增不出片段，表明成功地敲除了三个相邻的毒力基因actA、plcB和orfX。结果如图1所示。

实施例2 NTSNΔactA/plcB/orfX LD₅₀的测定

将野毒型菌株NTSN及传代至15代的突变菌株挑单菌落接种于BHI液体培养基，37℃摇振培养12h，把培养物离心并用PBS洗两次，沉淀用PBS悬浮后测定OD₆₀₀并调整OD₆₀₀使其达到0.80，将李斯特菌悬液进行梯度稀释，做平板菌落计数，取适宜稀释度的菌液进行动物实验，不同实验组腹腔注射所用剂量呈5倍递减。每一稀释度稀释菌液腹腔注射5只6周龄BALB/c小鼠，150μl/只，连续观察14天，记录接种后小鼠死亡情况，结果见下表1。由以上实例表明：发明人成功地构建了缺失actA,plcB和orfX基因的单核细胞增生李斯特菌减毒株NTSNΔactA/plcB/orfX，毒力比野毒型菌株显著降低794倍。

表1 NTSNΔactA/plcB/orfX LD₅₀的测定

实施例3 NTSNΔactA/plcB/orfX对BALB/c小鼠免疫保护作用的测定

按照实施例2中方法制备细菌，皮下免疫2组6-8周龄雌性BALB/c小鼠，2×10⁶CFU/只，每组6只，同时设定2组PBS磷酸缓冲液免疫阴性对照组(100μL/只)。第一次免疫两周后进行第二次免疫，二免14天后分别用血清型为4b的野毒株NTSN(7x10⁵CFU/只)和血清型为1/2b的菌株YC3-2(2.5x10⁶CFU/只)攻毒。结果如表2所示，NTSNΔactA/plcB/orf x能对上述两种血清型的野毒菌株的攻击提供100％的免疫保护，而PBS对照组小鼠不能对野毒菌株的攻击提供免疫保护。

表2 NTSNΔactA/plcB/orfX对小鼠的免疫保护效力

实施例4、NTSNΔactA/plcB/orfX对靶动物绵羊免疫保护作用的测定结果

按照实施例2中方法制备细菌，皮下免疫羊NTSNΔactA/plcB/orfX，1×10⁹CFU/只，共免疫8只，同时设定PBS磷酸缓冲液(1ml/只)免疫阴性对照组。第一次免疫两周后进行第二次免疫，二免14天后用野毒株NTSN攻毒，4×10¹⁰CFU/只。结果如图4所示，免疫组NTSNΔactA/plcB/orfX保护效力为87.5％。

实施例5 PCR方法鉴别NTSNΔactA/plcB/orfX和野毒型李斯特菌

设计毒力基因actA的引物分别扩增野毒株和突变株NTSNΔactA/plcB/orfX。野毒株能够扩增出actA，片段大小为810bp；突变株NTSNΔactA/plcB/orfX不能够扩增出actA。

设计引物如下：

actA基因正向引物：

5’-AGCGGATGAGTCTACACCACAA-3’(SEQ ID NO.8)

actA基因反向引物：

5’-GATTACTGGTAGGCTCGGCATA-3’(SEQ ID NO.9)

PCR反应体系为25μL：

NTSN：1μL

Mix酶：12.5μL

actA基因正向引物：：(100μmol/L)：1μL

actA基因反向引物：(100μmol/L)：1μL

超纯水：9.5μL

PCR反应条件为：94℃5min，94℃30s，60℃35s，72℃5min，30个循环，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离长为810bp的actA基因同源片段。

设计毒力基因plcB的引物分别扩增野毒株和突变株NTSNΔactA/plcB/orfX。野毒株能够扩增出plcB，片段大小为504bp；突变株NTSNΔactA/plcB/orfX不能够扩增出plcB。

设计引物如下：

plcB基因正向引物：

5’-GATAATCCGACAAATACTGACG-3’

plcB基因反向引物：

5’-TTCATAGAGCCATTCTTTCACG-3’

PCR反应体系为25μL：

NTSN：1μL

Mix酶：12.5μL

plcB基因正向引物：(100μmol/L)：1μL

plcB基因反向引物：(100μmol/L)：1μL

超纯水：9.5μL

PCR反应条件为：94℃5min，94℃30s，60℃35s，72℃5min，30个循环，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离长为810bp的plcB基因同源片段。

