CN101139567A - 双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种将野生型产单核细胞李斯特菌毒力基因缺失的构建方法。本发明将扩增出待删除基因两翼的同源片段actA、plcB后，利用SOEing PCR方法将其拼接，插入穿梭载体pKSV7中，经电转化导入产单核细胞李斯特菌，得到actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株(Listeriamonocytogenes yzu LM1－2)，保藏号CCTCC NO：M206107。解决了产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称LM)人兽共患病的病原，死亡率高及对食品的污染与危害等。本发明删除了actA和plcB基因，从而实现对野生型菌株yzuLM4的减毒。

Description

双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种将野生型产单核细胞李斯特菌毒力基因缺失的构建方法，特别涉及一种用于基因缺失的引物设计、电转化方法及通过温度和氯霉素抗性压力实现同源重组和脱掉质粒的方法，得到产单核细胞李斯特菌减毒突变株(Listeriamonocytogenes yzu LM1-2)，保藏号CCTCC NO：M206107。

背景技术

在现代医药中使用疫苗预防传染性疾病是最有效的措施，但是目前对于传染性疾病的预防控制方面，仍面临着挑战。大多数传统疫苗仅靠体液免疫起到对病菌的免疫保护作用，而对于胞内菌的清除而言，还需要由细胞免疫来介导。

在本发明之前，产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称LM)是一种胞内寄生的人兽共患病的病原，感染后发病死亡率约为25％；LM对食品也有相当程度的污染与危害，已引起世界各国的普遍关注和高度重视，其中研制预防李斯特菌病的减毒活疫苗是重要的内容。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，研究双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株及其构建方法。

本发明的技术方案是：

actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株构建方法，其特征在于扩增出待删除基因两翼的同源片段actA、plcB后，利用SOEing PCR方法将其拼接在一起，插入穿梭载体pKSV7中，经电转化导入产单核细胞李斯特菌。

本发明的又一技术方案是：

根据权利要求1得到的actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株(Listeria monocytogenes yzu LM1-2)。

本发明的优点和效果在于选择用于基因缺失的引物设计、电转化方法及通过温度和氯霉素抗性压力实现同源重组和脱掉质粒的方法，删除actA和plcB基因，从而实现对野生型菌株LM4的减毒。对野生型菌株和突变株的毒力测定结果表明突变株毒力显著降低，比野生型降低约三个数量级。本发明获得的减毒突变株不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用，而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础。此外，对于阐明LM毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件。

本发明的其它优点和效果将在下面继续描述。

说明书附图

图1——本发明的表达产物ActA与LM多抗的Western-blot试验结果图。

图2——本发明的LM在YAC培养基上的磷脂酶活性测定结果图。

图3——本发明的LM菌株对BALB/c小鼠LgLD50的测定结果图。

具体实施方式

本发明是基于，由于LM是胞内寄生菌，能溶解宿主细胞吞噬泡膜，在胞浆中生长繁殖，并可侵袭多种非吞噬细胞，这使它具有诱导CD8⁺T细胞介导的保护性免疫应答的能力，LM所具有的独特免疫应答机制使它成为一种非常具有吸引力的运送来自肿瘤和传染性病原体的外源抗原的疫苗载体。通过毒力基因缺失的方法可使LM毒力降低。actA和plcB基因的编码产物ActA和PC-PLC是与LM致病性相关的主要毒力因子，actA编码的表面蛋白ActA在LM胞内运动中起着重要作用，能产生一种使肌动蛋白聚合的因子，诱导LM一极的肌动蛋白的聚合，以促进LM在宿主细胞内的极向运动。基因plcB编码广谱磷脂酶C(PC-PLC)，在吞噬泡双层膜溶解中起作用。

BHI培养基(BactoTM Brain Heart Infusion)购买自BD公司；高保真Taq酶、限制性内切酶Sal I、EcoR I和T4DNA连接酶购自Takara公司；氨苄青霉素和氯霉素购自上海华舜生物工程有限公司；羊抗鼠IgG购自Sigma公司；6周龄BALB/c小鼠由扬州大学比较医学中心提供。

pKSV7载体的构建见K Smith，P Youngman.Use of a new integrational vectorto investigate compartment-specific expression of the Bacillus subtilis spoIMgene”.Biochimie，1992，705-710.

