CN103820374B - 引入人源cd24核苷酸序列的转化减毒李斯特菌及其疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种引入人源CD24核苷酸序列的转化减毒李斯菌及其疫苗，其特征在于，所述人源CD24核苷酸位于PKSV7穿梭质粒上，并在减毒李斯特菌或其子代中复制并表达；本发明疫苗克服现有技术中肝癌治疗的诸多不足，用于临床治疗和预防肝癌对化放疗药物的耐药性及术后的转移复发，具有较高的安全性和可靠性。

Description

引入人源CD24核苷酸序列的转化减毒李斯特菌及其疫苗

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是一种引入了人源CD24核苷酸序列的转化的减毒李斯特菌。

背景技术

肿瘤及其相关性疾病对人们的健康产生了越来越多的威胁。目前，全球范围内，肝细胞肝癌占到了80~90%，在最常见的肿瘤中列第五位，在肿瘤相关性死亡中列第三位。全世界，50%的肝细胞肝癌都是由于乙型肝炎病毒感染引起的。在中国，由于乙肝病毒感染的高发性，肝细胞肝癌的发病率高达1/10000。由于肝癌的恶性程度较高及较差的预后，目前的治疗主要集中在抗病毒治疗、放射治疗、药物化疗及手术治疗。但是，肝癌往往会产生化放疗抵抗以及术后的复发及转移。肝癌干细胞作为一个新的概念被提了出来，用来解释肝癌产生化放疗抵抗的机制。肝癌干细胞是存在于肝癌中的一小群细胞，它们能够自我更新、增殖、分化成肝癌细胞。这些细胞群通过某些已知或者未知的机制对化放疗药物产生抵抗，从而影响肿瘤的转移复发。随着表观遗传学的发展，一些非常重要的肝癌干细胞表面分子标记被陆续发现，如：CD13、CD90、CD133和EpCAM。这些表面标记对于鉴定和分离肝癌干细胞扮演着十分重要的角色。CD24是一个高度糖基化的、粘蛋白样的细胞表面蛋白，其高表达于诸多实体肿瘤，如：淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、食管癌、乳腺癌、肾透明细胞癌等。2012年，香港大学Irene Oi Lin Ng教授在国际顶级刊物《Cancer Cell》上撰文证明称：CD24在化放疗抵抗的肿瘤组织中高表达，是肝癌干细胞的重要表面标记。CD24+ 的肝癌细胞对于肝癌的化放疗及术后复发转移起到关键作用。

李斯特菌（Listeria monocytogenes)是一种格兰染色阳性的胞内寄生菌，对体抗力较差的老人、孕妇和小孩能够引起腹泻。20世纪，李斯特菌被认为是最有潜力的活疫苗载体，目前全球十大最有潜力的疫苗中，李斯特菌疫苗独占两席。李斯特菌在体内主要被巨噬细胞、肝库普佛细胞及脾淋巴细胞吞噬。李斯特菌溶血素O能够溶解细胞膜，使得李斯特菌能够自由进出细胞，在细胞与细胞之间传播。李斯特菌在胞内期分泌的蛋白可被蛋白酶降解并递呈给MHC-I 类通路。同时，该分泌蛋白可以直接被递呈并激活MHC-II分子通路。因此，李斯特菌疫苗可以激活CD4+和CD8+的T淋巴细胞。

PKSV7穿梭质粒是本领域常用的质粒载体，虽然在公开号为CN101139567A和CN122533829A 的专利文献中均记载了其在构建减毒李斯特菌株中的应用。但是，以李斯特菌作为疫苗载体，通过分子克隆技术使其能过表达及分泌人源性CD24蛋白，激活机体免疫应答，产生相应抗体，用于治疗肝癌化放疗抵抗病人及预防肝癌病人术后的转移及复发未见有报道。

发明内容

为克服现有技术中肝癌治疗的诸多不足，提供一种抗肝癌，特别是预防肝癌的化放疗抵抗以及术后的转移复发，安全性高具有疫苗特性的转化减毒李斯特菌。

本发明的技术方案是：

一种引入人源CD24核苷酸序列转化的减毒李斯特菌或其子代，所述人源CD24核苷酸位于PKSV7穿梭质粒上，并在减毒李斯特菌或其子代中复制并表达；所述PKSV7穿梭质粒编码减毒李斯特菌存活必须的右旋-丙氨酸基因。