电泳结果显示，野毒株能够扩增出actA和plcB基因，片段大小分别为810bp(图2A)和504bp(图2B)。突变株不能够扩增出actA和plcB基因(图2A和图2B)。

实施例6、磷脂酶活性试验鉴别NTSNΔactA/plcB/orfX和野毒型李斯特菌

生物活性鉴定：PC-PLC具有水解磷脂产生一系列水溶性脂肪酸的生物活性，而卵黄中富含磷脂，因此卵黄琼脂法成为一种定性鉴定PC-PLC生物活性的简便方法。配制卵黄琼脂炭粉(YAC)培养基：于100ml BHI固体培养基中加入0.5克活性炭粉，调pH值至6.5后高压灭菌，待冷却至45℃，李斯特菌在YAC培养基表面划线接种，置于37℃培养。在YAC培养基上培养约24小时后，接种在平板上的野毒型菌株周围出现透明圈。而NTSNΔactA/plcB/orfX周围始终未出现此现象，如图4所示。由此表明NTSNΔactA/plcB/orfX不具有磷脂酶生物活性，从蛋白水平上用于区分NTSNΔactA/plcB/orfX和野毒型李斯特菌。

实施例7间接ELISA方法鉴别NTSNΔactA/plcB/orfX和野毒型李斯特菌

将NTSN和NTSNΔactA/plcB/orfX以相同的剂量分别皮下注射体重约为10公斤的绵羊，同时设PBS注射的对照组，分别于7天、14天和21天采集血样并制备血清。利用间接ELISA方法检测抗PlcB的血清抗体和抗LLO的血清抗体，将PlcB蛋白1.12μg/孔包板，血清从1：400开始做倍比稀释，同时设空白对照，OPD显色。测定结果显示，从血清抗体进行1:400稀释到1:6400稀释，NTSNΔactA/plcB/orfX接种组的抗体水平均极显著低于NTSN感染组(图5A)。将LLO蛋白0.64ug/孔包板，血清从1:400开始倍比稀释，同时设空白对照，OPD显色。测定结果显示，从血清抗体进行1:400稀释到1:6400稀释，NTSNΔactA/plcB/orfX接种组的抗体水平与NTSN感染组的抗体水平没有显著性差异，表明检测PlcB抗体和LLO抗体的间接ELISA方法可用于区分本发明的NTSNΔactA/plcB/orfX疫苗免疫与野毒菌株的自然感染(图5B)。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1920