实施例1：

actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株构建方法，其特征在于扩增出待删除基因两翼的同源片段actA、plcB后，利用SOEing PCR方法将其拼接在一起，插入穿梭载体pKSV7中，经电转化导入产单核细胞李斯特菌，其步骤为：

1.产单核细胞李斯特菌actA基因同源片段的扩增

产单核细胞李斯特菌LM4用100μL超纯水悬浮，浓度为10⁹CFU/ml，100℃加热10分钟，12000rpm离心5分钟，取上清5μL进行PCR扩增反应，采用引物如下：

正义：5’CCGAATTCTTTAGTTCCGCAGTGGATGC3’

反义：5’GTCTAGCTCCAGTAGGGGATCCCTCGAGGCTGCAAATATTATG3’

正义引物含ECoRI酶切位点(下划线标出)。PCR反应体系为50μL：

细菌裂解上清：5μL

10×缓冲液：5μL

上游引物(100μmol/L)：1μL

下游引物(100μmol/L)：1μL

Taq酶(3U/μL)：0.5μL

4种dNTP混合物(2.5mmol/L)：4μL

超纯水：33.5μL

PCR反应条件为：94℃5min，94℃50s，45℃50s，72℃1min，5个循环，94℃50s，58℃50s，72℃1min，20个循环，72℃10min，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离，回收长为1000bp的actA基因同源片段。

2.产单核细胞李斯特菌plcB基因同源片段的扩增

产单核细胞李斯特菌LM4用100μL超纯水悬浮，浓度为10⁹CFU/ml，100℃加热10分钟，12000rpm离心5分钟，取上清5μL进行PCR扩增反应，采用引物如下：

正义：5’CATAATATTTGCAGCCTCGAGGGATCCCCTACTGGAGCTAGA3’

反义：5’TAGTCGACCTGTTGTCATCGAAGCGCAA3’

反义引物含Sal I酶切位点(下划线标出)。PCR反应体系为50μL：

细菌裂解上清：5μL

10×缓冲液：5μL

上游引物(100μmol/L)：1μL

下游引物(100μmol/L)：1μL

Taq酶(3U/μL)：0.5μL

4种dNTP混合物(2.5mmol/L)：4μL

超纯水：33.5μL

PCR反应条件为：94℃5min，94℃50s，45℃50s，72℃80s，5个循环，94℃50s，58℃50s，72℃80s，20个循环，72℃10min，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离，回收长为1200bp的基因同源片段。

3.actA基因同源片段和plcB基因同源片段的SOEing PCR拼接

正义：5’CCGAATTCTTTAGTTCCGCAGTGGATGC3’

反义：5’TAGTCGACCTGTTGTCATCGAAGCGCAA3’

PCR反应体系为50μL：

纯化的actA基因同源片段：4μL

纯化的plcB基因同源片段：4μL

10×缓冲液：5μL

上游引物(100μmol/L)：1μL

下游引物(100μmol/L)：1μL

Taq酶(3U/μL)：0.5μL

4种dNTP混合物(2.5mmol/L)：4μL

超纯水：30.5μL

PCR反应条件为：94℃5min，94℃50s，45℃50s，72℃150s，5个循环，94℃50s，55℃50s，72℃150s，20个循环，72℃10min，结束后用浓度为0.8％的琼脂糖电泳分离，回收长为2200bp的actA/plcB基因同源片段。

4.重组质粒pKSV7-actA/plcB的构建

回收的actA/plcB基因同源片段用EcoR I和Sal I双酶切，同时用EcoR I和Sal I双酶切穿梭载体pKSV7，然后将actA/plcB基因同源片段与载体进行连接反应，体系如下：

actA/plcB基因同源片段(EcoR I-SalI)：6μL

pKSV7(EcoR I-SalI)：1μL

连接缓冲液：1μL

T4DNA连接酶：1μL

4℃连接16小时，然后转化大肠杆菌DH5α，涂布添加有终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃培养18小时，挑取生长菌落接种至含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，提质粒鉴定。

获得质粒用EcoR I和Sal I进行双酶切，0.8％琼脂糖电泳观察到长约2200bp的目的条带，然后将重组质粒插入的插入序列进行测序，以验证构建的正确性。

5.重组菌Listeria monocytogenes yzu LM1-2(简称yzu LM1-2)的构建

取0.1μg重组质粒pKSV7-actA/plcB，以电穿孔法转化野生型产单核细胞李斯特菌LM4。将阳性克隆接种含有10μg/ml氯霉素的BHI液体培养基中在42℃振摇培养20小时后，取一铂尔转接至同样的培养基中在同样的条件下培养，转接8代，使同源片段actA/plcB与染色体上的actA与plcB基因进行同源重组；再转接至BHI液体培养基中30℃振摇培养20小时，在相同的条件下转接8代后，促使LM中的质粒脱掉，将菌液稀释后涂布到BHI平板上，将长出的菌落一一对应，接种至加有终浓度为10μg/ml氯霉素的BHI平板上，凡在该平板上不长的菌落，进行PCR鉴定，将阳性克隆命名为yzu LM1-2。PCR所用引物及PCR条件如下：

正义引物Dele-actA1：5’CGTATCACGAGGAGGGAGTAT3’

反义引物Dele-plcB2：5’TATATCCACCCGATAACGAG3’

PCR反应体系为25μL：

10×缓冲液：2.5μL

上游引物(100μmol/L)：0.5μL

下游引物(100μmol/L)：0.5μL

Taq酶(3U/μL)：0.25μL

4种dNTP混合物(2.5mmol/L)：2μL

基因组DNA：2μL

超纯水：17.25μL

PCR反应条件为：94℃5min；94℃50s，49℃50s，72℃3min，25个循环；72℃10min。

实施例2：Western-blot分析

将actA纯化蛋白经SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上，分别以yzu LM1-2及LM4的多抗血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体为二抗，二氨基联苯胺(DAB)为底物，进行蛋白印迹分析。