本发明中，转化减毒李斯特菌的方法，包括引入人源CD24核苷酸序列的步骤，所述人源CD24核苷酸位于PKSV7穿梭质粒上，并于减毒李斯特菌或其子代中复制并表达，所述PKSV7穿梭质粒编码减毒李斯特菌存活必须的右旋-丙氨酸基因。

本发明中，一种包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗，包括引入人源CD24核苷酸序列的步骤，所述人源CD24核苷酸位于PKSV7穿梭质粒上，并于减毒李斯特菌或其子代中复制并表达，所述PKSV7穿梭质粒编码减毒李斯特菌存活必须的右旋-丙氨酸基因。

本发明中，所述的包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗，其特征在于：将减毒李斯特菌菌体通过氯霉素抗性筛选，在无抗性的BHI培养基中，优选得到稳定的无氯霉素抗性的减毒李斯特菌疫苗。

本发明提供的转化的减毒李斯特菌能够过表达及分泌人源性CD24蛋白，有效的激活机体免疫系统，产生特异性抗体，杀伤肝癌干细胞，具有很好的防治肿瘤的作用。

本发明提供的包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗和现有技术相比具有以下优点：

1、口服本发明提供的减毒李斯特菌疫苗具有较高的安全性和可靠性，对各种组织器官无明显的损伤作用。

2、减毒李斯特菌肝癌干细胞无抗生素抗性：本发明为了能够筛选出能够成功导入穿梭质粒PKSV7-CD24的李斯特菌菌体，而人为的在PKSV7质粒载体中加入了氯霉素抗性。但是，该疫苗将来是要用于临床治疗和预防肝癌对化放疗药物的耐药性及术后的转移复发，人为引入的氯霉素抗性可能会使疫苗的使用者产生氯霉素耐药性。本发明通过将李斯特菌菌体在无抗性的BHI培养基中传7代，优选得到稳定的无氯霉素抗性的减毒李斯特菌疫苗，可避免肝癌患者治疗过程中出现氯霉素耐药性。

附图说明

图1为转化的减毒李斯特菌疫苗分泌人源性CD24蛋白电泳图。

图2为转化的减毒李斯特菌疫苗对细胞和组织的感染结果示意图。

图3（a）为减毒李斯特菌疫苗预防肝癌实验结果示意图。

图3（b）为减毒李斯特菌疫苗治疗肝癌实验结果示意图。

具体实施方式

结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 减毒李斯特菌疫苗的制备方法

本实施例中的菌株由宾夕法尼亚大学Franckle教授提供。

实施例涉及的培养基/试剂：

改良BHI(心脑灌注液)培养基：100ml 去离子水+3.7g BHI干粉+ 20mg 右旋丙氨酸；

BHIS（蔗糖心脑灌注液）：100ml 去离子水+3.7g BHI干粉+17.115g蔗糖+20mg 右旋丙氨酸；

SGWB（甘油蔗糖缓冲液）：1000ml 去离子水+171.15g蔗糖+100ml甘油+0.2383g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；

BHI培养基：100ml去离子水+3.7gBHI干粉；

BHI平板：100ml+去离子水+3.7gBHI干粉+100g琼脂糖；

BHI氯霉素抗性培养基：100ml去离子水+3.7gBHI干粉+1mg氯霉素；

BHI氯霉素抗性平板：100ml去离子水+3.7gBHI干粉+1mg氯霉素+100g琼脂糖；

其中，BHI干粉由OXOID公司生产，货号:750364。

（1）构建携带人CD24蛋白基因的PKSV7穿梭质粒

利用合成的针对CD24的引物对：

SEQ ID NO.1前引物：5’-TTGATATCATGGGCAGAGCAATGGTGGCC-3’