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 1

gtgggattaa atagatttat gcgtgcgatg atggtagttt tcattaccgc caactgcatt 60

acgattaacc ccgacataat atttgcagcg acagatagcg aagattccag tctgaacaca 120

gatgaatggg aagaagaaaa aacagaagag cagccaagcg aggtaaatac gggaccaaga 180

tacgaaactg cacgtgaagt aagttcacgt gatattgagg aactagaaaa atcgaataaa 240

gtgaaaaata cgaacaaagc agacctaata gcaatgttga aagcaaaagc agaaaaaggt 300

ccaaatatta ataataacaa cagtgaacaa agcgagaatg tggctataaa tgaagaagct 360

tcaggatccg cccgaccagc tatacaagtg gagcgtcgtc atccagggtt gccatcggat 420

agcgccgcgg aaattaaaaa aagaaggaaa gctatagcat catcggatag tgagcttgaa 480

agccttactt atccggataa accaacaaaa gcaactaaga aaaaagtggc gaaagcgtca 540

gttacggata cttctgaaag tgacttagat tctagcatgc agtcagcgga tgagtctaca 600

ccacaacctt taaaagcaaa tcaacaacca tttttcccta aagtatttaa aaaaataaaa 660

gatgcgggta aatgggtacg tgataaaatc gacgaaaatc ccgaagtgaa gaaagcaatt 720

gttgataaaa gtgcagggtt aattgaccaa ttattaacta agaagaaaaa tgaagaggta 780

aatgcttcgg actttccacc accacctacg gatgaagagt taagacttgc tttgccagag 840

acaccgatgc ttcttggttt taatgctcct gctacatcgg aaccgagctc attcgaattt 900

ccaccaccac ctacggatga agagttaaga cttgctttgc cagagacgcc aatgcttctt 960

ggttttaatg ctcctgctac atcggaaccg agctcattcg aatttccacc gcctccaaca 1020

gaagatgaac tagaaattat gcgggaaaca gcaccttcgc tagattctag ttttacaagc 1080

ggggatttag ctagtttgag aagtgctatt aatcgccata gccaaaattt ctctgatttt 1140

ccaccaatcc caacagaaga agagttgaac gggagaggcg gtataccaac atctgaagaa 1200

tttagttcgc tgaatagtgg tgattttaca gatgatgaaa acagcgagac aacagaagaa 1260

gaaattgatc gcctagctga tttaagagat agaggaacag gaaaacactc aagaaatgcg 1320

ggttttttac cattaaatcc gtttactagc agtccggttc cttcgttaac tccaaaggta 1380

ccgaaaataa gcgcgccggc tctgataact gacataacta aaaaagcacc atttaaaaat 1440

ccgccacagc cattaaatgt gtttaacaaa aaaactacaa cgaaaacagc accaaaaaaa 1500

ataacccctg tgaataccgc gccaaagcta gcagcacttc ctatcacgaa agcgcaagaa 1560

actgcgcttg gggaaaataa agcaccattt atagaaaaac aagcagagac aaacaatcgg 1620

ccaattgata tgccgagcct accagtaatc caaaaagaag ttacagaaag aaataaagag 1680

gaaatgaaac cgcaaaccga gggaaaagta gtaggagaaa gcgaaccagc taataatgtg 1740

aacggaaaaa aacgttctgc tggcattgaa gaaggaaaat taattgctaa aagtgcagaa 1800

gacgaaaaag caaaagaaga accagtgaac catacgacgt taattcttgc catgtttgct 1860

attggcgtgt tctctttagg agcggttatc aaaatcattc aattaagaaa aaatagttga 1920

<210> 2

<211> 639

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 2

Val Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr

1 5 10 15

Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp

20 25 30

Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr

35 40 45

Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala

50 55 60

Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys

65 70 75 80

Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys

85 90 95

Ala Glu Lys Gly Pro Asn Ile Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gln Ser Glu

100 105 110

Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Ser Ala Arg Pro Ala Ile

115 120 125

Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu

130 135 140

Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu

145 150 155 160

Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Thr Lys Lys Lys Val

165 170 175

Ala Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser

180 185 190

Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln

195 200 205

Gln Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys

210 215 220

Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys

245 250 255

Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu

260 265 270

Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn

275 280 285

Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro

290 295 300

Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu

305 310 315 320

Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro

325 330 335

Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro

340 345 350

Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser

355 360 365

Ala Ile Asn Arg His Ser Gln Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro

370 375 380

Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu

385 390 395 400

Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu

405 410 415

Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly

420 425 430

Thr Gly Lys His Ser Arg Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe

435 440 445

Thr Ser Ser Pro Val Pro Ser Leu Thr Pro Lys Val Pro Lys Ile Ser

450 455 460

Ala Pro Ala Leu Ile Thr Asp Ile Thr Lys Lys Ala Pro Phe Lys Asn

465 470 475 480

Pro Pro Gln Pro Leu Asn Val Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr

485 490 495

Ala Pro Lys Lys Ile Thr Pro Val Asn Thr Ala Pro Lys Leu Ala Ala

500 505 510

Leu Pro Ile Thr Lys Ala Gln Glu Thr Ala Leu Gly Glu Asn Lys Ala

515 520 525

Pro Phe Ile Glu Lys Gln Ala Glu Thr Asn Asn Arg Pro Ile Asp Met

530 535 540

Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln Lys Glu Val Thr Glu Arg Asn Lys Glu

545 550 555 560

Glu Met Lys Pro Gln Thr Glu Gly Lys Val Val Gly Glu Ser Glu Pro

565 570 575

Ala Asn Asn Val Asn Gly Lys Lys Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly

580 585 590

Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro

595 600 605

Val Asn His Thr Thr Leu Ile Leu Ala Met Phe Ala Ile Gly Val Phe

610 615 620

Ser Leu Gly Ala Val Ile Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Ser

625 630 635

<210> 3

<211> 870

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 3

gtgaagttca aaaaagtggt tctaggtatg tgcttgaccg caagtgttct agtctttcct 60

gtaacgataa aagcaagtgc ctgttgtgat gaatatctaa agccccccgc agctccgcat 120

gatattgaca gcaaattacc gcataaactt agttggtccg cggataatcc gacaaatact 180

gacgtaaata cgcactattg gctttttaaa caagcagaaa aaatactagc taaagatgta 240

gatcatatgc gagctaattt aatgaatgaa cttaaaaatt tcgacaaaca aattgctcaa 300

ggaatatatg acgcggatca taaaaatcca tattatgata ctagtacgtt tttatctcat 360

ttttataatc ctgataaaga taatacttat ttgccaggtt ttgctaatgc gaaaataaca 420

ggagccaagt attttaatca atcggtggct gattaccgag aagggaaatt tgacacagca 480

ttttataaat tgggcctagc aatccattat tatacggata ttagtcaacc tatgcacgcc 540

aataatttta ccgcaatatc ctatccacca ggctaccact gtgcatatga aaattacgta 600

gataccatta aacacaatta tcaagcaaca gaagacatgg tagtgaaaag attttgctca 660

aatgacgtga aagaatggct ctatgaaaat gcgaaaaggg cgaaagcgga ctatccgaaa 720

atagtcaatg cgaaaactaa aaaatcatac ttagtaggaa attccgaatg gaaaaaggat 780

acagtggaac ctactggagc tagactaaga gattcacagc aaactttggc aggcttttta 840

gaattttggt ctaaaaaaac aaatgaataa 870

<210> 4

<211> 289

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 4

Val Lys Phe Lys Lys Val Val Leu Gly Met Cys Leu Thr Ala Ser Val

1 5 10 15

Leu Val Phe Pro Val Thr Ile Lys Ala Ser Ala Cys Cys Asp Glu Tyr

20 25 30

Leu Lys Pro Pro Ala Ala Pro His Asp Ile Asp Ser Lys Leu Pro His

35 40 45

Lys Leu Ser Trp Ser Ala Asp Asn Pro Thr Asn Thr Asp Val Asn Thr

50 55 60

His Tyr Trp Leu Phe Lys Gln Ala Glu Lys Ile Leu Ala Lys Asp Val

65 70 75 80

Asp His Met Arg Ala Asn Leu Met Asn Glu Leu Lys Asn Phe Asp Lys

85 90 95

Gln Ile Ala Gln Gly Ile Tyr Asp Ala Asp His Lys Asn Pro Tyr Tyr

100 105 110

Asp Thr Ser Thr Phe Leu Ser His Phe Tyr Asn Pro Asp Lys Asp Asn

115 120 125

Thr Tyr Leu Pro Gly Phe Ala Asn Ala Lys Ile Thr Gly Ala Lys Tyr

130 135 140

Phe Asn Gln Ser Val Ala Asp Tyr Arg Glu Gly Lys Phe Asp Thr Ala

145 150 155 160

Phe Tyr Lys Leu Gly Leu Ala Ile His Tyr Tyr Thr Asp Ile Ser Gln

165 170 175

Pro Met His Ala Asn Asn Phe Thr Ala Ile Ser Tyr Pro Pro Gly Tyr

180 185 190

His Cys Ala Tyr Glu Asn Tyr Val Asp Thr Ile Lys His Asn Tyr Gln

195 200 205

Ala Thr Glu Asp Met Val Val Lys Arg Phe Cys Ser Asn Asp Val Lys

210 215 220

Glu Trp Leu Tyr Glu Asn Ala Lys Arg Ala Lys Ala Asp Tyr Pro Lys

225 230 235 240

Ile Val Asn Ala Lys Thr Lys Lys Ser Tyr Leu Val Gly Asn Ser Glu

245 250 255

Trp Lys Lys Asp Thr Val Glu Pro Thr Gly Ala Arg Leu Arg Asp Ser

260 265 270

Gln Gln Thr Leu Ala Gly Phe Leu Glu Phe Trp Ser Lys Lys Thr Asn

275 280 285

Glu

<210> 5

<211> 324

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 5

atgtatataa aagggaggtt aatctttttc tttgtaatgt ttgtaatcgc gttatgttcc 60

gtattaatat tgctgataat aaaaatgagc gtatggaaag aggaaccatt taatttaagt 120

gatgcaaagg agattgagtg tcttggaagt tgcaaaataa aaaatactaa tcaaaaaatc 180

catttcttct ccataaaaaa gaatttgttt gaggaaaagg gcaatatggc tggaattttg 240

aatgaacacg agcgaaaagg agctgataag tccattttca ttgtaatttt agatgatgaa 300

aaagggattg caaacgaaga gtaa 324

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 6

Met Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Ile Phe Phe Phe Val Met Phe Val Ile

1 5 10 15

Ala Leu Cys Ser Val Leu Ile Leu Leu Ile Ile Lys Met Ser Val Trp

20 25 30

Lys Glu Glu Pro Phe Asn Leu Ser Asp Ala Lys Glu Ile Glu Cys Leu

35 40 45

Gly Ser Cys Lys Ile Lys Asn Thr Asn Gln Lys Ile His Phe Phe Ser

50 55 60

Ile Lys Lys Asn Leu Phe Glu Glu Lys Gly Asn Met Ala Gly Ile Leu

65 70 75 80

Asn Glu His Glu Arg Lys Gly Ala Asp Lys Ser Ile Phe Ile Val Ile

85 90 95

Leu Asp Asp Glu Lys Gly Ile Ala Asn Glu Glu

100 105

<210> 7

<211> 2720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgggattaa atagatttat gcgtgcgatg atggtagttt tcattaccgc caactgcatt 60