如图1所示的免疫印迹结果可知，泳道1中，有一大小约为97kD的特异印迹带，而泳道2中没有印迹带出现，表明以yzu LM1-2免疫小鼠制备的血清中没有针对actA的抗体，在蛋白质水平上亦证实了actA基因的缺失。

实施例3：磷脂酶活性试验

生物活性鉴定：PC-PLC具有水解磷脂产生一系列水溶性脂肪酸的生物活性，而卵黄中富含磷脂，因此卵黄琼脂法成为一种定性鉴定PC-PLC生物活性的简便方法。配制卵黄琼脂炭粉(YAC)培养基：于100ml BHI固体培养基中加入0.5克活性炭粉，调pH值至6.5后高压灭菌，待冷却至45℃，yzu LM1-2在YAC培养基表面划线接种，置于37℃培养。

在YAC培养基上培养约24小时后，接种在平板上的野生型LM4菌株周围出现透明圈。而yzu LM1-2周围始终未出现此现象，如图2所示。由此表明yzuLM1-2不具有磷脂酶生物活性，从而说明plcB基因已缺失。

实施例4：重组菌株yzu LM1-2LD₅₀的测定

将野生型菌株LM4及传代至15代的重组菌株yzu LM1-2挑单菌落接种BHI液体培养基，30℃摇振培养15h，把培养物离心并用PBS洗两次，沉淀用PBS悬浮后调整比浊度使其达到OD₆₀₀为0.90，将LM悬液进行梯度稀释，做平板菌落计数，取适宜稀释度的菌液进行动物实验，不同实验组尾静脉注射所用剂量呈4倍递减。每一稀释度稀释菌液尾静脉注射5只6周龄BALB/c小鼠，100μl/只，连续观察14d，记录接种后小鼠死亡情况。

由图3可知，在BALB/c小鼠进行的动物毒力试验中，第15代的重组菌株所测得的LD₅₀为2.68×10⁷，野生型细菌所测得的LD₅₀为1.47×10⁴，数据表明重组菌yzu LM1-2毒力降低了3个数量级，对老鼠的毒力显著降低。

由以上实例表明：发明人成功地构建了缺失actA和plcB基因的产单核细胞李斯特菌减毒株丧失表达磷脂酶及表达actA蛋白的功能，毒力比野生型菌株显著降低。

Claims (7)

1.actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株构建方法，其特征在于扩增出待删除基因两翼的同源片段actA、plcB后，利用SOEing PCR方法将其拼接在一起，插入穿梭载体pKSV7中，经电转化导入产单核细胞李斯特菌。

2.根据权利要求1得到的actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株(Listeria monocytogenes yzu LM1-2)。

3.根据权利要求1所述的actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株构建方法，其特征在于产单核细胞李斯特菌actA基因同源片段的扩增方法是：采用正义、反义引物对产单核细胞李斯特菌进行PCR扩增反应，

正义：5’CCGAATTCTTTAGTTCCGCAGTGGATGC3’

反义：5’GTCTAGCTCCAGTAGGGGATCCCTCGAGGCTGCAAATATTATG3’

回收长为1000bp的actA基因同源片段。

4.根据权利要求1所述的actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株构建方法，其特征在于产单核细胞李斯特菌plcB基因同源片段的扩增方法是：采用正义、反义引物对产单核细胞李斯特菌进行PCR扩增反应，

正义：5’CATAATATTTGCAGCCTCGAGGGATCCCCTACTGGAGCTAGA3’

反义：5’TAGTCGACCTGTTGTCATCGAAGCGCAA3’

回收长为1200bp的plcB基因同源片段。

5.根据权利要求3或4所述的actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株构建方法，其特征在于actA基因同源片段和plcB基因同源片段的SOEing PCR拼接方法是，采用正义、反义引物对纯化的actA基因同源片段，纯化的plcB基因同源片段进行SOEing PCR拼接，

正义：5’CCGAATTCTTTAGTTCCGCAGTGGATGC3’

反义：5’TAGTCGACCTGTTGTCATCGAAGCGCAA3’

回收长为2200bp的actA/plcB基因同源片段。

6.根据权利要求5所述的actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株构建方法，其特征在于actA/plcB基因插入穿梭载体pKSV7的方法是：回收的actA/plcB基因同源片段用EcoRI和SalI双酶切，同时用EcoRI和SalI双酶切穿梭载体pKSV7，然后将actA/plcB基因同源片段与载体进行连接反应。

7.根据权利要求1所述的actA、pclB双基因缺失的产单核细胞李斯特菌减毒突变株构建方法，重组质粒pKSV7-actA/plcB电转化导入产单核细胞李斯特菌，42℃氯霉素压力下与染色体同源重组，之后在30℃无抗生素培养基中传代培养脱掉质粒。

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