SEQ ID NO.2后引物：5’-TTGCGGCCGCTCAAGAGTAGAGATGCAGAAG-3’ ,

以人的肝癌基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应，体外合成CD24基因序列，将该序列直接连接入T载体后立即转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，摇菌37℃过夜，得到高拷贝的CD24 DNA序列。经基因序列测序，证明CD24序列正确无误后，以EcoRV 和 NheI为酶切位点，将从高拷贝扩增的CD24序列从T载体上切下来，在T₄DNA 连接酶的作用下使其与酶切处理后充分线性化的PKSV7载体相连，从而连接入PKSV7载体。随后，将连接好的反应体系，转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，摇菌37℃过夜，得到浓度 >1000ng/μl的PKSV7-CD24质粒序列；

(2) 李斯特菌感受态细胞的制备：

a）菌种活化：挑选减毒李斯特菌单菌落，接入改良BHI培养基，在37℃摇床过夜培养；

b）转接：将活化的李斯特菌菌种按1:100转接入200ml改良BHI培养基中，继续培养，当600nm下吸光值（OD600）达到0.2~0.25时，加入氨苄青霉素，使氨苄青霉素的终浓度为10µg/ml；然后在37℃ 继续培养2h，当600nm下吸光值（OD600 ）为0.5 ~ 0.6时；将培养好的李斯特菌菌体冰浴10min，然后在4℃，5000 转/分钟离心 10 min，取菌体用200ml SGWB 液重悬菌体，然后在4°C，5000转/分钟离心 10 min；取菌体用90ml SGWB 液重悬菌体，然后在4°C下5000 转/分钟离心 10 min；取菌体再用45ml SGWB 液重悬菌体，加入溶菌酶，使溶菌酶的浓度达到10µg/ml后37°C水浴20min；然后在4°C 下3000转/分钟离心10 min，然后取菌体用20ml SGWB 液重悬菌体；然后在4°C，3000转/分钟离心10 min，再用1ml SGWB 液重悬菌体，得李斯特菌感受态细胞，50µl/管分装，保存于-80°C，备用；

在实际操作过程中，b）步骤中也可以按照1:40的比例将活化的李斯特菌菌种接入200ml改良BHI培养基中培养；也可以使用青霉素G代替氨苄青霉素。

(3)电转李斯特菌感受态细胞

取步骤(2)制备得到的李斯特菌感受态细胞50µl，加入1µg步骤(1)制备得到的PKSV7-CD24质粒，在冰上孵育5min，然后将感受态细胞和PKSV7-CD24质粒混合物加入到电转杯中电转：电压：10 kV/cm,电阻：400 Ώ,电容：25 µF；

细胞复苏：将1ml BHIS加入到上述电转的混合物中，30°C下静置培养1.5h，然后将复苏后的细胞涂布于BHI氯霉素抗性平板上；

实际操作中也可以用30～50转/分钟培养1.5h代替静置培养；

(4)穿梭质粒与李斯特菌重组传代

挑选步骤(3)转化后的李斯特细菌接入BHI氯霉素抗性培养基中，30℃过夜培养；然后在42℃条件下传代，一天传2次，早上一次：100传，晚上一次：1000传；实现第一次同源重组，至少传5代以后，取菌液分别稀释10⁵，10⁶，10⁷倍，用100ul涂布平板，42℃过夜培养。

挑单菌落，接入BHI培养基中，30℃过夜培养； 然后在30℃条件下，一天传2次，早上一次：100传，晚上一次：1000传，至少传7代以后，取菌液分别稀释10⁵，10⁶，10⁷倍，用100ul涂布BHI平板，30℃过夜培养；实现第二次同源重组。

对第二次同源重组的菌落进行氯霉素抗性筛选：挑选200个单菌落，同时分别接到BHI氯霉素抗性平板和BHI平板上，30℃过夜培养，如果菌落在BHI氯霉素抗性平板上菌落不生长，而在BHI平板上生长，与其对应的第二次同源重组的含有菌落的BHI培养基即为重组减毒李斯特菌疫苗。