acgattaacc ccgacataat atttgcagcg acagatagcg aagattccag tctgaacaca 120

gatgaatggg aagaagaaaa aacagaagag cagccaagcg aggtaaatac gggaccaaga 180

tacgaaactg cacgtgaagt aagttcacgt gatattgagg aactagaaaa atcgaataaa 240

gtgaaaaata cgaacaaagc agacctaata gcaatgttga aagcaaaagc agaaaaaggt 300

ccaaatatta ataataacaa cagtgaacaa agcgataatg tggctataaa tgaagaagct 360

tcaggatccg accgaccagc tatacaagtg gagcgtcgtc atccagggtt gccatcggat 420

agcgccgcgg aaattaaaaa aagaaggaaa gctatagcat catcggatag tgagcttgaa 480

agccttactt atccggataa accaacaaaa gcaactaaga aaaaagtggc gaaagcgtca 540

gttacggata cttctgaaag tgacttagat tctagcatgc agtcagcaga tgagtctaca 600

ccacaacctt taaaagcaaa tcaacaacca tttttcccta aagtatttaa aaaaataaaa 660

gatgcgggta aatgggtacg tgataaaatc gacgaaaatc ccgaagtgaa gaaagcaatt 720

gttgataaaa gtgcagggtt aattgaccaa ttattaacta agaagaaaaa tgaagaggta 780

aatgcttcgg actttccacc accacctacg gatgaagagt taagacttgc tttgccagag 840

acaccgatgc ttcttggttt taatgctcct gctacatcgg aaccgagctc attcgaattt 900

ccaccacctc caacagaaga tgaactagaa attatgcggg aaacagcacc ttcgctagat 960

tctagtttta caagcgggga tttagctagt ttgagaagtg ctattaatcg ccatagccaa 1020

aatttctctg attttccact aatgccaaca gaagaagagt tgaacgggag aggtggtata 1080

ccaacatctg aagaatttag ttcgctgaat agtggcgatt ttacagatga cgaaaacagc 1140

gagacaacag aagaagaaat tgatcgccta gctgatttaa gagatagagg aacaggaaaa 1200

cactcaagaa atgcgggttt tttaccatta aatccgttta ctagcagccc ggttccttcg 1260

ttaagtccaa aggtatcgaa aataagcgcg ccggctctga taactgacat aactaaaaaa 1320

gcaccattta aaaatccgcc acagccatta aatgtgttta acaaaaaaac tacaacgaaa 1380

acagcaccaa aaaaaataac ccctgtgaat accgcgccaa agctagcagc acttcctatc 1440

acgaaagcgc aagaaactgc gcttggggaa aataaagcac catttataga aaaacaagca 1500

gagacaaaca atcggccaat tgatatgccg agcctaccag taatccaaaa agaagttaca 1560

gaaagaaata aagaggaaat gaaaccgcaa accgaggaaa aagtggtagg agaaagcgaa 1620

ccagctaata atgtgaacgg aaaaaaacgt tctgctggca ttgaagaagg aaaattaatt 1680

gctaaaagtg cagaagacga aaaagcaaaa gaagaaccag tgaaccatac gacgttaatt 1740

cttgccatgt tagctattgg cgtgttctct ttaggagcgg ttatcaaaat cattcaatta 1800

agaaaaaata gttgaagacg cagaatgaaa gaaaaagtga ggtgagtgat gtgaagttca 1860

aaaaagtggt tctaggtatg tgcttgaccg caagtgttct agtctttcct gtaacgataa 1920

aagcaagtgc ctgttgtgat gaatatctaa agccccccgc agctccgcat gatattgaca 1980

gcaaattacc gcataaactt agttggtccg cggataatcc gacaaatact gaggtaaata 2040

cgcactattg gctttttaaa caagcggaaa aaatactagc taaagatgta gatcatatgc 2100

gagctaattt aatgaatgaa cttaaaaatt tcgacaaaca aattgctcaa ggaatatatg 2160

acgcggatca taaaaatcca tattatgata ctagtacgtt tttatctcat ttttataatc 2220

ctgataaaga taatacttat ttgccaggtt ttgctaatgc gaaaataaca ggagccaagt 2280

attttaatca atcggtggct gattaccgag aagggaaatt tgacacagca ttttataaat 2340

tgggcctagc aatccattat tatacggata ttagtcaacc tatgcacgcc aataatttta 2400

ccgcaatatc ctatccacca ggctaccact gtgcatatga aaattacgta gataccatta 2460

aacacaatta tcaagcaaca gaagacatgg tagtgaaaag attttgctca aatgacgtga 2520

aagaatggct ctatgaaaat gcgaaaaggg cgaaagcgga ctatccgaaa atagtcaatg 2580

cgaaaactaa aaaatcatac ttagtaggaa attccgaatg gaaaaaggat acagtggaac 2640

ctactggagc tagactaaga gattcacagc aaactttggc aggcttttta gaattttggt 2700

ctaaaaaaac aaatgaataa 2720

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcggatgag tctacaccac aa 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gattactggt aggctcggca ta 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gataatccga caaatactga cg 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttcatagagc cattctttca cg 22

<210> 12

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Ile Ser Leu

1 5 10 15

Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys

20 25 30

Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser

35 40 45

Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr

50 55 60

Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly

65 70 75 80

Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn

85 90 95

Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn

100 105 110

Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly

115 120 125

Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val

130 135 140

Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly

145 150 155 160

Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser

165 170 175

Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys

180 185 190

Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp

195 200 205

Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala

210 215 220

Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser

225 230 235 240

Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr

245 250 255

Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys

260 265 270

Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn

275 280 285

Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu

290 295 300

Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp

305 310 315 320

Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn

325 330 335

Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala

340 345 350

Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp

355 360 365

Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro

370 375 380

Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile

385 390 395 400

Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp

405 410 415

Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn

420 425 430

Ile Ser Trp Asp Glu Ile Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val

435 440 445

Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe

450 455 460

Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr

465 470 475 480

Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile

485 490 495

Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp

500 505 510

Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Ser Val Asp Asn Pro Ile

515 520 525

Glu

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtttaga atacgaaggg caatcag 47

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgctcgtgtt cattcaaaat tcttatactc cctcctcgtg at 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atcacgagga gggagtataa gaattttgaa tgaacacgag cg 42

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttacgccaag cttgcatgcc tgcagatcac cgtttgaaga cataccagg 49