实施例2 第二次同源重组的减毒李斯特菌分泌人源性CD24蛋白实验

减毒李斯特菌在通过电穿孔转入PKSV-CD24穿梭质粒之后，若要成为一个合格的疫苗必须能够持续稳定地分泌CD24蛋白，来有效激活机体的免疫应答。

本发明对实施例1获得的第二次同源重组菌落在BHI培养基中继续培养40代，分别提取5代、10代、15代、20代、30代和40代减毒李斯特菌子代菌体培养基，利用TCA/丙酮沉淀法提取BHI培养基中的分泌蛋白，用western blot法鉴定蛋白的表达中的蛋白质进行鉴定，实验结果表明，随着传代次数的增多，减毒李斯特菌能够持续稳定的分泌蛋白质，如图1所示。

实施例3 重组后的减毒李斯特菌活疫苗对细胞和组织的感染能力实验

减毒李斯特菌作为一种单核增生性格兰染色阳性细菌，对宿主细胞的感染能力对于其发挥激活细胞免疫应答和体液免疫应答发挥着关键性作用。

对实施例1重组后的减毒李斯特菌疫苗在体内的感染性进行实验，观察外源性基因重组后会不会影响疫苗株的生存和繁殖。方法是：

实验组：实施例1提供的重组减毒李斯特细菌疫苗；

对照组：由宾夕法尼亚大学Franckle教授提供的减毒李斯特菌疫苗；

a)选择HepG2、Snu423、SMMC-7721、Huh-7肝癌细胞株及小鼠巨噬细胞株Raw264.7,通过实验组和对照组疫苗对它们进行体外感染，发现实验组和对照组疫苗对在体外感染细胞株的能力并无明显差异。

b）选择体重10g的C57BL/6小鼠9只，利用实验组的疫苗通过灌胃针口服免疫小鼠三次，10⁹CFU/只，每周免疫一次，连续三周；第三次免疫结束后第1、3天取小鼠的肝、脾、肺、脑中提取李斯特菌菌体，结果表明重组后的李斯特菌主要分布在肝、脾组织中，在肾脏中发现少量李斯特菌，在肺及脑组织中几乎没有李斯特菌分布，且在肝、脾中的分布无明显统计学差异，在肝、脾中的含量如图2所示。同时，本发明通过电镜观察，结果表明在小鼠的肝、脾中有李斯特菌菌体的存在。

以上实验结果表明，实施例1提供的重组后的减毒李斯特菌疫苗对细胞和组织的具有好的感染性能。

实施例4 重组李斯特菌疫苗口服安全性实验

选择体重10的小鼠3只，利用实施例1的疫苗通过灌胃针口服免疫小鼠三次，10⁹CFU/只，每周免疫一次，连续三周；在第三次免疫后的第3天取小鼠的肝、脾进行H&E染色以判断组织损伤程度。在免疫过程中，没有小鼠出现死亡。观察H&E切片发现，肝脏在免疫后出现轻微的炎症反应，肝脏中央静脉结构无明显损伤，汇管区结构完整，肝细胞未见明显空泡样变、增生及坏死。脾脏炎症反应轻微。而在肾脏，没有看到肾脏组织出现损伤的表现。

以上结果表明，口服实施例1的疫苗具有较高的安全性和可靠性，对各种组织器官无明显的损伤作用。

实施例5 减毒李斯特菌疫苗抗肿瘤实验

李斯特菌属于兼性胞内寄生菌，可以同时激活MHC-I类和MHC-II类抗原递呈通路。此外，李斯特菌还会诱导记忆性T细胞的产生，当再次免疫时，可以迅速产生更为有效的免疫应答。本发明是采用体内抑瘤实验来评价该减毒重组李斯特菌疫苗的免疫预防和治疗效果。具体步骤如下：

a）实验动物模型的建立

小鼠移植皮下瘤动物模型的建立：取稳定转染的Hepa1-6-CD24小鼠肝癌细胞，以10⁶/100ul/只的剂量，用1ml注射器将肝癌细胞接种于24只6~8周龄的C57L/B6小鼠的右侧腹股沟皮下。同时以10⁹/CFU/只的剂量用灌胃针口服免疫小鼠，记录肿瘤生长情况。