<210> 17

<211> 649

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttagaatacg aagggcaatc aggtgcgcta aacgaatcgt tcgccgatgt ctttggttat 60

tttattgcgc caaatcattg gttgattggt gaggatgtct gtgtgcgtgg gttacgagat 120

gggcgaataa gaagcatcaa agatcctgac aaatataatc aagcggctca tatgaaggat 180

tatgaatcgc ttccaatcac agaggaaggc gactggggcg gagttcattt taatagtggt 240

ataccgaata aagcagccta caatacgatc actaaacttg gaaaagaaaa aacagaacag 300

ctttacttcc gcgccttaaa gtactattta acaaaaaaag cccagtttac cgatgcgaaa 360

aaagcactcc aacaagcggc gaaagattta tatggtgaag atgcttctaa aaaagttgcg 420

gaagcttggg aagcggtcgg agttaactga ttaacaaatg ttagagaaaa cttaattctt 480

caagtgatat tcttaaaata attcatgaat atttttttct taaattagct aattaagaag 540

ataaccaact gctaatccaa tttttaacgg aataaattag tgaaaatgaa ggccagattt 600

tccttgttct aaaaaggttg tattagcgta tcacgaggag ggagtataa 649

<210> 18

<211> 611

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaattttgaa tgaacacgag cgaaaaggag ctgataagtc cattttcatt gtaattttag 60

atgatgaaaa agggattgca aacgaagagt aaagttatga ttagttgtga ctttttcgtg 120

tcaatcaaaa aagtgttgtg agcaaatgtt cacaaaatat ctattgtaat agtgcagttt 180

gttaggtacc cttgaataga aaaaacaatg taggaggaac atctatgaaa atgcttaaaa 240

agggtacaac ggttttattt gtaatgatta tggcggttat gttagtcgcg tgtggggaca 300

aagaagaaac gaaaacttac tcactttccc aaaatggtgt tgattctaaa ttaacataca 360

catataaggg agacaaagtt actaaacaaa cagctgagaa cacaatgtca tatgcttcgc 420

taggtgttgc ttcaaaagaa gacgctgaaa aaatgcttaa agcaacaagc gataaattcc 480

aaggtattga tggtttaaaa gaaaagattg aatataaaga tgataaagct attgaaacac 540

tagaagtaga ttacactaaa atctcttcgg aagatatgaa caaaatccct ggtatgtctt 600

caaacggtga t 611

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtgtccttaa ctctctctgt ca 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acaagcctta gaaaacccca at 22

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtcagcggat gagtctacac cacaa 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tttggattac tggtaggctc ggcat 25

Claims (8)

1.一种单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株，为 actA 基因、plcB 基因和orfX 基因都不表达的单核细胞增生李斯特菌；其中，所述单核细胞增生李斯特菌为血清型4b菌株。

2.根据权利要求 1 所述的单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1） 所述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株为 actA 基因、plcB 基因和orfX基因被敲除的单核细胞增生李斯特菌；

2） 所述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株不能表达肌动蛋白聚集因子ActA、磷脂酶 PC-PLC 和溶解双层膜活性的 OrfX。

3.根据权利要求 2 所述的单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株，其特征在于，特征 1）中，actA 基因、plcB 基因和 orfX 基因同时被敲除，被敲除的 actA 基因、plcB 基因和 orfX 基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5所示。

4.如权利要求 1~3 任一所述的单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株的构建方法，包括步骤：将野毒型单核细胞增生李斯特菌中的 actA 基因、plcB 基因和 orfX 基因敲除；其中，所述单核细胞增生李斯特菌为血清型 4b菌株。

5.如权利要求 1~3 任一所述的单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株在制备单核细胞增生李斯特菌活疫苗中的用途。

6.一种单核细胞增生李斯特菌活疫苗，含有如权利要求 1~3 任一所述的单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株。

7.一种 PCR 检测试剂盒用于区分如权利要求 1-3 之任一所述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株或野毒单核细胞增生李斯特菌中的用途，所述试剂盒中包括actA 基因检测引物和/或 plcB 基因检测引物。

8.一种ELISA 检测试剂盒用于区分如权利要求1-3之任一所述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株免疫或野毒单核细胞增生李斯特菌中的用途，所述试剂盒中包括PlcB 蛋白和 LLO 蛋白。

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