b）、实验分组

治疗组和预防组均使用实施例1提供的疫苗，附图中标示为Lmdd-CD24；

对照组的疫苗为：Lmdd（由宾夕法尼亚大学Franckle教授提供的减毒李斯特菌疫苗；）

空白对照组疫苗为疫苗稀释剂PBS；

治疗组的小鼠：4只，来源于本实施例的a步骤；

预防组的小鼠：4只，来源于本实施例的a步骤；

对照治疗组的小鼠：4只，来源于本实施例的a步骤；

对照预防组的小鼠：4只，来源于本实施例的a步骤；

空白对照治疗组的小鼠：4只，来源于本实施例的a步骤；

空白对照预防组的小鼠：4只，来源于本实施例的a步骤；

c）、小鼠免疫方案：

预防组、对照预防组和空白对照预防组：在接种肿瘤前3天，以灌胃针给小鼠口服剂量为10⁹/CFU/只的相应疫苗进行免疫，然后以10⁶/100ul/只的剂量向小鼠接种Hepa-6-CD24肿瘤细胞，，以相同剂量和方法每周免疫小鼠一次，连续两周。以游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的最长径和最短径，取最大径和最小径之和的平均值计入，每3天测量一次，当肿瘤大小大于20.0mm时处死小鼠,截取15-36天的数据标绘制图3（a）。

治疗组、对照治疗组和空白对照治疗组：于接种Hepa-6-CD24肿瘤细胞（10⁶/100ul/只）后3天开始灌胃针给小鼠口服10⁹/CFU(集落形成单位)/只的相应疫苗免疫小鼠，以后每周免疫一次，连续两周，以游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的最长径和最短径。取最大径和最小径之和的平均值计入，每3天测量一次，当肿瘤大小大于20.0mm时处死小鼠。截取9-33天的数据标绘制图3（b）。

d）实验结果

实验结果如图3（a）和图3（b）所示，本发明提供的减毒重组李斯特菌疫苗能够明显抑制肝癌细胞的生产，与对照组相比，具有明显差异，显示出了很好的抗肝癌活性，尤其是针对表达CD24的肝癌细胞，能够对其产生有效的杀伤作用，可以预防肿瘤的转移和复发。

以上实验结果表明，本发明提供的减毒重组李斯特菌疫苗，不仅具有高的安全性，并且具有强的抑制肿瘤细胞生产的活性，有望开发成为新一代用于防治肝癌的药物或开发成为预防肝癌的化放疗抵抗以及术后的转移复发的药物，具有很好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京新赛尔思生物科技有限公司

<120> 引入人源CD24核苷酸序列的转化减毒李斯特菌及其疫苗

<130> 2013-11-25

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgatatcat gggcagagca atggtggcc 29

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgcggccgc tcaagagtag agatgcagaa g 31

Claims (4)

1.一种引入人源CD24 核苷酸序列的转化的减毒李斯特菌或其子代，其特征在于：所述人源CD24 核苷酸位于PKSV7 穿梭质粒上，并在减毒李斯特菌或其子代中复制并表达；所述PKSV7穿梭质粒编码减毒李斯特菌存活必须的右旋-丙氨酸基因。

2.一种转化减毒李斯特菌的方法，其特征在于：将人源CD24 核苷酸序列引入PKSV7 穿梭质粒后，与减毒李斯特菌感受态细胞电转复苏后获得转化减毒李斯特菌；所述PKSV7 穿梭质粒编码减毒李斯特菌存活必须的右旋-丙氨酸基因。

3.一种包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗，其特征在于：包括引入人源CD24 核苷酸序列的步骤，所述人源CD24 核苷酸位于PKSV7 穿梭质粒上，并于减毒李斯特菌或其子代中复制并表达；所述PKSV7 穿梭质粒编码减毒李斯特菌存活必须的右旋-丙氨酸基因。

4.根据权利要求3 所述的包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗，其特征在于：将减毒李斯特菌菌体通过氯霉素抗性筛选，优选得到稳定的无氯霉素抗性的减毒李斯特菌疫苗。